用非巖藻糖基化抗CD70抗體癌癥的方法與流程

用非巖藻糖基化抗CD70抗體癌癥的方法與流程

用非巖藻糖基化抗cd70抗體癌癥的方法
相關申請的交叉引用
1.本技術要求2019年12月30日提交的美國臨時申請號62/954,904和2020年4月17日提交的美國臨時申請號63/011,906的優先權，將所述申請的每一個的內容通過引用以其整體并入本文。ascii文本文件序列表的提交
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技術領域
3.本發明涉及使用非巖藻糖基化抗cd70抗體諸如包括骨髓增生異常綜合征(mds)和急性髓系白血病(aml)在內的髓系惡性腫瘤等癌癥的方法。

背景技術：

4.cd70是由多種正常和惡性細胞類型表達的細胞膜結合且分泌的分子的腫瘤壞死因子(tnf)家族的成員。cd70的一級氨基酸(aa)序列預測跨膜ii型蛋白其羧基末端暴露于細胞外部且其氨基末端位于質膜的胞質側內(bowman等人,1994,j.immunol.152:1756-61；goodwin等人,1993,cell 73:447-56)。人cd70由20個aa的細胞質結構域、18個aa的跨膜結構域和155個aa的細胞質外結構域構成，具有兩個潛在的n連接糖基化位點(bowman等人,同上；goodwin等人,同上)。放射性同位素標記的表達cd70的細胞用抗cd70抗體特異性免疫沉淀產生29和50kda的多肽(goodwin等人,同上；hintzen等人,1994,j.immunol.152:1762-73)。基于其與tnf-α和tnf-β尤其是在結構鏈c、d、h和1中的同源性，預測cd70的三聚體結構(petsch等人,1995,mol.immunol.32:761-72)。
5.最初的免疫組織學研究揭示cd70在扁桃體、皮膚和腸道中的生發中心b細胞和罕見t細胞上表達(hintzen等人,1994,int.immunol.6:477-80)。隨后，據報道cd70在最近被抗原激活的t和b淋巴細胞的細胞表面上表達，并且其表達在去除抗原刺激后減弱(lens等人,1996,eur.j.immunol.26:2964-71；lens等人,1997,immunology 90:38-45)。在淋巴系統中，激活的自然殺傷細胞(orengo等人,1997,clin.exp.immunol.107:608-13)和小鼠成熟外周樹突細胞(akiba等人,2000,j.exp.med.191:375-80)也表達cd70。在非淋巴譜系中，已經在胸腺髓質上皮細胞上檢測到cd70(hintzen等人,1994,同上；hishima等人,2000,am.j.surg pathol.24:742-46)。
6.cd70在正常的非造血細胞上不表達。cd70表達主要限于生理條件下新近被抗原激活的t和b細胞，并且當抗原刺激停止時其表達下調。來自動物模型的證據表明，cd70可促成免疫障礙，如類風濕性關節炎(brugnoni等人,1997,immunol.lett.55:99-104)、銀屑病關節炎(brugnoni等人,1997,immunol.lett.55:99-104)、和狼瘡(oelke等人,2004,arthritis rheum.50:1850-60)。除了其在炎癥反應中的潛在作用外，cd70還在多種轉化細
胞上表達，包括淋巴瘤b細胞、霍奇金細胞和里-施細胞(reed-sternberg cell)、神經起源的惡性細胞和多種癌。研究表明，來自急性髓系白血病(aml)和骨髓增生異常疾病(mds)患者的干細胞表達cd70及其受體cd27二者。這種配體-受體對之間的相互作用可以促進白血病原始細胞存活和增殖。
7.在哺乳動物宿主細胞中產生的單克隆抗體可以具有多種翻譯后修飾，包括糖基化。單克隆抗體(如igg1)在每條重鏈(每個完整抗體有兩條)的天冬酰胺297(asn297)處具有n連接的糖基化位點。與抗體上的asn297附接的聚糖典型地是復合雙觸角結構，其具有非常低或沒有二分型n-乙酰葡糖胺(二分型glcnac)，具有少量的末端唾液酸和不同量的半乳糖。所述聚糖通常也具有高水平的核心巖藻糖基化。已顯示抗體中核心巖藻糖基化的減少會改變fc效應子功能，特別是fcγ受體結合和adcc活性。這一觀察結果引起了工程化細胞系的興趣，因此它們產生了核心巖藻糖基化減少的抗體。
8.用于工程化細胞系以減少核心巖藻糖基化的方法包括基因敲除、基因敲入和rna干擾(rnai)。在基因敲除中，使編碼fut8(α1,6-巖藻糖基轉移酶)的基因失活。fut8催化巖藻糖殘基從gdp-巖藻糖轉移到n-聚糖的asn-連接的(n-連接的)glcnac的6位。據報道，fut8是唯一負責在asn297處將巖藻糖添加到n-連接的雙觸角碳水化合物的酶。基因敲入添加編碼酶(如gntiii或高爾基體α甘露糖苷酶ii)的基因。細胞中此類酶水平的增加使單克隆抗體從巖藻糖基化途徑轉移(導致核心巖藻糖基化減少)，并且二分型n-乙酰葡糖胺的量增加。rnai典型地還靶向fut8基因表達，導致降低mrna轉錄物水平或完全敲除基因表達。
9.工程化細胞系的替代方案包括使用作用于糖基化途徑中的酶的小分子抑制劑。抑制劑如栗精胺(catanospermine)在糖基化途徑早期起作用，產生具有未成熟聚糖(例如，高水平的甘露糖)和低巖藻糖基化水平的抗體。通過此類方法產生的抗體通常缺乏與成熟抗體相關的復雜n連接聚糖結構。小分子巖藻糖類似物也可用于產生具有復雜n連接聚糖但具有降低的核心巖藻糖基化的重組抗體。
10.需要抗cd70抗體，如具有降低的核心巖藻糖基化的抗cd70抗體，其可以對cd70表達細胞發揮臨床上有用的細胞毒性、細胞抑制或免疫調節作用，特別是對非cd70表達細胞不發揮不期望的作用。此類化合物將是針對表達cd70的癌癥的有用劑。
11.髓系惡性腫瘤包括急性髓系白血病(aml)、骨髓增殖性障礙(mpds)、骨髓增生異常綜合征(mds)和骨髓增生異常/骨髓增殖性綜合征，它們都是克隆性干細胞(hsc)或祖細胞惡性障礙(tiu等人,leukemia,第21(8)卷,第1648-57頁,2007)。
12.mds涵蓋多種亞型，包括伴有單系發育異常的mds、伴有環形鐵粒幼細胞的mds、伴有多系發育異常的mds、伴有過量原始細胞的mds、伴有分離的del(5q)的mds和不可分類的mds(arber等人,blood,第127卷,第2391-405頁,2016)。mds的特征在于一種或多種骨髓譜系中的無效造血作用。早期mds主要展現出過度細胞凋亡和造血細胞發育異常(claessens等人,blood,第99卷,第1594-601頁,2002；clasessens等人,blood,第105卷,第4035-42頁,2005)。在約三分之一的mds患者中，這種無效的造血作用之后進展為繼發性aml(saml)。盡管已經鑒定了與特定mds亞型(elbert等人,nature,第451(7176)卷,第335-9頁,2008)或疾病轉化(braun等人,blood,第107(3)卷,第1156-65頁,2006)相關的一些分子事件，但是對潛在的分子缺陷仍然知之甚少。除形態學特征外，目前沒有生物標記物可用于早期診斷和預后。
13.急性髓系白血病(aml)是白細胞髓系的惡性腫瘤。如果不的話，這種血瘀形成通常在數周至數月內是致命的血液和骨髓疾病。美國有30,000例aml，并且歐盟估計有47,000例aml(由mattson-jack確認的2010年患病率數據,2010)。aml是成人急性白血病的最普遍形式(約90％)并且含有約33％的新白血病病例。診斷為aml的患者的中位年齡為67歲。在美國，aml占癌癥死亡的大約1.2％。
14.aml引起非特異性癥狀，如體重減輕、疲勞、發燒和盜汗。aml通過血液檢查、骨髓檢查和實驗室檢查來診斷以確定aml亞型并確定決策。
15.本文中引用的所有參考文獻(包括專利申請、專利公開案和科學文獻)都通過引用以其整體并入本文，如同每個單獨的參考文獻被明確地且單獨地指示通過引用并入。

技術實現要素：

16.本文提供了一種受試者的表達cd70的癌癥的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的非巖藻糖基化抗cd70抗體，其中所述方法導致所述受試者中癌細胞的耗竭，其中所述方法不導致所述受試者中cd70+t調節性細胞(cd70+treg)的耗竭，其中所述抗cd70抗體包含含有seq id no:1的三個cdr的重鏈可變區、含有seq id no:2的三個cdr的輕鏈可變區和fc結構域，其中所述抗cd70抗體的cdr由kabat編號方案定義，并且其中所述癌癥選自骨髓增生異常綜合征(mds)和急性髓系白血病(aml)。在一些實施方案中，抗cd70抗體包含含有與seq id no:1的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列的重鏈可變區和含有與seq id no:2的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列的輕鏈可變區。在一些實施方案中，抗cd70抗體包含含有seq id no:1的氨基酸序列的重鏈可變區和含有seq id no:2的氨基酸序列的輕鏈可變區。在一些實施方案中，fc結構域是介導抗體依賴性細胞毒性(adcc)、抗體依賴性細胞吞噬作用(adcp)和補體依賴性細胞毒性(cdc)中的一種或多種的抗體效應子結構域。在一些實施方案中，fc結構域是介導adcc的抗體效應子結構域。在一些實施方案中，fc結構域是人fc結構域。在一些實施方案中，抗cd70抗體是沃瑟妥珠單抗(vorsetuzumab)。在一些實施方案中，抗體與劑綴合。在一些實施方案中，劑是化療劑或免疫調節劑。在一些實施方案中，劑是化療劑。在一些實施方案中，化療劑是一甲基澳瑞他汀e(mmae)或一甲基澳瑞他汀f(mmaf)。在一些實施方案中，所述方法包括施用抗cd70抗體體，其中所述抗cd70抗體體中的每種抗體包含含有seq id no:1的三個cdr的重鏈可變區、含有seq id no:2的三個cdr的輕鏈可變區和fc結構域，其中抗cd70抗體的cdr由kabat編號方案定義，其中所述抗cd70抗體體中至少50％的抗cd70抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，抗cd70抗體體中至少70％的抗cd70抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，抗cd70抗體體中至少90％的抗cd70抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，癌癥是mds。在一些實施方案中，mds是復發性或難治性mds。在一些實施方案中，受試者在先前的針對mds的低甲基化劑(hma)療法后經歷了失敗。在一些實施方案中，癌癥是aml。在一些實施方案中，aml是復發性或難治性aml。在一些實施方案中，受試者接受了2種先前方案以aml。在一些實施方案中，受試者接受了3種先前方案以aml。在一些實施方案中，至少約0.1％、至少約1％、至少約2％、至少約3％、至少約4％、至少約5％、至少約6％、至少約7％、至少約8％、至少約9％、至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、
至少約60％、至少約70％或至少約80％的所述癌細胞表達cd70。在一些實施方案中，與向受試者施用非巖藻糖基化抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，向受試者施用非巖藻糖基化抗cd70抗體導致癌細胞耗竭至少約5％、至少約6％、至少約7％、至少約8％、至少約9％、至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約95％或約100％。在一些實施方案中，與向受試者施用無巖藻糖基化抗cd70抗體之前cd70+treg的量相比，向受試者施用非巖藻糖基化抗cd70抗體導致cd70+treg耗竭不超過約20％、約10％、約9％、約8％、約7％、約6％、約5％、約4％、約3％、約2％、約1％或約0.1％。在一些實施方案中，在施用非巖藻糖基化抗cd70抗體之后，受試者中的一種或多種效果相對于基線得到改善。在一些實施方案中，所述一種或多種效果選自：客觀反應率、反應持續時間、達到反應的時間、無進展存活期和總存活期。在一些實施方案中，客觀反應率是至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約60％、至少約70％或至少約80％。在一些實施方案中，在施用非巖藻糖基化抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個月、至少約9個月、至少約10個月、至少約11個月、至少約12個月、至少約十八個月、至少約兩年、至少約三年、至少約四年或至少約五年的無進展存活期。在一些實施方案中，在施用非巖藻糖基化抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個月、至少約9個月、至少約10個月、至少約11個月、至少約12個月、至少約十八個月、至少約兩年、至少約三年、至少約四年或至少約五年的總存活期。在一些實施方案中，在施用非巖藻糖基化抗cd70抗體后，對抗cd70抗體的反應的持續時間是至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個月、至少約9個月、至少約10個月、至少約11個月、至少約12個月、至少約十八個月、至少約兩年、至少約三年、至少約四年或至少約五年。在一些實施方案中，抗cd70抗體的施用途徑是靜脈內。在一些實施方案中，所述受試者是人。在一些實施方案中，將抗cd70抗體與阿扎胞苷組合施用。在一些實施方案中，將抗cd70抗體與維奈妥拉組合施用。在一些實施方案中，將抗cd70抗體與阿扎胞苷和維奈妥拉組合施用。在一些實施方案中，將抗cd70抗體與氟喹諾酮組合施用。
17.本文還提供了一種用于表達cd70的癌癥的藥物組合物，所述組合物包含非巖藻糖基化抗cd70抗體和至少一種藥學上相容的成分，其中所述抗cd70抗體包含含有seq id no:1的三個cdr的重鏈可變區、含有seq id no:2的三個cdr的輕鏈可變區和fc結構域，其中抗cd70抗體的cdr由kabat編號方案定義，其中所述組合物用于本文任何實施方案的方法中。
18.本文還提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含非巖藻糖基化抗cd70抗體和在本文任何實施方案的方法中使用所述抗cd70抗體的說明書，其中所述抗cd70抗體包含含有seq id no:1的三個cdr的重鏈可變區、含有seq id no:2的三個cdr的輕鏈可變區和fc結構域，其中抗cd70抗體的cdr由kabat編號方案定義。
19.應當理解，本文中所描述的各種實施方案的一種、一些或全部特性都可以組合以形成本發明的其他實施方案。本發明的這些和其他方面對于本領域技術人員將變得清楚。
本發明的這些和其他實施方案由隨后的具體實施方式進行進一步描述。
附圖說明
20.本專利或申請文件包含至少一幅彩附圖。在請求并支付必要的費用后，官方將會提供帶有一幅或多幅彩附圖的本專利或專利申請公開案的副本。
21.圖1是sgn-70(巖藻糖基化h1f6)和sea-cd70(非巖藻糖基化h1f6)與各種fcγ受體結合的一系列感測圖。圖1中sgn-70標記為h1f6 wt，sea-cd70標記為h1f6 sea。使用生物層干涉測量法(bli)評估sgn-70和sea-cd70與fcγr i、iia、iiia、iib和fcrn的結合動力學和親和力。
22.圖2a-圖2b是使用流式細胞術評估sgn-70和sea-cd70(在圖2a-圖2b中標記為sea-70)對高親和力人fcγriiia受體(158v)(圖2a)或食蟹猴fcγriiia受體(圖2b)的結合的一系列圖。
23.圖3a-圖3b是示出sgn-70和sea-cd70在兩種cd70+aml細胞系molm-13(圖3a)和nomo-1(圖3b)中的adcc活性的一系列圖。
24.圖4a-圖4d是評估sgn-70(在圖4a-圖4d中標記為sgn-cd70)和sea-cd70對來自高親和力fcγriiia受體純合型(v/v 158)或低親和力fcγriiia受體純合型(f/f 158)供體的細胞中的cd70+treg和cd8 t細胞的影響的一系列圖。
25.圖4e-圖4h是評估巖藻糖基化(wt克隆13igg1)或非巖藻糖基化(sea克隆13igg1)抗tigit抗體對來自高親和力fcγriiia受體純合型(v/v158)或低親和力fcγriiia受體純合型(f/f158)供體的細胞中的treg和cd8 t細胞的影響的一系列圖。
26.圖5是在raji nhl伯基特淋巴瘤模型中評估用sea-cd70對隨時間的動物存活百分比的影響的卡普蘭-邁耶(kaplan-meyer)圖。sea-cd70被標記為h1f6sea。
27.圖6是評估h1f6sea、h1f6g1v1、h00sea和阿扎胞苷在mv-411急性髓系白血病模型中的抗腫瘤功效的圖。sea-cd70被標記為h1f6sea。包含與sea-cd70相同的cdr但包含失活骨架突變的抗體被標記為h1f6g1v1。無巖藻糖基化人igg1同種型對照抗體被標記為h00sea。
28.圖7a-圖7d是評估h1f6sea、h00sea(無巖藻糖基化人igg1同種型對照抗體)、h1f6g1v1(包含與sea-cd70相同的cdr但包含失活骨架突變的抗體)和阿扎胞苷在mv-411急性髓系白血病模型中的抗腫瘤功效的一系列蜘蛛圖。繪制每種條件的個體動物的腫瘤體積，并覆加于未組的中值腫瘤體積上。
29.圖8a-圖8b是評價sea-cd70和sgn-cd70介導的對aml細胞系的adcp活性的一系列圖。所示數據表示陽性巨噬細胞相對于背景對照的百分比。
30.圖9a-圖9b是評價sea-cd70和sgn-cd70 cdc介導的對aml細胞系的cdc活性的一系列圖。
31.圖10是在mv411 aml異種移植小鼠模型中評價sea-cd70與阿扎胞苷的組合對腫瘤生長的影響的圖。報告每個組的平均腫瘤體積(
±
sem)。對于每個組，繪制數據，直到每組中的第一只動物被處死以達到》1000mm3的腫瘤大小。
32.圖11a-圖11b是在mv411 aml異種移植小鼠模型中評價sea-cd70與阿扎胞苷
維奈妥拉(abt-199)或兩者(阿扎胞苷+維奈妥拉)的組合對腫瘤生長的影響的一系列圖。圖11a：報告每個組的平均腫瘤體積(
±
sem)。對于每個組，繪制數據，直到每組中的第一只動物被處死以達到》1000mm3的腫瘤大小。圖11b：對照、阿扎胞苷+維奈妥拉、和sea-cd70+阿扎胞苷+維奈妥拉組合(三重組合)的單個動物生長曲線。
具體實施方式
i.定義
33.除非另外定義，否則本文所使用的所有技術和科學術語均具有與所述方法和組合物所屬領域的普通技術人員通常所理解的含義相同的含義。當本文使用商品名時，申請人意圖獨立地包括商品名產品配制品、仿制藥品和商品名產品的一種或多種活物成分。如本文所用，除非另外說明，否則以下術語和短語具有賦予它們的含義。
34.術語“和/或”在用于本文的情況下被視為對兩個指定特征或組分中的每一個與或不與另一個的具體公開。因此，如在本文中以短語如“a和/或b”使用的術語“和/或”旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”(單獨)和“b”(單獨)。同樣地，如以短語如“a、b和/或c”使用的術語“和/或”旨在涵蓋以下方面中的每一個：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(單獨)；b(單獨)；以及c(單獨)。
35.應理解，本文所述的本發明的方面和實施方案包括“包含多個方面和實施方案”、“由多個方面和實施方案組成”和“基本上由多個方面和實施方案組成”。
36.單位、前綴和符號以其國際單位制(si)認可的形式表示。數值范圍包括定義所述范圍的數字。本文提供的標題不是對本公開文本的各個方面的限制，所述各個方面可以通過參考說明書作為整體而獲得。因此，通過從整體上參考說明書，可以更全面地定義下面緊接著定義的術語。
37.如本文所用，術語“cd70結合劑”和“抗cd70結合劑”是指抗cd70抗體、抗cd70抗體的衍生物或片段、或結合cd70并包含cd70結合抗體或其衍生物的至少一個cdr或可變區的其他藥劑。
38.術語“特異性結合”是指結合劑以高度選擇性的方式與其相應的抗原反應，而不與多種其他抗原(例如，非cd70分子)反應。
39.如本文所用，在cd70結合劑的上下文中，術語“功能性”表示結合劑能夠結合cd70。
40.如文中所用，術語“抑制(inhibit)”或“抑制(inhibition of)”意指減少可測量的量或完全防止。
41.在cd70結合劑對表達cd70的細胞的作用的上下文中，術語“耗竭”是指表達cd70的細胞的數量減少或消除。
[0042]“完整抗體”和“完整免疫球蛋白”在本文中定義為典型地約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，其由兩條相同的輕(l)鏈和兩條相同的重(h)鏈構成。每條輕鏈通過二硫鍵與重鏈共價連接以形成異二聚體。異四聚體通過這樣的異二聚體的兩條相同重鏈之間的共價二硫連鍵形成。盡管輕鏈和重鏈通過二硫鍵連接在一起，但兩條重鏈之間的二硫鍵數量隨免疫球蛋白(ig)同種型而變化。每條重鏈和輕鏈還具有規則間隔的鏈內二硫橋。每條重鏈在氨基末端具有可變結構域(vh)，隨后是三個或四個恒定結構域(ch1、ch2、ch3和/或ch4)，以
及ch1和ch2之間的鉸鏈(j)區。每條輕鏈具有兩個結構域，氨基末端可變結構域(v
l
)和羧基末端恒定結構域(c
l
)。v
l
結構域與vh結構域非共價締合，而c
l
結構域通常通過二硫鍵與ch1結構域共價連接。認為特定的氨基酸殘基在輕鏈與重鏈可變結構域之間形成界面(chothia等人,1985,j.mol.biol.186:651-663)。
[0043]
術語“高變”是指可變結構域內的如下某些序列，它們在抗體之間在序列上有很大不同，并且含有直接參與每種特定抗體對其特異性抗原決定簇的結合和特異性的殘基。輕鏈和重鏈可變結構域二者中的高變性集中在稱為互補決定區(cdr)或高變環(hvl)的三個區段中。cdr由kabat等人,1991,于:sequences of proteins of immunological interest,第5版public health service,national institutes of health,bethesda,m.d.中的序列比較來定義；而hvl根據可變結構域的三維結構進行結構定義，如由chothia和lesk,1987,j.mol.biol.196:901-917所述。當這兩種方法導致cdr的略微不同的鑒定時，優選結構定義。如kabat所定義(參見kabat等人,"sequences of proteins of immunological interest,第5版,出版號91-3242,u.s.dept.health&human services,nih,bethesda,m.d.,1991)，輕鏈可變結構域中cdr-l1位于約殘基24-34處，cdr-l2位于約殘基50-56處，cdr-l3位于約殘基89-97處，并且重鏈可變結構域中cdr-h1位于約殘基31-35處，cdr-h2位于約殘基50-65處，cdr-h3位于約殘基95-102處。
[0044]
每條重鏈和輕鏈中的三個cdr由框架區(fr)隔開，所述框架區含有傾向于變化較小的序列。從重鏈和輕鏈可變結構域的氨基末端到羧基末端，fr和cdr按以下順序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、和fr4。fr的大部分β折疊構型使每條鏈中的cdr彼此緊密接近以及與來自另一條鏈的cdr緊密接近。所得構型促成抗原結合位點(參見kabat等人,1991,nih出版號91-3242,第i卷,第647-669頁)，但不是所有的cdr殘基都必需直接參與抗原結合。
[0045]
fr殘基和ig恒定結構域典型地不直接參與抗原結合，但可促成抗原結合或介導抗體效應子功能。一些fr殘基可以以至少三種方式對抗原結合具有顯著影響：通過非共價地直接結合表位，通過與一個或多個cdr殘基相互作用，以及通過影響重鏈與輕鏈之間的界面。恒定結構域介導各種ig效應子功能，如抗體參與抗體依賴性細胞毒性(adcc)、補體依賴性細胞毒性(cdc)和/或抗體依賴性細胞吞噬作用(adcp)。
[0046]
基于恒定結構域的氨基酸序列，脊椎動物免疫球蛋白的輕鏈被指定為兩個明顯不同的類別(kappa(κ)和lambda(λ))中的一種。通過比較，根據恒定結構域的序列，哺乳動物免疫球蛋白的重鏈被指定為五個主要類別iga、igd、ige、igg和igm中的一種。igg和iga進一步分為亞類(同種型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga和iga2。對應于不同類別免疫球蛋白的重鏈恒定結構域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。天然免疫球蛋白類別的亞基結構和三維構型是熟知的。
[0047]
術語“抗體”、“抗cd70抗體”、“人源化抗cd70抗體”和“變體人源化抗cd70抗體”在本文中以最廣泛的意義使用，并且具體地涵蓋全長和天然抗體、單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、以及抗體或其抗原結合片段，如展現出所需生物活性(例如cd70結合)的抗體的可變結構域和其他部分。
[0048]
術語“單克隆抗體”(mab)是指從基本上同質的抗體體獲得的抗體；即，除了可能少量存在的天然存在的突變之外，構成體的單獨抗體是相同的。單克隆抗體對單個抗原
決定簇(也稱為表位)具有高度特異性。修飾語“單克隆”表示針對相同表位的基本上同質的抗體體，且不應解釋為需要通過任何特定方法產生抗體。單克隆抗體可以通過本領域已知的任何技術或方法制備；例如，等人,1975,nature 256:495首次描述的雜交瘤方法，或本領域已知的重組dna方法(參見，例如，美國專利號4,816,567)。在另一個例子中，單克隆抗體也可以使用clackson等人,1991,nature 352:624-628和marks等人,1991,j.mol.biol.222:581-597中所述的技術從噬菌體抗體文庫中分離。
[0049]
相比之下，多克隆抗體制劑中的抗體典型地是免疫球蛋白同種型和/或類別的異質體，并且還展現出多種表位特異性。
[0050]
如本文所用，術語“嵌合”抗體是如下一類型的單克隆抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一個或多個區域或結構域中的部分或完整氨基酸序列與來自另一物種或屬于另一免疫球蛋白類別或同種型的單克隆抗體中的相應序列或來自共有序列的相應序列相同、同源，或前者是后者的變體。嵌合抗體包括此類抗體的片段，條件是該抗體片段展現出其親本抗體的所需生物活性，例如與相同表位結合(參見例如美國專利號4,816,567；和morrison等人,1984,proc.natl.acad sci.usa 81:6851-6855)。產生嵌合抗體的方法是本領域已知的。(參見，例如，morrison,1985.science 229:1202；oi等人,1986,biotechniques4:214；gillies等人,1989,j.immunol.methods 125:191-202；美國專利號5,807,715；4,816,567；和4,816,397。)
[0051]
術語“抗體片段”、“抗cd70抗體片段”、“人源化抗cd70抗體片段”和“變體人源化抗cd70抗體片段”是指全長抗cd70抗體的一部分，其中保留了可變區或功能能力，例如特異性cd70表位結合。抗體片段的例子包括但不限于fab、fab’、f(ab’)2、fd、fv、scfv和scfv-fc片段、雙抗體、三抗體、四抗體、線性抗體、單鏈抗體和由抗體片段形成的其他多特異性抗體。(參見holliger和hudson,2005,nat.biotechnol.23:1126-1136。)
[0052]“單鏈fv”或“scfv”抗體片段是包含抗體的vh和v
l
結構域的單鏈fv變體，其中這些結構域存在于單個多肽鏈中并且能夠識別和結合抗原。scfv多肽任選地含有位于vh與v
l
結構域之間的多肽接頭，其使得scfv形成抗原結合所需的三維結構(參見，例如，pluckthun,1994,the pharmacology of monoclonal antibodies,第113卷,rosenburg和moore編,springer-verlag,紐約,第269-315頁)。
[0053]
術語“雙抗體”是指具有兩個抗原結合位點的小抗體片段。每個片段含有與輕鏈可變結構域(v
l
)連接的重鏈可變結構域(vh)，以形成v
h-v
l
或v
l-vh多肽。通過使用太短而不能使得在同一鏈上的兩個結構域之間配對的接頭，連接的v
h-v
l
結構域被迫與另一條鏈的互補結構域配對，產生兩個抗原結合位點。雙抗體更全面地描述于例如ep 404097；wo 93/11161；和hollinger等人,1993,proc.natl.acad.sci.usa 90:6444-6448中。
[0054]
術語“線性抗體”是指包含形成一對抗原結合區的一對串聯fd區段(v
h-ch1-v
h-ch1)的抗體。線性抗體可以是雙特異性或單特異性的，如zapata等人,1995,protein eng.8(10):1057-1062中所述。
[0055]“人源化抗體”是指免疫球蛋白氨基酸序列變體或其片段，其能夠結合預定抗原并包含可變區多肽鏈，所述可變區多肽鏈具有基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的框架區和基本上具有非人免疫球蛋白的氨基酸序列的一個或多個cdr。
[0056]
總體上，人源化抗體具有從非人來源引入其中的一個或多個氨基酸殘基。這些非
人氨基酸殘基在本文中稱為“輸入”殘基，其典型地取自“輸入”抗體結構域，特別是可變結構域。如本文所討論，輸入殘基、序列或抗體具有所需的親和力和/或特異性、或其他期望的抗體生物活性。
[0057]
通常，人源化抗體將基本上包含至少一個并且典型地兩個可變結構域的全部，其中全部或基本上全部cdr區對應于非人免疫球蛋白的那些cdr區，并且全部或基本上全部框架區是人免疫球蛋白序列(如來自例如共有序列或種系序列)的那些框架區。人源化抗體任選地還將包含(典型地是人免疫球蛋白的)免疫球蛋白fc結構域的至少一部分。例如，抗體可以含有輕鏈以及至少重鏈的可變結構域。適當時，抗體還可以包括重鏈的ch1、鉸鏈(j)、ch2、ch3和/或ch4區。
[0058]
人源化抗體可選自任何類別的免疫球蛋白，包括igm、igg、igd、iga和ige，以及任何同種型，包括igg1、igg2、igg3和lgg4。恒定區或結構域可以包括例如補體結合恒定結構域，其中希望人源化抗體展現出細胞毒性活性(例如igg1)。當不需要這種細胞毒性活性時，恒定結構域可以是另一類別(例如igg2)。人源化抗體可以包含來自多于一種類別或同種型的序列，并且選擇特定的恒定結構域以優化期望的效應子功能在本領域的普通技術范圍內。
[0059]
人源化抗體的fr和cdr區不需要精確地對應于親本序列，例如，可以通過取代、插入或缺失至少一個殘基來改變輸入cdr或共有fr，使得該位點的cdr或fr殘基不對應于共有或輸入抗體。此類突變通常不是廣泛的。通常，至少75％的人源化抗體殘基將對應于親本fr和cdr序列的那些殘基，更通常至少90％，最通常大于95％。
[0060]
如本文所用，術語“一種或多種抗體效應子功能”是指由ig的一個或多個fc結構域貢獻的功能。此類功能可以是例如抗體依賴性細胞毒性、抗體依賴性細胞吞噬作用或補體依賴性細胞毒性。這種功能可通過例如一個或多個fc效應子結構域與具有吞噬或裂解活性的免疫細胞上的fc受體結合或通過一個或多個fc效應子結構域與補體系統的組分結合來實現。典型地，由fc結合細胞或補體組分介導的一種或多種作用導致cd70靶向細胞的抑制和/或耗竭。不預期受任何特定理論的束縛，抗體的fc區可以募集fc受體(fcr)表達細胞并將它們與抗體包被的靶細胞并列。表達針對igg的表面fcr(包括fcγriii(cd16)、fcγrii(cd32)和fcγriii(cd64))的細胞可以充當效應細胞以破壞igg包被的細胞。此類效應細胞包括單核細胞、巨噬細胞、自然殺傷(nk)細胞、嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞。fcγr由igg的接合激活抗體依賴性細胞毒性(adcc)或抗體依賴性細胞吞噬作用(adcp)。adcc由cd16
+
效應細胞通過膜孔形成蛋白和蛋白酶的分泌介導，而吞噬作用由cd32
+
和cd64
+
效應細胞介導(參見fundamental immunology,第4版,paul編,lippincott-raven,n.y.,1997,第3、17和30章；uchida等人,2004,j.exp.med.199:1659-69；akewanlop等人,2001,cancer res.61:4061-65；watanabe等人,1999,breast cancer res.treat.53:199-207)。除了adcc和adcp之外，細胞結合的抗體的fc區還可以激活補體經典途徑來引發補體依賴性細胞毒性(cdc)。當抗體與抗原復合時，補體系統的c1q與抗體的fc區結合。c1q與細胞結合的抗體的結合可以引發涉及c4和c2的蛋白水解激活從而產生c3轉化酶的一連串事件。c3轉化酶將c3切割為c3b使得能夠激活包括c5b、c6、c7、c8和c9在內的末端補體組分。總的來說，這些蛋白質在抗體包被的細胞上形成膜攻擊復合物孔。這些孔破壞細胞膜完整性，從而殺傷靶細胞(參見immunobiology,第6版,janeway等人,garland science,n.y.,2005,第2章)。
[0061]
術語“抗體依賴性細胞毒性”或adcc是誘導細胞死亡的機制，其依賴于抗體包被的靶細胞與具有裂解活性的免疫細胞(也稱為效應細胞)的相互作用。此類效應細胞包括自然殺傷細胞、單核細胞/巨噬細胞和嗜中性粒細胞。效應細胞附接至ig的一個或多個fc效應子結構域，ig經由其抗原結合位點與靶細胞結合。抗體包被的靶細胞的死亡作為效應細胞活性的結果而發生。
[0062]
術語“抗體依賴性細胞吞噬作用”或adcp是指抗體包被的細胞被與ig的一個或多個fc效應子結構域結合的吞噬免疫細胞(例如巨噬細胞、嗜中性粒細胞和樹突細胞)以整體或部分內化的過程。
[0063]
術語“補體依賴性細胞毒性”或cdc是指誘導細胞死亡的機制，其中靶標結合抗體的一個或多個fc效應子結構域激活一系列酶促反應，最終導致在靶細胞膜上形成孔。典型地，抗原-抗體復合物(如抗體包被的靶細胞上的那些)結合并激活補體組分c1q，其轉而激活補體級聯，從而導致靶細胞死亡。補體的激活還可導致補體組分沉積在靶細胞表面上，所述補體組分通過結合白細胞上的補體受體(例如cr3)來促進adcc。
[0064]
如本文所用，“免疫細胞”是指參與調節免疫應答的造血譜系細胞。在典型的實施方案中，免疫細胞是t淋巴細胞、b淋巴細胞、nk細胞、單核細胞/巨噬細胞或樹突細胞。
[0065]
如本文所用，“效應細胞”是指表達免疫球蛋白的fc結構域的表面受體(fcr)的細胞。例如，表達包括fcγriii(cd16)、fcγrii(cd32)和fcγriii(cd64)在內的igg的表面fcr的細胞可作為效應細胞。此類效應細胞包括單核細胞、巨噬細胞、自然殺傷(nk)細胞、嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞。
[0066]“劑”是對癌細胞、激活的免疫細胞或其他靶細胞體發揮細胞毒性、細胞抑制和/或免疫調節作用的藥劑。劑的例子包括細胞毒性劑、化療劑、細胞抑制劑和免疫調節劑。
[0067]“細胞毒性作用”是指對靶細胞的耗竭、消除和/或殺傷。“細胞毒性劑”是指對細胞具有細胞毒性作用的藥劑。該術語旨在包括放射性同位素(如i
131
、i
125
、y
90
和re
186
)、化療劑和毒素(如細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素)及其片段。此類細胞毒性劑可與抗體(例如人源化抗cd70抗體)偶聯，且用于例如被指示用所述抗體進行的患者。在一個實施方案中，“細胞毒性劑”包括單克隆抗體，例如與本文所述的人源化抗體組合使用的抗體。
[0068]“化療劑”是可用于癌癥的化合物。化療劑的例子包括烷基化劑，如噻替派和環磷酰胺(cytoxan
tm
)；烷基磺酸酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮雜環丙烷，如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；乙烯亞胺和甲基蜜胺類(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撐硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹堿(包括合成類似物拓撲替康)；苔蘚抑素；海洋抑素(callystatin)；cc-1065(包括其阿多來新、卡折來新和比折來新合成類似物)和其衍生物；念珠藻素(特別是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀；澳瑞他汀類(包括類似物一甲基澳瑞他汀e和一甲基澳瑞他汀f(參見例如，2005年10月27日公開的美國公開申請號2005-0238649，其全部內容并入本文)；倍癌霉素(包括合成類似物、kw-2189和cbi-tmi)；艾榴塞
洛素(eleutherobin)；水鬼蕉堿(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑制素(spongistatin)；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀、異環磷酰胺、二氯甲基二乙胺、鹽酸氧化氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖、新恩比興、苯芥膽甾醇(phenesterine)、松龍苯芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亞，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γ1i和卡奇霉素參見例如，agnew,chem.intl.ed.engl.,33:183-186；達尼霉素(dynemicin)，包括達尼霉素a；雙磷酸鹽，如氯膦酸鹽；埃斯波霉素；以及新制癌菌素發團和相關的蛋白烯二炔抗生素發團)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放線菌素d(actinomycin)、土霉素(authramycin)、偶氮絲氨酸、博來霉素、放線菌素c(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋紅霉素、嗜癌霉素(carzinophilin)、霉素(chromomycin)、更生霉素、道諾霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星(adriamycin
tm
)(包括嗎啉代-多柔比星、氰基嗎啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊達比星、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素(如絲裂霉素c)、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、培洛霉素(peplomycin)、泛霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星、鏈黑菌素、鏈脲菌素、殺結核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；葉酸類似物，如二甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物，如氟達拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮雜尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷；雄激素，如卡普睪酮、丙酸甲雄烷酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷、睪內酯；抗腎上腺素，如氨魯米特、米托坦、曲絡司坦；葉酸補充劑，如葉酸；醋葡醛內酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶；安吖啶；貝斯布西(bestrabucil)；比生；依達曲酯(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；依法磷酸(elfornithine)；依利醋氨；埃博霉素；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明(lonidamine)；類美登素，如美登素(maytansine)和安絲菌素；米托胍腙、米托蒽醌；莫哌達醇(mopidamol)；尼曲吖啶(nitracrine)；噴司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙酰肼；丙卡巴肼；丙亞胺；根霉素；西佐喃；鍺螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢霉烯(trichothecenes)(尤其是t-2毒素、維拉庫林a(verracurin a)、漆斑菌素a(roridin a)和胺癸叮(anguidine)；烏拉坦(urethan)；長春地辛；達卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；哌泊溴烷；加息托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“ara-c”)；環磷酰胺；噻替派；紫杉烷類，例如紫杉醇(bristol-myers squibb oncology,普林斯頓，新澤西州)和多西他賽(-poulenc rorer,安東尼,法國)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemzar
tm
)；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長春堿；鉑；依托泊苷(vp-16)；異環磷酰胺；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱(navelbine
tm
)；諾肖林；替尼泊苷；依達曲沙；道諾霉素；氨基蝶呤；希羅達；伊班膦酸鹽；cpt-11；拓撲異構酶抑制劑rfs 2000；二氟甲基鳥氨酸(dmfo)；類視黃醇如視黃酸；卡培他
濱；以及任何上述的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。該定義還包括用以調節或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素劑，如抗雌激素劑和選擇性雌激素受體調節劑(serm)，包括例如他莫昔芬(包括nolvadex
tm
)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)、ly117018、奧那斯酮和托瑞米芬(fareston
tm
)；抑制調節腎上腺中雌激素產生的芳香酶的芳香酶抑制劑，例如4(5)-咪唑、氨魯米特、醋酸甲地孕酮(megace
tm
)、依西美坦、福美坦、法倔唑、伏氯唑(rivisor
tm
)、來曲唑(femara
tm
)和阿那曲唑(arimidex
tm
)；和抗雄激素如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任何上述的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。
[0069]
如本文所用，術語“前藥”是指藥物活性物質的前體或衍生物形式，其與母體藥物相比對腫瘤細胞的細胞毒性較小，并且能夠被酶促激活或轉化為更具活性的母體形式。參見，例如，wilman,1986,"prodrugs in cancer chemotherapy",biochemical society transactions,14,第375-382頁,615th meeting belfast；和stella等人,1985,"prodrugs:achemical approach to targeted drug delivery,"directed drug delivery,borchardt等人,(編),第247-267頁,humana press。有用的前藥包括但不限于含磷酸鹽的前藥、含硫代磷酸鹽的前藥、含硫酸鹽的前藥、含肽的前藥、d-氨基酸修飾的前藥、糖基化的前藥、含β-內酰胺的前藥、含任選經取代的苯氧基乙酰胺的前藥和含任選經取代的苯基乙酰胺的前藥、5-氟胞嘧啶和其他5-氟尿苷前藥(其可轉化為更具活性的細胞毒性游離藥物)。可以衍生為前藥形式的細胞毒物的例子包括但不限于上述那些化療劑。
[0070]“細胞抑制作用”是指細胞增殖的抑制。“細胞抑制劑(cytostatic agent)”是指對細胞具有細胞抑制作用，從而抑制特定細胞亞的生長和/或擴增的藥劑。
[0071]
如本文所用，術語“免疫調節作用”是指對免疫學應答的發展或維持的刺激(免疫刺激)或抑制(免疫抑制)。抑制可通過例如以下來實現：消除免疫細胞(例如t或b淋巴細胞)；誘導或產生可以調節(例如，下調)其他細胞的功能能力的免疫細胞；在免疫細胞中誘導無應答狀態(例如，免疫失能)；或增加、降低或改變免疫細胞的活性或功能，包括例如改變由這些細胞表達的蛋白質的模式(例如，改變某些類別的分子如細胞因子、趨化因子、生長因子、轉錄因子、激酶、共刺激分子或其他細胞表面受體等的產生和/或分泌)。“免疫調節劑”是指對細胞具有免疫調節作用的藥劑。在一些實施方案中，免疫調節劑對促進免疫應答的免疫細胞具有細胞毒性或細胞抑制作用。
[0072]
術語“標記”是指直接或間接與抗體綴合的可檢測化合物或組合物。標記本身可以是可檢測的(例如放射性同位素標記或熒光標記)，或者在酶標記的情況下，可以催化可檢測的底物化合物或組合物的化學變化。可制備標記的抗cd70抗體并用于各種應用，包括體外和體內診斷。
[0073]“分離的”核酸分子是從至少一種污染核酸分子中鑒定和分離的核酸分子，所述核酸分子在核酸的天然來源中通常與所述污染核酸分子締合。分離的核酸分子不同于其在自然界中發現的形式或配置。因此，分離的核酸分子不同于天然細胞中存在的核酸分子。然而，分離的核酸分子包括在通常表達抗體的細胞中包含的核酸分子，其中例如所述核酸分子位于與天然細胞中相比不同的染體位置。
[0074]
術語“控制序列”是指在特定宿主生物體中表達可操作連接的編碼序列所必需的多核苷酸序列。適用于原核細胞的控制序列包括例如啟動子、操縱子和核糖體結合位點序
列。真核控制序列包括但不限于啟動子、多腺苷酸化信號和增強子。這些控制序列可用于在原核和真核宿主細胞中表達和生產抗cd70結合劑。
[0075]
當核酸序列被放置成與另一核酸序列有功能關系時，其為“可操作地連接”。例如，如果核酸前序列或分泌前導序列表達為參與多肽分泌的前蛋白，則它與編碼多肽的核酸可操作地連接；如果啟動子或增強子影響序列的轉錄，則它與編碼序列可操作地連接；或者如果核糖體結合位點被定位為便于翻譯，則它與編碼序列可操作地連接。通常，“可操作地連接”意味著所連接的dna序列是連續的，并且在分泌前導序列的情況下，是連續的并且在閱讀框中。然而，增強子任選地是連續的。連接可通過在便利的限制位點進行連接來完成。如果不存在這樣的位點，合成的寡核苷酸銜接子或接頭可用于連接dna序列。
[0076]
術語“多肽”是指氨基酸及其等同物的聚合物，而不是指特定長度的產物；因此，“肽”和“蛋白質”包括在多肽的定義中。本文定義的“抗體”也包括在多肽的定義中。“多肽區”是指多肽的區段，所述區段可以含有例如一個或多個結構域或基序(例如，抗體的多肽區可以含有例如一個或多個互補決定區(cdr))。術語“片段”是指典型地具有多肽的至少20個連續或至少50個連續氨基酸的多肽的一部分。“衍生物”是相對于第二多肽具有一個或多個非保守或保守氨基酸取代的多肽或其片段；或通過共價附接第二分子(例如通過附接異源多肽)或通過糖基化、乙酰化、磷酸化等而修飾的多肽或其片段。“衍生物”的定義中還包括例如含有一個或多個氨基酸類似物(例如，非天然氨基酸等)的多肽、具有未取代連接以及本領域已知的天然和非天然存在的其他修飾的多肽。
[0077]“分離的”多肽是已從其自然環境的組分鑒定出并分離和/或回收的多肽。其自然環境的污染物組分是會干擾多肽的診斷或用途的材料，并且可以包括酶、激素和其他蛋白質或非蛋白質溶質。分離的多肽包括分離的抗體、或其片段或衍生物。“抗體”包括重組細胞內原位抗體，因為抗體的天然環境的至少一種組分將不存在。
[0078]
在某些實施方案中，將抗體純化至：(1)如通過勞里法(lowry method)所確定的按重量計大于95％的抗體，并且在其他方面按重量計大于99％，(2)足以獲得通過使用旋杯式序列分析儀所測的至少15個殘基的n末端或內部氨基酸序列的程度，或(3)在還原或非還原條件下使用考馬斯藍或優選銀染通過sds-page測得的同質性。
[0079]
在多肽的上下文中，術語“異源的”意指與另一多肽相比來自不同來源(例如，細胞、組織、生物體或物種)，使得這兩種多肽是不同的。典型地，異源多肽來自不同物種。
[0080]
在免疫球蛋白多肽或其片段的上下文中，“保守取代”意指基本上不降低免疫球蛋白多肽或其片段與抗原的特異性結合(例如，通過kd所測量)的一個或多個氨基酸取代(即，增加結合親和力，不顯著改變結合親和力，或使結合親和力降低不超過約40％、典型地不超過約30％、更典型地不超過約20％、甚至更典型地不超過約10％或最典型地不超過約5％的取代，如通過標準結合測定如elisa所測定)。
[0081]
在兩個或更多個核酸或多肽序列的上下文中，術語“相同”或“同一性百分比”是指在針對最大一致性(maximum correspondence)進行比較或比對時，兩個或更多個序列或子序列相同，或者具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸殘基。為了確定同一性百分比，出于最佳比較目的比對所述序列(例如，可在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入空位，以實現與第二氨基酸或核酸序列的最佳比對)。然后比較在相應氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。在第一序列中的位置由與第二序列中的相應位置相同的氨基酸殘基或
核苷酸占據時，那么分子在該位置處是相同的。兩個序列之間的同一性百分比是所述序列共有的同一性位置數的函數(即，同一性％＝同一性位置數/位置總數(例如，重疊位置)x100)。在一些實施方案中，兩個序列具有相同長度。
[0082]
在兩個核酸或多肽的上下文中，術語“基本相同”是指兩個或更多個序列或子序列具有至少50％、至少55％、至少60％、或至少65％同一性；典型地，至少70％或至少75％同一性；更典型地，至少80％或至少85％同一性；并且甚至更典型地，至少90％、至少95％或至少98％同一性(例如，如使用下文列出的其中一種方法所確定的)。
[0083]
在兩個或更多個多肽序列的上下文中，術語“相似性”或“相似性百分比”是指在針對最大一致性進行比較和比對時，兩個或更多個序列或子序列具有指定百分比的相同的或保守取代的氨基酸殘基，如使用下文列出的其中一種方法所測量的。舉例來說，當與第一序列中所含數量相等的數量的氨基酸相比時，或當與已經通過例如下文列出的其中一種方法比對的多肽比對相比時，第一氨基酸序列相對于第二氨基酸序列是至少50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％相同或保守取代的情況下，可以認為第一氨基酸序列與第二氨基酸序列相似。
[0084]
在多肽序列的上下文中，術語“基本相似性”或“基本相似”表示多肽區具有與參考序列具有至少70％、典型地至少80％、更典型地至少85％或至少90％或至少95％序列相似性的序列。例如，多肽基本上類似于第二多肽，例如，在兩種肽的不同之處在于一個或多個保守取代時。
[0085]
在抗cd70抗體或其衍生物的上下文中，具有與抗cd70抗體的一個或多個抗原結合區(例如，重鏈或輕鏈可變區，或重鏈或輕鏈cdr)基本相同或基本相似的一個或多個多肽區的蛋白質保留了與由抗cd70抗體識別的cd70表位的特異性結合，如使用本領域已知或本文提及的各種標準免疫測定中的任一種測定的。
[0086]
兩個序列之間的同一性百分比或相似性百分比的確定可以使用數學算法來完成。用于比較兩個序列的數學算法的優選非限制性例子是karlin和altschul,1990,proc.natl.acad.sci.usa 87:2264-2268的算法，如karlin和altschul,1993,proc.natl.acad.sci.usa 90:5873-5877中修改。這種算法被并入altschul等人,1990,j.mol.biol.215:403-410的nblast和xblast程序中。blast核苷酸搜索可用nblast程序來進行，得分＝100，字長＝12，以獲得與編碼目的蛋白質的核酸同源的核苷酸序列。blast蛋白質搜索可用xblast程序來進行，得分＝50，字長＝3，以獲得與目的蛋白質同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的空位比對，可以如altschul等人,1997，nucleic acids res.25:3389-3402中所述的使用空位blast(gapped blast)。可替代地，可使用psi-blast來進行迭代搜索，其檢測分子之間的遠距離關系(同上)。當使用blast、空位blast和psi-blast程序時，可以使用各程序(例如，xblast和nblast)的默認參數。用于比較序列的數學算法的另一個非限制性例子是myers和miller,cabios(1989)的算法。這種算法已并入到align程序(2.0版)中，所述程序是gcg序列比對軟件包的一部分。當利用align程序比較氨基酸序列時，可以使用pam120權重殘基表，空位長度罰分為12，空位罰分為4。用于序列分析的其他算法是本領域已知的，并且包括如torellis和robotti,1994,comput.appl.biosci.10:3-5中所述的advance和adam；和pearson和lipman,1988,proc.natl.acad.sci.usa 85:2444-8中所述的fasta。在fasta內，ktup是設置搜索靈敏度
和速度的控制選項。如果ktup＝2，通過查看比對殘基對，發現所比較的兩個序列中的相似區域；如果ktup＝1，檢查單個比對的氨基酸。對于蛋白質序列，ktup可以設置為2或1，或者對于dna序列，可以設置為1至6。如果ktup未指定，則對于蛋白質，默認值為2，對于dna，默認值為6。可替代地，可使用higgins等人,1996,methods enzymol.266:383-402中描述的clustal w算法進行蛋白質序列比對。
[0087]
如本文所用，表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，并且所有這些名稱都包括其后代。因此，“轉化體”和“轉化的細胞”包括原代主題細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移的數量。還應理解，由于故意或天然發生的突變，所有后代的dna含量可能不完全相同。包括具有與原始轉化的細胞中所篩選的相同功能或生物學活性的突變體后代。在意指不同的名稱的情況下，根據上下文將是清楚的。
[0088]
用于目的的術語“受試者”是指任何動物，特別是歸類為哺乳動物的動物，包括人、馴養動物和農場動物以及動物園動物、運動動物或寵物動物，如狗、馬、貓、牛等。優選地，受試者是人。
[0089]
如本文所用，“障礙”和術語“cd70相關障礙”和“cd70相關疾病”是指將受益于用如本文所述的抗cd70結合劑的任何病癥。“cd70相關障礙”和“cd70相關疾病”典型地在細胞表面上表達cd70或其片段。這包括慢性和急性障礙或疾病，包括使哺乳動物易患討論中的障礙的那些病理狀態。本文待的障礙的非限制性例子包括癌癥、髓系惡性腫瘤、血液惡性腫瘤、良性和惡性腫瘤、白血病和淋巴惡性腫瘤、癌以及炎性、血管生成性和免疫性障礙。下文公開了障礙的具體例子。
[0090]
如本文所用，術語“”和“療法”等意指包括導致任何臨床期望或有益效果的對疾病或障礙的性和預防性或抑制性措施，所述臨床期望或有益效果包括但不限于減輕或緩解疾病或障礙的一種或多種癥狀，消退、減緩或停止疾病或障礙的進展。因此，例如，術語包括在疾病或障礙的癥狀發作之前或之后施用藥劑，從而預防或消除疾病或障礙的所有體征。作為另一個例子，該術語包括在疾病的臨床表現之后施用藥劑以對抗疾病的癥狀。此外，在發作后和出現臨床癥狀后施用藥劑(其中施用影響疾病或障礙的臨床參數，如組織損傷的程度或轉移的量或程度，無論是否導致疾病的改善)構成如本文所用的“”或“療法”。
[0091]
如本文所用，術語“預防”(“prevention”或“prevent”)是指在表達cd70的癌癥或免疫障礙的臨床或診斷癥狀發作之前向受試者施用抗cd70結合劑(例如向具有獲得表達cd70的癌癥或免疫障礙的傾向或高風險的個體施用)，從而(a)阻斷表達cd70的癌癥或免疫障礙或其一種或多種臨床或診斷癥狀的發生或發作，(b)抑制表達cd70的癌癥或免疫障礙發作的嚴重性，或(c)降低表達cd70的癌癥或免疫障礙發作的可能性。
[0092]
術語“靜脈內輸注”是指在大于大約15分鐘，通常在大約30至90分鐘的時間段內將藥劑(例如劑)引入動物或人患者的靜脈中。
[0093]
術語“靜脈內推注”(“intravenous bolus”或“intravenous push”)是指將藥物施用于動物或人的靜脈中，使得身體在大約15分鐘或更短，通常5分鐘或更短的時間內接受藥物。
[0094]
術語“皮下施用”是指在動物或人患者的皮膚下，通常在皮膚和下面的組織之間的口袋內，通過從藥物容器相對緩慢持續的遞送引入藥劑(例如劑)。將皮膚捏住或牽拉
向上且離開下面的組織可產生口袋。
[0095]
術語“藥品說明書”用于指通常包括在產品的商業包裝中的說明書，該說明書包含關于使用此類產品的適應癥、用法、施用、禁忌癥和/或警告的信息。
[0096]“脂質體”是由各種類型的脂質、磷脂和/或表面活性劑構成的小囊泡，其可用于將藥物(例如抗體)遞送至哺乳動物。脂質體的組分通常以雙層形式排列，類似于生物膜的脂質排列。
[0097]
術語“皮下輸注”是指在動物或人患者的皮膚下，優選地在皮膚和下面的組織之間的口袋內，通過從藥物容器相對緩慢持續的遞送一個時間段引入藥物，所述時間段包括但不限于30分鐘或更短、或90分鐘或更短。任選地，輸注可以通過皮下植入被植入在動物或人患者的皮膚下的藥物遞送泵來進行，其中泵遞送預定量的藥物持續一個預定時間段，如30分鐘、90分鐘或跨越方案的長度的時間段。
[0098]
術語“皮下推注”是指在動物或人患者的皮膚下的藥物施用，其中推注藥物遞送少于約15分鐘；在另一方面，少于5分鐘，并且在再另一方面，少于60秒。在甚至又另一方面，施用在皮膚和下面的組織之間的口袋內，其中口袋可以通過將皮膚捏住或牽拉向上且離開下面的組織來產生。
[0099]
術語“有效量”是指足以抑制受試者中表達cd70的癌癥或免疫障礙的發生或改善其一種或多種臨床或診斷癥狀的抗cd70結合劑(例如，抗體或衍生物或其他結合劑)的量。根據本文所述的方法以“有效方案”施用有效量的藥劑。術語“有效方案”是指足以實現或預防表達cd70的癌癥或免疫障礙的藥劑的量和給藥頻率的組合。
[0100]
術語“有效量”用于指具有有益患者結局(例如生長停滯作用或細胞缺失)的劑的量。在一方面，有效量具有凋亡活性，或能夠誘導細胞死亡。在另一方面，有效量是指已顯示在例如減緩疾病進展中有效的目標血清濃度。功效可以以常規方式測量，這取決于待的病癥。例如，在以表達cd70的細胞為特征的腫瘤性疾病或障礙中，可以通過評估疾病進展時間(ttp)或確定反應率(rr)來測量功效。
[0101]
如本文所用，“完全反應”或“cr”是指所有靶病灶的消失；“部分反應”或“pr”是指靶病灶的最長直徑之和(sld)降低至少30％，以基線sld為參考；并且“疾病穩定”或“sd”是指以自開始以來的最小sld為參考，靶病灶既沒有足夠縮小以符合pr，也沒有足夠增加以符合pd。
[0102]
如本文所用，“無進展存活期”或“pfs”是指在期間和之后，所的疾病(例如，癌癥)沒有惡化的時間長度。無進展存活期可以包括患者經歷完全反應或部分反應的時間量以及患者經歷疾病穩定的時間量。
[0103]
如本文所用，“總反應率”或“orr”是指完全反應(cr)率和部分反應(pr)率的總和。
[0104]
如本文所用，“總存活率”或“os”是指組中在特定持續時間后可能存活的個體的百分比。
[0105]
如本文所用的“不良事件”(ae)是與使用藥物相關的任何不利且通常是無意或不希望的體征(包括異常的實驗室發現)、癥狀或疾病。藥物可能具有一種或多種相關的ae，并且每種ae可能具有相同或不同分級的嚴重程度。提及能夠“改變不良事件”的方法意指降低與使用不同方案相關的一種或多種ae的發生率和/或嚴重程度的方案。
[0106]
如本文所用的“嚴重不良事件”或“sae”是滿足以下標準之一的不良事件：
·
致命或危及生命(如在嚴重不良事件的定義中所用，“危及生命”是指患者在事件發生時有死亡風險的事件；它不是指假設其在更嚴重時可能會導致死亡的事件。
·
導致持續性或顯著的殘疾/無能
·
構成先天性異常/出生缺陷
·
具有醫學顯著性，即定義為危害患者或可能需要醫療或手術干預以防止以上列出的結局之一的事件。在決定ae是否“具有醫學顯著性”時，必須進行醫學和科學判斷
·
需要住院或延長現有住院，不包括以下情況：1)常規或監測潛在疾病，與病癥的任何惡化無關；2)對與研究中適應癥無關且自簽署知情同意書以來未惡化過的預先存在的病癥進行選擇性或預先計劃的；以及3)在患者總體狀況沒有任何惡化的情況下的社會原因和臨時看護。
[0107]
替代方案(例如，“或”)的使用應理解為意指替代方案中的一個、兩者或它們的任何組合。如本文中所用，不定冠詞“一個/一種(a)”或“一個/一種(an)”應被理解為是指“一個/一種或多個/多種”任何所述或列舉的組分。
[0108]
術語“約”或“基本上由
……
構成”是指在本領域普通技術人員確定的特定值或組成的可接受誤差范圍內的值或組成，其將部分取決于如何測量或確定所述值或組成，即測量系統的限制。例如，根據本領域的實踐，“約”或“基本上由
……
構成”可以意指在1個或超過1個標準差內。可替代地，“約”或“基本上由
……
構成”可以意指高達20％的范圍。此外，特別是關于生物系統或過程，所述術語可以意指值的多達一個數量級或多達5倍。當在本技術和權利要求中提供特定值或組成時，除非另有說明，否則應當假定“約”或“基本上由
……
構成”的含義在該特定值或組成的可接受的誤差范圍內。
[0109]
如文中所用，術語“藥學上可接受的”意指由聯邦政府或州政府的監管機構批準的或在美國藥典或其他普遍認可的藥典中列出的用于在動物體內，更特別地在人體內使用。術語“藥學上相容的成分”是指與抗cd70結合劑一起施用的藥學上可接受的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。
[0110]
如本文所用，短語“藥學上可接受的鹽”是指抗cd70結合劑或劑的藥學上可接受的有機或無機鹽。抗cd70結合劑或劑含有至少一個氨基，因此可用該氨基或其他合適的基團形成酸加成鹽。示例性鹽包括但不限于硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異煙酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、丹寧酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、龍膽酸鹽、富馬酸鹽、葡萄糖酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、谷氨酸鹽、甲基磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽和雙羥萘酸(即1,1'-亞甲基-雙-(2-羥基3-萘甲酸))鹽。藥學上可接受的鹽可以涉及包含另一種分子，如乙酸根離子、琥珀酸根離子或其他反離子。反離子可以是使母體化合物上的電荷穩定的任何有機或無機部分。此外，藥學上可接受的鹽在其結構中可以具有多于一個帶電荷的原子。多個帶電荷的原子是藥學上可接受的鹽的一部分的例子可以具有多個反離子。因此，藥學上可接受的鹽可以具有一個或多個帶電荷的原子和/或一個或多個反離子。
[0111]“藥學上可接受的溶劑化物”或“溶劑化物”是指一種或多種溶劑分子與抗cd70結合劑和/或劑的締合。形成藥學上可接受的溶劑化物的溶劑的例子包括但不限于水、異
丙醇、乙醇、甲醇、dmso、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
[0112]
縮寫“afp”是指二甲基纈氨酸-纈氨酸-海兔異亮氨酸(dolaisoleuine)-海兔脯氨酸(dolaproine)-苯丙氨酸-對苯二胺。
[0113]
縮寫“mmae”是指一甲基澳瑞他汀e。
[0114]
縮寫“aeb”是指通過使澳瑞他汀e與對乙酰基苯甲酸反應產生的酯。
[0115]
縮寫“aevb”是指通過使澳瑞他汀e與苯甲酰基戊酸反應產生的酯。
[0116]
縮寫“mmaf”是指海兔纈氨酸(dovaline)-纈氨酸-海兔異亮氨酸(dolaisoleunine)-海兔脯氨酸(dolaproine)-苯丙氨酸。
[0117]
縮寫“fk”和“phe-lys”是指接頭苯丙氨酸-賴氨酸。
[0118]
術語“treg”或“調節性t細胞”是指抑制cd4+cd25
+
和cd8
+
t細胞增殖和/或效應子功能，或以其他方式下調免疫應答的cd4
+
t細胞。值得注意的是，treg可下調由自然殺傷細胞、自然殺傷t細胞以及其他免疫細胞介導的免疫應答。
[0119]
術語“調節性t細胞功能”或“treg的功能”可互換使用，是指treg的導致cd4+cd25
+
或cd8
+
t細胞增殖的減少或效應t細胞介導的免疫應答的減少的任何生物學功能。treg功能可以經由本領域建立的技術來測量。用于測量treg功能的體外測定中的非限制性例子包括transwell抑制測定以及體外測定，在所述體外測定中從人外周血或臍帶血(或鼠脾臟或淋巴結)純化的靶常規t細胞(tconv)和treg任選地通過抗cd3
+
抗cd28包被珠粒(或抗原呈遞細胞(apc)，例如輻照的脾細胞或純化的樹突細胞(dc)或輻照的pbmc)激活，然后在體外檢測常規t細胞增殖(例如，通過測量放射性核苷酸(例如，[h]-胸苷)或熒光核苷酸的摻入，或通過cayman chemical mtt細胞增殖測定試劑盒，或通過用流式細胞儀監測綠熒光染料酯cfse或半萘熒光素(snarf-1)染料的稀釋度)。其他常見測定測量t細胞細胞因子反應。treg功能的可用體內測定包括treg在其中發揮重要作用的動物疾病模型中的測定，所述動物疾病模型包括例如，(1)穩態模型(使用幼稚穩態擴增cd4
+
t作為主要受treg抑制的靶細胞)、(2)炎性腸病(ibd)恢復模型(使用thl t細胞(thl7)作為主要受treg抑制的靶細胞)、(3)實驗性自身免疫性腦脊髓炎(eae)模型(使用thl 7和thl t細胞作為主要受treg抑制的靶細胞)、(4)b16黑素瘤模型(抗腫瘤免疫的抑制)(使用cd8
+
t細胞作為主要受treg抑制的靶細胞)、(5)在過繼轉移結腸炎中抑制結腸炎癥，其中幼稚cd4
+
cd45rb
m tconv細胞被轉移到ragv小鼠中，以及(6)foxp3挽救模型(使用淋巴細胞作為主要受treg抑制的靶細胞)。根據一種方案，所有模型都需要小鼠以得到供體t細胞體以及ragl-/-或foxp3小鼠以得到受體。有關各種可用測定的更多詳細信息，參見例如collison和vignali,in vitro treg suppression assays,chapter2in regulatory t cells:methods and protocols,methods in molecular biology,kassiotis和liston編,springer,2011,707:21-37；workman等人,in vivo treg suppression assays,chapter 9in regulatory t cells:methods and protocols,methods in molecular biology,kassiotis和liston編,springer,2011,119-156；takahashi等人,int.immunol,1998,10:1969-1980；thornton等人,j.exp.med.,1998,188:287-296；collison等人,j.immunol,2009,182:6121-6128；thornton和shevach,j.exp.med.,1998,188:287-296；asseman等人,j.exp.med.,1999,190:995-1004；dieckmann等人,j.exp.med.,2001,193:1303-1310；belkaid,nature reviews,2007,7:875-888；tang和bluestone,nature immunology,2008,9:239-244；
bettini和vignali,curr.opin.immunol,2009,21:612-618；dannull等人,j clin invest,2005,115(12):3623-33；tsaknaridis,等人,j neurosci res.,2003,74:296-308。
[0120]
如本文所述，任何濃度范圍、百分比范圍、比率范圍或整數范圍應理解為包括所述范圍內的任何整數的值，并且在適當時包括它們的分數(如整數的十分之一和百分之一)，除非另外指示。
[0121]
在以下小節中進一步詳細描述了本公開文本的各個方面。ii.抗cd70抗體
[0122]
本發明提供了源自小鼠抗體1f6的抗cd70抗體，如人源化抗體。1f6是針對cd70的鼠免疫球蛋白g1(igg1)單克隆抗體。1f6和人源化1f6變體描述于美國專利號8,067,546和國際專利公開案wo 2006/113909中。在一些實施方案中，抗cd70抗體是非巖藻糖基化的。
[0123]
小鼠1f6抗體的人源化形式的結合親和力(即，解離常數kd)優選地在小鼠抗體1f6對于人cd70的結合親和力的五倍或兩倍之內。人源化1f6抗體特異性結合天然形式的人cd70和/或由中國倉鼠卵巢(cho)細胞重組表達的人cd70，如同衍生它們的小鼠抗體一樣。優選的人源化1f6抗體對于人cd70的親和力等于或大于(即，大于測量的誤差界限之外)1f6對于人cd70的親和力(例如，1f6的親和力的1.1至5倍、1.1至3倍、1.5至3倍、1.7至2.3倍或1.7至2.1倍或所述親和力的約兩倍)。優選的人源化1f6抗體與1f6結合相同的表位和/或競爭結合人cd70。
[0124]
在一些實施方案中，在動物模型或臨床試驗中，本發明的抗體抑制癌癥(例如，細胞的生長、轉移和/或對生物體的致死性)，如在培養物中繁殖的癌細胞上所示。動物模型可以通過將表達cd70的人腫瘤細胞系植入適當的免疫缺陷型嚙齒動物品系(例如無胸腺裸鼠或scid小鼠)中而形成。這些腫瘤細胞系可以在免疫缺陷型嚙齒動物宿主中通過皮下注射建立為實體瘤，或者通過靜脈內注射建立為播散性腫瘤。
[0125]
一旦在宿主內建立，這些腫瘤模型就可以用于如實施例中所述評價抗cd70抗體或其綴合形式的功效。
[0126]
通常，本公開文本的抗cd70抗體結合cd70，例如人cd70，并對惡性細胞(如癌細胞)發揮細胞抑制和細胞毒性作用。本公開文本的抗cd70抗體優選地是單克隆的，并且可以是多特異性抗體、人抗體、人源化抗體或嵌合抗體、單鏈抗體、fab片段、f(ab')片段、由fab表達文庫產生的片段以及上述任一者的cd70結合片段。在一些實施方案中，本公開文本的抗cd70抗體特異性地結合cd70。本公開文本的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何類型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、類別(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或子類。
[0127]
在本公開文本的某些實施方案中，所述抗cd70抗體是如本文所述的抗原結合片段(例如，人抗原結合片段)，并且包括但不限于fab、fab'和f(ab')2、fd、單鏈fv(scfv)、單鏈抗體、二硫鍵連接的fv(sdfv)和包含v
l
或vh結構域的片段。包含單鏈抗體的抗原結合片段可以包含單獨的或與以下全部或一部分組合的一個或多個可變區：鉸鏈區、ch1、ch2、ch3和cl結構域。本公開文本還包括抗原結合片段，所述抗原結合片段包含一個或多個可變區與鉸鏈區、ch1、ch2、ch3和cl結構域的任何組合。在一些實施方案中，所述抗cd70抗體或其抗原結合片段是人、鼠(例如，小鼠和大鼠)、驢、綿羊、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞的抗體。
[0128]
本公開文本的抗cd70抗體可以是單特異性、雙特異性、三特異性或具有更大的多
特異性。多特異性抗體可以對cd70的不同表位具有特異性，或者可以對cd70以及異源蛋白二者均具有特異性。參見例如pct公開案wo 93/17715；wo 92/08802；wo91/00360；wo 92/05793；tutt,等人,1991,j.immunol.147:60 69；美國專利號4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；kostelny等人,1992,j.immunol.148:1547 1553。
[0129]
本公開文本的抗cd70抗體可以是人源化抗體。在一些實施方案中，本公開文本的抗cd70抗體是小鼠抗體1f6的人源化抗體。1f6的人源化形式描述于美國專利號8,067,546中。人源化抗體是基因工程化抗體，其中來自非人“供體”抗體的cdr被移植到人“受體”抗體序列中(參見例如，queen,us 5,530,101和5,585,089；winter,us5,225,539；carter,us 6,407,213；adair,us 5,859,205；和foote,us 6,881,557)。所述受體抗體序列可以是例如成熟的人抗體序列、此類序列的復合物、人抗體序列的共有序列或種系區序列。對于重鏈，優選的受體序列是種系vh外顯子vhl-2(在文獻中也稱為hv1-2)(shin等人,1991,embo j.10:3641-3645)，并且對于鉸鏈區(jh)，優選的受體序列是外顯子j
h-6(mattila等人,1995,eur.j.immunol.25:2578-2582)。對于輕鏈，優選的受體序列是外顯子vk2-30(在文獻中也稱為kv2-30)，并且對于鉸鏈區，優選的受體序列是外顯子jk-4(hieter等人,1982,j.biol.chem.257:1516-1522)。因此，人源化抗體是具有完全或基本上來自供體抗體的一些或所有cdr以及全部或基本上來自人抗體序列的可變區框架序列和恒定區(如果存在的話)的抗體。類似地，人源化重鏈具有完全或基本上來自供體抗體重鏈的至少一個、兩個和通常所有三個cdr以及基本上來自人重鏈可變區框架和恒定區序列的重鏈可變區框架序列和重鏈恒定區(如果存在的話)。類似地，人源化輕鏈具有完全或基本上來自供體抗體輕鏈的至少一個、兩個和通常所有三個cdr以及基本上來自人輕鏈可變區框架和恒定區序列的輕鏈可變區框架序列和輕鏈恒定區(如果存在的話)。不同于納米抗體和dab，人源化抗體包含人源化重鏈和人源化輕鏈。當各自cdr之間至少60％、85％、90％、95％或100％的相應殘基(如kabat定義)相同時，人源化抗體中的cdr基本上來自非人抗體中的相應cdr。當由kabat定義的相應殘基的至少85％、90％、95％或100％相同時，抗體鏈的可變區框架序列或抗體鏈的恒定區分別基本上來自人可變區框架序列或人恒定區。
[0130]
盡管人源化抗體通常摻入來自小鼠抗體的所有六個cdr(優選地如kabat所定義)，但它們也可制備成具有來自小鼠抗體的少于所有cdr(例如，至少3、4或5個)的cdr(例如，pascalis等人,j.immunol.169:3076,2002；vajdos等人,journal of molecular biology,320:415-428,2002；iwahashi等人,mol.immunol.36:1079-1091,1999；tamura等人,journal of immunology,164:1432-1441,2000)。
[0131]
基于對cdr構象和/或與抗原結合的可能存在的影響，可以選擇來自人可變區框架殘基的某些氨基酸進行取代。對此類可能存在的影響的研究是通過建模、檢查特定位置處氨基酸的特征或對特定氨基酸的取代或誘變作用的經驗觀察進行的。
[0132]
例如，當鼠可變區框架殘基與選擇的人可變區框架殘基之間的氨基酸不同時，可以將人框架氨基酸取代為來自小鼠抗體的等效框架氨基酸，條件是合理地預期所述氨基酸：(1)直接非共價結合抗原，(2)與cdr區相鄰，(3)以其他方式與cdr區相互作用(例如，在cdr區的約6a內)；或者
(4)介導重鏈與輕鏈之間的相互作用。
[0133]
本公開文本的抗cd70抗體可以根據它們所包含的特定cdr來描述或詳細說明。給定cdr或fr的精確氨基酸序列邊界可以使用許多熟知的方案中的任一種容易地確定，包括以下中所述的那些：kabat等人(1991),“sequences of proteins of immunological interest,”第5版public health service,national institutes of health,貝塞斯達,馬里蘭州(“kabat”編號方案)；al-lazikani等人,(1997)jmb 273,927-948(“chothia”編號方案)；maccallum等人,j.mol.biol.262:732-745(1996),“antibody-antigen interactions:contact analysis and binding site topography,”j.mol.biol.262,732-745.”(“contact”編號方案)；lefranc mp等人,“imgt unique numbering for immunoglobulin and t cell receptor variable domains and ig superfamily v-like domains,”dev comp immunol,2003年1月；27(1):55-77(“imgt”編號方案)；honegger a和pl
ü
ckthun a,“yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,”j mol biol,2001年6月8號；309(3):657-70(“aho”編號方案)；以及martin等人,“modeling antibody hypervariable loops:a combined algorithm,”pnas,1989,86(23):9268-9272(“abm”編號方案)。給定cdr的邊界可以根據用于鑒定的方案而變化。在一些實施方案中，給定抗體或其區域(例如，其可變區)的“cdr”或“互補決定區”或單獨指定的cdr(例如，cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3)應理解為涵蓋如由任何上述方案所定義的一個(或特定)cdr。例如，在聲明特定的cdr(例如，cdr-h3)含有給定vh或v
l
區氨基酸序列中的相應cdr的氨基酸序列的情況下，應理解，這種cdr具有在可變區內的相應cdr(例如，cdr-h3)的序列，如由任何上述方案所定義的。可以指定用于鑒定特定的一個或多個cdr(如由kabat、chothia、abm或imgt方法定義的cdr)的方案。
[0134]
本文所述的抗cd70抗體和抗cd70抗體-藥物綴合物的cdr序列是根據kabat等人(1991),“sequences of proteins of immunological interest,”第5版public health service,national institutes of health,bethesda,md中所述的kabat編號方案，除非另有說明。
[0135]
在一方面，本文提供了抗cd70抗體，其包含含有seq id no:1的三個cdr的重鏈可變區和含有seq id no:2的三個cdr的輕鏈可變區，其中所述抗cd70抗體的cdr由kabat編號方案定義。在一些實施方案中，抗cd70抗體還包含fc結構域。在一些實施方案中，抗cd70抗體是非巖藻糖基化的。
[0136]
本文所述的抗cd70抗體可以包含任何合適的框架可變結構域序列，前提是所述抗體保留結合cd70(例如，人cd70)的能力。如本文所用，重鏈框架區稱為“hc-fr1-fr4”，而輕鏈框架區稱為“lc-fr1-fr4”。
[0137]
在本文所述的抗cd70抗體的一些實施方案中，重鏈可變結構域包含qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftnygmnwvrqapgqglkwmgwinty tgeptyadafkgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycardygdygmdywgq gttvtvss(seq id no:1)的氨基酸序列，并且輕鏈可變結構域包含divmtqspdslavslgeratincrasksvstsgysfmhwyqqkpgqppklliylasnl es gvpdrfsgsg sgtdftltisslqaedvavyycqhsrevpwtfgqgtkveik(seq id no:2)的氨基酸序列。
[0138]
在本文所述的抗cd70抗體的一些實施方案中，重鏈可變結構域包含qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftnygmnwvrqapgqglkwmgwinty tgeptyadafkgrvtmtrdtsistaymelsrl
rsddtavyycardygdygmdywgq gttvtvss(seq id no:1)的氨基酸序列，并且輕鏈可變結構域包含divmtqspdslavslgeratincrasksvstsgysfmhwyqqkpgqppklliylasnl es gvpdrfsgsg sgtdftltisslqaedvavyycqhsrevpwtfgqgtkveikr(seq id no:7)的氨基酸序列。
[0139]
在一個方面，本文提供了抗cd70抗體，其包含含有seq id no:1的氨基酸序列的重鏈可變結構域或包含含有seq id no:2的氨基酸序列的輕鏈可變結構域。在一些實施方案中，所述重鏈可變結構域的n末端谷氨酰胺被環化以形成焦谷氨酸。在一個方面，本文提供了抗cd70抗體，其包含含有seq id no:1的氨基酸序列的重鏈可變結構域和包含含有seq id no:2的氨基酸序列的輕鏈可變結構域。在一些實施方案中，所述重鏈可變結構域的n末端谷氨酰胺被環化以形成焦谷氨酸。
[0140]
在一個方面，本文提供了抗cd70抗體，其包含含有seq id no:1的氨基酸序列的重鏈可變結構域或包含含有seq id no:7的氨基酸序列的輕鏈可變結構域。在一些實施方案中，所述重鏈可變結構域的n末端谷氨酰胺被環化以形成焦谷氨酸。在一個方面，本文提供了抗cd70抗體，其包含含有seq id no:1的氨基酸序列的重鏈可變結構域和包含含有seq id no:7的氨基酸序列的輕鏈可變結構域。在一些實施方案中，所述重鏈可變結構域的n末端谷氨酰胺被環化以形成焦谷氨酸。
[0141]
在一些實施方案中，本文提供了抗cd70抗體，其包含含有與seq id no:1的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列的重鏈可變結構域。在一些實施方案中，所述重鏈可變結構域的n末端谷氨酰胺被環化以形成焦谷氨酸。在某些實施方案中，包含與seq id no:1的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列的重鏈可變結構域含有相對于參考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，并保留與cd70(例如，人cd70)結合的能力。在某些實施方案中，在seq id no:1中總共1至10個氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些實施方案中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5個氨基酸)發生在cdr之外的區域中(即在fr中)。在一些實施方案中，所述抗cd70抗體包含seq id no:1的重鏈可變結構域序列，其包括該序列的翻譯后修飾。在一些實施方案中，所述重鏈可變結構域的n末端谷氨酰胺被環化以形成焦谷氨酸。
[0142]
在一些實施方案中，本文提供了包含輕鏈可變結構域的抗cd70抗體，所述輕鏈可變結構域包含與seq id no:2的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些實施方案中，包含與seq id no:2的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列的輕鏈可變結構域含有相對于參考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，并保留與cd70(例如，人cd70)結合的能力。在某些實施方案中，在seq id no:2中總共1至10個氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些實施方案中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5個氨基酸)發生在cdr之外的區域中(即在fr中)。在一些實施方案中，所述抗cd70抗體包含seq id no:2的輕鏈可變結構域序列，其包括該序列的翻譯后修飾。
[0143]
在一些實施方案中，本文提供了包含輕鏈可變結構域的抗cd70抗體，所述輕鏈可變結構域包含與seq id no:7的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些實施方案中，包含與seq id no:5的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列的輕鏈可變結構域含有相對于參考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，并保留與cd70(例如，人cd70)結合的能力。在某些實施方案中，在seq id no:7中總共1至10個氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些實施方案中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5個氨基酸)發生在cdr之外的區域中(即在fr中)。在一些實施方案中，所述抗cd70抗體包含seq id no:7的輕鏈可變結構域序列，其包括該序列的翻譯后修飾。
[0144]
在一些實施方案中，本文提供了包含如下重鏈的抗cd70抗體，所述重鏈包含與氨基酸序列qvqlvqsgae vkkpgasvkv sckasgytft nygmnwvrqa pgqglkwmgw intytgepty adafkgrvtm trdtsistay melsrlrsdd tavyycardy gdygmdywgq gttvtvssas tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk(seq id no:3)具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些實施方案中，包含與seq id no:3的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列的重鏈含有相對于參考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，并保留與cd70(例如，人cd70)結合的能力。在某些實施方案中，在seq id no:3中總共1至10個氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些實施方案中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5個氨基酸)發生在cdr之外的區域中(即在fr中)。在一些實施方案中，所述抗cd70抗體包含seq id no:3的重鏈序列，其包括該序列的翻譯后修飾。
[0145]
在一些實施方案中，本文提供了包含如下輕鏈的抗cd70抗體，所述輕鏈包含與divmtqspds lavslgerat incrasksvs tsgysfmhwy qqkpgqppkl liylasnles gvpdrfsgsg sgtdftltis slqaedvavy ycqhsrevpw tfgqgtkvei krtvaapsvf ifppsdeqlk sgtasvvcll nnfypreakv qwkvdnalqs gnsqesvteq dskdstysls stltlskady ekhkvyacev thqglsspvt ksfnrgec(seq id no:4)的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些實施方案中，包含與seq id no:4的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列的輕鏈含有相對于參考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，并保留與cd70(例如，人cd70)結合的能力。在某些實施方案中，在seq id no:4中總共1至10個氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些實施方案中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5個氨基酸)發生在cdr之外的區域中(即在fr中)。在一些實施方案中，所述抗cd70抗體包含seq id no:4的輕鏈序列，其包括該序列的翻譯后修飾。
[0146]
在一些實施方案中，抗cd70抗體包含如上文提供的任何實施方案中的重鏈可變結構域和如上文提供的任何實施方案中的輕鏈可變結構域。在一個實施方案中，所述抗體包
含seq id no:1的重鏈可變結構域序列和seq id no:2的輕鏈可變結構域序列，其包括那些序列的翻譯后修飾。在一些實施方案中，所述重鏈可變結構域的n末端谷氨酰胺被環化以形成焦谷氨酸。
[0147]
在一些實施方案中，抗cd70抗體包含：i)與包含seq id no:1的氨基酸序列的重鏈可變區具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，和ii)與包含seq id no:2的氨基酸序列的輕鏈可變區具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述重鏈可變結構域的n末端谷氨酰胺被環化以形成焦谷氨酸。
[0148]
在一些實施方案中，所述抗cd70抗體是單克隆抗體。
[0149]
在一些實施方案中，抗cd70抗體包含重鏈可變區或輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含美國專利號8,067,546、美國專利號8,562,987、美國專利號9,428,585、美國專利號9,701,752、us 2009/0148942、us 2012/0045436、us 2014/0178936、us 2017/0022282或國際專利公開案wo 2006/113909中所述的抗cd70抗體的三個cdr，所述輕鏈可變區包含以上文獻中所述的抗cd70抗體的三個cdr。在一些實施方案中，抗cd70抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含美國專利號8,067,546、美國專利號8,562,987、美國專利號9,428,585、美國專利號9,701,752、us 2009/0148942、us 2012/0045436、us2014/0178936、us 2017/0022282或國際專利公開案wo 2006/113909中所述的抗cd70抗體的三個cdr，所述輕鏈可變區包含以上文獻中所述的抗cd70抗體的三個cdr。在一些實施方案中，cdr由kabat編號方案定義。
[0150]
在一些實施方案中，抗cd70抗體包含美國專利號8,067,546、美國專利號8,562,987、美國專利號9,428,585、美國專利號9,701,752、us 2009/0148942、us2012/0045436、us 2014/0178936、us 2017/0022282或國際專利公開案wo 2006/113909中所述的抗cd70抗體的重鏈可變區或輕鏈可變區。在一些實施方案中，抗cd70抗體包含美國專利號8,067,546、美國專利號8,562,987、美國專利號9,428,585、美國專利號9,701,752、us 2009/0148942、us 2012/0045436、us 2014/0178936、us 2017/0022282或國際專利公開案wo 2006/113909中所述的抗cd70抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區。
[0151]
在一些實施方案中，抗cd70抗體是抗cd70抗體，如人源化1f6變體，如美國專利號8,067,546、美國專利號8,562,987、美國專利號9,428,585、美國專利號9,701,752、us 2009/0148942、us 2012/0045436、us 2014/0178936、us 2017/0022282或國際專利公開案wo 2006/113909中所述。
[0152]
在一些實施方案中，抗cd70抗體包含含有抗cd70抗體沃瑟妥珠單抗的三個cdr的重鏈可變區或含有抗cd70抗體沃瑟妥珠單抗的三個cdr的輕鏈可變區。在一些實施方案中，抗cd70抗體包含含有抗cd70抗體沃瑟妥珠單抗的三個cdr的重鏈可變區和含有抗cd70抗體沃瑟妥珠單抗的三個cdr的輕鏈可變區。在一些實施方案中，cdr由kabat編號方案定義。
[0153]
在一些實施方案中，抗cd70抗體包含抗cd70抗體沃瑟妥珠單抗的重鏈可變區或輕鏈可變區。在一些實施方案中，抗cd70抗體包含抗cd70抗體沃瑟妥珠單抗的重鏈可變區和輕鏈可變區。
[0154]
在一些實施方案中，抗cd70抗體是沃瑟妥珠單抗(vorsetuzumab)。
[0155]
本發明的抗cd70抗體也可以根據其與cd70(例如人cd70)的結合親和力來進行描述或指定。優選的結合親和力包括解離常數或kd小于5x10-2
m、10-2
m、5x10-3
m、10-3
m、5x10-4
m、
10-4
m、5x10-5
m、10-5
m、5x10-6
m、10-6
m、5x10-7
m、10-7
m、5x10-8
m、10-8
m、5x10-9
m、10-9
m、5x10-10
m、10-10
m、5x10-11
m、10-11
m、5x10-12
m、10-12
m、5x10-13
m、10-13
m、5x10-14
m、10-14
m、5x10-15
m、或10-15
m的那些。
[0156]
存在五類免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg和igm，具有分別稱為α、δ、ε、γ和μ的重鏈。γ和α類別被進一步分為多個亞類，例如，人表達以下亞類：igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。igg1抗體可以以多種稱為同種異型的多態變體(綜述于jefferis和lefranc 2009.mabs第1卷第4期1-7中)存在，其中的任一種適用于本文的一些實施方案中。人體中的常見同種異型變體是通過字母a、f、n、z或其組合命名的那些。在本文的任一個實施方案中，抗體可以包含含有人igg fc區的重鏈fc區。在另外的實施方案中，所述人igg fc區包含人igg1。
[0157]
在一些實施方案中，抗cd70抗體包含如上文提供的任何實施方案中的重鏈可變結構域和如上文提供的任何實施方案中的輕鏈可變結構域。在一個實施方案中，抗體包含重鏈恒定區和輕鏈恒定區，所述重鏈恒定區包含as tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk(seq id no:5)的氨基酸序列，所述輕鏈恒定區包含tvaapsvf ifppsdeqlk sgtasvvcll nnfypreakv qwkvdnalqs gnsqesvteq dskdstysls stltlskady ekhkvyacev thqglsspvt ksfnrgec(seq id no:6)的氨基酸序列，包括那些序列的翻譯后修飾。
[0158]
抗體還包括經修飾的衍生物，所述修飾即通過任何類型的分子與抗體共價附接，使得共價附接不會阻止抗體與cd70結合或對細胞發揮細胞抑制或細胞毒性作用。例如但非限制性地，抗體衍生物包括已經例如通過以下方式修飾的抗體：糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通過已知的保護/阻斷基團衍生化、蛋白水解切割、與細胞配體或其他蛋白質連接等。可以通過已知技術進行多種化學修飾中的任何一種，所述已知技術包括但不限于特異性化學切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代謝合成等。此外，衍生物可以含有一種或多種非經典氨基酸。
[0159]
cd70結合劑可任選地包括介導或刺激針對表達cd70的靶細胞的adcc、adcp和/或cdc反應的抗體效應子結構域。一個或多個效應子結構域可以是例如ig分子的一個或多個fc結構域。例如在表達cd70的癌癥或免疫障礙中，這樣的cd70結合劑可以對應地對表達cd70的癌細胞發揮細胞毒性或細胞抑制作用，或對激活的淋巴細胞或樹突細胞發揮細胞毒性、細胞抑制或免疫調節作用。典型地，cd70結合劑募集和/或激活細胞毒性白細胞(例如自然殺傷(nk)細胞、吞噬細胞(例如巨噬細胞)和/或血清補體組分)。
[0160]
抗cd70抗體可以是人源化抗體、單鏈抗體、scfv、雙抗體、fab、微型抗體、scfv-fc、fv等。在一些實施方案中，cd70抗原結合區可以連接到一個或多個效應子結構域(例如免疫球蛋白的鉸鏈-ch2-ch3結構域)，或具有效應子功能的一個或多個效應子結構域的部分或片段。抗原結合抗體片段(包括單鏈抗體)可包含例如與效應子結構域(例如單獨的或與ch1、鉸鏈和/或c
l
結構域組合的ch2和/或ch3結構域)的全部或部分組合的一個或多個可變區。此
外，抗原結合片段可包含效應子結構域的任何組合。在一些實施方案中，抗cd70抗體可以是包含連接到鉸鏈-ch2-ch3結構域的cd70結合可變區的單鏈抗體。
[0161]
抗cd70抗體的效應子結構域可以來自任何合適的人免疫球蛋白同種型。例如，人免疫球蛋白介導cdc和adcc/adcp的能力通常分別依序為igm≈igg1≈igg3》igg2》igg4和igg1≈igg3》igg2/igm/igg4。cd70結合多肽可表達為包含適當恒定結構域的重組融合蛋白，以產生一種或多種所需效應子功能。當與靶細胞結合時，抗cd70抗體或衍生物可通過抗體效應子功能如adcc、cdc和adcp在體外和體內觸發靶細胞破壞。
[0162]
cd70結合劑可任選地綴合至劑，如細胞毒性劑、細胞抑制劑或免疫調節劑。有用類別的細胞毒性劑或免疫調節劑包括例如抗微管蛋白劑、澳瑞他汀、dna小溝結合劑、dna復制抑制劑、烷基化劑(例如，鉑絡合物，如順鉑、單(鉑)、雙(鉑)和三核鉑絡合物和卡鉑)、蒽環類、抗生素、抗葉酸、抗代謝物、化學療法增敏劑、倍癌霉素、依托泊苷、氟化嘧啶、離子載體、萊克西菌素、亞、順氯氨鉑、預形成化合物、嘌呤抗代謝物、嘌呤霉素、放射增敏劑、類固醇、紫杉烷、拓撲異構酶抑制劑、長春花生物堿等。在一些典型的實施方案中，劑是細胞毒性劑。合適的細胞毒性劑包括例如多拉司他汀(例如，澳瑞他汀e、afp、mmaf、mmae)、dna小溝結合劑(例如，烯二炔類和萊克西菌素)、倍癌霉素、紫杉烷(例如，紫杉醇和多西紫杉醇)、嘌呤霉素、長春花生物堿、cc-1065、sn-38、拓撲替康、嗎啉代-多柔比星、根霉素、氰基嗎啉代-多柔比星、棘霉素、考布他汀、紡錘菌素、埃博霉素a和b、雌莫司汀、隱藻素、西馬多汀、類美登素、盤皮海綿內酯、艾榴塞洛素和米托蒽醌。在具體的實施方案中，細胞毒性劑或細胞抑制劑是澳瑞他汀e(在本領域中也稱為多拉司他汀-10)或其衍生物。典型地，澳瑞他汀e衍生物是例如在澳瑞他汀e和酮酸之間形成的酯。例如，澳瑞他汀e可以與對乙酰基苯甲酸或苯甲酰基戊酸反應，從而分別產生aeb和aevb。其他典型的澳瑞他汀衍生物包括afp、mmaf和mmae。澳瑞他汀e及其衍生物的合成和結構描述于美國專利申請公開號20030083263和20050009751、國際專利申請號pct/us03/24209、國際專利申請號pct/us02/13435和美國專利號6,323,315；6,239,104；6,034,065；5,780,588；5,665,860；5,663,149；5,635,483；5,599,902；5,554,725；5,530,097；5,521,284；5,504,191；5,410,024；5,138,036；5,076,973；4,986,988；4,978,744；4,879,278；4,816,444；和4,486,414中。在具體的實施方案中，細胞毒性劑是dna小溝結合劑。(例如參見美國專利號6,130,237。)例如，在一些實施方案中，小溝結合劑是cbi化合物。在其他實施方案中，小溝結合劑是烯二炔(例如卡奇霉素)。抗微管蛋白劑的例子包括但不限于紫杉烷(例如，(紫杉醇))、(多西紫杉醇)、t67(tularik)、長春花生物堿(例如，長春新堿、長春堿、長春地辛和長春瑞濱)和多拉司他汀(例如，澳瑞他汀e、afp、mmaf、mmae、aeb、aevb)。其他抗微管蛋白劑包括例如巴卡丁衍生物、紫杉烷類似物(例如，埃博霉素a和b)、諾考達唑、秋水仙堿和秋水仙胺、雌莫司汀、隱藻素(cryptophysin)、西馬多汀、類美登素、康普瑞汀、盤皮海綿內酯和艾榴塞洛素。在一些實施方案中，細胞毒性劑是類美登素，另一組抗微管蛋白劑。例如，在具體的實施方案中，類美登素是美登素或dm-1(immunogen,inc.；也參見chari等人,1992,cancer res.52:127-131)。
[0163]
在一些實施方案中，抗cd70抗體可以是嵌合的，包含人或非人fc區或其部分。例如，抗體可以包括非人來源的fc結構域或部分，例如嚙齒動物(例如小鼠或大鼠)、驢、綿羊、兔、山羊、豚鼠、駱駝科動物、馬、雞或猴(例如獼猴、恒河猴等)。
[0164]
抗cd70結合劑(如抗體)可以是單特異性的、雙特異性的、三特異性的或具有更多特異性。多特異性抗體可以對cd70的不同表位具有特異性，和/或可以對cd70以及異源蛋白二者均具有特異性。(參見例如，pct公開案wo 93/17715、wo 92/08802、wo 91/00360和wo 92/05793；tutt等人,1991,j.immunol.147:60-69；美國專利號4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；和5,601,819；kostelny等人,1992,j.immunol.148:1547-1553。)可用于實踐本文所述方法的多特異性抗體(包括雙特異性和三特異性抗體)是免疫特異性地結合cd70(包括但不限于具有單克隆抗體1f6的cdr的抗體)和介導adcc、adcp和/或cdc的第二細胞表面受體或受體復合物(如cd16/fcγriii、cd64/fcγri、殺傷抑制或激活受體或補體控制蛋白cd59)的抗體。在一些實施方案中，多特異性抗體的部分與第二細胞表面分子或受體復合物的結合可增強抗cd70抗體或其他cd70結合劑的效應子功能。
[0165]
抗體可通過本領域中已知的方法來生成。例如，可以使用本領域中已知的各種技術來制備單克隆抗體，所述各種技術包括例如使用雜交瘤、重組體及噬菌體展示技術或其組合。雜交瘤技術一般論述于例如harlow等人,antibodies:a laboratory manual(cold spring harbor laboratory press,第2版,1988)；和hammerling等人,monoclonal antibodies and t-cell hybridomas,第563-681頁(elsevier,n.y.,1981)中。可用于制備抗cd70抗體的噬菌體展示方法的例子包括例如以下中披露的那些：hoogenboom和winter,1991,j.mol.biol.227:381；marks等人,1991,j.mol.biol.222:581；quan和carter,2002,the rise of monoclonal antibodies as therapeutics in anti-ige and allergic disease,jardieu和fick jr.,編,marcel dekker,new york,ny,第20章,第427-469頁；brinkman等人,1995,j.immunol.methods 182:41-50；ames等人,1995,j.immunol.methods 184:177-186；kettleborough等人,1994,eur.j.immunol.24:952-958；persic等人,1997,gene 187:9-18；burton等人,1994,advances in immunology 57:191-280；pct申請號pct/gb91/01134；pct公開案wo90/02809、wo 91/10737、wo 92/01047、wo 92/18619、wo 93/11236、wo 95/15982、wo 95/20401和美國專利號5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108(其披露內容通過引用并入本文)。
[0166]
可用于產生單鏈抗體的技術的例子包括美國專利4,946,778和5,258,498；huston等人,1991,methods in enzymology 203:46-88；shu等人,1993,proc.natl.acad.sci.usa90:7995-7999；和skerra等人,1988,science 240:1038-1040中所述的那些。
[0167]
制備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。全長雙特異性抗體的傳統產生基于兩條免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達來進行，其中所述兩條鏈具有不同的特異性(參見例如，milstein等人,1983,nature 305:537-39)。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadromas))產生10種不同的抗體分子的潛在混合物，其中一些具有正確的雙特異性結構。在國際公開號wo 93/08829和traunecker等人,1991,embo j.10:3655-59中披露了相似的程序。
[0168]
根據不同的方法，將具有所需結合特異性的抗體可變結構域(抗體-抗原結合位點)與免疫球蛋白恒定結構域序列融合。融合物典型地具有免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其包含鉸鏈區、ch2區和ch3區的至少一部分。在一些實施方案中，融合物包括存在于至少一種
融合物中的含有輕鏈結合所必需的位點的第一重鏈恒定區(ch1)。將具有編碼免疫球蛋白重鏈融合物和(如果需要的話)免疫球蛋白輕鏈的序列的核酸插入單獨的表達載體中，并且共轉染到合適的宿主生物體中。當構建中所使用的不等比率的三條多肽鏈提供最佳產率時，這在實施方案中為調整三個多肽片段的相互比例提供極大的靈活性。然而，當相等比率的至少兩條多肽鏈的表達產生高產率時或當比率不是特別重要時，可能將兩條或全部三條多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體中。
[0169]
在此方法的一個實施方案中，雙特異性抗體具有一條臂中的具有第一結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一條臂中的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)。這種不對稱結構促進了所需雙特異性化合物從不需要的免疫球蛋白鏈組合中的分離，因為僅在雙特異性分子的一半中存在免疫球蛋白輕鏈提供了容易的分離方式(參見例如，國際公開號wo 94/04690，其通過引用以其整體并入本文)。
[0170]
對于雙特異性抗體的進一步討論，參見例如，suresh等人,1986,methods in enzymology 121:210；rodrigues等人,1993,j.immunology 151:6954-61；carter等人,1992,bio/technology 10:163-67；carter等人,1995,j.hematotherapy 4:463-70；merchant等人,1998,nature biotechnology 16:677-81。使用此類技術，可以制備雙特異性抗體用于或預防本文定義的疾病。
[0171]
雙功能抗體也描述于歐洲專利公開號epa 0 105 360中。如該參考文獻中公開的，雜合或雙功能抗體可以通過生物學方式(即通過細胞融合技術)或化學方式(尤其是使用交聯劑或二硫橋形成試劑)獲得，并且可以包含完整抗體或其片段。獲得此類雜合抗體的方法披露于例如國際公開案wo 83/03679和歐洲專利公開號epa 0 217 577中，兩者均通過引用并入本文。
[0172]
在一些實施方案中，人框架區中的框架殘基將被來自cdr供體抗體的對應殘基取代以改變或優選改善抗原結合。這些框架取代是通過本領域中熟知的方法來鑒定的，例如，通過對cdr和框架殘基的相互作用建模以鑒定對于抗原結合而言重要的框架殘基，以及通過序列比較以鑒定在特定位置的不尋常的框架殘基。(參見例如，美國專利號5,585,089；riechmann等人,1988,nature 332:323)。可以使用本領域已知的多種技術將抗體人源化，包括例如cdr-移植(參見例如，ep 0 239 400；pct公開案wo 91/09967；美國專利號5,225,539；5,530,101；和5,585,089)、飾面或表面重修(參見例如，ep 0 592106；ep 0 519 596；padlan,1991,molecular immunology 28(4/5):489-498；studnicka等人,1994,protein engineering 7(6):805-814；roguska等人,1994,proc.natl.acad.sci.usa91:969-973)、和鏈改組(參見例如，美國專利號5,565,332)(所有這些參考文獻通過引用并入本文)。
[0173]
人源化單克隆抗體可以通過本領域已知的重組dna技術產生，例如使用以下中所述的方法：國際公開號wo 87/02671；歐洲專利公開號0 184 187；歐洲專利公開號0171 496；歐洲專利公開號0 173 494；國際公開號wo 86/01533；美國專利號4,816,567；歐洲專利公開號0 012 023；berter等人,1988,science 240:1041-43；liu等人,1987,proc.natl.acad.sci.usa 84:3439-43；liu等人,1987,j.immunol.139:3521-26；sun等人,1987,proc.natl.acad.sci.usa 84:214-18；nishimura等人,1987,cancer.res.47:999-1005；wood等人,1985,nature 314:446-449；shaw等人,1988,j.natl.cancer inst.80:1553-59；morrison,1985,science 229:1202-07；oi等人,1986,biotechniques 4:214；美
國專利號5,225,539；jones等人,1986,nature 321:552-25；verhoeyan等人,1988,science 239:1534；和beidler等人,1988,j.immunol.141:4053-60，其中的每一個都通過引用以其整體并入本文。
[0174]
如上所述，cd70結合劑可以是抗cd70抗體的衍生物。通常，抗cd70抗體衍生物包含抗cd70抗體(包括例如抗原結合片段或保守取代的多肽)和至少一個與抗cd70抗體異源的多肽區或其他部分。例如，可以修飾抗cd70抗體，例如通過共價附接任何類型的分子。典型的修飾包括例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通過已知的保護/封閉基團進行衍生化、蛋白水解切割、與細胞配體(例如白蛋白結合分子)或其他蛋白質連接等。許多化學修飾中的任一種可以通過已知技術進行，包括但不限于特異性化學切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代謝合成等。
[0175]
在一些實施方案中，共價附接不干擾效應子功能，例如不防止抗體衍生物通過抗原結合區或其衍生區域特異性結合cd70，或不防止一個或多個效應子結構域特異性結合fc受體。
[0176]
在一些實施方案中，抗體衍生物是包含一個或多個單體的多聚體，例如二聚體，其中每個單體包括(i)抗cd70抗體的抗原結合區，或由其衍生的多肽區(例如通過一個或多個氨基酸的保守取代)，和(ii)多聚化(例如二聚化)多肽區，使得抗體衍生物形成特異性結合cd70的多聚體(例如同二聚體)。在典型的實施方案中，抗cd70抗體的抗原結合區或由其衍生的多肽區與異源蛋白以重組或化學方式融合，其中所述異源蛋白包含二聚化或多聚化結構域。在出于或預防免疫障礙或表達cd70的癌癥的目的而將抗體衍生物施用于受試者之前，使衍生物經受允許形成同二聚體或異二聚體的條件。如本文所用，異二聚體可包含相同的二聚化結構域但不同的cd70抗原結合區，相同的cd70抗原結合區但不同的二聚化結構域，或不同的cd70抗原結合區和二聚化結構域。
[0177]
典型的二聚化結構域是源自轉錄因子的那些。在一個實施方案中，二聚化結構域是堿性區亮氨酸拉鏈(“bzip”)的二聚化結構域(參見vinson等人,1989,science246:911-916)。有用的亮氨酸拉鏈結構域包括例如酵母轉錄因子gcn4、哺乳動物轉錄因子ccaat/增強子結合蛋白c/ebp、和癌基因核轉化產物fos和jun的那些。(參見例如，landschultz等人,1988,science 240:1759-64；baxevanis和vinson,1993,curr.op.gen.devel.3:278-285；o’shea等人,1989,science 243:538-542。)在另一個實施方案中，二聚化結構域是堿性區螺旋-環-螺旋(“bhlh”)蛋白的二聚化結構域。(參見例如，murre等人,1989,cell 56:777-783。還參見davis等人,1990,cell 60:733-746；voronova和baltimore,1990,proc.natl.acad.sci.usa 87:4722-26。)特別有用的hhlh蛋白是myc、max和mac。
[0178]
在又其他實施方案中，二聚化結構域是免疫球蛋白恒定區，例如重鏈恒定區或其結構域(例如ch1結構域、ch2結構域和/或ch3結構域)。(參見例如，美國專利號5,155,027；5,336,603；5,359,046；和5,349,053；ep 0 367 166；和wo 96/04388。)
[0179]
已知異二聚體在fos與jun之間形成(bohmann等人,1987,science238:1386-1392)，在atf/creb家族的成員中形成(hai等人,1989,genes dev.3:2083-2090)，在c/ebp家族的成員中形成(cao等人,1991,genes dev.5:1538-52；williams等人,1991,genes dev.5:1553-67；roman等人,1990,genes dev.4:1404-15)，和在atf/creb與fos/jun家族的成員之間形成(hai和curran,1991,proc.natl.acad.sci.usa88:3720-24)。因此，當將cd70
結合蛋白作為包含不同二聚化結構域的異二聚體施用于受試者時，可以使用前述的任何組合。
[0180]
在其他實施方案中，抗cd70抗體衍生物是與第二抗體綴合的抗cd70抗體(“抗體異源綴合物”)(參見例如，美國專利號4,676,980)。可用于實踐本發明方法的異源綴合物包含結合cd70的抗體(例如，具有單克隆抗體1f6的cdr和/或重鏈的抗體)和結合介導adcc、吞噬作用和/或cdc的表面受體或受體復合物(如cd16/fcgriii、cd64/fcgri、殺傷細胞激活或抑制受體、或補體控制蛋白cd59)的抗體。在一個典型的實施方案中，多特異性抗體的部分與第二細胞表面分子或受體復合物的結合增強抗cd70抗體的效應子功能。在其他實施方案中，抗體可以是劑。本文描述了合適的抗體劑。
[0181]
在一些實施方案中，本文所述的任何抗cd70抗體是非巖藻糖基化的。
[0182]
在一些實施方案中，本文提供了包含多種如本文所述的抗cd70抗體的抗cd70抗體體，其中抗cd70抗體體中的抗cd70抗體具有降低的核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，抗cd70抗體體中至少20％的抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，抗cd70抗體體中至少30％的抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，抗cd70抗體體中至少40％的抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，抗cd70抗體體中至少50％的抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，抗cd70抗體體中至少60％的抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，抗cd70抗體體中至少70％的抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，抗cd70抗體體中至少80％的抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，抗cd70抗體體中至少90％的抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，抗cd70抗體體中至少95％的抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，抗cd70抗體體中至少98％的抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，抗cd70抗體體中至少99％的抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，抗cd70抗體體中至少99.5％的抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，抗cd70抗體體中基本上沒有(即小于0.5％)抗體具有核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，抗cd70抗體體中的所有抗體缺乏核心巖藻糖基化。
[0183]
如美國專利號10,196,445中所述，抗體糖基化的修飾可以通過例如在具有改變的糖基化機制的宿主細胞中表達抗體來實現。已經描述了具有改變的糖基化機制的細胞，并且可以將其用作表達本公開文本的重組抗體的宿主細胞，從而產生具有改變的糖基化的抗體。例如，細胞系ms704、ms705和ms709缺乏巖藻糖基轉移酶基因，fut8(α-(1,6)巖藻糖基轉移酶(參見美國專利申請公開號20040110704；yamane-ohnuki等人(2004)biotechnol.bioeng.87:614)，使得在這些細胞系中表達的抗體在其碳水化合物上缺乏巖藻糖。作為另一個例子，ep 1176195還描述了具有功能性破壞的fut8基因的細胞系以及將巖藻糖添加到結合抗體fc區的n-乙酰葡糖胺的活性很小或沒有的細胞系，例如大鼠骨髓瘤細胞系yb2/0(atcc crl 1662)。pct公開案wo 03/035835描述了變體cho細胞系lec13，其具有降低的將巖藻糖附接至asn(297)連接的碳水化合物的能力，還導致了在該宿主細胞中表達的抗體的低巖藻糖基化。還參見shields等人(2002)j.biol.chem.277:26733。具有修飾的糖基化譜的抗體也可以在雞蛋中產生，如pct公開號wo2006/089231中所述。可替代地，可以在植物細胞如浮萍屬(lemna)中產生具有修飾的糖基化譜的抗體。參見例如美國公開號2012/0276086。pct公開號wo 99/54342描述了如下細胞系，其被工程化為表達修飾糖蛋白
的糖基轉移酶(例如，β(1,4)-n-乙酰葡糖胺轉移酶iii(gntiii))，使得在工程化細胞系中表達的抗體展現出增加的二分型glcnac結構，這導致抗體的adcc活性增加。還參見等人(1999)nat.biotech.17:176。可替代地，抗體的巖藻糖殘基可使用巖藻糖苷酶切割掉。例如，酶α-l-巖藻糖苷酶從抗體中除去巖藻糖基殘基。tarentino等人(1975)biochem.14:5516。具有降低的核心巖藻糖基化的抗體可通過在已經使用基因敲除、基因敲入或rnai經工程化以降低核心巖藻糖基化的細胞系中產生抗體來制備。作用于糖基化途徑中的酶的小分子抑制劑也可用于產生具有降低的核心巖藻糖基化的抗體。在美國專利號8,163,551中描述了此類方法。在一些實施方案中，如本文所述的具有降低的核心巖藻糖基化的抗cd70抗體通過在包含有效量的巖藻糖類似物的培養基中培養表達所述抗體的宿主細胞來產生，所述巖藻糖類似物降低了巖藻糖向由宿主細胞產生的抗體或抗體衍生物的復合n-糖苷連接糖鏈中的摻入。參見美國專利號8,163,551。pereira等人(2018)mabs 10(5):693-711也描述了產生非巖藻糖基化抗體的方法。
[0184]
在一些實施方案中，抗cd70抗體或其衍生物競爭性抑制mab 1f6與cd70的結合，如通過本領域已知的用于測定競爭性結合的任何方法(例如本文所述的免疫測定)所測定。在典型的實施方案中，抗體競爭性抑制1f6與cd70的結合至少50％、至少60％、至少70％或至少75％。在其他實施方案中，抗體競爭性抑制1f6與cd70的結合至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
[0185]
可通過各種已知方法中的任一種測定抗體與cd70的特異性結合。可以使用的免疫測定包括例如，使用諸如蛋白質印跡等技術的競爭性和非競爭性測定系統、放射免疫測定、elisa(酶聯免疫吸附測定)、“夾心”免疫測定、免疫沉淀測定、沉淀素反應、凝膠擴散沉淀素反應、免疫擴散測定、凝集測定、補體結合測定、免疫放射測定、熒光免疫測定和蛋白a免疫測定。此類測定是常規的并且是本領域熟知的。(參見例如，ausubel等人編,short protocols in molecular biology(john wiley and sons,inc.,紐約,第4版1999)；harlow和lane,using antibodies:a laboratory manual(cold spring harbor laboratory press,冷泉港,紐約州,1999)。
[0186]
此外，抗體與cd70的結合親和力以及抗體cd70相互作用的解離速率可以通過競爭性結合測定來確定。競爭性結合測定的一個例子是放射免疫測定，其包括在漸增量的未經標記的cd70的存在下，將經標記的cd70(例如3h或
125
i)與目的抗體一起孵育，并且檢測與經標記的cd70結合的抗體。然后，抗體與cd70的親和力和結合解離速率可以通過scatchard圖分析的數據來測定。與第二抗體(例如mab 1f6)的競爭也可以使用放射免疫測定來測定。在這種情況下，在漸增量的未經標記的第二抗體的存在下，將cd70與目的抗體一起孵育，所述目的抗體與經標記的化合物(例如，3h或
125
i)綴合。可替代地，抗體與cd70的結合親和力以及抗體-cd70相互作用的結合和解離速率可以通過表面等離子體共振來測定。在一些實施方案中，抗cd70抗體或其衍生物可以靶向并積聚在表達cd70的細胞的膜上。
[0187]
抗cd70抗體及其衍生物可通過本領域已知的用于合成蛋白質的方法來產生，典型地例如通過重組表達技術來產生。與cd70結合的抗體或其衍生物的重組表達典型地包括構建含有編碼抗體或其衍生物的核酸的表達載體。可以使用本領域已知的技術通過重組dna技術來產生用于產生蛋白質分子的載體。標準技術例如在sambrook和russell,molecular cloning:a laboratory manual(cold spring harbor laboratory press,冷泉港,紐約
州,第3版,2001)；sambrook等人,molecular cloning:a laboratory manual(cold spring harbor laboratory press,冷泉港,紐約州,第2版,1989)；short protocols in molecular biology(ausubel等人,john wiley and sons,紐約,第4版,1999)；以及glick和pasternak,molecular biotechnology:principles and applications of recombinant dna(asm press,華盛頓,第2版,1998)中描述的那些可以用于重組核酸方法、核酸合成、細胞培養、轉基因摻入和重組蛋白表達。
[0188]
例如，對于抗cd70抗體的重組表達，表達載體可以編碼所述抗體的重鏈或輕鏈，或重鏈或輕鏈可變結構域，其可操作地連接至啟動子。表達載體可以包括例如編碼抗體分子的恒定區的核苷酸序列(參見例如，pct公開案wo 86/05807；pct公開案wo89/01036；和美國專利號5,122,464)，并且可以將抗體的可變結構域克隆到這種載體中以表達整個重鏈或輕鏈。通過常規技術將表達載體轉移到宿主細胞中，然后通過常規技術培養轉染的細胞以產生抗cd70抗體。在用于表達雙鏈抗體的典型實施方案中，可以在宿主細胞中共表達編碼重鏈和輕鏈的載體以表達整個免疫球蛋白分子。
[0189]
多種原核和真核宿主表達載體系統可用于表達抗cd70抗體或其衍生物。典型地，真核細胞用于表達重組蛋白，特別是對于完整重組抗cd70抗體分子。例如，與載體(如來自人巨細胞病毒的主要中間早期基因啟動子元件)結合使用的哺乳動物細胞如中國倉鼠卵巢細胞(cho)是用于產生抗cd70抗體及其衍生物的有效表達系統(參見例如，foecking等人,1986,gene 45:101；cockett等人,1990,bio/technology 8:2)。
[0190]
其他宿主表達系統包括例如細菌細胞中基于質粒的表達系統(參見例如，ruther等人,1983,embo 1,2:1791；inouye和inouye,1985,nucleic acids res.13:3101-3109；van heeke和schuster,1989,j.biol.chem.24:5503-5509)；昆蟲系統，例如在草地貪夜蛾細胞中使用苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(acnpv)表達載體；和哺乳動物細胞中基于病毒的表達系統，例如基于腺病毒的系統(參見例如，logan和shenk,1984,proc.natl.acad.sci.usa 81:355-359；bittner等人,1987,methods in enzymol.153:51-544)。
[0191]
此外，可以選擇調節插入序列的表達或以所需具體方式修飾并加工基因產物的宿主細胞株。可以選擇適當的細胞系或宿主系統以確保對表達的蛋白質的正確修飾和加工(例如，糖基化、磷酸化和切割)。為此，可以使用具有用于適當加工初級轉錄物和基因產物的細胞機制的真核宿主細胞。這樣的哺乳動物宿主細胞包括例如cho、vero、bhk、hela、cos、mdck、293、3t3和w138。
[0192]
穩定的表達系統典型地用于重組抗cd70抗體或其衍生物或其他cd70結合劑的長期高產率生產。例如，穩定表達抗cd70抗體或其衍生物的細胞系可通過用由適當的表達控制元件(例如，啟動子和增強子序列、轉錄終止子、多腺苷酸化位點)和選擇性標記物控制的dna轉化宿主細胞、然后使轉化的細胞在選擇性培養基中生長來工程化。選擇性標記物賦予對選擇的抗性，并允許細胞將dna穩定地整合到它們的染體中并生長以形成集落，進而可以克隆并擴增成細胞系。可以使用許多選擇系統，包括例如單純皰疹病毒胸苷激酶、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶和腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因，它們可以分別用于tk-、hgprt-或aprt-細胞。此外，抗代謝物抗性可用作以下基因的選擇基礎：dhfr，其賦予對甲氨蝶呤的抗性；gpt，其賦予對霉酚酸的抗性；neo，其賦予對氨基糖苷g-418的抗性；和hygro，
其賦予對潮霉素的抗性。重組dna技術領域中通常已知的方法可常規地用于選擇所需的重組克隆，并且此類方法描述于例如current protocols in molecular biology(ausubel等人編,john wiley and sons,紐約州,1993)；kriegler,gene transfer and expression,a laboratory manual(stockton press,紐約州,1990)；current protocols in human genetics(dracopoli等人編,john wiley and sons,紐約州,1994,第12和13章)；以及colberre-garapin等人,1981,j.mol.biol.150:1中。
[0193]
可以通過載體擴增來增加抗體或衍生物的表達水平。(一般參見，例如，bebbington和hentschel,the use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in dna cloning,第3卷(academic press,紐約,1987)。)當表達抗cd70抗體或其衍生物的載體系統中的標記物是可擴增的時，宿主細胞培養基中存在的抑制劑水平的增加將選擇具有增加拷貝數的賦予對抑制劑的抗性的標記基因的宿主細胞。相關抗體基因的拷貝數也將增加，從而增加抗體或其衍生物的表達(參見crouse等人,1983,mol.cell.biol.3:257)。
[0194]
當抗cd70抗體包含重鏈和輕鏈或其衍生物時，可將宿主細胞用兩種表達載體共轉染，第一種載體編碼重鏈蛋白，第二種載體編碼輕鏈蛋白。這兩種載體可以含有相同的選擇性標記物，其使得重鏈和輕鏈蛋白的表達相同。可替代地，可以使用編碼并能夠表達重鏈和輕鏈蛋白二者的單一載體。在這種情況下，通常將輕鏈置于重鏈之前以避免過量的毒性游離重鏈(參見proudfoot,1986,nature 322:52；kohler,1980,proc.natl.acad.sci.usa 77:2197)。重鏈和輕鏈的編碼序列可以包含cdna或基因組dna。
[0195]
一旦產生了抗cd70抗體或其衍生物(例如，通過動物、化學合成或重組表達)，可以通過用于純化蛋白質的任何合適的方法純化，包括，例如，通過譜(例如，離子交換或親和譜(例如，用于純化具有完整fc區的抗體的蛋白a譜))、離心、差異溶解度、或通過用于純化蛋白質的任何其他標準技術進行純化。抗cd70抗體或其衍生物可例如與標記序列如肽融合，以促進通過親和譜進行純化。合適的標記氨基酸序列包括例如，六組氨酸肽，如pqe載體(qiagen,inc.，查茨沃思(chatsworth)，加利福尼亞州，91311)中提供的標簽；和“ha”標簽，其對應于衍生自流感血凝素蛋白的表位(wilson等人,1984,cell 37:767)；和“flag”標簽。
[0196]
一旦產生抗cd70抗體或其衍生物，其對表達cd70的癌細胞發揮細胞抑制或細胞毒性作用或對表達cd70的免疫細胞發揮免疫調節作用的能力通過下文所述或本領域已知的方法來測定。
[0197]
為了使激活的免疫細胞或表達cd70的癌細胞外的抗cd70抗體的活性最小化，可使用特異性結合細胞膜結合的cd70但不結合可溶性cd70的抗體，使得抗cd70抗體集中在激活的免疫細胞或表達cd70的癌細胞的細胞表面。
[0198]
典型地，抗cd70抗體或衍生物是基本上純化的(例如，基本上不含限制其作用或產生不期望的副作用的物質)。在一些實施方案中，抗cd70抗體或衍生物的純度為至少約40％、至少約50％或至少約60％。在一些實施方案中，抗cd70抗體或衍生物的純度為至少約60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％或95％-98％。在一些實施方案中，抗cd70抗體或衍生物的純度為大約99％。iii.方法
[0199]
本發明提供了受試者中表達cd70的癌癥如髓系惡性腫瘤的方法，其包括向所述受試者施用有效量的抗cd70抗體，如本文所述的非巖藻糖基化抗cd70抗體。髓系惡性腫瘤包括急性髓系白血病(aml)、骨髓增殖性障礙(mpds)、骨髓增生異常綜合征(mds)和骨髓增生異常/骨髓增殖性綜合征，它們都是克隆性干細胞(hsc)或祖細胞惡性障礙。在一些實施方案中，癌癥是mds。在一些實施方案中，癌癥是aml。mds涵蓋多種亞型，包括伴有單系發育異常的mds、伴有環形鐵粒幼細胞的mds、伴有多系發育異常的mds、伴有過量原始細胞的mds、伴有分離的del(5q)的mds和不可分類的mds。mds的特征在于一種或多種骨髓譜系中的無效造血作用。早期mds主要展現出過度細胞凋亡和造血細胞發育異常。在約三分之一的mds患者中，這種無效的造血作用之后進展為繼發性aml(saml)。aml是白細胞髓系的惡性腫瘤。在一些實施方案中，所述方法包括向受試者施用有效量的非巖藻糖基化抗cd70抗體，其中所述抗cd70抗體包含含有seq id no:1的三個cdr的重鏈可變區、含有seq id no:2的三個cdr的輕鏈可變區和fc結構域，其中所述抗cd70抗體的cdr由kabat編號方案定義。在一些實施方案中，所述方法包括向受試者施用抗cd70抗體體，其中所述抗cd70抗體體中至少30％的抗cd70抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，所述方法包括向受試者施用抗cd70抗體體，其中所述抗cd70抗體體中至少40％的抗cd70抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，所述方法包括向受試者施用抗cd70抗體體，其中所述抗cd70抗體體中至少50％的抗cd70抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，所述方法包括向受試者施用抗cd70抗體體，其中所述抗cd70抗體體中至少60％的抗cd70抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，所述方法包括向受試者施用抗cd70抗體體，其中所述抗cd70抗體體中至少70％的抗cd70抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，所述方法包括向受試者施用抗cd70抗體體，其中所述抗cd70抗體體中至少80％的抗cd70抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，所述方法包括向受試者施用抗cd70抗體體，其中所述抗cd70抗體體中至少90％的抗cd70抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，所述方法包括向受試者施用抗cd70抗體體，其中所述抗cd70抗體體中至少95％的抗cd70抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，所述方法包括向受試者施用抗cd70抗體體，其中所述抗cd70抗體體中至少98％的抗cd70抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，所述方法包括向受試者施用抗cd70抗體體，其中所述抗cd70抗體體中至少99％的抗cd70抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，所述方法包括向受試者施用抗cd70抗體體，其中所述抗cd70抗體體中至少99.5％的抗cd70抗體缺乏核心巖藻糖基化。在一些實施方案中，將抗cd70抗體與低甲基化劑(hma)組合施用。在一些實施方案中，hma是阿扎胞苷。在一些實施方案中，將抗cd70抗體與bh3-模擬物組合施用。在一些實施方案中，將抗cd70抗體與維奈妥拉組合施用。在一些實施方案中，將抗cd70抗體與hma和bh3-模擬物組合施用。在一些實施方案中，將抗cd70抗體與hma和維奈妥拉組合施用。在一些實施方案中，將抗cd70抗體與阿扎胞苷和bh3-模擬物組合施用。在一些實施方案中，將抗cd70抗體與阿扎胞苷和維奈妥拉組合施用。
[0200]
在一些實施方案中，本文提供了一種受試者中表達cd70的mds的方法，其包括施用有效量的本文所述的抗cd70抗體。在一些實施方案中，抗cd70抗體是非巖藻糖基化的。在一些實施方案中，mds是復發性或難治性mds。在一些實施方案中，mds是復發性mds。在一些實施方案中，mds是難治性mds。在一些實施方案中，受試者在先前的針對mds的低甲
基化劑(hma)療法后經歷了失敗。hma(也稱為去甲基化劑)是抑制dna甲基化的藥物。在一些實施方案中，hma是dna甲基轉移酶抑制劑。在一些實施方案中，hma是阿扎胞苷。在一些實施方案中，hma是地西他濱。
[0201]
在一些實施方案中，本文提供了一種受試者中表達cd70的aml的方法，其包括施用有效量的本文所述的抗cd70抗體。在一些實施方案中，抗cd70抗體是非巖藻糖基化的。在一些實施方案中，aml是復發性或難治性aml。在一些實施方案中，aml是復發性aml。在一些實施方案中，aml是難治性aml。在一些實施方案中，受試者接受了1種先前方案以aml。在一些實施方案中，受試者接受了2種先前方案以aml。在一些實施方案中，受試者接受了3種先前方案以aml。
[0202]
在一些實施方案中，至少約0.1％、至少約1％、至少約2％、至少約3％、至少約4％、至少約5％、至少約6％、至少約7％、至少約8％、至少約9％、至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約60％、至少約70％或至少約80％的來自受試者的癌細胞表達cd70。在一些實施方案中，至少0.1％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的來自受試者的癌細胞表達cd70。在一些實施方案中，使用免疫組織化學(ihc)測定表達cd70的細胞的百分比。在一些實施方案中，使用流式細胞術測定表達cd70的細胞的百分比。在一些實施方案中，使用酶聯免疫吸附測定(elisa)來測定表達cd70的細胞的百分比。
[0203]
在一方面，用本文所述的抗cd70抗體癌癥的方法導致在施用抗體后所述受試者中一種或多種效果相對于基線的改善。在一些實施方案中，所述一種或多種效果是客觀反應率、反應持續時間、達到反應的時間、無進展存活期、總存活期或其任何組合。在一個實施方案中，所述一種或多種效果是疾病穩定。在一個實施方案中，所述一種或多種效果是部分反應。在一個實施方案中，所述一種或多種效果是完全反應。在一個實施方案中，所述一種或多種效果是客觀反應率。在一個實施方案中，所述一種或多種效果是反應持續時間。在一個實施方案中，所述一種或多種效果是達到反應的時間。在一個實施方案中，所述一種或多種效果是無進展存活期。在一個實施方案中，所述一種或多種效果是總存活期。在一個實施方案中，所述一種或多種效果是癌癥消退。
[0204]
在本文提供的方法或用途或用于所述用途的產品的一個實施方案中，對用如本文所述的抗cd70抗體的反應可以包括以下標準(cheson標準)：
oncol 21(24):4642-9)進行修改。
[0205]
在本文提供的方法或用途或用于所述用途的產品的一個實施方案中，對用如本文所述的抗cd70抗體的反應可以包括以下標準(cheson標準)：
沒有示出iwg反應標準的刪除。為了將血紅蛋白從克/分升轉換為克/升，將克/分升乘以10。mds表示骨髓增生異常綜合征；hgb，血紅蛋白；cr，完全緩解；hi，血液學改善；pr，部分緩解；fab，法國-美國-英國；pfs，無進展存活期；dfs，無病存活期。*發育異常變化應考慮發育異常變化的正常范圍(修改)。(ramos f,fernandez-ferrero s,suarez d,等人myelodysplastic syndrome:a search for minimal diagnostic criteria.leuk res.1999；23:283-290)對iwg反應標準的修改。在一些情況下，方案療法可能需要在4-周時間段前開始進一步(例如鞏固、維持)。此類受試者可包括在療法開始時適合的反應類別中。重復化療過程中的短暫性血細胞減少不應被認為中斷反應的持久性，只要它們恢復到前一療程的改善計數即可。(cheson bd,greenberg pl,bennett jm,lowenberg b,wijermans pw,nimer sd,pinto a,beran m,de witte tm,stone rm,mittelman m,sanz gf,gore sd,schiffer ca,kantarjian h(2006).clinical application and proposal for modification of the international working group(iwg)response criteria in myelodysplasia.blood 108(2):419-25)。
rbc＝紅細胞a間隔≥1周的至少2次測量(不受輸血影響)的前計數平均值(修改)。b對iwg反應標準的修改。c在沒有其他解釋如急性感染、重復化療療程(修改)、胃腸道出血、溶血等的情況下。建議總體上報告2種紅系和血小板反應，并按個體反應模式報告(cheson 2006)
[0206]
在本文提供的方法或用途或用于所述用途的產品的一個實施方案中，用本文所述的抗cd70抗體的有效性通過測量客觀反應率來評估。在一些實施方案中，客觀反應率是具有預定義量的腫瘤大小減小且持續最小時間段的患者的比例。在一些實施方案中，客觀反應率是基于cheson標準。在一個實施方案中，客觀反應率是至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約60％、至少約70％或至少約80％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少約20％-80％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少約30％-80％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少約40％-80％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少約50％-80％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少約60％-80％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少約70％-80％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少約80％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少約85％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少約90％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少約95％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少約98％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少約99％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少20％-80％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少30％-80％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少40％-80％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少50％-80％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少60％-80％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少70％-80％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少80％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少85％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少90％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少95％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少98％。在一個實施方案中，客觀反應率是至少99％。在一個實施方案中，客觀反應率是100％。
[0207]
在本文所述的方法或用途或用于所述用途的產品的一個實施方案中，對用本文所
述的抗cd70抗體的反應通過測量在施用本文所述的抗cd70抗體后的無進展存活期的時間來評估。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個月、至少約9個月、至少約10個月、至少約11個月、至少約12個月、至少約十八個月、至少約兩年、至少約三年、至少約四年或至少約五年的無進展存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少約6個月的無進展存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少約一年的無進展存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少約兩年的無進展存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少約三年的無進展存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少約四年的無進展存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少約五年的無進展存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少十八個月、至少兩年、至少三年、至少四年或至少五年的無進展存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少6個月的無進展存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少一年的無進展存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少兩年的無進展存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少三年的無進展存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少四年的無進展存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少五年的無進展存活期。
[0208]
在本文所述的方法或用途或用于所述用途的產品的一個實施方案中，對用本文所述的抗cd70抗體的反應通過測量在施用本文所述的抗cd70抗體后的總存活期的時間來評估。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個月、至少約9個月、至少約10個月、至少約11個月、至少約12個月、至少約十八個月、至少約兩年、至少約三年、至少約四年或至少約五年的總存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少約6個月的總存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少約一年的總存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少約兩年的總存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少約三年的總存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少約四年的總存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少約五年的總存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少約12個月、至少十八個月、至少兩年、至少三年、至少四年或至少五年的總存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少6個月的總存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗
cd70抗體后，所述受試者展現出至少一年的總存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少兩年的總存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少三年的總存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少四年的總存活期。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少五年的總存活期。
[0209]
在本文所述的方法或用途或用于所述用途的產品的一個實施方案中，對用本文所述的抗cd70抗體的反應通過測量在施用本文所述的抗cd70抗體后對本文所述的抗cd70抗體的反應的持續時間來評估。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，對本文所述的抗cd70抗體的反應的持續時間是至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個月、至少約9個月、至少約10個月、至少約11個月、至少約12個月、至少約十八個月、至少約兩年、至少約三年、至少約四年或至少約五年。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，對本文所述的抗cd70抗體的反應的持續時間是至少約6個月。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，對本文所述的抗cd70抗體的反應的持續時間是至少約一年。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，對本文所述的抗cd70抗體的反應的持續時間是至少約兩年。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，對本文所述的抗cd70抗體的反應的持續時間是至少約三年。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，對本文所述的抗cd70抗體的反應的持續時間是至少約四年。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，對本文所述的抗cd70抗體的反應的持續時間是至少約五年。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，對本文所述的抗cd70抗體的反應的持續時間是至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少十八個月、至少兩年、至少三年、至少四年或至少五年。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，對本文所述的抗cd70抗體的反應的持續時間是至少6個月。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，對本文所述的抗cd70抗體的反應的持續時間是至少一年。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，對本文所述的抗cd70抗體的反應的持續時間是至少兩年。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，對本文所述的抗cd70抗體的反應的持續時間是至少三年。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，對本文所述的抗cd70抗體的反應的持續時間是至少四年。在一些實施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗體后，對本文所述的抗cd70抗體的反應的持續時間是至少五年。
[0210]
在本文所述的方法或用途或用于所述用途的產品的一個實施方案中，向受試者施用本文所述的抗cd70抗體如非巖藻糖基化抗cd70抗體導致受試者中癌細胞的耗竭。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，施用本文所述的抗cd70抗體如非巖藻糖基化抗cd70抗體導致癌細胞耗竭至少約5％、至少約6％、至少約7％、至少約8％、至少約9％、至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約95％或約100％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少約5％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少約10％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之
前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少約20％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少約30％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少約40％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少約50％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少約60％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少約70％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少約80％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少約90％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少約95％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少約99％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭約100％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，施用本文所述的抗cd70抗體如非巖藻糖基化抗cd70抗體導致癌細胞耗竭至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少約15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少約80％、至少約90％、至少95％或100％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少5％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少10％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少20％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少30％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少40％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少50％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少60％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少70％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少80％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少90％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少95％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭至少99％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，癌細胞耗竭100％。
[0211]
在本文所述的方法或用途或用于所述用途的產品的一個實施方案中，向受試者施用本文所述的抗cd70抗體如非巖藻糖基化抗cd70抗體不會導致受試者中cd70+t調節性細胞(cd70+treg)的耗竭。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前cd70+treg的量相比，施用本文所述的抗cd70抗體如非巖藻糖基化抗cd70抗體導致cd70+treg耗竭不超過約50％、約40％、約30％、約20％、約10％、約9％、約8％、約7％、約6％、約5％、約4％、約3％、約2％、約1％或約0.1％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超過約50％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超過約40％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超過約30％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超過約20％。
在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超過約10％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超過約5％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超過約1％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超過約0.1％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前cd70+treg的量相比，施用本文所述的抗cd70抗體如非巖藻糖基化抗cd70抗體導致cd70+treg耗竭不超過50％、40％、30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.1％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超過50％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超過40％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超過30％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超過20％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超過10％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超過5％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超過1％。在一些實施方案中，與向受試者施用抗cd70抗體之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超過0.1％。
[0212]
在一些實施方案中，巖藻糖基化抗cd70抗體比包含相同重鏈和輕鏈氨基酸序列的非巖藻糖基化形式的抗cd70抗體更大程度地耗竭受試者中的cd70+treg。在一些實施方案中，當受試者為高親和力fcγriiia受體純合型(v/v 158)時，巖藻糖基化抗cd70抗體比包含相同重鏈和輕鏈氨基酸序列的非巖藻糖基化形式的抗cd70抗體更大程度地耗竭受試者中的cd70+treg。在一些實施方案中，當受試者為低親和力fcγriiia受體純合型(f/f 158)時，巖藻糖基化抗cd70抗體與包含相同重鏈和輕鏈氨基酸序列的非巖藻糖基化形式的抗cd70抗體在相同程度上耗竭受試者中的cd70+treg。在一些實施方案中，當受試者為高親和力fcγriiia受體純合型(v/v 158)時，巖藻糖基化抗cd70抗體和包含相同重鏈和輕鏈氨基酸序列的非巖藻糖基化形式的抗cd70抗體均不耗竭cd8 t細胞。在一些實施方案中，當受試者為低親和力fcγriiia受體純合型(f/f 158)時，巖藻糖基化抗cd70抗體和包含相同重鏈和輕鏈氨基酸序列的非巖藻糖基化形式的抗cd70抗體均不耗竭cd8 t細胞。iv.細胞毒性、細胞抑制和免疫調節活性的測定
[0213]
確定抗體是否介導針對靶細胞的效應子功能的方法是已知的。此類方法的說明性例子在下文中描述。
[0214]
為了確定抗cd70抗體是否介導針對激活的免疫細胞或表達cd70的癌細胞的抗體依賴性細胞毒性，可以使用在抗體和效應免疫細胞的存在下測量靶細胞死亡的測定。用于測量這類細胞毒性的測定可基于在效應細胞和靶標特異性抗體存在下孵育后從代謝標記的靶細胞釋放
51
cr的測定(參見例如，perussia和loza,2000,methods in molecular biology 121:179-92；以及“51
cr release assay of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity(adcc)”current potocols in immunology,coligan等人編,wileyand sons,1993)。例如，可用不同濃度的抗cd70抗體處理用na
251
cro4標記并以5,000個細胞/孔的密度鋪板在96孔板的激活的免疫細胞(例如，激活的淋巴細胞)或表達cd70的癌細胞30分
鐘，然后與正常人外周血單個核細胞(pbmc)混合4小時。伴隨靶細胞死亡的膜破壞將
51
cr釋放到培養物上清液中，可將其收集并評估放射性作為細胞毒性活性的量度。測量adcc的其他測定可涉及非放射性標記或基于特定酶的誘導釋放。例如，基于時間分辨熒光測定法的非放射性測定是可商購的(delphia，perkin elmer)。該測定基于用熒光增強配體的乙酰氧基甲酯(batda)加載靶細胞，所述熒光增強配體的乙酰氧基甲酯穿透細胞膜，然后水解形成膜不可滲透的親水配體(tda)。當與靶標特異性抗體和pbmc效應細胞混合時，tda從裂解細胞中釋放，并且當與銪混合時可用于形成高熒光螯合物。用時間分辨熒光計測量的信號與細胞裂解的量相關。
[0215]
為了確定抗cd70抗體是否介導針對激活的免疫細胞或表達cd70的癌細胞的抗體依賴性細胞吞噬作用，可以使用測量效應免疫細胞(例如，新鮮培養的巨噬細胞或建立的巨噬細胞樣細胞系)進行的靶細胞內化的測定(參見例如，munn和cheung,1990,j.exp.med.172:231-37；keler等人,2000,j.immunol.164:5746-52；akewanlop等人,2001,cancer res.61:4061-65)。例如，可將靶細胞用親脂性膜染料如pkh67(sigma)標記，用靶標特異性抗體包被，并與效應免疫細胞混合4-24小時。然后可以通過用對吞噬細胞表面標記物(例如cd14)特異的熒光染料標記的抗體復染來鑒定效應細胞，并通過雙流式細胞術或熒光顯微術分析細胞。雙陽性細胞代表具有內化靶細胞的效應細胞。對于這些測定，效應細胞可以是衍生自pbmc的單核細胞，其已經通過用m-csf或gm-csf培養5-10天而分化成巨噬細胞(參見例如，munn和cheung,同上)。可從atcc獲得的人巨噬細胞樣細胞系u937(larrick等人,1980,j.immunology 125:6-12)或thp-1(tsuchiya等人,1980,int.j.cancer 26:171-76)可用作替代的吞噬細胞來源。
[0216]
確定抗體在與靶細胞結合后是否介導補體依賴性細胞毒性的方法也是已知的。相同的方法可用于確定抗cd70抗體是否介導對激活的免疫細胞或表達cd70的癌細胞的cdc。此類方法的說明性例子在下文中描述。
[0217]
活性補體的來源可以是正常人血清或從包括兔在內的實驗動物中純化。在標準測定中，在補體的存在下將抗cd70抗體與表達cd70的激活的免疫細胞(例如激活的淋巴細胞)或表達cd70的癌細胞一起孵育。這種抗cd70抗體介導細胞裂解的能力可通過若干讀出測定。在一個例子中，使用na
51
cro4釋放測定。在該測定中，用na
51
cro4標記靶細胞。洗去未摻入的na
51
cro4，并將細胞以合適的密度，通常為5,000至50,000個細胞/孔鋪板在96孔板中。在正常血清或純化的補體的存在下與抗cd70抗體的孵育典型地是在37℃下在5％co2氣氛中持續2-6小時。通過γ射線計數測定培養上清液的等分試樣中指示細胞裂解的所釋放的放射性。通過去污劑(0.5％-1％np-40或triton x-100)處理釋放摻入的na
51
cro4來測定最大細胞裂解。在僅存在補體而沒有任何抗cd70抗體的孔中測定自發背景細胞裂解。細胞裂解百分比計算為(抗cd70抗體誘導的裂解-自發裂解)/最大細胞裂解)。第二個讀出是活細胞對代謝染料例如阿爾瑪藍的還原。在該測定中，將靶細胞與抗cd70抗體和補體一起孵育，并如上所述孵育。在孵育結束時，添加1/10體積的阿爾瑪藍(biosource international，卡馬里奧(camarillo)，加利福尼亞州)。在37℃下在5％co2氣氛中繼續孵育長達16小時。通過在530nm激發和590nm發射的熒光分析測定作為代謝活性活細胞指示物的阿爾瑪藍還原。第三個讀出是細胞膜對碘化丙啶(pi)的滲透性。由于補體激活而在質膜中形成孔有助于pi進入細胞，在那里它將擴散到細胞核中并結合dna。與dna結合后，600nm的pi熒光顯著增加。用抗
cd70抗體和補體處理靶細胞如上所述進行。孵育結束時，添加pi至終濃度為5μg/ml。然后使用用于激發的488nm氬激光通過流式細胞術檢查細胞懸浮液。通過在600nm的熒光發射檢測裂解的細胞。v.包含抗cd70抗體的藥物組合物及其施用
[0218]
可以將包含抗cd70抗體的組合物施用于患有或有風險患上表達cd70的癌癥的受試者。本發明還提供了抗cd70抗體在制造用于預防或表達cd70的癌癥的藥物中的用途。如本文所用，術語“受試者”是指可以被施用cd70結合劑的任何哺乳動物患者，包括例如人和非人哺乳動物，如靈長類動物、嚙齒動物和狗。專門用于使用本文所述方法進行的受試者包括人。在預防或表達cd70的癌癥中，可以將抗體單獨施用或與其他組合物組合施用。
[0219]
各種遞送系統是已知的并且可用于施用抗cd70抗體。引入方法包括但不限于皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外和口服途徑。抗cd70抗體可例如通過輸注或推注(例如靜脈內或皮下)、通過上皮或粘膜皮膚內層(例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收來施用，并且可與其他生物活性劑如化療劑一起施用。施用可以是全身的或局部的。在一個實施方案中，本文所述的抗cd70抗體經腸胃外施用。腸胃外施用是指除腸內和外用施用以外的施用方式，通常是通過注射施用，并且包括表皮、靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眼眶內、心臟內、真皮內、腹膜內、腱內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、顱內、胸腔內、硬膜外和胸骨內注射和輸注。在一些實施方案中，本文所述的抗cd70抗體的施用途徑是靜脈內注射或輸注。在一些實施方案中，本文所述的抗cd70抗體的施用途徑是靜脈內輸注。
[0220]
在具體實施方案中，抗cd70抗體組合物通過注射、通過導管、通過栓劑或通過植入物來施用，所述植入物為多孔、無孔或凝膠狀材料，包括膜(如sialastic膜)或纖維。通常，當施用組合物時，使用抗cd70抗體不吸收的材料。
[0221]
可將抗cd70抗體作為包含有效量的抗體和一種或多種藥學上相容的成分的藥物組合物施用。例如，藥物組合物典型地包含一種或多種藥物載體(例如，無菌液體，如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等)。當靜脈內施用藥物組合物時，水是更典型的載體。鹽水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液體載體，特別是用于可注射溶液。合適的藥物賦形劑包括例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果希望，組合物還可以含有少量的潤濕劑或乳化劑、或ph緩沖劑。這些組合物可以采取溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉末、緩釋配制品等形式。所述組合物可以用傳統的粘合劑和載體(如甘油三酯)配制成栓劑。口服配制品可包括標準載體如藥物級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。合適的藥物載體的例子描述于e.w.martin的“remington’s pharmaceutical sciences”中。此類組合物將含有有效量的典型地呈純化形式的蛋白質連同合適量的載體，以便提供用于適當施用于患者的形式。配制品與施用方式相對應。
[0222]
在典型的實施方案中，根據常規程序將藥物組合物配制為適于靜脈內施用于人的藥物組合物。典型地，用于靜脈內施用的組合物是在無菌等滲水性緩沖液中的溶液。必要時，所述藥物組合物還可以包括增溶劑和局部麻醉劑(如利多卡因)以緩解注射部位的疼痛。通常，成分分開或混合在一起以單位劑型提供，例如，作為在氣密密封容器中的干燥的
凍干粉或無水濃縮物，所述氣密密封容器例如是指明活性劑的量的安瓿瓶或小藥囊。在通過輸注施用藥物時，可以用含有無菌藥用級水或鹽水的輸注瓶進行分配。在通過注射施用藥物時，可以提供一安瓿瓶的無菌注射用水或鹽水，使得可以在施用前將成分混合。
[0223]
此外，藥物組合物可以作為藥物試劑盒提供，所述藥物試劑盒包含(a)含有凍干形式的抗cd70抗體的容器和(b)含有藥學上可接受的注射用稀釋劑(例如無菌水)的第二容器。藥學上可接受的稀釋劑可用于重構或稀釋凍干的抗cd70抗體。任選地，與一個或多個此類容器相關的可以是由管理藥品或生物產品的制造、使用或銷售的政府機構規定的形式的通告，所述通告反映了制造、使用或銷售機構批準用于人施用。
[0224]
可通過標準臨床技術確定有效或預防表達cd70的癌癥的抗cd70抗體的量。另外，可以任選地采用體外測定來幫助鑒定最佳劑量范圍。待用于配制品中的確切劑量還將取決于施用途徑以及表達cd70的癌癥的階段，并且應當根據從業者的判斷和每名患者的情況決定。可以從源自體外或動物模型測試系統的劑量-反應曲線外推有效劑量。
[0225]
例如，抗cd70抗體的毒性和功效可在細胞培養物或實驗動物中通過用于測定ld
50
(使50％體致死的劑量)和ed
50
(在50％體中有效的劑量)的標準藥學程序來測定。毒性效應與效果之間的劑量比率是指數，并且其可以被表示為比率ld
50
/ed
50
。展現出大指數的抗cd70抗體是優選的。當抗cd70抗體展現出毒副作用時，可使用將抗cd70抗體靶向受累組織部位的遞送系統，以最小化對非cd70表達細胞的潛在損害，從而減少副作用。
[0226]
從細胞培養測定和動物研究獲得的數據可用于配制用于人的劑量范圍。抗cd70抗體的劑量通常在包括ed50在內的循環濃度范圍內，伴隨毒性很小或沒有毒性。劑量可取決于所采用的劑型和所利用的施用途徑而在這個范圍內變化。對于在該方法中使用的抗cd70抗體，有效劑量最初可以根據細胞培養測定估計。可以在動物模型中配制劑量，以達到包括如在細胞培養中確定的ic
50
(即，測試化合物實現癥狀的半最大抑制的濃度)在內的循環血漿濃度范圍。這樣的信息可以用于更準確地確定在人中的有用劑量。可以例如通過高效液相譜測量血漿中的水平。
[0227]
通常，施用于患有表達cd70的癌癥的患者的抗cd70抗體的劑量為約0.1mg/kg至100mg/kg受試者體重。更典型地，施用于受試者的劑量為0.1mg/kg至50mg/kg受試者體重，甚至更典型地為1mg/kg至30mg/kg、1mg/kg至20mg/kg、1mg/kg至15mg/kg、1mg/kg至12mg/kg、1mg/kg至10mg/kg或1mg/kg至7.5mg/kg受試者體重。在一些實施方案中，抗cd70抗體的劑量為1.5mg/kg。在一些實施方案中，劑量為5mg/kg。在一些實施方案中，劑量為10mg/kg。在一些實施方案中，劑量為20mg/kg。通常，由于對外來蛋白的免疫應答，在人體內人抗體的半衰期比來自其他物種的抗體的半衰期長。因此，較低劑量的包含抗cd70抗體的人源化或嵌合抗體和較低頻率的施用通常是可能的。
[0228]
可以將抗cd70抗體的劑量例如每天、每周一次(每周)、每周兩次、每周三次、每周四次、每周五次、每兩周、每月或根據需要以其他方式施用。
[0229]
在一些實施方案中，抗cd70抗體的劑量對應于次優劑量(即，低于抗cd70抗體的ec
50
)。例如，抗cd70抗體的劑量可包括選自窗的最低25％、最低15％、最低10％或最低5％的劑量。如本文所用，術語“窗”是指提供安全和有效療法的藥物劑量范圍或其在身體系統中的濃度范圍。
[0230]
在一些實施方案中，抗cd70抗體的劑量為約0.05mg/kg至約1mg/kg、或約0.1mg/kg至約0.9mg/kg、或約0.15至約0.75mg/kg受試者體重。這樣的劑量可以每周施用1至約15次。各劑量可以相同或不同。例如，約0.15mg/kg劑量的抗cd70抗體可以按每四天、五天、六天或七天時間段施用1至10次。
[0231]
在一些實施方案中，包含抗cd70抗體的藥物組合物還可包含劑(例如，非綴合的細胞毒性劑或免疫調節劑，例如本文所述的那些中的任一種)。抗cd70結合劑也可與一種或多種用于或預防表達cd70的癌癥的劑組合共同施用。例如，組合療法可包括劑(例如，細胞抑制劑、細胞毒性劑或免疫調節劑，如未綴合的細胞抑制劑、細胞毒性劑或免疫調節劑，如常規用于癌癥的那些)。組合療法還可包括例如施用靶向激活的淋巴細胞、樹突細胞或表達cd70的癌細胞的表面上除cd70以外的受體或受體復合物的藥劑。這種藥劑的例子包括與激活的淋巴細胞、樹突細胞或表達cd70的癌細胞的表面處的分子結合的第二非cd70抗體。另一個例子包括靶向這種受體或受體復合物的配體。通常，這樣的抗體或配體與激活的淋巴細胞、樹突細胞或表達cd70的癌細胞上的細胞表面受體結合，并通過向激活的淋巴細胞、樹突細胞或表達cd70的癌細胞遞送細胞抑制或細胞毒性信號來增強抗cd70抗體的細胞毒性或細胞抑制作用。這種組合施用可對疾病參數(例如，癥狀的嚴重性、癥狀的數量或復發的頻率)具有累加或協同作用。另一個例子包括低甲基化劑(hma)。在一些實施方案中，hma是阿扎胞苷另一個例子包括bh3-模擬物。另一個例子包括維奈妥拉在一些實施方案中，藥物組合物包含抗cd70抗體、hma和bh3-模擬物。在一些實施方案中，藥物組合物包含抗cd70抗體、hma和維奈妥拉。在一些實施方案中，藥物組合物包含抗cd70抗體、阿扎胞苷和bh3-模擬物。在一些實施方案中，藥物組合物包含抗cd70抗體、阿扎胞苷和維奈妥拉。
[0232]
關于用于組合施用的方案，在一個具體的實施方案中，將抗cd70抗體與劑同時施用。在另一個具體的實施方案中，將劑在施用抗cd70抗體之前或之后施用，在施用抗cd70抗體之前或之后至少一小時且多達數月，例如至少一小時、五小時、12小時、一天、一周、一個月或三個月施用。在一些實施方案中，在施用抗cd70抗體和任選地劑后監測受試者。vi.制品和試劑盒
[0233]
在另一方面，提供了一種制品或試劑盒，所述制品或試劑盒包含本文所述的抗cd70抗體。制品或試劑盒還可以包含本文所述的抗cd70抗體在本發明的方法中的使用說明書。因此，在某些實施方案中，制品或試劑盒包含本文所述的抗cd70抗體在受試者的癌癥(例如髓系惡性腫瘤)的方法中的使用說明書，所述方法包括向受試者施用有效量的本文所述的抗cd70抗體。在一些實施方案中，癌癥是mds。在一些實施方案中，癌癥是aml。在一些實施方案中，癌癥是復發性或難治性癌癥。在一些實施方案中，所述受試者是人。
[0234]
所述制品或試劑盒還可以包含容器。合適的容器包括例如瓶、小瓶(例如雙室小瓶)、注射筒(如單室或雙室注射筒)和試管。在一些實施方案中，所述容器是小瓶。所述容器可以用各種材料(如玻璃或塑料)制成。所述容器容納配制品。
[0235]
制品或試劑盒還可以包含在容器上或與容器相關聯的標簽或藥品說明書，所述標簽或藥品說明書可以指示重構和/或使用配制品的說明。所述標簽或藥品說明書可以進一步指示所述配制品可用于或旨在用于皮下、靜脈內(例如，靜脈內輸注)或用于受試者
中的癌癥的其他施用方式。容納配制品的容器可以是一次性小瓶或多次使用的小瓶，其允許重復施用重構的配制品。制品或試劑盒還可以包含含有合適的稀釋劑的第二容器。制品或試劑盒還可以包括從商業、和用戶角度來看期望的其他材料，包括其他緩沖液、稀釋劑、過濾器、針、注射筒和具有使用說明的藥品說明書。
[0236]
本文的制品或試劑盒任選地還包含容器，所述容器包含第二藥劑，其中所述抗cd70抗體是第一藥物，并且所述制品或試劑盒還包括標簽或藥品說明書上的關于以有效量的第二藥物所述受試者的說明書。在一些實施方案中，所述標簽或藥品說明書指示所述第一藥物和第二藥物將依序或同時施用。
[0237]
在一些實施方案中，本文所述的抗cd70抗體作為凍干粉末存在于所述容器中。在一些實施方案中，所述凍干粉末在氣密密封的容器(如小瓶、安瓿瓶或小藥囊)中，所述容器指示活性劑的量。在通過注射施用所述藥物的情況下，注射用無菌水或生理鹽水的安瓿瓶可以例如任選地作為所述試劑盒的一部分而提供，使得成分可以在施用之前混合。如果需要的話，此類試劑盒還可以包括一種或多種各種常規藥物組分，例如像具有一種或多種藥學上可接受的載體的容器、另外的容器等，這對于本領域技術人員來說是清楚的。所述試劑盒中還可以包含作為插頁或作為標簽的印刷說明書，其指示待施用的組分的量、施用指南和/或混合組分的指導。
[0238]
通過參考以下實施例將更全面地理解本發明。然而，它們不應被解讀為限制本發明的范圍。應當理解，本文描述的實施例和實施方案僅用于說明目的，并且根據它們進行的各種修改或改變將為本領域技術人員知曉，并且應包括在本技術的精神和范圍內以及所附權利要求的范圍內。實施例實施例1：sea-cd70與fcγ受體結合的評價
[0239]
在體內，單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞和nk細胞可經由fcγri、fcγriia和fcγriiia介導adcp(抗體依賴性細胞介導的吞噬作用)和adcc(抗體依賴性細胞介導的細胞毒性)。雖然所有三種受體均可參與adcp，但fcγriiia被認為是參與adcc的主要fcγ受體。igg1抗體的非巖藻糖基化導致與fcγriiia和b以更高親和力結合，并且因此可以增加adcc和adcp活性。
[0240]
sea-cd70(非巖藻糖基化hif6)是一種靶向cd70的人源化非巖藻糖基化單克隆抗體，其由seattle genetics開發用于患有目前不存在護理標準的難治性和/或復發性急性髓系白血病(aml)或骨髓增生異常綜合征(mds)的患者。sea-cd70是一種結合cd70的人源化單克隆igg1抗體。sea-cd70是非巖藻糖基化抗體，其以比巖藻糖基化親本抗體sgn-70(hif6)更高的親和力結合fcγriiia，并通過cdc、adcp和放大的adcc引起對cd70陽性細胞的靶向殺傷增加。
[0241]
使用生物層干涉測量法(bli)評估sgn-70和sea-cd70與fcγr i、iia、iiia、iib和fcrn的結合動力學。圖1示出sgn-70(標記為h1f6 wt)和sea-70(標記為h1f6 sea)與fcγri、iia、iiia、iib和fcrn結合的感測圖。
[0242]
通過bli評估sgn-70和sea-cd70與人fcγri、fcγriia h131、fcγriia r131、fcγriiia f158和fcγriiia v158的結合動力學。參數列于表1中。將生物素化的avi標記的人fcγr單體fc n297a lala-pg和fc受體新生兒(fcrn)單體fc n297a ihh融合蛋白(在
seattle genetics設計和表達)加載到高精度鏈霉親和素生物傳感器(fortebio)上，以在緩沖液a(0.1％牛血清白蛋白[bsa]，0.02％tween20，1
×
磷酸鹽緩沖鹽水[pbs]ph 7.4)中進行100秒傳感器檢查后達到0.3與1nm之間的響應。在另一次基線測量后，對于fcγri、iia、iiia、fcrn ph 6和fcrn ph 7.4，將滴定的抗體分別在緩沖液b(1％酪蛋白，0.2％tween20，1
×
pbs ph 7.4)中締合600、10、100、50和10秒，并解離1000、50、100、500和50秒。在分析之前，在每個測定中減去參考。所有的感測圖用締合開始時的y軸對準和步間解離校正進行處理。使用1:1朗繆爾等溫線全局擬合模型來擬合曲線。表1：sgn-70和sea-cd70的bli結合方案的參數cd70的bli結合方案的參數bli＝生物層干涉測量法；bsa＝牛血清白蛋白；fcrn＝fc受體新生兒；pbs＝磷酸鹽緩沖鹽水；s＝秒。
[0243]
使用表2中列舉的參數通過bli測定人cd70親和力。在用購自fortebio的ahc(抗fc)生物傳感器固定6μg/ml抗體57秒之前和之后，在緩沖液a(0.1％bsa，0.02％tween20，1
×
pbs ph 7.4)中進行基線測量。在緩沖液b(1％酪蛋白，0.2％tween20，1
×
pbs ph 7.4)中獲取第二基線后，使滴定的hcd70分析物在緩沖液b中締合600秒并解離1000秒。hcd70抗原購自r&d(目錄號9328-cl，批號dgsr0217071)，并使用1.5倍摩爾過量的購自thermo fisher scientific的ez連接n-羥基琥珀酰亞胺生物素(目錄號20217，批號si249775)進行生物素化。
表2：人cd70的bli結合方案的參數bsa＝牛血清白蛋白；pbs＝磷酸鹽緩沖鹽水；s＝秒。
[0244]
sea-cd70和sgn-70具有相似的與hfcγri和iia結合和解離的速率。然而，與sgn-70相比，sea-cd70展現出對fcγriiia更高的結合親和力。進行bli實驗以觀察sea-cd70和sgn-70與以下項的結合和解離速率以及與以下項的結合親和力：fcγri、fcγriia(h/h高親和力和r/r低親和力等位基因)和fcγriiia(f/f低親和力和v/v高親和力等位基因)。還進行了與fcrn的結合動力學，并發現sea-cd70和sgn-70以相似的動力學和親和力結合。
[0245]
使用生物層干涉測量法(bli)評估sgn-70和sea-cd70與高親和力fcγriiia(158v)受體變體的結合動力學(表3)。sea-cd70的非巖藻糖基化骨架展現出對fcγriiia(158v)受體的結合親和力增加8倍。將生物素化的avi標記的人fcγr單體fc n297alala-pg和fcrn單體fc n297a ihh融合蛋白(在seattle genetics設計和表達)加載到高精度鏈霉親和素生物傳感器(fortebio)上，以在緩沖液a(0.1％bsa，0.02％tween20，1
×
pbs ph 7.4)中進行200至300秒傳感器檢查后達到0.3與1nm之間的響應。在第二個基線后，滴定的sea-cd70或sgn-70抗體締合，直到最高濃度達到平衡并解離，直到響應接近基線。在分析之前，在每個測定中減去參考。所有的感測圖用締合開始時的y軸對準和步間解離校正進行處理。使用1:1朗繆爾等溫線全局擬合模型來擬合曲線。表3.通過bli得出的sgn-70和sea-cd70 fcγriiia結合的動力學參數kd＝平衡解離常數；k
off
＝解離速率常數；k
on
＝結合速率常數。實施例2：通過流式細胞術得出的sgn-70和sea-cd70與hfcγriiia和cfcγriiia的結合
[0246]
盡管bli方法用于通過監測結合動力學來評估受體親和力，但其主要設定為監測單價結合。為了增加bli數據集，還進行了流式細胞術(圖2a和圖2b)。轉化cho細胞以過表達高親和力人fcγriiia受體(158v)(圖2a)或食蟹猴fcγriiia受體(圖2b)，并進行非巖藻糖基化抗體sea-cd70(標記為sea-70)或親本巖藻糖基化抗體sgn-70的結合。如在bli實驗中觀察到的，與sgn-70相比，非巖藻糖基化抗體sea-cd70以更高的親和力結合人和食蟹猴fcγriiia。
[0247]
如下進行cho-fcγriiia結合測定：
1.解凍細胞：將細胞于2019年6月11日解凍，并在培養基中培養1周以從凍融中恢復。數據vi-cell xr2.04,beckman coulter,inc.2.洗滌：將6千萬個細胞在50ml管中在pbs中洗滌1次。將細胞再次計數并以2.2
×
106/ml重懸浮。然后每孔吸移0.1ml3.制作抗體的10
×
稀釋液：制備10
×
稀釋液(在稀釋板中3mg/ml、1mg/ml、0.3mg/ml、0.1mg/ml、0.03mg/ml、0.01mg/ml、0.003mg/ml、0.001mg/ml和0.0003mg/ml)。pbs＝磷酸鹽緩沖鹽水。4.抽吸：將洗液吸入孔中，并用多通道移液管吸取100μl相應的抗體稀釋液。相應濃度為300、100、30、10、3、1、0.03、0.01、0.003、0.001和0.0003μg/ml，一式三份。濃度沿96孔圓底板豎直下降。5.渦旋：在板的每一側用力敲拍后，使用渦旋機輕輕混合。然后將板在4℃下孵育1小時。6.離心：將細胞離心、抽吸并在200μl 1
×
bd染緩沖液/孔中洗滌。抽吸最后一次洗液后，通過在渦旋器上渦旋板使細胞重懸浮。7.制備抗體：抗人igg-pe(jackson，目錄號109-116-170)是通過將1mg/ml濃縮物1:50稀釋以產生33μg/ml飽和濃度來制備的。通過敲拍板的側面將抗體混合物充分混合。將混合物在冰箱(4℃)中在黑暗中孵育30分鐘。8.洗滌：將混合物離心。然后吸出上清液。用200μl 2
×
bd染緩沖液洗滌各孔。9.分析樣品：在attune上以高通量取樣器(hts)模式通過流式細胞術分析樣品。將中值熒光強度(mfi)作圖(幾何平均值)，并在prizm中計算每個的平衡解離常數(kd)。實施例3：sea-cd70和sgn-70在aml cd70+細胞中的adcc
[0248]
盡管sgn-70不直接誘導cd70陽性靶細胞中的細胞凋亡，但sea-cd70確實介導可能導致靶標陽性細胞消除的效應子功能。在使用pbmc作為自然殺傷(nk)細胞來源的標準adcc測定中，sea-cd70以劑量依賴性方式誘導兩種cd70陽性aml細胞系的裂解，而使用非結合對照人igg未實現裂解。這些實驗證明，sea-cd70具有高于sgn-cd70抗體的抗體依賴性細胞毒性活性。
[0249]
使用兩種cd70+aml細胞系作為adcc靶標評價adcc活性(圖3a和圖3b)。標記aml細胞系molm-13(圖3a)和nomo-1(圖3b)，并與測試抗體或同種型對照滴定液混合。使用
easysep人nk細胞富集試劑盒(stem cell technologies)從冷凍保存的正常供體pbmc中分離效應細胞。以效應細胞與靶細胞的比率10:1按25,000:250,000添加效應細胞。孵育4小時后，計算特異性細胞裂解百分比。
[0250]
使aml細胞系在適當的生長培養基中生長，同時在37℃下在5％co2中孵育。使用vicell xr細胞計數器計數懸浮細胞。將所需體積的細胞與新鮮生長培養基混合并以0.5m/ml的接種密度鋪板。
[0251]
以下方案用于評估adcc活性：1.將兩小瓶hupbmc在37℃水浴中解凍并重懸浮于1％fbs-rpmi培養基中。離心細胞，然后按照制造商的方案，使用easysep人nk細胞富集試劑盒分離nk細胞。2.使用sgn-70和sea-cd70抗體制備抗體滴定液，起始濃度為2μg/ml(工作濃度6μg/ml)，并在1％fbs-rpmi培養基中從10x稀釋至20pg/ml。3.將靶腫瘤細胞(molm-3或nomo-1)以50μl/孔在1％fbs-rpmi中鋪板到96孔圓底板中。然后，將抗體稀釋液和同種型對照以50μl/孔接種到同一板中。然后，將分離的nk效應細胞以50μl/孔以1:10比率的腫瘤:nk細胞在1％fbs-rpmi培養基中鋪板到同一96孔圓底板中。4.添加對照孔并用培養基使總體積達到150μl。5.將測試板在37℃下在5％co2培養箱中孵育4小時。當孵育剩余45分鐘時，將15μl/孔的裂解溶液添加至最大裂解對照孔中，并放回培養箱中進行4小時孵育的剩余時間。6.將測試板在離心機中以250xg離心4分鐘，并將來自每個孔的50μl上清液轉移到新的平底透明板中。7.以50μl/孔添加cytotox 96試劑，并在室溫下在暗處孵育30分鐘。然后，向所有孔中添加50μl/孔的終止溶液。8.使用spectramax 190板讀取器在490nm下測量每孔的吸光度，并將獲得的值轉換為文本文件并輸出到excel和graphpad prism中用于進一步數據分析。9.將細胞毒性通過減除背景并以裂解溶液處理達到的最大裂解的百分比報告。實施例4：sgn-70和sea-cd70對調節性t細胞的影響
[0252]
為了評價sea-cd70對cd70+t細胞耗竭的作用，用漸增濃度的sgn-70或sea-cd70處理含有幼稚、記憶和treg子集的pbmc 24小時。在實驗結束時，將細胞用zombie aqua活力染料染并評估總的存活treg幼稚和記憶cd4和cd8 t細胞數。用低親和力fcγriiia受體純合型(f/f 158)(圖4c和圖4d)或高親和力fcγriiia受體純合型(v/v158)(圖4a和圖4b)的供體進行耗竭評估。使用靶向tigit的巖藻糖基化(wt克隆13igg1)和非巖藻糖基化(sea克隆13igg1)抗體作為陽性對照(圖4e-圖4h)。靶向cd70的抗體均未誘導低親和力f/f 158供體中的t調節性細胞耗竭(圖4c)。當使用v/v高親和力供體時，巖藻糖基化抗cd70抗體(標記為sgn-cd70)導致t調節性細胞耗竭，然而，出乎意料地，非巖藻糖基化抗體sea-cd70雖然對cd70+aml細胞系具有增加的adcc活性，但不誘導treg細胞耗竭(圖4a)。無論使用v/v高親和力供體(圖4b)還是低親和力供體(圖4d)，巖藻糖基化和非巖藻糖基化抗cd70抗體均不耗竭cd8+細胞。
[0253]
與對于cd70靶向抗體所觀察到的相比之下，當使用v/v高親和力供體(圖4e)或低親和力供體(圖4g)時，非巖藻糖基化抗tigit抗體(標記為sea克隆13igg1)比巖藻糖基化抗
tigit抗體(標記為wt克隆13igg1)更大程度地耗竭treg細胞。
[0254]
sea-cd70與sgn-70相比缺乏treg的耗竭因以下原因是出乎意料的：不僅鑒于比較巖藻糖基化和非巖藻糖基化抗tigit抗體的結果，而且鑒于報道其他非巖藻糖基化抗體的活性的出版物。例如，us 2019/0284287證明非巖藻糖基化抗cd25抗體具有比相應的巖藻糖基化抗cd25抗體更大的adcc活性，導致誘導的treg(itreg)的更多裂解和耗竭。類似地，美國專利號10,196,445證明非巖藻糖基化抗ctla4抗體導致treg的裂解和耗竭，而相應的巖藻糖基化抗ctla4抗體則不會。
[0255]
已經顯示treg的耗竭可具有負面的，甚至潛在致命的后果。例如，已經證明使用白喉毒素耗竭treg在兩種小鼠模型中導致嚴重的自身免疫性障礙。參見kim等人(2009)j.immunol.183:7631-7634。此外，treg細胞的急性消除可導致終末期自身免疫病。參見kim等人(2007)nat.immunol.8(2):191-7。實施例5：sea-cd70在髓系惡性腫瘤患者中的i期臨床研究
[0256]
這是一項1期、開放標簽、多中心、劑量遞增和隊列擴展研究，旨在評價sea-cd70在患有髓系惡性腫瘤的成人中的安全性、耐受性、藥代動力學(pk)和抗腫瘤活性。本文評價了sea-cd70在患有髓系惡性腫瘤如骨髓增生異常綜合征(mds)和急性髓系白血病(aml)的患者中的安全性和功效。該試驗評價了發生的副作用以及sea-cd70是否有效mds和aml。
[0257]
該研究具有三個部分，共入組60名受試者。a部分是劑量遞增隊列，旨在確定如用低甲基化劑失敗(hma失敗)后復發性/難治性mds受試者中sea-cd70單一療法的最大耐受劑量(mtd)或推薦的擴展劑量。b部分是擴展隊列，旨在評價如在hma失敗后sea-cd70單一療法在復發性/難治性mds受試者中的安全性和耐受性。c部分是擴展隊列，旨在評價sea-cd70單一療法在復發性/難治性aml受試者中的安全性和耐受性。入組試驗的受試者為≥18歲，包括男性和女性受試者。在每個周期的第1天和第15天施用sea-cd70。靜脈內施用所有組分。入組試驗的受試者的納入標準和排除標準示于表4中。表4.納入和排除標準的列表
[0258]
結局度量如表5所述。所有組分將被靜脈內施用。表5.結局度量
實施例6：在raji nhl伯基特淋巴瘤小鼠模型中h1f6sea對存活期的劑量依賴性作用。
[0259]
研究表明，急性髓系白血病(aml)和骨髓增生異常疾病(mds)表達cd70及其受體cd27。本研究的目的是測試動物響應于抗cd70單克隆抗體sea-cd70(h1f6sea)的存活期。在表達cd70的細胞異種移植小鼠模型即raji nhl伯基特模型中評估響應于施用sea-cd70的動物存活期。
[0260]
在第0天，給scid小鼠的尾靜脈靜脈內植入1
×
106個raji細胞。植入后一天，將動物隨機分成組，每組八只小鼠。在腫瘤植入后第1天，將h1f6sea以0.3、1和3mg/kg每日一次，每四天對動物腹膜內給藥，共4個周期(q4dx4)。將原液濃度的抗體稀釋至適當濃度并以10μl/g體重注射至動物中。然后監測動物的疾病癥狀。跟蹤動物直到出現疾病癥狀，然后安樂死。隨時間對動物進行分析，并且當動物出現疾病癥狀時處死動物。在植入后，未組中的動物顯示出20天的中位存活期，而用0.3mg/kg h1f6sea的動物進行到36.5天，而用1或3mg/kg的動物進行到68和69.5天。表6示出了研究期間每天每組中的動物總數。計算所有組中動物的存活百分比(圖5)。卡普蘭-邁耶圖顯示和未動物之間存活百分比的顯著增加，以及0.3mg/kg與1或3mg/kg之間的劑量反應(圖5)。對包括0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg的h1f6sea劑量的所有組的實驗天數的存活百分比進行定量。與未的小鼠相比，用h1f6sea小鼠增加了存活期(圖5)。表6.h1f6sea在raji nhl伯基特淋巴瘤模型中的抗腫瘤活性的卡普蘭-邁耶結果。
實施例7.在mv411急性髓系白血病小鼠模型中h1f6sea對腫瘤生長的劑量依賴性作用。
[0261]
在該研究中，在表達cd70的細胞異種移植小鼠模型(mv-411系，為急性髓系白血病模型)中評估響應于施用抗cd70抗體sea-cd70(h1f6sea)的腫瘤生長。將腫瘤生長報告為體積，并計算為每個組中動物的平均值(圖6)以及對每個組中每個個體報告(圖7a-圖7d，表7)。來自不同組中的個體動物的每日腫瘤體積(mm3)總結于表7中。
[0262]
在第0天，在scid小鼠的側腹皮下植入5
×
106個mv-411細胞。當達到平均腫瘤尺寸50mm3時(通過使用下式測量：體積(mm3)＝0.5*長度*寬度2，其中長度是較長尺寸)，將小鼠隨機分到組中，每組六只小鼠。按照組來動物；接受抗體的組每4天，四個周期，接受阿扎胞苷的動物每4天，四個周期。腹膜內給予。將原液濃度的抗體和化療稀釋至適當濃度并以10μl/g體重注射至動物中。在整個研究中，每周兩次測量腫瘤長度和寬度以及動物體重，并使用上述公式計算腫瘤體積。追蹤動物，直至測得的腫瘤體積為約1000mm3，此時對動物實施安樂死。基于腫瘤植入后九天接受的，對動物按不同時間表給藥；接受抗體的動物以q4dx4，而對阿扎胞苷的動物每四天每天一次給藥，共四個周期(q4dx4)。腫瘤體積隨時間變化的分析表明，與未組的動物或用非結合抗體的那些相比，有適度的腫瘤延遲(圖6和圖7a-圖7d)。當觀察每組中腫瘤達到10倍變化所需要的時間時，未組平均需要26.8天，而h1f6sea 10mg/kg組平均需要32.65天，腫瘤生長延遲18％(圖6和圖7a-圖7d)。然而，這可能更長，因為一只動物從未達到10倍的變化。用阿扎胞苷(在圖6、圖7d和表7中標記為vidaza)的動物也顯示出生長延
遲，需要33.68天達到10倍變化，腫瘤生長延遲20.5％(圖6和圖7a-圖7d)。還應注意，h1f6sea 10mg/kg組中的一只小鼠顯示出非常穩固的腫瘤生長延遲，其延長了研究的時間(圖7a和表7)。表7.h1f6sea、h1f6g1v1、h00sea和vidaza在mv-411急性髓系白血病模型中的抗腫瘤功效。實施例8.sea-cd70和sgn-cd70介導的對aml細胞系的adcp活性的評價。
[0263]
使用加載親脂性熒光染料并與單核細胞衍生的巨噬細胞混合過夜的cd70+靶細胞(nomo-1和molm-13)測定sea-cd70和sgn-cd70(也稱為sgn-70)介導的adcp。通過流式細胞術測定熒光標記的靶細胞的吞噬作用。測量吞噬作用的雙標記重合事件(熒光靶細胞)的出現和抗cd11c陽性以鑒定單核細胞/巨噬細胞。巨噬細胞以抗體劑量依賴性方式易于吞噬包被有sea-cd70或sgn-cd70的靶細胞(圖8a和圖8b)。sea-cd70和sgn-cd70介導的吞噬作用達到相似的水平。
[0264]
以下方案用于評估對aml細胞系的adcc活性：1.使用pkh26紅熒光細胞接頭微型試劑盒(sigma aldrich)并遵循制造商的說明書標記靶細胞。2.將細胞(4000個細胞/孔)與指定的測試品一起孵育30分鐘，洗滌并重懸浮于加有10％超低igg fbs的rpmi中。3.將通過將pbmc衍生的單核細胞與500u/ml(50ng/ml)gm-csf一起孵育10-12天產生的pbmc衍生的巨噬細胞(100,000個細胞/孔)添加到靶細胞中，并在37℃下孵育2小時。4.將板離心并將細胞重懸浮于100μl apc-cd11抗體(巨噬細胞標記物)中并在冰
上孵育30分鐘。5.將細胞洗滌，重懸浮于pbs中，并通過流式細胞術分析以確定吞噬作用的百分比。實施例9.sea-cd70和sgn-cd70介導的對aml細胞系的cdc活性的評價。
[0265]
通過補體結合進一步測試sea-cd70和sgn-cd70誘導細胞裂解的能力。將cd70陽性的aml細胞系經熒光標記并用漸增濃度的針對cd70的抗體處理。然后將細胞暴露于人補體并裂解(測定為熒光染料的釋放)。當在未熱滅活的正常人血清的存在下用sea-cd70或sgn-cd70包被時，cd70+aml細胞系molm-13和nomo-1以抗體特異性、劑量依賴性方式裂解(圖9a和圖9b)。
[0266]
以下方案用于評估對aml細胞系的cdc活性：1.將細胞與10mg/ml抗crp單克隆抗體混合物(抗hcd46、抗hcd55、抗hcd59)在冰上孵育30分鐘。2.將細胞洗滌并鋪板(200,000個細胞/孔)在含有未熱滅活血清、sytox green(life technology)和以指定最終濃度添加的抗體的培養基中，在37℃下放置2小時。3.通過在envison板讀取器(perkin elmer)上檢測sitox綠熒光信號來定量細胞死亡，并相對于陽性對照(1％triton x-100處理的細胞)歸一化。實施例10.在mv411 aml異種移植小鼠模型中sea-cd70和阿扎胞苷的組合對腫瘤生長的作用
[0267]
在該研究中，在表達cd70的細胞異種移植小鼠模型mv4-11系中評估響應于單獨或與阿扎胞苷組合施用無巖藻糖基化抗cd70抗體sea-cd70(h1f6sea)的腫瘤生長。將腫瘤生長報告為體積并計算為每個組中動物的平均值(圖10)。在第0天，在scid小鼠的側腹皮下植入5x10e6個mv4-11細胞。當達到平均腫瘤尺寸50mm3時(通過使用下式測量：體積(mm3)＝0.5*長度*寬度2，其中長度是較長尺寸)，將小鼠隨機分到組中，每組9只小鼠。腹膜內給予。將原液濃度的抗體和化療稀釋至適當濃度并以10μl/g體重注射至動物中。在整個研究中，每周兩次測量腫瘤長度和寬度以及動物體重，并使用上述公式計算腫瘤體積。追蹤動物，直至測得的腫瘤體積為約1000mm3，此時對動物實施安樂死。基于接受的，動物按不同時間表給藥；接受抗體的動物用10mg/kg的劑量(q4dx5)，對阿扎胞苷的動物每天給藥一次，持續連續五天(阿扎胞苷2mg/kg；q1dx5)，共3個周期(3周)，接受組合的動物以與單一相同的劑量和時間表接受每種。腫瘤體積隨時間變化的分析表明，當與對照未動物相比時，阿扎胞苷和sea-cd70二者均減少腫瘤生長。此外，當動物用sea-cd70和阿扎胞苷的組合時，與未的動物和單一的sea-cd70或阿扎胞苷相比，觀察到腫瘤延遲的進一步增加(圖10)。如所預期的，用sea-cd70 g1v1抗體在減少腫瘤生長方面無效，所述抗體在fc結構域中攜帶減少與fcγ受體結合的突變(e233p、l234v、l235a)(參見mcearchern等人,2008,clin.cancer res.14(23):7763-72；armour等人,1999,eur.j.immunol.29:2613-2624)。出乎意料地，當sea-cd70 g1v1與阿扎胞苷組合時，觀察到腫瘤生長的顯著延遲(圖10)。不希望受任何理論束縛，這種觀察結果潛藏的機制可能與由阿扎胞苷引起的cd70或cd27表達的變化或與cd27/cd70信號傳導的抑制有關。當觀察每組中腫瘤達到10倍變化所需要的時間時，未動物平均需要17.82天，而sea-cd70組平均需要25.08天，腫瘤生長延遲31％(圖10)。用阿扎胞苷的動
物也顯示出生長延遲，需要26.59天達到10倍變化，與未的對照相比腫瘤生長延遲33％(圖10)。用阿扎胞苷和sea-cd70的組合的動物平均需要33.81天達到10倍增加(腫瘤生長延遲47.3％)(圖10)，表明與作為單一藥劑使用的兩種藥劑相比，sea-cd70和阿扎胞苷的組合有效地延遲腫瘤生長。實施例11.在mv4-11 aml異種移植小鼠模型中sea-cd70與阿扎胞苷、維奈妥拉(abt-199)或兩者(阿扎胞苷+維奈妥拉)的組合對腫瘤生長的作用。
[0268]
在該研究中，在表達cd70的細胞異種移植小鼠模型mv4-11系中評估響應于單獨或與阿扎胞苷維奈妥拉(abt-199)、或sea-cd70+阿扎胞苷+維奈妥拉(三重組合)組合施用無巖藻糖基化抗cd70抗體sea-cd70(h1f6sea)的腫瘤生長。將腫瘤生長報告為體積并計算為每個組中動物的平均值(圖11a)。在第0天，在免疫受損scid小鼠的側腹皮下植入5x10e6個mv4-11細胞。當達到平均腫瘤尺寸50mm3時(通過使用下式測量：體積(mm3)＝0.5*長度*寬度2，其中長度是較長尺寸)，將小鼠隨機分到組中，每組10只小鼠。將原液濃度的抗體和化療稀釋至適當濃度并以10μl/g體重注射至動物中。在整個研究中，每周兩次測量腫瘤長度和寬度以及動物體重，并使用上述公式計算腫瘤體積。追蹤動物，直至測得的腫瘤體積為約1000mm3，此時對動物實施安樂死。基于接受的，動物按不同時間表給藥；接受抗體的動物用10mg/kg抗體(q4dx5)，對阿扎胞苷的動物每天給藥(2mg/kg)，每周持續連續五天(q1dx5)，共3個周期(3周)；維奈妥拉以25mg/kg每天口服灌飼給藥，持續連續21天(q1dx21)。接受組合的動物以與單一相同的劑量和時間表接受每種。
[0269]
如圖11a所示，當作為單一藥劑給藥時，sea-cd70、阿扎胞苷和維奈妥拉延遲腫瘤生長。值得注意的是，與相對單組相比，向阿扎胞苷或維奈妥拉中添加sea-cd70顯著降低腫瘤生長(在第39天的兩個比較中p《0.05，雙因素方差分析)。在與單一藥劑相比時，維奈妥拉+阿扎胞苷的組合還進一步抑制腫瘤生長(在第39天分別與阿扎胞苷或維奈妥拉單組相比，p《0.01和p《0.001，雙因素方差分析)。
[0270]
與兩種藥劑組合相比，將sea-cd70添加至維奈妥拉和阿扎胞苷(三重組合)進一步延遲腫瘤生長(第39天p＝0.0594，雙因素方差分析)。第46天，阿扎胞苷+維奈妥拉組合組的平均腫瘤大小為349.9
±
141.7mm3(平均值
±
sem)，而三重組合的平均腫瘤大小為85
±
11.09mm3(平均值
±
sem)(p《0.05；單尾t檢驗)。如圖11b所示，當觀察單一動物腫瘤生長曲線時，用維奈妥拉+阿扎胞苷的組合的五只動物在第56天達到腫瘤體積增加10倍，而用重組合的僅一只動物在實驗中斷時達到10倍閾值。
[0271]
總之，這些結果表明，當添加至標準護理劑(阿扎胞苷、維奈妥拉、或阿扎胞苷+維奈妥拉的組合)中時，sea-cd70進一步延遲腫瘤生長。

技術特征：

1.一種受試者的表達cd70的癌癥的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的非巖藻糖基化抗cd70抗體，其中所述方法導致所述受試者中癌細胞的耗竭，其中所述方法不導致所述受試者中cd70+t調節性細胞(cd70+treg)的耗竭，其中所述抗cd70抗體包含含有seq id no:1的三個cdr的重鏈可變區、含有seq id no:2的三個cdr的輕鏈可變區和fc結構域，其中所述抗cd70抗體的cdr由kabat編號方案定義，并且其中所述癌癥選自骨髓增生異常綜合征(mds)和急性髓系白血病(aml)。2.根據權利要求1所述的方法，其中所述抗cd70抗體包含含有與seq id no:1的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列的重鏈可變區和含有與seq id no:2的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列的輕鏈可變區。3.根據權利要求1所述的方法，其中所述抗cd70抗體包含含有seq id no:1的氨基酸序列的重鏈可變區和含有seq id no:2的氨基酸序列的輕鏈可變區。4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述fc結構域是介導抗體依賴性細胞毒性(adcc)、抗體依賴性細胞吞噬作用(adcp)和補體依賴性細胞毒性(cdc)中的一種或多種的抗體效應子結構域。5.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述fc結構域是介導adcc的抗體效應子結構域。6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述fc結構域是人fc結構域。7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述抗cd70抗體是沃瑟妥珠單抗。8.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述抗體與劑綴合。9.根據權利要求8所述的方法，其中所述劑是化療劑或免疫調節劑。10.根據權利要求8所述的方法，其中所述劑是化療劑。11.根據權利要求10所述的方法，其中所述化療劑是一甲基澳瑞他汀e(mmae)或一甲基澳瑞他汀f(mmaf)。12.根據權利要求8所述的方法，其中所述劑是免疫調節劑。13.根據權利要求1-12中任一項所述的方法，其中所述方法包括施用抗cd70抗體體，其中所述抗cd70抗體體中的每種抗體包含含有seq id no:1的三個cdr的重鏈可變區、含有seq id no:2的三個cdr的輕鏈可變區和fc結構域，其中所述抗cd70抗體的cdr由kabat編號方案定義，其中所述抗cd70抗體體中至少50％的抗cd70抗體缺乏核心巖藻糖基化。14.根據權利要求13所述的方法，其中所述抗cd70抗體體中至少70％的抗cd70抗體缺乏核心巖藻糖基化。15.根據權利要求13所述的方法，其中所述抗cd70抗體體中至少90％的抗cd70抗體缺乏核心巖藻糖基化。16.根據權利要求1-15中任一項所述的方法，其中所述癌癥是mds。17.根據權利要求16所述的方法，其中所述mds是復發性或難治性mds。18.根據權利要求17所述的方法，其中所述受試者在先前的針對所述mds的低甲基化劑(hma)療法后經歷了失敗。19.根據權利要求1-15中任一項所述的方法，其中所述癌癥是aml。20.根據權利要求19所述的方法，其中所述aml是復發性或難治性aml。21.根據權利要求20所述的方法，其中所述受試者接受了2種先前方案以所述
aml。22.根據權利要求20所述的方法，其中所述受試者接受了3種先前方案以所述aml。23.根據權利要求1-22中任一項所述的方法，其中至少約0.1％、至少約1％、至少約2％、至少約3％、至少約4％、至少約5％、至少約6％、至少約7％、至少約8％、至少約9％、至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約60％、至少約70％或至少約80％的所述癌細胞表達cd70。24.根據權利要求1-23中任一項所述的方法，其中與向所述受試者施用所述非巖藻糖基化抗cd70抗體之前癌細胞的量相比，向所述受試者施用所述非巖藻糖基化抗cd70抗體導致癌細胞耗竭至少約5％、至少約6％、至少約7％、至少約8％、至少約9％、至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約95％或約100％。25.根據權利要求1-24中任一項所述的方法，其中與向所述受試者施用所述無巖藻糖基化抗cd70抗體之前cd70+treg的量相比，向所述受試者施用所述非巖藻糖基化抗cd70抗體導致cd70+treg耗竭不超過約20％、約10％、約9％、約8％、約7％、約6％、約5％、約4％、約3％、約2％、約1％或約0.1％。26.根據權利要求1-25中任一項所述的方法，其中在施用所述非巖藻糖基化抗cd70抗體之后，所述受試者中的一種或多種效果相對于基線得到改善。27.根據權利要求26所述的方法，其中所述一種或多種效果選自：客觀反應率、反應持續時間、達到反應的時間、無進展存活期和總存活期。28.根據權利要求1-27中任一項所述的方法，其中所述客觀反應率是至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約35％、至少約40％、至少約45％、至少約50％、至少約60％、至少約70％或至少約80％。29.根據權利要求1-28中任一項所述的方法，其中在施用所述非巖藻糖基化抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個月、至少約9個月、至少約10個月、至少約11個月、至少約12個月、至少約十八個月、至少約兩年、至少約三年、至少約四年或至少約五年的無進展存活期。30.根據權利要求1-29中任一項所述的方法，其中在施用所述非巖藻糖基化抗cd70抗體后，所述受試者展現出至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個月、至少約9個月、至少約10個月、至少約11個月、至少約12個月、至少約十八個月、至少約兩年、至少約三年、至少約四年或至少約五年的總存活期。31.根據權利要求1-30中任一項所述的方法，其中在施用所述非巖藻糖基化抗cd70抗體后，對所述抗cd70抗體的反應的持續時間是至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月、至少約6個月、至少約7個月、至少約8個月、至少約9個月、至少約10個月、至少約11個月、至少約12個月、至少約十八個月、至少約兩年、至少約三年、至少約四年或至少約五年。32.根據權利要求1-31中任一項所述的方法，其中所述抗cd70抗體的施用途徑是靜脈
內。33.根據權利要求1-32中任一項所述的方法，其中所述受試者是人。34.根據權利要求1-33中任一項所述的方法，其中將所述抗cd70抗體與阿扎胞苷組合施用。35.根據權利要求1-33中任一項所述的方法，其中將所述抗cd70抗體與維奈妥拉組合施用。36.根據權利要求1-33中任一項所述的方法，其中將所述抗cd70抗體與阿扎胞苷和維奈妥拉組合施用。37.根據權利要求1-35中任一項所述的方法，其中將所述抗cd70抗體與氟喹諾酮組合施用。38.一種用于表達cd70的癌癥的藥物組合物，所述組合物包含非巖藻糖基化抗cd70抗體和至少一種藥學上相容的成分，其中所述抗cd70抗體包含含有seq id no:1的三個cdr的重鏈可變區、含有seq id no:2的三個cdr的輕鏈可變區和fc結構域，其中所述抗cd70抗體的cdr由kabat編號方案定義，其中所述組合物用于根據權利要求1-37中任一項所述的方法中。39.一種試劑盒，所述試劑盒包含非巖藻糖基化抗cd70抗體和在根據權利要求1-37中任一項所述的方法中使用所述抗cd70抗體的說明書，其中所述抗cd70抗體包含含有seq id no:1的三個cdr的重鏈可變區、含有seq id no:2的三個cdr的輕鏈可變區和fc結構域，其中所述抗cd70抗體的cdr由kabat編號方案定義。

技術總結

本公開文本提供了使用非巖藻糖基化抗CD70抗體諸如包括骨髓增生異常綜合征(MDS)和急性髓系白血病(AML)在內的髓系惡性腫瘤等癌癥的方法。腫瘤等癌癥的方法。腫瘤等癌癥的方法。

技術研發人員：

S

受保護的技術使用者：

思進股份有限公司

技術研發日：

2020.12.28

技術公布日：

2023/1/13