一種PCVⅡ型Cap蛋白純化方法與流程
一種pcvⅱ型cap蛋白純化方法
技術(shù)領(lǐng)域
1.本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是豬圓環(huán)病毒疫苗(porcine circovirus，pcv)中pcvⅱ型cap蛋白純化方法。
背景技術(shù)：
2.豬圓環(huán)病毒疫苗(porcine circovirus，pcv)有兩個(gè)血清型pcv-1和pcv-2，其中pcv-1為非致病性的病毒，pcv-2為致病性的病毒，是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,pmws)的主要病原。在真核表達(dá)中，應(yīng)用較廣的是通過(guò)將pcv-2的orf2基因(cap蛋白)插入到昆蟲(chóng)桿狀病毒，用昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)，獲得重組的pcv-2的cap蛋白，制備亞單位疫苗真核表達(dá)生產(chǎn)方式得到不含標(biāo)簽的蛋白，根據(jù)蛋白的等電點(diǎn)(pi)在不同ph條件下所帶電荷種類(lèi)不同，采用陽(yáng)離子樹(shù)脂通過(guò)配基所帶相反電荷進(jìn)行異性電荷相吸。昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)使用的培養(yǎng)基等原材料成本非常昂貴，為降低純化工藝中的損失，回收率成為純化工藝要求最主要的指標(biāo)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
3.為了克服以上問(wèn)題，本技術(shù)提供一種工藝簡(jiǎn)單、成本低、回收率高的pcv2-cap蛋白純化方法。
4.一種pcv2-cap蛋白純化方法，包括如下步驟：
5.1)細(xì)胞液的處理
6.將細(xì)胞液凍融1-3次，對(duì)凍融后的細(xì)胞液進(jìn)行細(xì)胞碎片去除；
7.2)蛋白的吸附純化
8.選擇匯瓊離sp-hpr對(duì)pcv2-cap蛋白、洗脫液一：稱(chēng)取十二水合磷酸氫二鈉13g、二水合磷酸二氫鈉0.247g、氯化鈉29.25g，溶于1l ddh2o中，ph值為7.5～7.6進(jìn)行吸附純化。
9.其中，
10.步驟2)蛋白的吸附純化具體流程如下：
11.填料平衡：取填料裝柱，用約一個(gè)柱體積的ph值為6.6～6.8的緩沖液平衡柱子，控制流速125-135ml/min；
12.上樣：將細(xì)胞蛋白液ph值調(diào)整至6.6～6.8，上柱控制流速125-135ml/min，直至細(xì)胞液全部泵完；上樣完成后用約1.5倍柱體積上樣緩沖液平衡柱子，洗脫料液和雜蛋白，調(diào)節(jié)柱體內(nèi)的ph；
13.洗脫：使用洗脫液一對(duì)蛋白進(jìn)行洗脫并收集，測(cè)試不同的洗脫液對(duì)蛋白回收率的影響；將洗脫液泵入柱子，控制流速125-135ml/min；當(dāng)?shù)鞍讬z測(cè)儀上的數(shù)字升至90后開(kāi)始收獲，當(dāng)?shù)鞍讬z測(cè)儀數(shù)值再次降至90時(shí)停止收獲；洗脫后用平衡緩沖液補(bǔ)充至所需體積，補(bǔ)充至所需體積后的蛋白含量理論值為500μg/ml，蛋白收率為70％-75％。
14.步驟1)中細(xì)胞液處理中，采用2次凍融。使用過(guò)濾或離心的方法去除細(xì)胞碎片；使用過(guò)濾的方法，使用0.45μm+0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾除去細(xì)胞碎片；使用離心的方法，是將細(xì)胞
液以5000rpm的轉(zhuǎn)速離心30min處理，離心后收集上清液。
15.蛋白的純度檢驗(yàn)：對(duì)純化前和純化后取樣的蛋白液，進(jìn)行12％ sds-page凝膠檢測(cè)，電泳完畢后染、洗脫、拍照。拍照后使用bandscan 5.0軟件進(jìn)行蛋白純度測(cè)定。
16.本發(fā)明建立了一種pcv2-cap蛋白的純化方法，并對(duì)純化過(guò)程進(jìn)行了適當(dāng)優(yōu)化，使用凍融后過(guò)濾的方法對(duì)細(xì)胞液進(jìn)行前處理，使用匯瓊離sp-hpr填料對(duì)蛋白進(jìn)行吸附純化，選取一種合適的洗脫液洗脫蛋白，提高回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方法可明顯提高目的蛋白的純度，并顯著提高目的蛋白的濃度。
附圖說(shuō)明
17.圖1實(shí)施例中三個(gè)樣品的純化前和純化后的蛋白電泳
具體實(shí)施方式
18.1材料
19.1.1填料陽(yáng)離子交換樹(shù)脂匯瓊離sp-hpr、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂匯瓊離mmc-hpr購(gòu)自ge公司。
20.1.2試劑本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純產(chǎn)品
21.1.3配制試劑：
22.洗脫液一：稱(chēng)取十二水合磷酸氫二鈉13g、二水合磷酸二氫鈉0.247g、氯化鈉29.25g，溶于1l ddh2o中，ph值為7.5～7.6。
23.洗脫液二：稱(chēng)取十二水合磷酸氫二鈉13g、二水合磷酸二氫鈉0.247g、氯化鈉59.5g，溶于1l ddh2o中，ph值為7.8～7.9。
24.1.3儀器材料純化柱、蛋白檢測(cè)儀、蠕動(dòng)泵
25.2方法
26.2.1細(xì)胞液的處理
27.2.1.1細(xì)胞破碎方法將收獲的細(xì)胞液取出四份，記為1、2、3、4號(hào)樣品，其中1號(hào)樣品不做處理，2號(hào)樣品凍融1次，3號(hào)樣品凍融2次，4號(hào)樣品凍融3次。使用重組pcv2-cap蛋白含量elisa檢測(cè)方法檢測(cè)四個(gè)樣品中的蛋白含量，觀察凍融次數(shù)對(duì)細(xì)胞液中蛋白含量的影響。
28.2.1.2細(xì)胞碎片去除方法根據(jù)2.1.1種的結(jié)果，選擇凍融兩次后的細(xì)胞液進(jìn)行細(xì)胞碎片去除。分別使用過(guò)濾或離心的方法去除細(xì)胞碎片。使用過(guò)濾的方法，使用0.45μm+0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾除去細(xì)胞碎片。使用離心的方法，是將細(xì)胞液以5000rpm的轉(zhuǎn)速離心30min處理，離心后收集上清液。處理完成后，使用重組pcv2-cap蛋白含量elisa檢測(cè)方法檢測(cè)兩種方法處理后的蛋白含量，觀察過(guò)濾和離心對(duì)細(xì)胞液中蛋白含量的影響。
29.2.2蛋白的吸附純化本方法是使用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂對(duì)目的蛋白進(jìn)行吸附再洗脫的方式進(jìn)行的，選擇匯瓊離sp-hpr和匯瓊離mmc-hpr對(duì)pcv2-cap蛋白進(jìn)行吸附純化，測(cè)試填料的選擇對(duì)蛋白回收率的影響。
30.填料平衡：取兩種填料裝柱，用約一個(gè)柱體積的ph值為6.6～6.8的緩沖液平衡柱子，控制流速125-135ml/min。
31.上樣：將細(xì)胞蛋白液ph值調(diào)整至6.6～6.8，上柱控制流速125-135ml/min，直至細(xì)胞液全部泵完。上樣完成后用約1.5倍柱體積上樣緩沖液平衡柱子，洗脫料液和雜蛋白，調(diào)
節(jié)柱體內(nèi)的ph。
32.洗脫：使用洗脫液一和洗脫液二對(duì)蛋白進(jìn)行洗脫并收集，測(cè)試不同的洗脫液對(duì)蛋白回收率的影響。將洗脫液泵入柱子，控制流速125-135ml/min。當(dāng)?shù)鞍讬z測(cè)儀上的數(shù)字升至90后開(kāi)始收獲，當(dāng)?shù)鞍讬z測(cè)儀數(shù)值再次降至90時(shí)停止收獲。洗脫后用平衡緩沖液補(bǔ)充至所需體積，補(bǔ)充至所需體積后的蛋白含量理論值為500μg/ml，蛋白收率為70％-75％。對(duì)收獲得到的蛋白使用重組pcv2-cap蛋白含量elisa檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算蛋白回收率。
33.2.3蛋白的純度檢驗(yàn)對(duì)純化前和純化后取樣的蛋白液，進(jìn)行12％ sds-page凝膠檢測(cè)，電泳完畢后染、洗脫、拍照。拍照后使用bandscan 5.0軟件進(jìn)行蛋白純度測(cè)定。
34.3結(jié)果
35.3.1凍融及凍融次數(shù)對(duì)細(xì)胞液中蛋白含量的影響
36.將收獲的細(xì)胞液取出四份，記為1、2、3、4號(hào)樣品，其中1號(hào)樣品不做處理，2號(hào)樣品凍融1次，3號(hào)樣品凍融2次，4號(hào)樣品凍融3次。使用重組pcv2-cap蛋白含量elisa檢測(cè)方法檢測(cè)四個(gè)樣品中的蛋白含量。依同樣的實(shí)驗(yàn)方法，取不同的細(xì)胞液，重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表一。結(jié)果顯示，不凍融的樣品蛋白含量較低，凍融1次、2次和3次的結(jié)果相差不大，根據(jù)該結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇凍融1～3次均可。
37.表一凍融及凍融次數(shù)對(duì)細(xì)胞液中蛋白含量的影響
[0038][0039][0040]
3.2過(guò)濾和離心對(duì)細(xì)胞液中蛋白含量的影響
[0041]
將凍融兩次后的細(xì)胞液使用過(guò)濾或離心的方法去除細(xì)胞碎片。使用過(guò)濾的方法，使用0.45μm+0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾除去細(xì)胞碎片。使用離心的方法，是將細(xì)胞液以5000rpm的轉(zhuǎn)速離心處理，離心后收集上清液。處理完成后，使用重組pcv2-cap蛋白含量elisa檢測(cè)方法檢測(cè)兩種方法處理后的蛋白含量。依同樣的實(shí)驗(yàn)方法，使用不同的細(xì)胞液，重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表二。結(jié)果顯示，過(guò)濾或離心的方法對(duì)細(xì)胞液中的蛋白含量影響不大，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況，選擇過(guò)濾的方式除去細(xì)胞碎片。
[0042]
表二過(guò)濾和離心對(duì)細(xì)胞液中蛋白含量的影響
[0043]
[0044]
3.3填料對(duì)蛋白回收率的影響
[0045]
取兩種填料匯瓊離sp-hpr和匯瓊離mmc-hpr裝柱，緩沖液平衡柱子，控制流速。取1000ml細(xì)胞蛋白液上柱，控制流速，直至細(xì)胞液全部泵完。上樣完成后用上樣緩沖液平衡柱子，使用洗脫液一對(duì)蛋白進(jìn)行洗脫并收集，用緩沖液將洗脫的蛋白液補(bǔ)充至200ml。對(duì)收獲得到的蛋白使用重組pcv2-cap蛋白含量elisa檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算蛋白回收率。依同樣的實(shí)驗(yàn)方法，使用不同的細(xì)胞液，重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表三。結(jié)果顯示，使用匯瓊離sp-hpr填料的回收率明顯高于匯瓊離mmc-hpr填料。
[0046]
表三填料對(duì)蛋白回收率的影響
[0047][0048][0049]
3.4洗脫液對(duì)蛋白回收率的影響
[0050]
使用填料匯瓊離sp-hpr對(duì)細(xì)胞液進(jìn)行吸附純化，細(xì)胞液上樣完成后，用約1.5倍柱體積上樣緩沖液平衡柱子，使用洗脫液一和洗脫液二對(duì)蛋白進(jìn)行洗脫并收集，用緩沖液將洗脫的蛋白液補(bǔ)充至所需體積。對(duì)收獲得到的蛋白使用重組pcv2-cap蛋白含量elisa檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算蛋白回收率，測(cè)試洗脫液對(duì)蛋白回收率的影響。依同樣的實(shí)驗(yàn)方法，使用不同的細(xì)胞液，重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表三。結(jié)果顯示，使用洗脫液一的回收率明顯高于洗脫液二。
[0051]
表四洗脫液對(duì)蛋白回收率的影響
[0052][0053]
3.5蛋白的純度檢驗(yàn)
[0054]
對(duì)純化前和純化后取樣的蛋白液，進(jìn)行12％ sds-page凝膠檢測(cè)，電泳完畢后染、洗脫、拍照，如圖1所示，pcv2-cap蛋白在28kda處出現(xiàn)明顯條帶。使用bandscan 5.0軟件進(jìn)行蛋白純度分析，結(jié)果顯示，純化前的樣品中含有較多的雜蛋白，純化后目的蛋白的純度有明顯提升。由此可知，該工藝可提高目的蛋白的純度。
pbst洗滌5遍，在吸水紙上扣干反應(yīng)板。將顯液a液和b液等量混合配制顯底物,加入反應(yīng)板,每孔100μl,37℃避光孵育10分鐘。反應(yīng)板每孔中加入50μl終止液,即刻(10min內(nèi))置于酶標(biāo)儀中，測(cè)定450nm處的光吸收值,并保存數(shù)據(jù)。
[0071]
2.3數(shù)據(jù)處理
[0072]
使用relpot4.0軟件對(duì)酶標(biāo)儀測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到分析結(jié)果,以a表示。
[0073]
樣品的蛋白含量＝a(分析結(jié)果)*n(樣品的稀釋倍數(shù))。
技術(shù)特征：
1.一種pcv2-cap蛋白純化方法，包括如下步驟：1)細(xì)胞液的處理將細(xì)胞液凍融1-3次，對(duì)凍融后的細(xì)胞液進(jìn)行細(xì)胞碎片去除；2)蛋白的吸附純化選擇匯瓊離sp-hpr對(duì)pcv2-cap蛋白、洗脫液一：稱(chēng)取十二水合磷酸氫二鈉13g、二水合磷酸二氫鈉0.247g、氯化鈉29.25g，溶于1l ddh2o中，ph值為7.5～7.6進(jìn)行吸附純化。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的pcv2-cap蛋白純化方法，其特征在于：步驟2)蛋白的吸附純化具體流程如下：填料平衡：取填料裝柱，用約一個(gè)柱體積的ph值為6.6～6.8的緩沖液平衡柱子，控制流速125-135ml/min；上樣：將細(xì)胞蛋白液ph值調(diào)整至6.6～6.8，上柱控制流速125-135ml/min，直至細(xì)胞液全部泵完；上樣完成后用約1.5倍柱體積上樣緩沖液平衡柱子，洗脫料液和雜蛋白，調(diào)節(jié)柱體內(nèi)的ph；洗脫：使用洗脫液一對(duì)蛋白進(jìn)行洗脫并收集，測(cè)試不同的洗脫液對(duì)蛋白回收率的影響；將洗脫液泵入柱子，控制流速125-135ml/min；當(dāng)?shù)鞍讬z測(cè)儀上的數(shù)字升至90后開(kāi)始收獲，當(dāng)?shù)鞍讬z測(cè)儀數(shù)值再次降至90時(shí)停止收獲；洗脫后用平衡緩沖液補(bǔ)充至所需體積，補(bǔ)充至所需體積后的蛋白含量理論值為500μg/ml，蛋白收率為70％-75％。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的pcv2-cap蛋白純化方法，其特征在于：細(xì)胞液處理中，采用2次凍融。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的pcv2-cap蛋白純化方法，其特征在于：細(xì)胞液處理中，使用過(guò)濾或離心的方法去除細(xì)胞碎片；使用過(guò)濾的方法，使用0.45μm+0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾除去細(xì)胞碎片；使用離心的方法，是將細(xì)胞液以5000rpm的轉(zhuǎn)速離心30min處理，離心后收集上清液。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是豬圓環(huán)病毒疫苗(porcine circovirus，PCV)中PCVⅡ型Cap蛋白純化方法。本發(fā)明建立了一種PCV2-cap蛋白的純化方法，并對(duì)純化過(guò)程進(jìn)行了適當(dāng)優(yōu)化，使用凍融后過(guò)濾的方法對(duì)細(xì)胞液進(jìn)行前處理，使用匯瓊離SP-HPR填料對(duì)蛋白進(jìn)行吸附純化，選取一種合適的洗脫液洗脫蛋白，提高回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方法可明顯提高目的蛋白的純度，并顯著提高目的蛋白的濃度。并顯著提高目的蛋白的濃度。并顯著提高目的蛋白的濃度。
