一種
一種
‘
鳳丹’牡丹體細胞胚再分化生成不定芽的誘導方法
技術領域
1.本發明涉及植物組織培養技術領域，尤其涉及一種
‘
鳳丹’牡丹體細胞胚再分化生成不定芽的誘導方法。
背景技術：
2.目前，雖已在牡丹多種外植體培養中誘導出了愈傷組織，但不同基因型和外植體誘導成功率存在極大差異。近年來，愈傷組織誘導和增殖方法已較為成熟，主要的瓶頸問題之一是愈傷組織難以分化出健康的不定芽，而組織培養體系建立的最主要環節在于愈傷組織再分化過程。當前，大量研究仍以鱗芽為外植體這一直接器官發生途徑來實現植株再生，通過體胚發生途徑實現牡丹離體再生少有報道。有研究表明，誘導愈傷組織體胚發生進而再分化形成的再生植株可保持母株優良性狀。
3.‘
鳳丹’(paeonia ostiit.hong et j.x.zhang)因其籽油品質高成為目前新興的木本油料植物之一。分株、嫁接等傳統的繁殖方法，不能滿足市場對優質牡丹種苗的需求。截至目前，
‘
鳳丹’牡丹尚未建立起成熟穩定的組織培養體系，關鍵技術瓶頸之一是愈傷組織分化率低。因此，加快牡丹組織培養技術的研究，提高愈傷組織分化率，有利于牡丹快速育苗，保存母株的優良性狀，為分子生物學育種研究提供基礎。
技術實現要素：
4.本發明的目的在于提供一種
‘
鳳丹’牡丹體細胞胚再分化生成不定芽的誘導方法。本發明選用
‘
鳳丹’無菌苗的子葉為外植體，配合優化組織培養方式，誘導體細胞胚再分化不定芽，可提高不定芽分化率，加快
‘
鳳丹’牡丹快速育苗進程。
5.為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
6.本發明提供了一種
‘
鳳丹’牡丹體細胞胚再分化生成不定芽的誘導方法，包括如下步驟：
7.(1)取經浸泡、去皮、消毒處理后的
‘
鳳丹’牡丹種子的種胚，接種于無菌苗誘導培養基，誘導培養，得到無菌苗；
8.(2)取所述無菌苗的子葉接入體細胞胚誘導培養基，誘導培養，得到體細胞胚；
9.(3)將所述體細胞胚接入再分化誘導培養基，誘導培養，得到不定芽。
10.優選的，步驟(1)中所述無菌苗誘導培養基以ms培養基為基礎培養基，包括以下濃度的組分：蔗糖20～30g/l，瓊脂5～8g/l，naa 0.5～1.0mg/l，6-ba 0.8～2.0mg/l和活性炭0.5～2.0mg/l，所述無菌苗誘導培養基的ph值為5.8～6.0。
11.優選的，步驟(2)中所述體細胞胚誘導培養基以msb培養基為基礎培養基，包括以下濃度的組分：蔗糖20～30g/l、瓊脂5～8g/l、tdz 0.2～1.0mg/l、2,4-d 0.4～1.0mg/l，所述體細胞胚誘導培養基的ph值5.8～6.0。
12.優選的，步驟(3)中所述再分化誘導培養基為以ms培養基、wpm培養基或mbp培養基為基礎培養基。
13.優選的，所述以ms培養基為基礎培養基時，包括以下濃度的組分：蔗糖20～30g/l、瓊脂5～8g/l，ph值為5.8～6.0。
14.優選的，以wpm培養基為基礎培養基時，包括以下濃度的組分：瓊脂5～8g/l、蔗糖20～30g/l，tdz 0.1～0.8mg/l、2,4-d 0.2～1.0mg/l，ph值為5.8～6.0。
15.優選的，以mbp培養基為基礎培養基時，包括以下濃度的組分：瓊脂5～8g/l、蔗糖20～30g/l，tdz 0.2～1.0mg/l、2,4-d 0.2～0.8mg/l，ph值為5.8～6.0。
16.優選的，步驟(1)～(3)中所述誘導培養的條件為：先進行暗培養，再進行光照培養；所述誘導培養的溫度獨立為24～25℃，相對濕度獨立為85％～95％；所述光照培養的強度獨立為2000～3000lx，光照周期獨立為14～18h/d。
17.優選的，步驟(1)中所述誘導培養的總時間為4～5周；步驟(2)中所述誘導培養的總時間為3～4周；步驟(3)中所述誘導培養的總時間為3～4周；其中，步驟(1)～(3)的暗培養時間獨立為5～10d。
18.本發明提供了一種
‘
鳳丹’牡丹體細胞胚再分化生成不定芽的誘導方法。本發明以無菌苗的子葉為外植體誘導愈傷組織形成體細胞胚，縮短了
‘
鳳丹’牡丹愈傷組織脫分化培養時間，加速不定芽的形成，在誘導體細胞胚再分化的培養過程中，改變基礎培養基，發現ms培養基對誘導體細胞胚不定芽分化具有顯著效果，提高了
‘
鳳丹’牡丹體細胞胚分化效率；改變基礎培養基后，去掉外源激素的添加，大大增強了體細胞胚不定芽分化效率，為提高
‘
鳳丹’牡丹體細胞胚不定芽發生的研究提供良好的技術體系，為
‘
鳳丹’牡丹組織培養體系建立提供了可靠的技術支持。
附圖說明
19.圖1為實施例1，體細胞胚接入再分化誘導培養基4周后分化的不定芽。
20.圖2為實施例2，體細胞胚接入再分化誘導培養基4周后分化的不定芽。
21.圖3為實施例3，體細胞胚接入再分化誘導培養基4周后分化的不定芽。
22.圖4為實施例1、2、3的不定芽誘導培養結果數據對比統計圖，其中wpm為實施例1，mbp為實施例2，ms為實施例3。
具體實施方式
23.本發明提供了一種
‘
鳳丹’牡丹體細胞胚再分化生成不定芽的誘導方法，包括如下步驟：
24.(1)取經浸泡、去皮、消毒處理后的
‘
鳳丹’牡丹種子的種胚，接種于無菌苗誘導培養基，誘導培養，得到無菌苗；
25.(2)取所述無菌苗的子葉接入體細胞胚誘導培養基，誘導培養，得到體細胞胚；
26.(3)將所述體細胞胚接入再分化誘導培養基，誘導培養，得到不定芽。
27.本發明取經浸泡、去皮、消毒處理后的
‘
鳳丹’牡丹種子的種胚，接種于無菌苗誘導培養基，誘導培養，得到無菌苗。
28.在本發明中，所述
‘
鳳丹’牡丹種子優選選取當年8月份新收取的，經過后熟后的種子。
29.在本發明中，所述浸泡優選使用蒸餾水。
30.在本發明中，所述浸泡的時間優選為24～48h，進一步優選為36h。
31.在本發明中，所述消毒優選為在超凈工作臺內進行。
32.在本發明中，所述消毒處理的方法優選用紫外燈照射20～30min，通風5～10min，再使用75％醫用酒精浸泡10～30s后無菌水涮洗2～3次，然后用0.1％的浸泡5～10min后再以無菌水涮洗3～8次；進一步優選用紫外燈照射30min，通風10min，再使用75％醫用酒精浸泡20s后無菌水涮洗3次，然后用0.1％的浸泡8min后再以無菌水涮洗6次。
33.在本發明中，所述無菌苗誘導培養基以ms培養基為基礎培養基，優選包括以下濃度的組分：蔗糖20～30g/l，瓊脂5～8g/l，naa 0.5～1.0mg/l，6-ba0.8～2.0mg/l和活性炭0.5～2.0mg/l；進一步優選包括以下濃度的組分：蔗糖22～30g/l，瓊脂6～8g/l，naa 0.6～0.9mg/l，6-ba 1.0～1.5mg/l和活性炭1.0～1.5mg/l；再進一步優選包括以下濃度的組分：蔗糖30g/l，瓊脂6.8g/l，naa 0.8/mg/l，6-ba 1.4mg/l和活性炭1.0mg/l。
34.在本發明中，所述無菌苗誘導培養基的ph值優選為5.8～6.0，進一步優選為5.9。
35.在本發明中，所述誘導培養的條件優選為先進行暗培養，再進行光照培養。
36.在本發明中，所述誘導培養的溫度優選為24～25℃，進一步優選為25℃。
37.在本發明中，所述誘導培養的相對濕度優選為85％～95％，進一步優選為90％。
38.在本發明中，所述誘導培養的總時間優選為4～5周，進一步優選為4周；
39.在本發明中，所述暗培養的時間優選為5～10d，進一步優選為7d。
40.在本發明中，所述光照培養的強度優選為2000～3000lx，進一步優選為2500lx。
41.在本發明中，所述光照培養的光照周期優選為14～18h/d，進一步優選為16h/d。
42.本發明誘導培養得到無菌苗后，取所述無菌苗的子葉接入體細胞胚誘導培養基，誘導培養，得到體細胞胚。
43.在本發明中，所述接入前，優選將無菌苗和體細胞胚誘導培養基帶入超凈工作臺進行消毒處理。
44.在本發明中，所述消毒處理優選為用紫外燈照射20～30min，再通風5～10min；進一步優選用紫外燈照射30min，再通風10min。
45.在本發明中，所述無菌苗的子葉接入體細胞胚誘導培養基前，優選切取1/3～5/6部分，在其背部劃2～3處切口；進一步優選切取2/3部分，在其背部劃3處切口。
46.在本發明中，所述體細胞胚誘導培養基以msb培養基為基礎培養基，優選包括以下濃度的組分：蔗糖20～30g/l、瓊脂5～8g/l、tdz 0.2～1.0mg/l、2,4-d 0.4～1.0mg/l，進一步優選包括以下濃度的組分：蔗糖22～30g/l、瓊脂6～8g/l、tdz 0.3～0.6mg/l、2,4-d 0.5～0.8mg/l；再進一步優選包括以下濃度的組分：蔗糖30g/l、瓊脂6.8g/l、tdz 0.3mg/l、2,4-d 0.7mg/l。
47.在本發明中，所述體細胞胚誘導培養基的ph值優選為5.8～6.0，進一步優選為5.9。
48.在本發明中，所述誘導培養的條件優選為先進行暗培養，再進行光照培養。
49.在本發明中，所述誘導培養的溫度優選為24～25℃，進一步優選為25℃。
50.在本發明中，所述誘導培養的相對濕度優選為85％～95％，進一步優選為90％。
51.在本發明中，所述誘導培養的總時間優選為3～4周，進一步優選為3周；
52.在本發明中，所述暗培養的時間優選為5～10d，進一步優選為7d。
53.在本發明中，所述光照培養的強度優選為2000～3000lx，進一步優選為2500lx。
54.在本發明中，所述光照培養的光照周期優選為14～18h/d，進一步優選為16h/d。
55.本發明誘導培養得到體細胞胚后，將所述體細胞胚接入再分化誘導培養基，誘導培養，得到不定芽。
56.在本發明中，所述接入前，優選將體細胞胚和再分化誘導培養基帶入超凈工作臺進行消毒處理。
57.在本發明中，所述消毒處理優選為用紫外燈照射20～30min，再通風5～10min；進一步優選用紫外燈照射30min，再通風10min。
58.在本發明中，所述再分化誘導培養基優選為以ms培養基、wpm培養基或mbp培養基為基礎培養基。
59.在本發明中，所述再分化誘導培養基以ms培養基為基礎培養基時，優選包括以下濃度的組分：蔗糖20～30g/l、瓊脂5～8g/l；進一步優選包括以下濃度的組分：蔗糖30g/l、瓊脂6.8g/l。
60.在本發明中，所述再分化誘導培養基以wpm培養基為基礎培養基時，優選包括以下濃度的組分：瓊脂5～8g/l、蔗糖20～30g/l，tdz 0.1～0.8mg/l、2,4-d 0.2～1.0mg/l；進一步優選包括以下濃度的組分：瓊脂6～8g/l、蔗糖22～30g/l，tdz 0.3～0.6mg/l、2,4-d 0.4～0.8mg/l；再進一步優選包括以下濃度的組分：瓊脂6.8g/l、蔗糖30g/l，tdz 0.4mg/l、2,4-d 0.6mg/l。
61.在本發明中，所述再分化誘導培養基以mbp培養基為基礎培養基時，優選包括以下濃度的組分：瓊脂5～8g/l、蔗糖20～30g/l，tdz 0.2～1.0mg/l、2,4-d 0.2～0.8mg/l；進一步優選包括以下濃度的組分：瓊脂6～8g/l、蔗糖22～30g/l，tdz 0.4～0.8mg/l、2,4-d 0.4～0.6mg/l；再進一步優選包括以下濃度的組分：瓊脂6.8g/l、蔗糖30g/l，tdz 0.6mg/l、2,4-d 0.5mg/l。
62.在本發明中，所述再分化誘導培養基的ph值優選為5.8～6.0，進一步優選為5.9。
63.在本發明中，所述誘導培養的條件優選為先進行暗培養，再進行光照培養。
64.在本發明中，所述誘導培養的溫度優選為24～25℃，進一步優選為25℃。
65.在本發明中，所述誘導培養的相對濕度優選為85％～95％，進一步優選為90％。
66.在本發明中，所述誘導培養的總時間優選為3～4周，進一步優選為4周；
67.在本發明中，所述暗培養的時間優選為5～10d，進一步優選為7d。
68.在本發明中，所述光照培養的強度優選為2000～3000lx，進一步優選為2500lx。
69.在本發明中，所述光照培養的光照周期優選為14～18h/d，進一步優選為16h/d。
70.下面結合實施例對本發明提供的技術方案進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發明保護范圍的限定。
71.實施例1
72.本發明提供了一種
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鳳丹’牡丹體細胞胚再分化生成不定芽的誘導方法，具體操作如下：
73.選取當年8月份新收取的經過后熟后的
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鳳丹’牡丹種子，將顆粒飽滿的健康成熟種子剝去種皮，蒸餾水浸泡36h，備用。將浸泡后的去皮種子帶進超凈工作臺，用紫外燈照射30min，通風10min，再使用75％醫用酒精浸泡20s后無菌水涮洗3次，然后用0.1％的浸
泡8min后再以無菌水涮洗6次，備用。取消毒后的種子切取種胚，接種于無菌苗誘導培養基。無菌苗誘導培養基以ms培養基為基礎培養基，其中包括：蔗糖30g/l，瓊脂6.8g/l，naa 0.8mg/l，6-ba 1.4mg/l和活性炭1.0mg/l，ph值調整至5.9。
74.將接種后的無菌苗誘導培養基轉移至組培室，設置組培室的溫度為25℃，相對濕度控制為90％。先進行7d的暗培養，暗培養結束后，調整光照強度為2500lx，光照周期為16h/d，繼續培養至4周，得到無菌苗。
75.將無菌苗的子葉為外植體進行體細胞胚發生的誘導，將無菌苗和體細胞胚誘導培養基帶入超凈工作臺，紫外燈照射30min，通風10min，將轉接工具用酒精燈灼燒等待降溫后，將無菌苗子葉切取2/3部分，在其背部劃3處切口，轉接至體細胞胚誘導培養基。體細胞胚誘導培養基以msb培養基為基礎培養基，包括以下濃度的組分：蔗糖30g/l、瓊脂6.8g/l、tdz 0.3mg/l、2,4-d 0.7mg/l，ph值調整至5.9。
76.將接種后的體細胞胚誘導培養基轉移至組培室，設置組培室的溫度為25℃，相對濕度控制為90％。先進行7d的暗培養，暗培養結束后，調整光照強度為2500lx，光照周期為16h/d，繼續培養至3周，得到體細胞胚。
77.將體細胞胚和再分化誘導培養基帶入超凈工作臺，紫外燈照射30min，通風10min，將體細胞胚轉接至再分化誘導培養基。再分化誘導培養基以wpm培養基為基礎培養基，包括以下濃度的組分：瓊脂6.8g/l、蔗糖30g/l，tdz 0.4mg/l、2,4-d 0.6mg/l，ph值調整至5.9。
78.將接種后的再分化誘導培養基轉移至組培室，設置組培室的溫度為25℃，相對濕度控制為90％。先進行7d的暗培養，暗培養結束后，調整光照強度為2500lx，光照周期為16h/d，繼續培養至4周，得到不定芽。誘導培養得到的不定芽如圖1所示。
79.實施例2
80.取實施例1誘導培養得到的體細胞胚，與再分化誘導培養基一起帶入超凈工作臺，紫外燈照射30min，通風10min，將體細胞胚轉接至再分化誘導培養基。再分化誘導培養基以mbp培養基為基礎培養基，包括以下濃度的組分：瓊脂6.8g/l、蔗糖30g/l，tdz 0.6mg/l、2,4-d 0.5mg/l，ph值調整至5.9。
81.將接種后的再分化誘導培養基轉移至組培室，設置組培室的溫度為25℃，相對濕度控制為90％。先進行7d的暗培養，暗培養結束后，調整光照強度為2500lx，光照周期為16h/d，繼續培養至4周，得到不定芽。誘導培養得到的不定芽如圖2所示。
82.實施例3
83.取實施例1誘導培養得到的體細胞胚，與再分化誘導培養基一起帶入超凈工作臺，紫外燈照射30min，通風10min，將體細胞胚轉接至再分化誘導培養基。再分化誘導培養基以ms培養基為基礎培養基，包括以下濃度的組分：蔗糖30g/l、瓊脂6.8g/l，ph值調整至5.9。
84.將接種后的再分化誘導培養基轉移至組培室，設置組培室的溫度為25℃，相對濕度控制為90％。先進行7d的暗培養，暗培養結束后，調整光照強度為2500lx，光照周期為16h/d，繼續培養至4周，得到不定芽。誘導培養得到的不定芽如圖3所示。
85.將實施例1～3的不定芽分化結果進行對比，如圖4所示。從圖4可以看出，實施例1～3的不定芽分化率均達15％以上。其中，實施例2的不定芽分化率可達30％以上，實施例3的不定芽分化率更是高達44.75％。
86.以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人
員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
技術特征：
1.一種
‘
鳳丹’牡丹體細胞胚再分化生成不定芽的誘導方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)取經浸泡、去皮、消毒處理后的
‘
鳳丹’牡丹種子的種胚，接種于無菌苗誘導培養基，誘導培養，得到無菌苗；(2)取所述無菌苗的子葉接入體細胞胚誘導培養基，誘導培養，得到體細胞胚；(3)將所述體細胞胚接入再分化誘導培養基，誘導培養，得到不定芽。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述無菌苗誘導培養基以ms培養基為基礎培養基，包括以下濃度的組分：蔗糖20～30g/l，瓊脂5～8g/l，naa0.5～1.0mg/l，6-ba 0.8～2.0mg/l和活性炭0.5～2.0mg/l，所述無菌苗誘導培養基的ph值為5.8～6.0。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述體細胞胚誘導培養基以msb培養基為基礎培養基，包括以下濃度的組分：蔗糖20～30g/l、瓊脂5～8g/l、tdz 0.2～1.0mg/l、2,4-d 0.4～1.0mg/l，所述體細胞胚誘導培養基的ph值為5.8～6.0。4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述再分化誘導培養基為以ms培養基、wpm培養基或mbp培養基為基礎培養基。5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述以ms培養基為基礎培養基時，包括以下濃度的組分：蔗糖20～30g/l、瓊脂5～8g/l，ph值為5.8～6.0。6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，以wpm培養基為基礎培養基時，包括以下濃度的組分：瓊脂5～8g/l、蔗糖20～30g/l，tdz0.1～0.8mg/l、2,4-d 0.2～1.0mg/l，ph值為5.8～6.0。7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，以mbp培養基為基礎培養基時，包括以下濃度的組分：瓊脂5～8g/l、蔗糖20～30g/l，tdz0.2～1.0mg/l、2,4-d 0.2～0.8mg/l，ph值為5.8～6.0。8.根據權利要求1～7任一項所述的方法，其特征在于，步驟(1)～(3)中所述誘導培養的條件為：先進行暗培養，再進行光照培養；所述誘導培養的溫度獨立為24～25℃，相對濕度獨立為85％～95％；所述光照培養的強度獨立為2000～3000lx，光照周期獨立為14～18h/d。9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述誘導培養的總時間為4～5周；步驟(2)中所述誘導培養的總時間為3～4周；步驟(3)中所述誘導培養的總時間為3～4周；其中，步驟(1)～(3)的暗培養時間獨立為5～10d。
技術總結
本發明提供了一種
