一種體外制備血小板的方法及其培養基與流程
1.本發明涉及干細胞分化領域，具體涉及臍帶血造血干細胞的分離、純化、增殖和分化。更具體地，涉及一種體外制備血小板的方法。
背景技術：
2.血小板是血液組成的部份，分化自骨髓當中的巨核細胞。血小板在臨床主要用于血液腫瘤疾病，亦可應用于其他腫瘤疾病、敗血癥、內臟出血等。此外，血小板于再生醫療被廣泛應用，有助于傷口復原、組織修護、抑制發炎等，部分眼科疾病亦會使用血小板眼藥水進行角膜修護或干眼癥。
3.血小板是巨核細胞成熟后胞質脫落產生的膜狀結構，在體外生存期較短，而在骨髓中，巨核細胞的含量極低(占有核細胞的0.01％)，難于大量獲得并進行原代培養。因此，可以透過體外培養提高巨核細胞的產量，進而高效率地得到血小板是目前迫切需要解決的問題。
4.現有技術中，血小板的主要來源為無償獻血與體外細胞培養。前者從血液中離心、壓板等程序分離出血小板，然而該技術受限于血液的供給量，且血小板的量取決于原血源，較為不穩定；而后者則可以從ips細胞技術、臍帶血(samarkanova等，blood transfus.2020,18(3):208
–
216)來制備血小板。ips細胞技術雖然可以誘導細胞轉化為巨核細胞、血小板，但仍需嘗試誘導條件，且穩定細胞狀態、有效率地取得巨核細胞與血小板會是技術難點，耗時且耗費用。因此，近年國外已有從臍帶血制備血小板的技術，并將此技術試圖應用于歐洲gmp制程(good manufacturing practice)(lawrence等，npj regen.med.2021,6:27)。
5.目前國內臍帶血在血液制備應用多用于制備血漿，例如富血小板血漿(platelet-rich plasma，prp)，再從離心血漿提取血小板。因此，現有技術較缺乏生產量高、純度高、血小板分化效率高的方法。
技術實現要素：
6.本發明可以透過巨核細胞培養基、血小板成熟培養基，從臍帶血造血干細胞穩定制備大量、純度高的血小板。
7.為了達到上述目的，本發明提供以下技術方案：
8.本發明提供一種體外制備血小板的方法，包括以下步驟：
9.1)分離出血液樣本中的干細胞；
10.2)于巨核細胞分化培養基中培養；
11.3)更換為血小板成熟培養基；
12.4)收集成熟的血小板。
13.優選地，血液樣本為人臍帶血。
14.優選地，上述分離純化方法為透過磁力分離血液樣本中的干細胞。
15.優選地，上述干細胞為cd34
+
人造血干細胞。
16.在一優選的實施方案中，巨核細胞分化培養基包含人血小板生成素和干細胞因子。
17.優選地，巨核細胞分化培養基由sfem培養基、50-100μg/ml人血小板生成素(human thrombopoietin,htpo)、50μg/ml干細胞因子(stem cell factor,scf)組成。
18.更優選地，巨核細胞分化培養基包含sfem培養基、100μg/ml人血小板生成素、50μg/ml干細胞因子組成。
19.優選地，巨核細胞分化培養基還包含rock抑制劑。
20.更優選地，上述rock抑制劑為y-27632。
21.更優選地，巨核細胞分化培養基包含10μm y-27632。
22.在一優選的實施方案中，血小板成熟培養基包含its、谷氨酰胺(glutamax)、硫代甘油(monothioglycerol)、抗壞血酸(ascorbic acid)、fbs、青鏈霉素(penicillin-streptomycin，ps)、肝素(heparin)、人血小板生成素(human thrombopoietin,htpo)、rock抑制劑、adam17抑制劑、ahr拮抗劑。
23.優選地，血小板成熟培養基包含imdm培養基(iscove modified dulbecco medium,imdm)、1
×
胰島素-轉鐵蛋白-硒、1
×
谷氨酰胺、0.45mm硫代甘油、50g/ml抗壞血酸、15％fbs、1
×
青鏈霉素、10u/ml肝素、50μg/ml人血小板生成素、10μm y-27632、15μmkp-457和0.75μm sr-1。
24.本發明還提供一種分化培養基，上述分化培養基包含sfem培養基、50-100μg/ml人血小板生成素、50μg/ml干細胞因子。
25.優選地，上述分化培養基包含sfem培養基、100μg/ml人血小板生成素、50μg/ml干細胞因子。
26.更優選地，上述分化培養基還包含rock抑制劑。
27.更優選地，上述rock抑制劑為y-27632。
28.另一方面，本發明提供一種成熟培養基，上述成熟培養基包含胰島素-轉鐵蛋白-硒、谷氨酰胺、硫代甘油、抗壞血酸、fbs、青鏈霉素、肝素、人血小板生成素、rock抑制劑、adam17抑制劑、ahr拮抗劑。
29.優選地，上述成熟培養基包含imdm培養基、1
×
胰島素-轉鐵蛋白-硒、1
×
谷氨酰胺、0.45mm硫代甘油、50g/ml抗壞血酸、15％fbs、1
×
青鏈霉素、10u/ml肝素、50μg/ml人血小板生成素、10μm y-27632、15μm kp-457、0.75μm sr-1。
30.本發明提供大規模制備血小板的步驟：
31.首先，將孵育好的人臍血干細胞加入聚苯乙烯管中，并將該管置于磁極進行分離，去除上清液，重復該步驟三次即可得到純度高的造血干細胞特定亞(cd34
+
)。
32.接著，將高純度的cd34
+
造血干細胞進行體外增殖培養，得到大量的高純度cd34
+
造血干細胞，利于得到大量的巨核細胞。
33.將上述得到的cd34
+
造血干細胞種于巨核細胞分化培養基。在一些實施方式中，巨核細胞分化培養基為在sfem培養基中加入50-100μg/ml人血小板生成素與50μg/ml干細胞因子；亦可加入10μm y-27632，以減少細胞凋亡。利用該巨核細胞分化培養基培養11天可獲得最高產量的巨核細胞。
34.其后將巨核細胞的培養基更換為血小板成熟培養基，以促進血小板的成熟，在一些實施方式中，其中使用優化的成熟培養基，其內容為imdm培養基中加入1
×
its、1
×
谷氨酰胺、0.45mm硫代甘油、50g/ml抗壞血酸、15％高過濾fbs、1
×
青鏈霉素、10u/ml肝素、50μg/ml人血小板生成素、10μm y-27632、15μm kp-457、0.75μm sr-1。
35.血小板培養過程可將培養基水平搖震，搖動速度90rpm，并置于攝氏37度、5％co2的環境；抑或可對細胞進行攪拌培養，攪拌速度100rpm，并置于攝37度、5％co2的環境。培養血小板6-12天后，離心收集、檢測成熟的血小板。
36.與現有技術相比，本發明的有益效果在于：
37.1.從血液樣本中分離出干細胞亞cd34
+
，使得起始細胞純度更高，以更好實現下游分化，如巨核細胞的分化。
38.2.優化的巨核細胞分化培養基，能夠保證產生更高質量和純度的巨核細胞，利于血小板的產量與純度。
39.3.優化的血小板成熟培養基，以此提高血小板的分化效率。
附圖說明
40.構成本技術的一部分的說明書附圖用來提供對本發明的進一步理解，本發明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成本發明的不當限定。在附圖中：
41.圖1是表示體外制備血小板的流程。從臍血中通過磁力分選cd34
+
hpc作為起始細胞，之后誘導hpc分化為巨核細胞，在優化的成熟培養基作用下，將巨核細胞進一步成熟產生血小板。
42.圖2是表示檢測分化血小板的體外凝集功能結果。從體外分化的血小板，在cacl2、adp和纖維蛋白原(fibrinogen)存在的條件下，可形成交織的網狀結構，且隨著cacl2的濃度增加，交織效果越充分。
具體實施方式
43.以下結合附圖與具體實施例對本發明做進一步的描述，本發明的保護內容不局限于以下實施例。還應該理解，本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發明的保護范圍。在不背離發明構思的精神和范圍下，本領域技術人員能夠想到的變化和優點都被包括在本發明中，并且以所附的權利要求及其任何等同物為本發明的保護范圍。
44.本文中使用的所有技術和科學術語具有被本發明所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。在其他情況下，本文使用的某些術語會在說明書中闡明其含義。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，均為本領域技術人員的普遍知識和公知常識。本技術中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。
45.在本發明的說明書和權利要求書中，除非文中另外明確指出，單數形式“一個”、“一”和“這個”包括復數形式。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，均為本領域技術人員的普遍知識和公知常識，或按照制造廠商所建議的條件。如無特別說明，實施例所用的所有材料和試劑均為市售產品。
46.通過以下詳細說明結合附圖可以進一步理解本發明的特點和優點。所提供的實施
例僅是對本發明方法的說明，而不以任何方式限制本發明揭示的其余內容。
47.本發明旨在提供一種大規模制備血小板的方法，通過人臍血分離獲得cd34
+
造血干細胞，并通過造血干細胞的增殖擴大起始細胞的數量，之后進一步使用優化的巨核細胞分化及血小板成熟培養基，以及血小板生成的物理條件，建立高純度、高產量與高分化效率的血小板體外制備的方法。
48.實施例1：人臍血造血干細胞特定亞(cd34
+
hpc)的分離純化
49.1)采集臍血于抗凝管中并混勻，室溫短暫保存或運輸；
50.2)于無菌環境下將臍血收集于50ml離心管中，最大收集量為17ml；
51.3)按照5μl/ml臍帶血的比例，將rosettesep cocktail(stemcell,#17897)加入臍血中，混勻并室溫孵育10分鐘；
52.4)加入等體積稀釋緩沖液(sb buffer：pbs中加入2％fbs和1mm edta)并混勻；
53.5)在50ml sepmate
tm-50(stemcell，386450-1)中加入15ml密度梯度離心液lymphoprep(stemcell，#07801)，然后將上一步稀釋后的臍血倒入；
54.6)1200g，10分鐘離心，分層后將上層液體快速倒入新的50ml離心管中；
55.7)用sb buffer將此離心管加滿；
56.8)300g，10分鐘離心，小心去除上清液，并加入0.5ml sb buffer懸浮細胞；
57.9)將細胞加入12
×
75mm 5ml圓底聚苯乙烯管中；
58.10)按照100μl/ml的比例加入selection cocktail(stemcell,#17897)，混勻于室溫孵育10分鐘；
59.11)按照50μl/ml的比例加入rapidspheres(stemcell,#17897)，混勻并于室溫孵育1分鐘；
60.12)加入適量sb buffer，使得終體積為2.5ml；
61.13)將聚苯乙烯管置于磁極(stemcell，#18000)中，室溫放置3分鐘以分離細胞，之后去除上清并再次加入適量sb buffer，使得終體積為2.5ml；
62.14)再重復步驟13)三次；
63.15)將細胞轉移至新的15ml離心管中，300g離心10分鐘，低降速，之后去除上清；
64.16)用250μl sefm培養基(stemcell，#09650)懸浮細胞并計數。
65.實施例2：cd34
+
hpc的體外培養及擴增
66.1)按照每2ml擴增培養基加入2
×
104個細胞的比例將細胞種于低吸附6孔板中，于攝氏37度，5％co2下培養，每2-3天換液一次，每次更換3/4的新鮮擴增培養基；
67.2)擴增培養基：sfem培養基中加入1/10體積的stemspan
tm
擴增添加物(stemcell，#02691)；
68.3)細胞在擴增培養基中進行培養，約3天傳代一次，每次按照1:5比例進行離心(1000rpm，5分鐘，常溫)傳代。從使用擴增培養基開始計算，總體擴增時間不超過12天；
69.4)每兩天對細胞進行計數，以記錄細胞的倍增曲線；
70.5)對細胞進行cd34(bd biosciences，340669)和/或cd45(bdpharmingen，555482)染，通過流式細胞分析或免疫熒光實驗以確定cd34
+
hpc的比例。
71.實施例3：人臍血來源血小板的制備
72.3.1巨核細胞的分化：
73.按照每2ml分化培養基加入5
×
105個細胞的比例將cd34
+
hpc種于低吸附6孔板中，于攝氏37度，5％co2下培養，每2-3天換液一次，每次更換3/4的新鮮分化培養基。
74.分化培養基：sfem培養基中加入50μg/ml人血小板生成素(human thrombopoietin，htpo；peprotech,300-18)和50μg/ml干細胞因子(stem cell factor，scf；peprotech,300-07)。
75.優化方法一：分化培養基中人血小板生成素的含量升高至100μg/ml，可提高巨核細胞分化效率。
76.優化方法二：分化培養基中加入10μm y-27632(selleck,s1049)，可減少凋亡細胞數量。
77.3.2巨核細胞的檢測：
78.從使用分化培養基開始計算，巨核細胞總分化時間至11天左右時可達到最高產量，其純度可以對細胞進行cd41a(bd pharmingen,555467)和cd42b(bd pharmingen,555472)染后，進行流式細胞分析或免疫熒光實驗以確定。
79.3.3血小板的成熟：
80.將巨核細胞的培養基更換為成熟培養基，以促進血小板的成熟，一般在更換成熟培養基6-12天后進行血小板的收集和功能檢測。
81.成熟培養基：iscove modified dulbecco medium(imdm；thermofisher,12440053)中加入1
×
胰島素-轉鐵蛋白-硒(its，insulin-transferrin-selenium)(thermofisher，41400045)、1
×
谷氨酰胺(glutamax；thermofisher,35050-061)、0.45mm硫代甘油(monothioglycerol,sigma,m6145)、50g/ml抗壞血酸(ascorbic acid,sigma,a4544)、15％高過濾(highly filtered)的fbs(gibico,10100147)，1
×
青鏈霉素(penicillin-streptomycin)(thermofisher,15140122)、10u/ml肝素(heparin；stemcell,#07980)、50μg/ml人血小板生成素(htpo)、10μm y-27632，15μm kp-457(mce,hy-110397)、0.75μm sr-1(merck millipore,182706)。
82.優化方法一：更換成熟培養基后，將細胞放置于水平搖床上進行搖震培養，轉速90rpm，攝氏37度，5％co2；此方法成熟效率高于靜置培養。
83.優化方法二：更換成熟培養基后，將細胞放置于50ml離心管中，總培養體系20ml，加入攪拌槳(十字形，4葉，葉寬0.8cm)對細胞進行攪拌培養，攪拌速度100rpm，攝氏37度，5％co2；此方法血小板的成熟效率最高。
84.實施例4：血小板的體外凝集功能檢測
85.通過兩步離心法(800rpm，5分鐘收集上清，上清再次2500rpm離心10分鐘后收集沉淀)收集成熟的血小板。對血小板計數后進行體外凝集功能檢測：每100μl反應體系中，加入1-100
×
105血小板，1-10mm cacl2，10μm adp(sigma，a2754-500mg)和10μg/ml纖維蛋白原(fibrinogen；sigma，f3879-100mg)，pbs補齊至100μl。吹打混勻后放入攝氏37度培養箱進行反應，在反應0小時和24小時對細胞進行顯微拍照記錄(結果見圖2)，結果顯示在cacl2、adp和纖維蛋白原(fibrinogen)存在的條件下，可形成交織的網狀結構，且隨著cacl2的濃度增加，交織效果越充分。
86.本發明提及的所有文獻都在本技術中全文引用作為參考。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價
形式的修改同樣落于本技術權利要求書所限定的范圍。
技術特征：
1.一種體外制備血小板的方法，其特征在于，包括以下步驟：1)分離純化血液樣本中的干細胞；2)于巨核細胞分化培養基中培養；3)更換為血小板成熟培養基；4)收集成熟的血小板。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述血液樣本為人臍帶血。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述分離純化步驟為透過磁力分離血液樣本中的干細胞。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述干細胞為cd34
+
人造血干細胞。5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述巨核細胞分化培養基包含人血小板生成素和干細胞因子。6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述巨核細胞分化培養基包含sfem培養基、50-100μg/ml人血小板生成素、50μg/ml干細胞因子。7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述巨核細胞分化培養基包含sfem培養基、100μg/ml人血小板生成素、50μg/ml干細胞因子。8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述巨核細胞分化培養基包含rock抑制劑。9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述rock抑制劑為y-27632。10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述血小板成熟培養基包含胰島素-轉鐵蛋白-硒、谷氨酰胺、硫代甘油、抗壞血酸、fbs、青鏈霉素、肝素、人血小板生成素、rock抑制劑、adam17抑制劑、ahr拮抗劑。11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述血小板成熟培養基包含imdm培養基、1
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胰島素-轉鐵蛋白-硒、1
×
谷氨酰胺、0.45mm硫代甘油、50g/ml抗壞血酸、15％fbs、1
×
青鏈霉素、10u/ml肝素、50μg/ml人血小板生成素、10μm y-27632、15μm kp-457、0.75μm sr-1。
技術總結
本發明提供一種通過體外細胞培養體系制備血小板的方法。該方法涉及分離純化人臍帶血，進而得到人類造血干細胞亞(CD34
