一種人外周血干細胞提取方法及應用與流程
1.本發明涉及干生物醫學技術領域，尤其涉及一種人外周血干細胞提取方法及應用。
背景技術：
2.近30年里，造血干細胞被廣泛地應用于血液病的臨床實踐，已成為和治愈惡性血液病、重型再生障礙性貧血、某些實體瘤、某些異常免疫病、某些遺傳病、代謝病和極重度骨髓型放射病的最有效方法，已成為現代醫學異軍突起的重要方向。
3.生理狀況下造血干細胞是定位在人體內平均氧濃度為3％的低氧環境中，而造血干細胞采集及處理程序則是在比人體內氧濃度高得多的21％氧氣濃度環境下完成，目前全世界進行的普通細胞培養條件，都是遠遠超過生理條件的高氧氣濃度。只是許多細胞對這種有毒的高氧環境的耐受能力比較高，干細胞這種相對脆弱的細胞則不同。研究人員發現，即便是短暫暴露于高氧環境下，也會給造血干細胞帶來明顯負面影響，造成造血干細胞數量減少、功能降低最終導致移植療效下降。他們將這種效應稱作為超出生理范圍的氧休克/應激動 (extraphysiologicoxygen shock/stress，ephoss)。因此，需要提供一種避免給干細胞帶來損害的干細胞提取方法。
技術實現要素：
4.為解決背景技術中提到的問題，本發明的目的在于提供一種人外周血干細胞提取方法及應用。
5.為了實現上述目標，本發明的技術方案為：
6.一種人外周血干細胞提取方法，包括如下步驟：
7.(1)：取新鮮抗凝血與羥乙基淀粉550按1:1比例混合，并加入環孢菌素 a，環保菌素a的濃度為0.3μg/ml，37℃條件下反應5-10分鐘，得到混合液；
8.(2)：向步驟(1)所得的混合液中加入全血及組織稀釋液，混勻，20℃～30 ℃條件下自然沉降20～30分鐘，吸取上清液備用，其中全血及組織稀釋液的體積為步驟(1)中所得的混合液的體積的二分之一；
9.(3)：向步驟(2)所得的上清液中加入細胞洗滌液，混勻，離心15分鐘，棄上清液保留沉淀細胞，其中細胞洗滌液的體積為步驟(2)中所得上清液的兩倍；
10.(4)：向步驟(3)所得的細胞沉淀中加入全血及組織稀釋液形成混合液，調整細胞濃度為2
×
108～1
×
109個/ml，將所得混合液同細胞分離液加入離心管內，其中混合液疊加于細胞分離液的液面之上，混合液的體積為分離液的兩倍；
11.(5)：將步驟(4)的混合液與細胞分離液離心20分鐘，離心管中由上至下分為四層：
12.第一層：稀釋液層；
13.第二層：環狀乳白層；
14.第三層：透明分離液層；
15.第四層：極少數紅細胞層；
16.(6)：將步驟(5)所得環狀乳白層吸取后與細胞洗滌液混合，離心15 分鐘，將沉淀洗滌即可得所需干細胞，其中，細胞洗滌液的體積為步驟(5)所得環狀乳白層的5～10倍。
17.一種人外周血干細胞提取方法在人體干細胞提取中的應用，包括如下步驟：
18.(1)：采用g-csf結合amd3100聯合動員骨髓msc釋放入血，連續5天皮下注射50μg/kg g-csf，第六天皮下注射5mg/kg amd3100，1小時后無菌條件下采血；
19.(2)：將步驟1所得血液與羥乙基淀粉550按1:1比例混合，并加入環孢菌素a，環保菌素a的濃度為0.3μg/ml，37℃條件下反應5-10分鐘，得到混合液；
20.(3)：向步驟(2)所得的混合液中加入全血及組織稀釋液，混勻，20℃～30 ℃條件下自然沉降20～30分鐘，吸取上清液備用，其中全血及組織稀釋液的體積為步驟(1)中所得的混合液的體積的二分之一；
21.(4)：向步驟(3)所得的上清液中加入細胞洗滌液，混勻，離心15分鐘，棄上清液保留沉淀細胞，其中細胞洗滌液的體積為步驟(2)中所得上清液的兩倍；
22.(5)：向步驟(4)所得的細胞沉淀中加入全血及組織稀釋液形成混合液，調整細胞濃度為2
×
108～1
×
109個/ml，將所得混合液同細胞分離液加入離心管內，其中混合液疊加于細胞分離液的液面之上，混合液的體積為分離液的兩倍；
23.(6)：將步驟(5)的混合液與細胞分離液離心20分鐘，離心管中由上至下分為四層：
24.第一層：稀釋液層；
25.第二層：環狀乳白層；
26.第三層：透明分離液層；
27.第四層：極少數紅細胞層；
28.(7)：將步驟(6)所得環狀乳白層吸取后與細胞洗滌液混合，離心15 分鐘，將沉淀洗滌即可得所需干細胞，其中，細胞洗滌液的體積為步驟(5)所得環狀乳白層的5～10倍。
29.本發明的有益效果為：向人外周血添加環孢菌素a能夠保證在空氣中收集人外周血中的造血干細胞時避免發生ephoss反應,從而增加了可用于移植的造血干細胞數目，提取的造血干細胞不分化，不轉化，提取率高。
具體實施方式
30.下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明的實施例，本領域普通技術人員所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明的保護范圍。
31.實施例1：
32.一種人外周血干細胞提取方法在人體干細胞提取中的應用，包括如下步驟：
33.(1)：采用g-csf結合amd3100聯合動員骨髓msc釋放入血，連續5天皮下注射50μg/kg g-csf，第六天皮下注射5mg/kg amd3100，1小時后無菌條件下采血10ml；
34.(2)：將步驟1所得血液與羥乙基淀粉550(cat#：hes-tbd550)按1:1 比例混合，并加入環孢菌素a，環保菌素a的濃度為0.3μg/ml，37℃條件下反應10分鐘，得到混合液；
35.(3)：向步驟(2)所得的混合液中加入全血及組織稀釋液(cat#：2010c1119)，混勻，30℃條件下自然沉降30分鐘，吸取上清液備用，其中全血及組織稀釋液 (cat#：2010c1119)的體積為步驟(1)中所得的混合液的體積的二分之一；
36.(4)：向步驟(3)所得的上清液中加入細胞洗滌液(cat#：2010x1118)，混勻，以1800轉/分離心15分鐘，采用半徑15cm水平轉子，棄上清液保留沉淀細胞，其中細胞洗滌液的體積為步驟(2)中所得上清液的兩倍；
37.(5)：向步驟(4)所得的細胞沉淀中加入全血及組織稀釋液(cat#： 2010c1119)形成混合液，調整細胞濃度為1
×
109個/ml，將所得混合液同細胞分離液加入離心管內，其中混合液疊加于細胞分離液的液面之上，混合液的體積為分離液的兩倍；
38.(6)：將步驟(5)的混合液與細胞分離液(分離液采用天津灝洋tbd實驗室的分離液)以1500轉/分離心20分鐘，采用半徑15cm水平轉子，離心管中由上至下分為四層：
39.第一層：稀釋液層；
40.第二層：環狀乳白層，含有干細胞；
41.第三層：透明分離液層；
42.第四層：極少數紅細胞層；
43.(7)：將步驟(6)所得環狀乳白層吸取后與細胞洗滌液(cat#： 2010x1118)混合，以1800轉/分離心15分鐘，采用半徑15cm水平軸轉子，將沉淀洗滌兩次即可得所需干細胞，細胞洗滌液(cat#：2010x1118)的體積為步驟(6)中所得環狀乳白層的10倍。
44.由于在血液中加入了環孢菌素a，能夠保證在空氣中收集人外周血中的造血干細胞時避免發生ephoss反應,從而增加了可用于移植的造血干細胞數目，提取的造血干細胞不分化，不轉化，提取率可達到80％。
45.以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所有的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
技術特征：
1.一種人外周血干細胞提取方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)：取新鮮抗凝血與羥乙基淀粉550按1:1比例混合，并加入環孢菌素a，環保菌素a的濃度為0.3μg/ml，37℃條件下反應5-10分鐘，得到混合液；(2)：向步驟(1)所得的混合液中加入全血及組織稀釋液，混勻，20℃～30℃條件下自然沉降20～30分鐘，吸取上清液備用，其中全血及組織稀釋液的體積為步驟(1)中所得的混合液的體積的二分之一；(3)：向步驟(2)所得的上清液中加入細胞洗滌液，混勻，離心15分鐘，棄上清液保留沉淀細胞，其中細胞洗滌液的體積為步驟(2)中所得上清液的兩倍；(4)：向步驟(3)所得的細胞沉淀中加入全血及組織稀釋液形成混合液，調整細胞濃度為2
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108～1
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109個/ml，將所得混合液同細胞分離液加入離心管內，其中混合液疊加于細胞分離液的液面之上，混合液的體積為分離液的兩倍；(5)：將步驟(4)的混合液與細胞分離液離心20分鐘，離心管中由上至下分為四層：第一層：稀釋液層；第二層：環狀乳白層；第三層：透明分離液層；第四層：極少數紅細胞層；(6)：將步驟(5)所得環狀乳白層吸取后與細胞洗滌液混合，離心15分鐘，將沉淀洗滌即可得所需干細胞，其中，細胞洗滌液的體積為步驟(5)所得環狀乳白層的5～10倍。2.如權利要求1所述的一種人外周血干細胞提取方法在人體干細胞提取中的應用，其特征在于，包括如下步驟：(1)：采用g-csf結合amd3100聯合動員骨髓msc釋放入血，連續5天皮下注射50μg/kg g-csf，第六天皮下注射5mg/kg amd3100，1小時候無菌條件下采血；(2)：將步驟1所得血液與羥乙基淀粉550按1:1比例混合，并加入環孢菌素a，環保菌素a的濃度為0.3μg/ml，37℃條件下反應5-10分鐘，得到混合液；(3)：向步驟(2)所得的混合液中加入全血及組織稀釋液，混勻，20℃～30℃條件下自然沉降20～30分鐘，吸取上清液備用，其中全血及組織稀釋液的體積為步驟(1)中所得的混合液的體積的二分之一；(4)：向步驟(3)所得的上清液中加入細胞洗滌液，混勻，離心15分鐘，棄上清液保留沉淀細胞，其中細胞洗滌液的體積為步驟(2)中所得上清液的兩倍；(5)：向步驟(4)所得的細胞沉淀中加入全血及組織稀釋液形成混合液，調整細胞濃度為2
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108～1
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109個/ml，將所得混合液同細胞分離液加入離心管內，其中混合液疊加于細胞分離液的液面之上，混合液的體積為分離液的兩倍；(6)：將步驟(5)的混合液與細胞分離液離心20分鐘，離心管中由上至下分為四層：第一層：稀釋液層；第二層：環狀乳白層；第三層：透明分離液層；第四層：極少數紅細胞層；(7)：將步驟(6)所得環狀乳白層吸取后與細胞洗滌液混合，離心15分鐘，將沉淀洗滌即可得所需干細胞，其中，細胞洗滌液的體積為步驟(5)所得環狀乳白層的5～10倍。
技術總結
本發明涉及生物醫學技術領域，具體公開了一種人外周血干細胞提取方法及應用，人外周血干細胞提取方法包括如下步驟：(1)：取新鮮抗凝血與羥乙基淀粉550混合，加入環孢菌素A，得混合液；(2)：向步驟(1)所得的混合液中加入全血及組織稀釋液，混勻，沉降，取上清液；(3)：向步驟(2)所得的上清液中加入細胞洗滌液，混勻，離心，棄上清液保留沉淀細胞；(4)：向步驟(3)所得的細胞沉淀中加入全血及組織稀釋液形成混合液，調整細胞濃度，將所得混合液同細胞分離液加入離心管內；(5)：將步驟(4)的混合液與細胞分離液離心，得到環狀乳白層；(6)：將步驟(5)所得環狀乳白層吸取后與細胞洗滌液混合，離心，將沉淀洗滌。將沉淀洗滌。
