一種利用AF4對(duì)EVs及其異質(zhì)性亞進(jìn)行溫和、低損傷分離、純化、富集的方法及裝置
一種利用af4對(duì)evs及其異質(zhì)性亞進(jìn)行溫和、低損傷分離、純化、富集的方法及裝置
技術(shù)領(lǐng)域
1.本發(fā)明屬于evs及其異質(zhì)性亞分離及富集技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用af4對(duì)evs及其異質(zhì)性亞進(jìn)行溫和、低損傷分離、純化、富集的方法及裝置。
背景技術(shù)：
2.細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles，evs)是指從細(xì)胞膜上脫落或者由細(xì)胞分泌的雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡狀小體，廣泛存在于體液當(dāng)中，evs攜帶著豐富的生物學(xué)信息，并參與細(xì)胞間通訊、細(xì)胞遷移、血管新生和免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程。
3.研究表明，evs具有異質(zhì)性，即在一個(gè)evs體內(nèi)部，各異質(zhì)性亞在生物發(fā)生、物理特征(如大小、密度、形態(tài)、顆粒數(shù))和內(nèi)容物(如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸)各不相同。evs負(fù)載的內(nèi)容物既是細(xì)胞對(duì)不同生理和病理?xiàng)l件的反應(yīng)，又會(huì)對(duì)其受體細(xì)胞產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)。因此，明確界定evs異質(zhì)性亞的生物物理特性、功能、成因和調(diào)控機(jī)制，不僅有助于了解其在生理病理過(guò)程中的確切作用，還將有助于識(shí)別病理狀態(tài)下的潛在診斷/預(yù)后生物標(biāo)志物。為加速evs應(yīng)用于臨床診斷和提供理論依據(jù)。
4.國(guó)際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)(international society for extracellular vesicles，isev)于2018年發(fā)布最新指南：《misev2018》，建議用以下操作性術(shù)語(yǔ)來(lái)對(duì)evs進(jìn)行定義：
①
物理特性：尺寸“small evs”(sevs：《100nm or《200nm)和“medium/large evs”(m/levs：》200nm)、密度；
②
生化成分(cd63
+
/cd81
+-evs、annexin a5-stained evs)；
③
利用evs的產(chǎn)生條件或細(xì)胞來(lái)源來(lái)描述(如：腫瘤細(xì)胞exos，低氧產(chǎn)生的exos)。
5.目前有研究通過(guò)rna測(cè)序和定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析了連續(xù)過(guò)濾分離的小鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的sevs、mevs、levs異質(zhì)性亞的細(xì)胞外rna(exrnas)和細(xì)胞外蛋白(exptns)，發(fā)現(xiàn)mevs亞的mrna最緊密地反映了細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，而sevs亞的exrnas富集在小的非編碼rna中，cd9主要是sevs亞標(biāo)記物，而levs亞上始終有cd81，nono蛋白主要存在于levs亞中。
6.evs異質(zhì)性亞的分離是深入開展evs研究的基礎(chǔ)。目前的分離方法主要是離心法，如常用的差速超速離心法(differential ultracentrifugation，duc)，即通過(guò)對(duì)樣品施加不同的離心力達(dá)到分離的目的，可通過(guò)低速(2000g)、中速(10000g)、高速(100000g)離心實(shí)現(xiàn)對(duì)evs異質(zhì)性亞的分離。但duc法存在以下缺點(diǎn)：
①
即使在離心力較低的情況下也會(huì)導(dǎo)致evs發(fā)生團(tuán)聚，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)同一粒徑范圍evs亞的絕對(duì)分離；
②
duc分離會(huì)對(duì)evs施加破壞力導(dǎo)致其活性降低，不利于后續(xù)對(duì)其進(jìn)行深入的生物學(xué)活性研究；
③
分離時(shí)間長(zhǎng)，成本較高，只能通過(guò)不同轉(zhuǎn)速的多次離心得到不同evs亞；
④
分離過(guò)程中無(wú)法對(duì)evs異質(zhì)性亞進(jìn)行分析和定量。
⑤
難以將蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片與evs分離開來(lái)；
7.在實(shí)際研究中，生物基質(zhì)中的蛋白雜質(zhì)或細(xì)胞碎片會(huì)嚴(yán)重影響evs研究的可靠性，蛋白雜質(zhì)或細(xì)胞碎片會(huì)導(dǎo)致難以對(duì)evs樣品進(jìn)行準(zhǔn)確的蛋白濃度定量，進(jìn)而顯著影響下游分析結(jié)果，使數(shù)據(jù)難以比較、重現(xiàn)以及對(duì)各分組間的結(jié)果進(jìn)行分析，且無(wú)法排除蛋白質(zhì)雜質(zhì)
和細(xì)胞碎片的作用，最終影響evs生物活性研究的真實(shí)性。而目前的研究多是將evs進(jìn)行提取后，直接進(jìn)行研究，缺少合適的純化方法，深入研究evs的生物活性需要開發(fā)一種有效的純化方案，迫切解決這一問(wèn)題成為evs界的一個(gè)普遍的共識(shí)。因此，開發(fā)一種成本低、條件溫和、保留evs樣品生物特性的分離、純化富集方法成為evs異質(zhì)性亞研究領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。
8.非對(duì)稱場(chǎng)流分離技術(shù)(af4)是基于樣品的分子擴(kuò)散和與樣品分子擴(kuò)散反方向的交叉流的作用的分離方法，af4沒(méi)有固定相和填料，在流體環(huán)境中完成分離過(guò)程，因此具有低剪切力、分離條件溫和、適合生物大分子分離表征的特點(diǎn)，在分離過(guò)程中，小粒徑樣品由于擴(kuò)散系數(shù)小，更接近池道拋物線層流的中心位置，會(huì)先洗脫出來(lái)，大粒徑樣品會(huì)更遠(yuǎn)離拋物線層流中心位置，被后洗脫出來(lái)，實(shí)現(xiàn)樣品的分離。此外，af4可與多角度激光檢測(cè)器(mals)耦合，同時(shí)提供樣品的粒徑分布、顆粒數(shù)量等信息。可通過(guò)優(yōu)化af4分離條件，將蛋白質(zhì)雜質(zhì)與evs樣品進(jìn)行分離，蛋白質(zhì)雜質(zhì)由于粒徑小，在分離過(guò)程中被先洗脫出來(lái)，囊泡被后洗脫出來(lái)，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)evs樣品的純化和evs異質(zhì)性亞樣品的分離。
9.在采用af4及其它譜技術(shù)(如尺寸排阻譜法)對(duì)evs異質(zhì)性亞進(jìn)行分離時(shí)，流動(dòng)相會(huì)稀釋evs導(dǎo)致樣本濃度降低，以往的研究多采用超濾法對(duì)evs異質(zhì)性亞樣品進(jìn)行富集，超濾法同離心法一樣會(huì)施加離心力，同樣會(huì)遇到離心導(dǎo)致的evs樣品發(fā)生團(tuán)聚及生物受損等問(wèn)題，需要一種溫和、低損傷的evs異質(zhì)性亞樣品富集方法。可以利用af4技術(shù)優(yōu)勢(shì)解決這一問(wèn)題。
10.但由于獲得的evs異質(zhì)性亞樣品通常濃度低、體積大，因此需要大體積進(jìn)樣，而af4進(jìn)樣環(huán)最大進(jìn)樣體積為100μl，無(wú)法直接達(dá)到富集目的。且目前尚無(wú)商品化大體積進(jìn)樣環(huán)，定制大體積進(jìn)樣環(huán)成本很高并且耗時(shí)，很難實(shí)現(xiàn)。并且由于af4流動(dòng)相單向過(guò)濾器(＜100nm)的限制，大于100nm的樣品無(wú)法通過(guò)加在流動(dòng)相中泵入到池道中。因此可通過(guò)改裝af4管路，實(shí)現(xiàn)大體積樣本進(jìn)樣，且目前尚無(wú)低成本、低損傷evs生物活性的富集方法，因此基于af4溫和、低損傷的技術(shù)特性，可通過(guò)在原有af4儀器基礎(chǔ)上，進(jìn)行管路改造，開發(fā)低成本、低損傷富集evs異質(zhì)性亞的方法不僅有助于對(duì)evs異質(zhì)性亞樣品進(jìn)行高效富集，還可根據(jù)需要富集后連接檢測(cè)器，進(jìn)行在線富集與檢測(cè)，對(duì)evs功能研究具有重要意義。且還可進(jìn)一步應(yīng)用于環(huán)境中微量的納米尺寸顆粒物的富集研究，為環(huán)境中微量的納米尺寸顆粒物的研究提供新方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
11.本發(fā)明的目的是提供一種利用af4對(duì)evs及其異質(zhì)性亞進(jìn)行溫和、低損傷分離、純化富集的方法，該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)實(shí)驗(yàn)中實(shí)際提取的尺寸分布在30-400nm的廣泛粒徑分布的血小板來(lái)源細(xì)胞外囊泡(pevs)亞混合體進(jìn)行分離表征，且可以實(shí)現(xiàn)對(duì)evs異質(zhì)性亞的高效富集，解決了目前evs研究中由于存在蛋白質(zhì)雜質(zhì)可能造成的結(jié)果偏差以及異質(zhì)性亞富集過(guò)程中所造成的生物特性改變等問(wèn)題。
12.本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種利用af4對(duì)evs及其異質(zhì)性亞進(jìn)行溫和、低損傷分離、純化、富集的方法的裝置。
13.為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
14.一種利用af4對(duì)evs及其異質(zhì)性亞進(jìn)行溫和、低損傷分離、純化、富集的方法，包
括以下步驟：
15.1)分離、純化：利用af4對(duì)廣泛粒徑分布的evs樣品按照粒徑大小進(jìn)行分離，蛋白質(zhì)雜質(zhì)與evs進(jìn)行分離，同時(shí)evs按照粒徑由小至大被洗脫出來(lái)，實(shí)現(xiàn)分離純化evs；
16.2)富集：將分離后得到的不同的evs異質(zhì)性亞樣品通過(guò)進(jìn)行af4富集，在原有的af4的進(jìn)樣器和af4系統(tǒng)eclipse dualtec儀器間連接大體積進(jìn)樣管路以替代原有管路，并重新設(shè)定進(jìn)樣程序通過(guò)聚集模式和聚集進(jìn)樣模式來(lái)回切換實(shí)現(xiàn)不同體積evs樣品的富集。
17.進(jìn)一步地，步驟1)中所述的分離、純化，梯度洗脫為交叉流流速5min內(nèi)由2ml/min下降至0.25ml/min；后30min由0.25ml/min下降至0.09ml/min。
18.進(jìn)一步地，步驟1)中所述的分離、純化，進(jìn)樣量為100μl；檢測(cè)器流速為1ml/min；膜的類型為10kda rc膜，流動(dòng)相為10mm pbs溶液。
19.進(jìn)一步地，步驟1)中所述的分離、純化，根據(jù)保留時(shí)間不同，將蛋白質(zhì)雜質(zhì)與evs樣品進(jìn)行分離，達(dá)到evs樣品純化目的。
20.進(jìn)一步地，步驟2)中所述的富集，在af4的進(jìn)樣器和af4系統(tǒng)eclipse dualtec儀器之間連接大體積進(jìn)樣管路以替代原有管路。所述大體積進(jìn)樣管路的規(guī)格為10ml，也可以選用其他規(guī)格大體積進(jìn)樣管路。
21.進(jìn)一步地，步驟2)中所述的富集，富集時(shí)，更改進(jìn)樣程序設(shè)定，先進(jìn)行聚集模式，之后進(jìn)行聚集進(jìn)樣模式，然后根據(jù)需要富集的樣本量在聚集模式和聚集進(jìn)樣模式兩種模式間來(lái)回切換。
22.進(jìn)一步地，步驟2)所述富集時(shí)，交叉流流速為恒定的2ml/min，膜的類型為10kda rc膜，流動(dòng)相為10mm pbs溶液。洗脫模式為聚集模式和聚集進(jìn)樣模式。
23.進(jìn)一步地，在所述聚集模式下，流動(dòng)相帶不經(jīng)過(guò)進(jìn)樣器，從流動(dòng)相瓶經(jīng)液相泵進(jìn)入af4系統(tǒng)eclipse dualtec儀器，后經(jīng)池道進(jìn)口端和出口端也泵入池道，在池道進(jìn)樣口附近形成對(duì)流。
24.進(jìn)一步地，在所述聚集進(jìn)樣模式下，流動(dòng)相經(jīng)過(guò)進(jìn)樣器，將大體積管路中樣品經(jīng)池道進(jìn)樣口帶入池道，此時(shí)在池道內(nèi)部，溶劑和任何小于半透膜孔徑的物質(zhì)可穿過(guò)半透膜進(jìn)入廢液管，大于半透膜孔徑的囊泡可被保留在池道內(nèi)部。
25.利用af4對(duì)evs及其異質(zhì)性亞進(jìn)行溫和、低損傷分離、純化、富集的方法的裝置，包括af4分離純化模塊、af4富集模塊，af4富集模塊是在進(jìn)樣器和af4系統(tǒng)eclipse dualtec儀器間連接大體積進(jìn)樣管路以替代原有管路。
26.本發(fā)明的有益效果：
27.本發(fā)明利用af4，實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)中實(shí)際提取的30-400nm的廣泛粒徑分布的evs亞混合體進(jìn)行分離、純化、表征。通過(guò)af4分離，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)evs樣品中蛋白質(zhì)雜質(zhì)的去除及evs異質(zhì)性亞樣品的分離，解決了目前evs研究中由于存在蛋白質(zhì)雜質(zhì)導(dǎo)致evs功能研究的準(zhǔn)確性受質(zhì)疑的問(wèn)題。
28.且通過(guò)改造af4管路與重新設(shè)定進(jìn)樣程序，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)evs異質(zhì)性亞樣品的高效富集，解決了evs異質(zhì)性亞分離富集過(guò)程中損傷其生物特性的問(wèn)題。本方法具有成本低、靈活性高、易操作等特點(diǎn)。對(duì)比常用的超濾法富集細(xì)胞外囊泡，超濾法富集倍數(shù)為80到100倍；此方法富集倍數(shù)可高達(dá)160倍甚至更高，在富集效果上有更高優(yōu)勢(shì)。采用af4法富集，在電鏡下觀察到的evs數(shù)量更多且形態(tài)更加良好，更利于后續(xù)針對(duì)evs異質(zhì)性亞的深入研
究。
附圖說(shuō)明
29.圖1為實(shí)施例1中血小板來(lái)源細(xì)胞外囊泡(pevs)的af4分離、純化結(jié)果圖；
30.圖2為實(shí)施例1中pevs的af4分離富集原理圖譜示意圖；
31.圖3為實(shí)施例1中改造af4管路富集evs原理示意圖；
32.圖4為實(shí)施例1中af4濃縮與超濾法濃縮后spevs、mpevs、lpevs亞的tem成像分析示意圖。
具體實(shí)施方式
33.下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例以及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
34.實(shí)施例1
35.本實(shí)施例的利用af4對(duì)evs及其異質(zhì)性亞進(jìn)行溫和、低損傷分離、純化、富集的方法包括以下步驟：
36.1)evs異質(zhì)性亞的分離、純化：
37.采用以下方法制備pevs樣品：取10ml大鼠全血于枸櫞酸鈉抗凝管中，隨后使用低速離心機(jī)，在22℃，800rpm/min條件下，離心10min，取上清液(血漿)于15ml離心管中，在22℃，3000rpm/min條件下，離心10min，棄去1/2上清，將剩余上清與沉淀重懸，得到富血小板血漿。隨后將生物素化tim4-fc蛋白與鏈霉親和素磁珠偶聯(lián)，從富血小板血漿中提取pevs，用0.8μm的水相過(guò)濾膜過(guò)濾，置于液相進(jìn)樣瓶中(因樣品體積小，進(jìn)樣瓶中需輔助內(nèi)插管)。
38.利用af4對(duì)pevs進(jìn)行分離、純化、表征。分離、純化條件為：梯度洗脫為交叉流流速5min內(nèi)由2ml/min下降至0.25ml/min；后30min由0.25ml/min下降至0.09ml/min；進(jìn)樣量為100μl；檢測(cè)器流速為1ml/min；膜的類型為10kda rc膜，流動(dòng)相為10mm pbs溶液，分離程序如表1所示。所得結(jié)果如圖1所示。利用af4-mals對(duì)pevs樣品進(jìn)行分離、純化、表征，pevs的粒徑分布范圍為30nm-400nm，蛋白質(zhì)雜質(zhì)出峰時(shí)間為8-11min，pevs樣品出峰時(shí)間為11-40minn，建立的pevs分析方法具有較好的重現(xiàn)性。
39.表1：af4分離pevs程序
[0040][0041]
本發(fā)明根據(jù)《misev2018》將pevs按尺寸分為small(＜100nm)、medium(100-200nm)、large(＞200nm)三個(gè)亞，即spevs、mpevs、lpevs三個(gè)亞。異質(zhì)性亞的af4分離、表征結(jié)果如表2所示，由表2可見af4-mals檢測(cè)pevs異質(zhì)性亞的s亞平均旋轉(zhuǎn)半徑為38.17nm；m亞平均旋轉(zhuǎn)半徑為63.6nm；l亞平均旋轉(zhuǎn)半徑為123.1nm，具有良好的重現(xiàn)性。同時(shí)可對(duì)pevs異質(zhì)性亞的顆粒濃度進(jìn)行測(cè)定。
[0042]
表2 af4-mals分離、檢測(cè)pevs異質(zhì)性亞粒徑及顆粒數(shù)結(jié)果
[0043][0044]
af4-mals分離檢測(cè)evs異質(zhì)性亞，一次進(jìn)樣，分離、純化、檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行，且可收集分離餾分進(jìn)行異質(zhì)性亞的深入研究。如表3所示。af4分離表征全程耗時(shí)1h，相對(duì)于離心法分離需要6-7h，af4具有耗時(shí)短的優(yōu)點(diǎn)；且分離所用流動(dòng)相為pbs，成本低；同時(shí)可以提供異質(zhì)性亞的粒徑分布和平均半徑信息，并且可以最大程度減少evs樣品的聚集，最大程度保留樣品的生物特性，更利于后續(xù)的異質(zhì)性亞的深入研究。
[0045]
表3離心法與af4分離evs方法的對(duì)比
[0046][0047]
2)pevs異質(zhì)性亞的富集
[0048]
如圖3為af4富集evs原理圖，在進(jìn)樣器和af4系統(tǒng)eclipse dualtec儀器間連接10ml大體積進(jìn)樣管路，替代原有管路。通過(guò)聚集模式(focus mode)和聚集進(jìn)樣模式(focus inject mode)實(shí)現(xiàn)evs的富集，通過(guò)兩種模式的切換，可根據(jù)自身實(shí)際evs樣品體積，實(shí)現(xiàn)不同體積evs樣品的富集，靈活易操作。
[0049]
具體操作如下：
[0050]
首先更改af4程序設(shè)定，先設(shè)定af4在focus模式下持續(xù)1min，cross flow為恒定的2ml/min。在此focus模式下，流動(dòng)相從流動(dòng)相瓶經(jīng)液相泵進(jìn)入af4系統(tǒng)eclipse dualtec儀器，后通過(guò)af4系統(tǒng)eclipse dualtec儀器進(jìn)入池道的in let口和out let口，在池道進(jìn)樣口附近形成對(duì)流，此時(shí)流動(dòng)相帶不經(jīng)過(guò)進(jìn)樣器。
[0051]
將步驟1)中分離收集好的pevs異質(zhì)性亞樣品中的spevs亞樣品，渦旋混勻，在10ml注射器一端連接peek普魯爾接頭，準(zhǔn)備10ml etef管，兩端連接peek整體式高壓接頭，將10ml etef管一端連接在10ml注射器的普魯爾接頭上，一端放入收集的spevs亞樣品管中，利用注射器吸力將spevs亞樣品吸入10ml etef管，此過(guò)程可最大程度減少etef管中含有氣泡，以防氣泡泵入af4池道導(dǎo)致spevs亞樣品回收率降低。
[0052]
后將af4系統(tǒng)eclipse dualtec儀器out let口與進(jìn)樣器出口位置管路卸下，將承裝spevs亞樣品的etef管連接在af4系統(tǒng)eclipse dualtec儀器out let口與進(jìn)樣器出口位置，同時(shí)在液相進(jìn)樣瓶中加滿流動(dòng)相pbs，放置在進(jìn)樣器中設(shè)定位置。隨后通過(guò)計(jì)算af4管路實(shí)際流速和樣品途徑管路的時(shí)間，計(jì)算出etef管路中全部體積spevs亞樣品進(jìn)入池道并且達(dá)到平衡所需時(shí)間。當(dāng)以2.0ml/min為聚焦流流速時(shí)，進(jìn)樣口端實(shí)際進(jìn)樣速度約為0.4ml/min，樣品聚焦松弛平衡時(shí)間需3-5min。因此，10ml樣品在線富集時(shí)長(zhǎng)為25min，為確保樣品在池道中充分平衡，增加5min樣品平衡時(shí)間。設(shè)置af4為聚集模式下持續(xù)1min，交叉
流為恒定的2ml/min；聚集進(jìn)樣模式下持續(xù)30min，交叉流為恒定的2ml/min。
[0053]
在聚集進(jìn)樣模式下，流動(dòng)相從流動(dòng)相瓶經(jīng)液相泵進(jìn)入af4系統(tǒng)eclipse dualtec儀器，后經(jīng)過(guò)進(jìn)樣器，可以將etef管路中樣品經(jīng)池道in let口帶入池道，同時(shí)，流動(dòng)相經(jīng)out let口進(jìn)入池道，在池道進(jìn)樣口處達(dá)到平衡。此時(shí)在池道內(nèi)部，spevs亞樣品在縱向受到向下的橫流的作用和樣品自身向上的擴(kuò)散力的作用，兩種力的作用方向相反，樣品在這兩種相反的力的作用下逐漸達(dá)到平衡，此平衡位置會(huì)與池道膜存在一定距離，可以最大程度降低樣品的吸附。溶劑和任何小于半透膜孔徑的物質(zhì)可穿過(guò)半透膜進(jìn)入廢液管，大于半透膜孔徑的囊泡可被保留在池道內(nèi)部，可將大體積spevs亞樣品富集在進(jìn)樣口附近，pbs作為流動(dòng)相可最大程度保護(hù)樣品生物特性。收集重復(fù)進(jìn)樣5次的pevs異質(zhì)性亞餾分，共計(jì)得到spevs樣品30ml，收集得到mpevs樣品45ml，lpevs樣品60ml。當(dāng)需要富集的樣品體積超過(guò)etef管路體積時(shí)，可換更大體積的管路(20ml/30ml)或在af4程序設(shè)置時(shí)重復(fù)增加focus、focus inject程序，在focus模式下更換etef管路，重新裝載樣品，實(shí)現(xiàn)不同體積的樣品富集。因af4腔體體積在微升級(jí)別，當(dāng)泵入大體積樣品溶液(幾毫升甚至幾百毫升)時(shí)，保留在分離腔室中的顆粒物的溶液體積可以實(shí)現(xiàn)從大體積至af4池道容量體積(約380μl)的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而達(dá)到富集的目的。通過(guò)兩種模式的切換，實(shí)現(xiàn)不同體積evs樣品的富集，實(shí)現(xiàn)不同體積evs樣品的富集，也可根據(jù)自身實(shí)際evs樣品或其他環(huán)境中微量顆粒物樣品體積選擇更換etef管路，實(shí)現(xiàn)不同體積的evs樣品的富集，成本低、靈活易操作。
[0054]
樣品富集完成后，停止液相泵運(yùn)行。在5ml注射器口處連接peek普魯爾接頭、在含15cm hplc 1/16管路連接線的peek翻邊管接頭另一端連接peek整體式高壓接頭，與連接在注射器的peek普魯爾接頭連接，接下來(lái)將peek翻邊管接頭連接在池道out let口處；將另一段含15cm hplc 1/16管路連接線的peek翻邊管接頭連接在池道in let口處，管路另一端接入1.5ml ep管。為最大程度減少對(duì)樣品的稀釋，用注射器泵入1ml空氣，此時(shí)注射器內(nèi)空氣壓力將富集完成的spevs樣品推出，收集樣品約380μl于ep管中，-80℃儲(chǔ)存。
[0055]
經(jīng)af4法濃縮后，各亞樣品體積可減小至腔室體積。
[0056]
evs異質(zhì)性亞富集程序如表4所示。
[0057]
表4 evs異質(zhì)性亞富集程序
[0058][0059]
管路改造后af4法濃縮spevs、mpevs、lpevs異質(zhì)性亞樣品的富集倍數(shù)如表5所示。
[0060]
表5管路改造后af4法濃縮5次分離收集的spevs、mpevs、lpevs異質(zhì)性亞樣品的富集倍數(shù)
[0061][0062]
為驗(yàn)證af4濃縮的準(zhǔn)確性與可行性，實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)比了常用的用來(lái)濃縮evs異質(zhì)性亞的超濾法，采用乙酸雙氧鈾染料對(duì)超濾法及af4法濃縮的spevs、mpevs、lpevs亞樣品進(jìn)行負(fù)染，利用tem進(jìn)行透射電鏡成像分析，結(jié)果如圖4所示，可見在電鏡下，超濾法濃縮后evs異質(zhì)性亞數(shù)量少于af4法，且觀察到的evs亞均存在膜結(jié)構(gòu)破損的情況，可能是由于超濾法對(duì)樣品施加較大離心力導(dǎo)致樣品沉淀或吸附在超濾柱上。而af4是通過(guò)在流體環(huán)境中進(jìn)行富集，且未施加高轉(zhuǎn)速外力，樣品顆粒自身的擴(kuò)散力會(huì)使樣品與膜存在距離，最大程度降低樣品的吸附，富集后evs樣品形態(tài)良好，膜結(jié)構(gòu)完整，保留樣品的生物特性，更利于后續(xù)對(duì)evs異質(zhì)性亞進(jìn)行深入研究。證明af4可以對(duì)evs的富集效果優(yōu)于超濾法。
[0063]
本實(shí)施例的利用af4對(duì)evs及其異質(zhì)性亞進(jìn)行溫和、低損傷分離、純化、富集的方法的裝置，包括af4分離模塊、af4富集模塊，af4富集模塊是在進(jìn)樣器和af4系統(tǒng)eclipse dualtec間連接10ml大體積進(jìn)樣管路，替代原有管路。具體使用時(shí)，針對(duì)需要富集的evs及其異質(zhì)性亞的量不同，可以選用其他多種體積規(guī)格的大體積進(jìn)樣管路。
技術(shù)特征：
1.一種利用af4對(duì)evs及其異質(zhì)性亞進(jìn)行溫和、低損傷分離、純化、富集的方法，其特征在于，包括以下步驟：1)分離、純化：利用af4實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)雜質(zhì)與evs分離，同時(shí)對(duì)廣泛粒徑分布的evs樣品按照粒徑大小進(jìn)行分離，實(shí)現(xiàn)evs及其異質(zhì)性亞的分離與純化；2)富集：將分離后得到的不同粒徑的evs異質(zhì)性亞樣品通過(guò)af4進(jìn)行富集，在原有的af4的進(jìn)樣器和af4系統(tǒng)eclipse dualtec儀器之間連接大體積進(jìn)樣管路以替代原有管路，通過(guò)將原有聚集、進(jìn)樣、洗脫模式改為聚集模式和聚集進(jìn)樣模式來(lái)回切換實(shí)現(xiàn)不同體積evs樣品的富集。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用af4對(duì)evs及其異質(zhì)性亞進(jìn)行溫和、低損傷分離、純化、富集的方法，其特征在于，步驟1)中所述的分離、純化，梯度洗脫為交叉流流速5min內(nèi)由2ml/min下降至0.25ml/min；后30min由0.25ml/min下降至0.09ml/min。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用af4對(duì)evs及其異質(zhì)性亞進(jìn)行溫和、低損傷分離、純化、富集的方法，其特征在于，步驟1)中所述的分離、純化，進(jìn)樣量為100μl；檢測(cè)器流速為1ml/min；膜的類型為10kda rc膜，流動(dòng)相為10mm pbs溶液。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用af4對(duì)evs及其異質(zhì)性亞進(jìn)行溫和、低損傷分離、純化、富集的方法，其特征在于，步驟1)中所述的純化，根據(jù)保留時(shí)間不同，將蛋白質(zhì)雜質(zhì)與evs樣品進(jìn)行分離，達(dá)到evs樣品純化目的。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用af4對(duì)evs及其異質(zhì)性亞進(jìn)行溫和、低損傷分離、純化、富集的方法，其特征在于，步驟2)所述富集時(shí)，更改進(jìn)樣程序設(shè)定，先進(jìn)行聚集模式，之后進(jìn)行聚集進(jìn)樣模式，然后根據(jù)需要富集的樣本量在聚集模式和聚集進(jìn)樣模式兩種模式間來(lái)回切換。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用af4對(duì)evs及其異質(zhì)性亞進(jìn)行溫和、低損傷分離、純化、富集的方法，其特征在于，步驟2)中所述的富集，交叉流流速為恒定的2ml/min，膜的類型為10kda rc膜，流動(dòng)相為10mm pbs溶液；洗脫模式為聚集模式和聚集進(jìn)樣模式。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用af4對(duì)evs及其異質(zhì)性亞進(jìn)行溫和、低損傷分離、純化、富集的方法，其特征在于，在所述聚集模式下，通過(guò)設(shè)定進(jìn)樣程序，流動(dòng)相不經(jīng)過(guò)進(jìn)樣器，從流動(dòng)相瓶經(jīng)液相泵進(jìn)入af4系統(tǒng)eclipse dualtec儀器，后經(jīng)池道進(jìn)口端和出口端也泵入池道，在池道進(jìn)樣口附近形成對(duì)流。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用af4對(duì)evs及其異質(zhì)性亞進(jìn)行溫和、低損傷分離、純化、富集的方法，其特征在于，在所述聚集進(jìn)樣模式下，流動(dòng)相經(jīng)過(guò)進(jìn)樣器，可以將大體積管路中樣品經(jīng)池道進(jìn)樣口帶入池道，此時(shí)在池道內(nèi)部，溶劑和任何小于半透膜孔徑的物質(zhì)可穿過(guò)半透膜進(jìn)入廢液管，大于半透膜孔徑的囊泡可被保留在池道內(nèi)部。9.利用af4對(duì)evs及其異質(zhì)性亞進(jìn)行溫和、低損傷分離、純化、富集的方法的裝置，其特征在于，包括af4分離模塊、af4富集模塊，af4富集模塊是在進(jìn)樣器和af4系統(tǒng)eclipse dualtec儀器間連接大體積進(jìn)樣管路以替代原有管路。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種利用AF4對(duì)EVs及其異質(zhì)性亞進(jìn)行溫和、低損傷分離、純化、富集的方法及裝置。該利用AF4對(duì)EVs及其異質(zhì)性亞進(jìn)行溫和、低損傷分離、純化、富集的方法，包括以下步驟：利用AF4對(duì)廣泛粒徑分布的EVs樣品按照粒徑大小進(jìn)行分離、純化；將分離、純化后得到的EVs異質(zhì)性亞樣品通過(guò)改變AF4管路進(jìn)行富集，在原有的AF4的進(jìn)樣器和AF4系統(tǒng)Eclipse DUALTEC儀器間連接大體積進(jìn)樣管路以替代原有管路，重新設(shè)定進(jìn)樣程序，通過(guò)聚集模式和聚集進(jìn)樣模式來(lái)回切換實(shí)現(xiàn)不同體積EVs樣品的富集。實(shí)現(xiàn)對(duì)廣泛粒徑分布的EVs亞混合體進(jìn)行分離、純化，且可以實(shí)現(xiàn)對(duì)EVs異質(zhì)性亞的高效富集，解決了EVs樣品中由于存在過(guò)多蛋白質(zhì)雜質(zhì)而導(dǎo)致其研究結(jié)果的偏差及其異質(zhì)性亞在富集過(guò)程中所造成的生物特性改變等關(guān)鍵問(wèn)題。中所造成的生物特性改變等關(guān)鍵問(wèn)題。中所造成的生物特性改變等關(guān)鍵問(wèn)題。
