一種竹節參多糖及其制備方法和應用
1.本發明屬于天然提取物技術領域，具體涉及一種竹節參多糖及其制備方法和應用。
背景技術：
2.冠狀病毒（coronavirus，cov），是一種具有囊膜的正鏈rna病毒，因其囊膜表面的棒狀凸起形如花冠，故名冠狀病毒。根據血清學特性和遺傳學差異，該病毒主要分為α、β、γ和δ屬，其中β屬中的sars-cov、mers-cov、sars-cov-2均能引起嚴重的呼吸系統疾病。該病毒具有傳染性強、致病性高、變異頻率快和難以防控等特點。人類感染后能引起輕癥至重癥肺炎，導致部分重癥患者死亡，給社會安全和經濟發展帶來巨大的挑戰。目前，對該類病毒的防控措施主要以疫苗注射和抗病毒藥物為主。然而，現有疫苗對不斷變異的毒株抵抗作用有限，且具有滯后性。盡管一些藥物(瑞德西韋、莫那匹納韋、甲磺酸卡莫司他、阿比朵爾等)在方面為covid-19患者贏得了寶貴的時間，但這些藥物的抗病毒作用效果有限，且毒副作用較大，可能導致患者出現惡心、嘔吐、肝酶升高以及肝組織損傷等副反應。因此篩選、尋或開發一類具有普遍適用性的抗冠狀病毒藥物具有重要意義。
3.竹節參（panax japonicus c. a. mey，又名竹節三七、竹節人參、白三七等）為五加科人參屬(panax l.)多年生植物，主要分布于湖北、貴州、云南、陜西、甘肅、安徽等地區，兼具北藥人參和南藥三七的功效，既補氣又補血，被民間譽為“草藥之王”，以根莖入藥，具有活血化瘀，消腫止痛，提高機體免疫力，延緩衰老，并具有護肝、抗炎、抗疲勞、抗腫瘤等療效。目前，對竹節參功效范圍大多集中益氣活血、抗炎鎮痛和增強機體抵抗力等方面。盡管現有技術中有關于竹節參在抗病毒活性方面應用的報道，但其發揮抗病毒藥效的活性成分并不明確。目前，對竹節參多糖的研究主要集中在調血脂和抗腫瘤方面，在預防和病毒方面的應用尚未見報道。
技術實現要素：
4.有鑒于此，本發明的目的在于提供一種竹節參多糖及其制備方法和應用，制備得到多糖組分，具有抗新型冠狀病毒的活性。
5.本發明提供了一種竹節參多糖，單糖組成包括以下種類的單糖：鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸和甘露糖；所述木糖、葡萄糖醛酸和甘露糖的總摩爾量與半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖的摩爾量之比為（0.45~0.92）：（1.63~3.12）：（0.99~1.41）：（2.62~3.54）：（2.40~2.92）。
6.優選的，所述竹節參多糖是一種rg-i型果膠,由[
→
2)-α-l-rhap-(1
→
4)-α-d-galpa-(1
→
]二糖重復單位交替連接形成主鏈，在rhap的o-4位形成分支連接有側鏈，主鏈分支度為45%~65%，所述側鏈包括以下成分：α-l-1,5-阿拉伯聚糖、β-d-1,4-半乳聚糖、i型阿拉伯半乳聚糖和ii型阿拉伯半乳聚糖；
所述竹節參多糖的分子量在50.0 kda~100.0 kda之間，所述竹節參多糖包括以下摩爾百分比的單糖：阿拉伯糖26.2%~35.4%、半乳糖24.0%~29.2%、半乳糖醛酸16.3%~31.2%、鼠李糖9.9%~14.1%、木糖1.5%~4.7%、葡萄糖醛酸1.8%~3.0%和甘露糖1.2%~1.5%。
[0007]
本發明提供了所述竹節參多糖的制備方法，包括以下步驟：1）竹節參干燥根莖經過水提醇沉，將醇沉后的體系固液分離，收集固相，得到竹節參總多糖；2）將步驟1）中所述竹節參總多糖溶解，上樣于離子交換層析柱，依次使用蒸餾水、0.2 m氯化鈉溶液、0.3 m氯化鈉溶液洗脫，收集0.2 m氯化鈉溶液洗脫組分并采用截留分子量為3500 da的透析袋透析除鹽，得到竹節參多糖；3）將步驟2）中所述竹節參多糖溶解后上樣于凝膠排阻層析柱，用0.15 m氯化鈉溶液洗脫后，收集有效的譜峰所對應的洗脫溶液，經除鹽和凍干，得到精制的竹節參多糖。
[0008]
優選的，步驟1）中所述醇沉時體系中乙醇水溶液的終濃度為體積百分含量的50%~80%。
[0009]
優選的，步驟2）中離子交換層析柱的上樣線性流速為15 ~30 ml/min，洗脫線性流速為15 ~60 ml/min；每升離子交換層析柱填料的載樣量不超過50 g。
[0010]
優選的，步驟3）中所述凝膠排阻層析柱的上樣線性流速為2.5~5 ml/min，洗脫線性流速為0.3~0.5 ml/min；上樣溶液的體積不超過凝膠排阻層析柱體積的2%。
[0011]
本發明提供了所述竹節參多糖或所述竹節參多糖的制備方法制備得到竹節參多糖在制備預防和/或新型冠狀病毒感染的藥物中的應用。
[0012]
優選的，所述新型冠狀病毒包括野生型毒株和/或變異型毒株。
[0013]
本發明提供了一種新型冠狀病毒增殖抑制劑，包括所述竹節參多糖和輔料。
[0014]
本發明提供了一種抗新型冠狀病毒藥物，包括所述竹節參多糖和藥學上可接受的輔料。
[0015]
本發明提供了一種竹節參多糖，本發明以竹節參為原料經過水提醇沉方法提取總多糖，再依次經過離子交換層析柱（cl-型）和凝膠排阻層析柱分離純化獲得。所述竹節參多糖在細胞水平驗證具有抑制新型冠狀病毒sars-cov-2等多種新型冠狀病毒的增殖復制作用，能夠廣泛抗新型冠狀病毒。此外，竹節參多糖從中藥中提取得到，屬于天然活性物質，毒副作用小，具有較高的使用安全性。
[0016]
綜上，竹節參多糖具有抑制新型冠狀病毒感染的功效，可作為潛在的抗新型冠狀病毒的候選藥物，為病毒傳播的防控和抗病毒藥物的研發提供了獲選天然的候選分子。
附圖說明
[0017]
圖1為竹節參多糖分子量分布的高效凝膠排阻譜檢測結果圖；圖2為竹節參多糖單糖組成的高效液相譜檢測結果圖；圖3為竹節參多糖的核磁共振波譜（
13
c nmr）圖；圖4為竹節參多糖對mdck細胞生長安全性的影響結果圖；圖5為竹節參多糖抑制新型冠狀病毒野生型毒株感染力的檢測結果圖；圖6為竹節參多糖抑制新型冠狀病毒變異型感染力的檢測結果圖。
具體實施方式
[0018]
本發明提供了一種竹節參多糖，單糖組成包括以下種類的單糖：鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸和甘露糖；所述木糖、葡萄糖醛酸和甘露糖的總摩爾量與半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖的摩爾量之比為（0.45~0.92）：（1.63~3.12）：（0.99~1.41）：（2.62~3.54）：（2.40~2.92）。
[0019]
在本發明中，所述竹節參多糖由[
→
2)-α-l-rhap-(1
→
4)-α-d-galpa-(1
→
]二糖重復單位交替連接形成主鏈，在rhap的o-4位形成分支連接有側鏈，主鏈分支度為45%~65%，所述側鏈包括以下成分：α-l-1,5-阿拉伯聚糖、β-d-1,4-半乳聚糖、i型阿拉伯半乳聚糖和ii型阿拉伯半乳聚糖。
[0020]
在本發明實施例中，所述竹節參多糖的分子量優選為50.0 kda~100.0 kda，所述竹節參多糖包括以下摩爾百分比的單糖：阿拉伯糖26.2%~35.4%、半乳糖24.0%~29.2%、半乳糖醛酸16.3%~31.2%、鼠李糖9.9%~14.1%、木糖1.5%~4.7%、葡萄糖醛酸1.8%~3.0%和甘露糖1.2%~1.5%。
[0021]
本發明提供了所述竹節參多糖的制備方法，包括以下步驟：1）竹節參干燥根莖經過水提醇沉，將醇沉后的體系固液分離，收集固相，得到竹節參總多糖；2）將步驟1）中所述竹節參總多糖溶解，上樣于離子交換層析柱，依次使用蒸餾水、0.2 m氯化鈉溶液、0.3 m氯化鈉溶液洗脫，收集0.2 m氯化鈉溶液洗脫組分并采用截留分子量為3500 da的透析袋透析除鹽，得到竹節參多糖；3）將步驟2）中所述竹節參多糖溶解后上樣于凝膠排阻層析柱，用0.15 m氯化鈉溶液洗脫后，收集有效的譜峰所對應的洗脫溶液，經除鹽和凍干，得到精制的竹節參多糖。
[0022]
本發明首先將竹節參干燥根莖經過水提醇沉，將醇沉后的體系固液分離，收集固相，得到竹節參總多糖。
[0023]
在本發明中，所述竹節參干燥根莖的重量與水的體積比為1:10~20（kg/l），更優選為1:15。所述水提時，水溫優選為85~100℃，更優選為90~95℃。所述水提的次數優選為2~4次，更優選為3次。每次水提的時間優選為2~4h，更優選為3h。合并三次水提得到的提取液，減壓濃縮至原體積的1/15~1/60，在4000 r/min的條件下離心20 min~30 min，收集上清液。得到上清液后進行醇沉。所述醇沉時體系中乙醇的終濃度優選為體積百分含量50%~80%，更優選為60%~70%。所述醇沉的時間優選為10~14h，更優選為12h。
[0024]
得到竹節參總多糖后，本發明將竹節參總多糖溶解，上樣于離子交換層析柱，依次使用蒸餾水、0.2 m氯化鈉溶液、0.3 m氯化鈉溶液洗脫，收集0.2 m氯化鈉溶液洗脫組分采用截留分子量為3500 da的透析袋透析除鹽，得到竹節參多糖。
[0025]
在本發明中，溶解后的竹節參總多糖溶液的濃度優選為50~100 g/l，更優選為60~90 g/l，進一步優選為70~80 g/l，最優選為75 g/l。
[0026]
在本發明中，離子交換層析柱的上樣流速優選為15~30 ml/min，更優選為20~25 ml/min；每升填料的載樣量不超過50 g。在本發明實施例中，所述離子交換層析柱購自博格隆（上海）生物技術有限公司，規格為5.0
×
30.0 cm；填料優選為deae-纖維素，購自上海源葉生物科技有限公司。
[0027]
在本發明中，所述洗脫時，線性流速優選為15~60 ml/min，更優選為30 ~45 ml/min。在本發明實施例中，所述蒸餾水、0.2 m氯化鈉溶液和0.3 m氯化鈉溶液的洗脫體積為5l。
[0028]
得到竹節參多糖后，本發明將所述竹節參多糖溶解后上樣于凝膠排阻層析柱，用0.15 m氯化鈉溶液洗脫后，收集有效的譜峰所對應的洗脫溶液，經除鹽和凍干，得到精制的竹節參多糖。
[0029]
在本發明中，溶解后的竹節參多糖溶液的濃度優選為50~100 g/l，更優選為60~90 g/l，進一步優選為70~80 g/l，最優選為75 g/l。溶解后，經過離心，取上清液進行上樣。所述離心的轉速優選為10000~12000 rpm，更優選為12000 rpm。所述離心的時間優選為20~30 min，更優選為25 min。
[0030]
在本發明中，所述凝膠排阻層析柱的上樣流速優選為2.5 ml/min~5 ml/min，更優選為3 ml/min~4 ml/min。上樣溶液的體積不超過凝膠排阻層析柱體積的2%。所述洗脫時，線性流速優選為0.3~0.5 ml/min，更優選為0.4 ml/min。在本發明實施例中，所述凝膠排阻層析柱優選為sepharose cl-6b凝膠排阻層析柱，層析柱購自博格隆（上海）生物技術有限公司，規格為4.6
×
100.0 cm；填料購自美國通用醫療公司（ge healthcare）。由高效凝膠排阻譜檢測圖譜可見，在13~21 min內出現多糖對應的譜峰。
[0031]
本發明提供了所述竹節參多糖或所述竹節參多糖的制備方法制備得到竹節參多糖在制備預防和/或新型冠狀病毒感染的藥物中的應用。
[0032]
在本發明中，所述竹節參多糖還優選以竹節參多糖的衍生物的形式存在。所述竹節參多糖的衍生物包括竹節參多糖的鹽類衍生物、竹節參多糖的溶劑化物和/或竹節參多糖的水合物。所述竹節參多糖的衍生物包括竹節參多糖的鹽類衍生物、竹節參多糖的溶劑化物和/或竹節參多糖的水合物。所述竹節參多糖的鹽類衍生物優選為竹節參多糖鈉鹽、竹節參多糖鉀鹽和竹節參多糖銨鹽。所述竹節參多糖的溶劑化物優選為竹節參多糖與甘油、二甲基亞砜、乙醇、丙二醇和聚乙二醇中的至少一種溶劑形成的溶劑化物。
[0033]
在本發明中，所述新型冠狀病毒（sars-cov-2）包括野生型毒株和/變異型毒株。所述變異型毒株優選包括奧密克戎毒株。
[0034]
在本發明中，所述精制的竹節參多糖在細胞水平證明，對細胞無毒副作用，保證使用安全性。同時，在細胞水平上，所述竹節參多糖能夠抑制新型冠狀病毒的復制。可見，所述竹節參多糖具有抗新型冠狀病毒感染的作用，擴寬了竹節參多糖的藥物學功效，為抗病毒藥物的制備提供了新思路。
[0035]
本發明提供了一種病毒增殖抑制劑，包括所述竹節參多糖和輔料。
[0036]
在本發明中，所述竹節參多糖還優選以竹節參多糖的衍生物的形式存在。所述竹節參多糖的衍生物包括竹節參多糖的鹽類衍生物、竹節參多糖的溶劑化物和/或竹節參多糖的水合物。
[0037]
本發明對所述抑制劑的輔料沒有特殊限制，采用本領域所熟知的抑制劑的輔料即可。本發明對所述抑制劑的制備方法沒有特殊限制，采用本領域所熟知的抑制劑的制備方法即可。所述抑制劑的有效成分含量為大于或等于10mg/ml。
[0038]
本發明提供了一種抗病毒藥物，包括所述竹節參多糖和藥學上可接受的輔料。
[0039]
在本發明中，所述竹節參多糖還優選以竹節參多糖的衍生物的形式存在。所述竹
節參多糖的衍生物包括竹節參多糖的鹽類衍生物、竹節參多糖的溶劑化物和/或竹節參多糖的水合物。所述竹節參多糖的鹽類衍生物優選為竹節參多糖鈉鹽、鉀鹽和銨鹽。所述竹節參多糖的溶劑化物優選為竹節參多糖的甘油、二甲基亞砜、乙醇、丙二醇、聚乙二醇溶劑化物。
[0040]
本發明對抗病毒藥物的輔料沒有特殊限制，采用本領域所熟知的藥物的輔料即可。本發明對抗病毒藥物的制備方法沒有特殊限制，采用本領域所熟知的藥物的制備方法即可。
[0041]
下面結合實施例對本發明提供的一種竹節參多糖及其制備方法和應用進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發明保護范圍的限定。
[0042]
實施例11.稱取中藥竹節參（干燥根莖）1000 g，使用18 l蒸餾水在90℃的條件下提取3 h后收集提取液，重復提取3次。合并三次的提取液，在溫度為60℃，真空度為0.1 mpa的條件下進行減壓濃縮至終體積為2 l。將濃縮后的提取液進行離心（4000 rpm
×
30 min），收集上清后向溶液中加入6 l的95%乙醇，靜置沉淀12 h。進一步離心（4000 rpm
×
30 min）以收集沉淀，依次向沉淀中加入95％乙醇、無水乙醇、乙醚，充分攪拌后離心，沉淀減壓干燥過夜。共得到167 g竹節參總多糖，記為wjp。
[0043]
2.稱取40 g的wjp溶解于400 ml的蒸餾水中，離心（4000 rpm
×
30 min）后上樣于deae-纖維素離子交換層析柱（cl-型；5.0
×
30.0 cm），上樣流速為15 ml/min。依次使用5 l的蒸餾水、5 l的0.2 m氯化鈉溶液和5 l的0.3 m氯化鈉溶液進行洗脫，洗脫流速為15 ml/min，收集0.2 m氯化鈉溶液的洗脫組分，減壓濃縮后使用透析袋進行透析除鹽（截留分子量為3500 da），冷凍干燥后得到14 g的竹節參多糖，記為wjpa。
[0044]
3.稱取500 mg的wjpa溶解于5 ml的蒸餾水中，離心（12000 rpm
×
30 min）后上樣于sepharose cl-6b凝膠排阻層析柱（4.6
×
100.0 cm），上樣流速為2.5 ml/min，使用0.15 m氯化鈉溶液進行洗脫，洗脫流速為0.4 ml/min，利用自動部分收集器收集樣品，每 20 min收集一管。利用苯酚-硫酸顯測定洗脫曲線，收集合適的洗脫峰，減壓濃縮后使用截留分子量為3500 da的透析袋進行透析除鹽，凍干后得到156 mg的竹節參多糖，記為wjpa-b。
[0045]
4. wjpa-b的高效凝膠排阻譜檢測結果如圖1所示，平均分子量為68.0 kda；單糖組成的高效液相檢測結果如圖2所示，由阿拉伯糖（30.5%）、半乳糖（28.5%）、半乳糖醛酸（20.9%）、鼠李糖（14.1%）、葡萄糖醛酸（2.8%）、木糖（2.0%）和甘露糖（1.2%）組成；其
13
c nmr譜圖如圖3所示，由[
→
2)-α-l-rhap-(1
→
4)-α-d-galpa-(1
→
]二糖重復單位交替連接形成主鏈，在rhap的o-4位形成分支連接有側鏈，主鏈分支度為60%，所述側鏈涉及以下成分：α-l-1,5-阿拉伯聚糖、β-d-1,4-半乳聚糖、i型阿拉伯半乳聚糖和ii型阿拉伯半乳聚糖。
[0046]
實施例21.稱取中藥竹節參（干燥根莖）1000 g，使用16 l蒸餾水在90℃的條件下提取3 h后收集提取液，重復提取3次。合并三次的提取液，在溫度為60℃，真空度為0.1 mpa的條件下進行減壓濃縮至終體積為2 l。將濃縮后的提取液進行離心（4000 rpm
×
30 min），收集上清后向溶液中加入3 l的95%乙醇，靜置沉淀12 h。進一步離心（4000 rpm
×
30 min）以收集沉淀，依次向沉淀中加入95％乙醇、無水乙醇、乙醚，充分攪拌后離心，沉淀減壓干燥過夜。共得到135 g竹節參總多糖，記為wjp。
[0047]
2.稱取40 g的wjp溶解于400 ml的蒸餾水中，離心（4000 rpm
×
30 min）后上樣于deae-纖維素離子交換層析柱（cl-型；5.0
×
30.0 cm），上樣流速為15 ml/min。依次使用5 l的蒸餾水、5 l的0.2 m氯化鈉溶液和5 l的0.3 m氯化鈉溶液進行洗脫，洗脫流速為30 ml/min，收集0.2 m氯化鈉溶液的洗脫組分，減壓濃縮后使用透析袋進行透析除鹽（截留分子量為3500 da），冷凍干燥后得到16.5 g的竹節參多糖，記為wjpa。
[0048]
3.稱取500 mg的wjpa溶解于5 ml的蒸餾水中，離心（12000 rpm
×
30 min）后上樣于sepharose cl-6b凝膠排阻層析柱（4.6
×
100.0 cm），上樣流速為2.5 ml/min，使用0.15 m氯化鈉溶液進行洗脫，洗脫流速為0.4 ml/min，利用自動部分收集器收集樣品，每20 min收集一管。利用苯酚-硫酸顯測定洗脫曲線，收集合適的洗脫峰，減壓濃縮后使用截留分子量為3500 da的透析袋進行透析除鹽，凍干后得到173 mg的竹節參多糖，記為wjpa-b。
[0049]
4. wjpa-b的高效凝膠排阻譜檢測結果如圖1所示，平均分子量為83.0 kda；單糖組成的高效液相檢測結果如圖2所示，由阿拉伯糖（35.4%）、半乳糖（29.2%）、半乳糖醛酸（16.3%）、鼠李糖（9.9%）、木糖（4.7%）、葡萄糖醛酸（3.0%）和甘露糖（1.5%）組成；
13
c nmr譜圖如圖3所示，由[
→
2)-α-l-rhap-(1
→
4)-α-d-galpa-(1
→
]二糖重復單位交替連接形成主鏈，在rhap的o-4位形成分支連接有側鏈，主鏈分支度為65%，所述側鏈涉及以下成分：α-l-1,5-阿拉伯聚糖、β-d-1,4-半乳聚糖、i型阿拉伯半乳聚糖和ii型阿拉伯半乳聚糖。
[0050]
實施例31.稱取中藥竹節參（干燥根莖）1000 g，使用20 l蒸餾水在90℃的條件下提取3 h后收集提取液，重復提取3次。合并三次的提取液，在溫度為60℃，真空度為0.1 mpa的條件下進行減壓濃縮至終體積為2 l。將濃縮后的提取液進行離心（4000 rpm
×
30 min），收集上清后向溶液中加入8 l的95%乙醇，靜置沉淀12 h。進一步離心（4000 rpm
×
30 min）以收集沉淀，依次向沉淀中加入95％乙醇、無水乙醇、乙醚，充分攪拌后離心，沉淀減壓干燥過夜。共得到183 g竹節參總多糖，記為wjp。
[0051]
2. 稱取40 g的wjp溶解于400 ml的蒸餾水中，離心（4000 rpm
×
30 min）后上樣于deae-纖維素離子交換層析柱（cl
??
型；5.0
×
30.0 cm），上樣流速為15 ml/min。依次使用5 l的蒸餾水、5 l的0.2 m氯化鈉溶液和5 l的0.3 m氯化鈉溶液進行洗脫，洗脫流速為45 ml/min，收集0.2 m氯化鈉溶液的洗脫組分，減壓濃縮后使用透析袋進行透析除鹽（截留分子量為3500 da），冷凍干燥后得到11.5 g的竹節參多糖，記為wjpa。
[0052]
3. 稱取500 mg的wjpa溶解于5 ml的蒸餾水中，離心（12000 rpm
×
30 min）后上樣于sepharose cl-6b凝膠排阻層析柱（4.6
×
100.0 cm），上樣流速為2.5 ml/min，使用0.15 m氯化鈉溶液進行洗脫，洗脫流速為0.4 ml/min，利用自動部分收集器收集樣品，每20 min收集一管。利用苯酚-硫酸顯測定洗脫曲線，收集合適的洗脫峰，減壓濃縮后使用截留分子量為3500 da的透析袋進行透析除鹽，凍干后得到144 mg的竹節參多糖，記為wjpa-b。
[0053]
4. wjpa-b的高效凝膠排阻譜檢測結果如圖1所示，平均分子量為52.0 kda；單糖組成的高效液相檢測結果如圖2所示，由阿拉伯糖（26.2%）、半乳糖（24.0%）、半乳糖醛酸（31.2%）、鼠李糖（14.1%）、葡萄糖醛酸（1.8%）、木糖（1.5%）和甘露糖（1.2%）組成；
13
c nmr譜圖如圖3所示，由[
→
2)-α-l-rhap-(1
→
4)-α-d-galpa-(1
→
]二糖重復單位交替連接形成主鏈，在rhap的o-4位形成分支連接有側鏈，主鏈分支度為45%，所述側鏈涉及以下成分：α-l-1,5-阿拉伯聚糖、β-d-1,4-半乳聚糖、i型阿拉伯半乳聚糖和ii型阿拉伯半乳聚糖。
[0054]
實施例4竹節參多糖對細胞安全性的評價考克斯班尼犬腎臟細胞系（mdck），來源于軍事獸醫研究所病毒學研究室。將于液氮中儲存的mdck細胞取出，連續傳三代將其復蘇，待細胞長勢良好后用于實驗研究。
[0055]
將mdck細胞接種與96孔板，并進行細胞計數，每孔細胞量為1
×
105，在37℃，5％co2恒溫細胞孵育箱中培養過夜。待細胞密度在70~80%時分別加入實施例1、2和3制備的多糖溶液，使其終濃度分別為0μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml，800μg/ml和1000μg/ml，共6個濃度，每個濃度測6個復孔。另設立pbs對照，同樣進行6個重復，繼續培養，每天在顯微鏡下觀察細胞狀態。加藥48h左右時，每孔加入10μl的mtt溶液（5mg/ml），于37℃、5％co2的孵育箱繼續培養3~4小時后，加入100μl二甲基亞砜（dmso）溶液，輕輕混勻后置于37℃、5％co2條件中繼續孵育10~15分鐘后進行od
570
值的測定。使用graphpad prism 8.0對所測數據進行分析，按照公式i計算wjpa-b多糖對mdck細胞生長的活力影響。
[0056]
mdck細胞活力（%）=wjpa-b多糖處理組od
570
值/對照組od
570
值
×
100%
???????
公式i其中，所述對照組od
570
值為濃度0μg/ml的多糖溶液處理組od
570
值。
[0057]
檢測結果如表1和圖4所示，1000μg/ml的wjpa-b多糖在對mdck細胞未觀察到顯著的生長抑制現象。
[0058]
表1 wjpa-b對mdck細胞生長的影響（平均值
±
標準差，單位為%）實施例5竹節參多糖對野生型新型冠狀病毒（sars-cov-2/k005321）在細胞水平復制的影響非洲綠猴腎細胞(vero-e6)來源于軍事獸醫研究所病毒學研究室。竹節參多糖由上述實施例1~3制備得到。將于液氮中儲存的vero-e6細胞取出，連續傳三代將其復蘇，待細胞長勢良好后用于實驗研究。將長勢良好的vero-e6細胞以胰酶消化后進行細胞計數，接種于96孔板，每孔細胞量為1
×
105。在接種12小時內且細胞處于單層狀態時進行藥物作用的
研究。將于-80℃保存新型冠狀病毒野生型毒株（sars-cov-2/k005321）放置于冰上緩慢融化，分別將含量為moi=0.1的病毒稀釋液接種于96孔板中，接毒5h后進行給藥，在96孔板中分別加入50μl梯度濃度的實施例1、2和3制備的竹節參多糖稀釋液（0μg/ml，10μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml），同時還設置細胞對照組即正常培養的細胞。每個處理進行3個重復。將接種后的細胞板放置于37℃，5%的co2培養箱中繼續培養后運用mtt法檢測細胞活性，加藥24h左右時，每孔加入10μl的mtt溶液（5mg/ml），于37℃、5％co2孵育箱培養3~4小時后，加入100μl二甲基亞砜（dmso）溶液，輕輕混勻后置于37℃、5％co2條件中繼續孵育10~15分鐘后對細胞懸液進行od
570
值測定，按照公式ii計算抑制率。
[0059]
抑制率（%）=(wjpa-b多糖處理組od
570
值-病毒對照組od
570
值)
÷
(細胞對照組od
570
值-病毒對照組od
570
值)
×
100%
????????????
公式ii其中，病毒對照組od
570
值是指濃度為0μg/ml的竹節參多糖稀釋液處理組的od值。
[0060]
實驗結果揭示，竹節參多糖對新型冠狀病毒野生型毒株（sars-cov-2/k005321）在細胞水平的復制有一定的抑制作用。檢測結果如表2和圖5所示，三組wjpa-b多糖在vero-e6細胞上對新型冠狀病毒野生型毒株（sars-cov-2/k005321）的半數抑制濃度ec
50
值分別為11.38μg/ml、11.65μg/ml、13.3μg/ml。
[0061]
表2 wjpa-b對新冠病毒野生型毒株（sars-cov-2/k005321）抑制率（平均值
±
標準差，單位為%）實施例6竹節參多糖對變異型新型冠狀病毒（sars-cov-2/omicron ba.1）在細胞水平復制的影響人肝癌細胞(huh7)來源于軍事獸醫研究所病毒學研究室。竹節參多糖是上述實施例1~3制備得到。將于液氮中儲存的huh7細胞取出，連續傳三代將其復蘇，待細胞長勢良好后用于實驗研究。將長勢良好的huh7細胞以胰酶消化后進行細胞計數，接種于96孔板，每孔細胞量為1
×
105。在接種12小時內且細胞處于單層狀態時進行藥物作用的研究。將于-80℃保存變異型新型冠狀病毒毒株（sars-cov-2/omicron ba.1）放置于冰上緩慢融化，分別將
含量為moi=0.1的病毒稀釋液接種于96孔板中，接毒5h后進行給藥，在96孔板中分別加入50μl梯度濃度的實施例1、2和3制備的竹節參多糖溶液（0μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml，800μg/ml，1000μg/ml），進行3個重復。將接種后的細胞板放置于37℃，5%的co2培養箱中繼續培養，6小時加藥處理，并在48h后運用rt-qpcr法（characterization of two heterogeneous lethal mouse-adapted sars-cov-2 variants recapitulating representatinve aspects of human covid-19.front immunol,2022,2,7:13:821664,doi:10.3389,fimmu.2022.821664.）檢測病毒ct值，按照公式iii計算病毒核酸拷貝數。
[0062]
病毒核酸拷貝數=10
│
[(ct-41.02)
÷
3.444]
│
×
33.33
??????
公式iii。
[0063]
實驗結果揭示竹節參多糖對新型冠狀病毒變異型毒株（sars-cov-2/omicron ba.1）在細胞水平的復制有一定的抑制作用。檢測結果如表3和圖6所示，三組wjpa-b多糖可有效降低新型冠狀病毒變異型毒株（sars-cov-2/omicron ba.1）在huh7細胞中的病毒rna拷貝數。
[0064]
表3 wjpa-b對新冠病毒變異型毒株（sars-cov-2/omicron ba.1）拷貝數影響結果（平均值
±
標準差，單位為病毒rna拷貝數/ml）以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
技術特征：
1.一種竹節參多糖，其特征在于，單糖組成包括以下種類的單糖：鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸和甘露糖；所述木糖、葡萄糖醛酸和甘露糖的總摩爾量與半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖的摩爾量之比為（0.45~0.92）：（1.63~3.12）：（0.99~1.41）：（2.62~3.54）：（2.40~2.92）。2.根據權利要求1所述竹節參多糖，其特征在于，所述竹節參多糖是一種rg-i型果膠，由[
→
2)-α-l-rhap-(1
→
4)-α-d-galpa-(1
→
]二糖重復單位交替連接形成主鏈，在rhap的o-4位形成分支連接有側鏈，主鏈分支度為45%~65%，所述側鏈包括以下成分：α-l-1,5-阿拉伯聚糖、β-d-1,4-半乳聚糖、i型阿拉伯半乳聚糖和ii型阿拉伯半乳聚糖；所述竹節參多糖的分子量為50.0 kda~100.0 kda；所述竹節參多糖含有以下摩爾百分比的單糖：阿拉伯糖26.2%~35.4%、半乳糖24.0%~29.2%、半乳糖醛酸16.3%~31.2%、鼠李糖9.9%~14.1%、木糖1.5%~4.7%、葡萄糖醛酸1.8%~3.0%和甘露糖1.2%~1.5%。3.權利要求1或2所述竹節參多糖的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）竹節參干燥根莖經水提醇沉，將醇沉后的體系固液分離，收集固相，得到竹節參總多糖；（2）將步驟1）中所述竹節參總多糖溶解，上樣于離子交換層析柱，依次使用蒸餾水、0.2 m氯化鈉溶液、0.3 m氯化鈉溶液洗脫，收集0.2 m氯化鈉溶液洗脫組分并采用截留分子量為3500 da的透析袋透析除鹽，得到竹節參多糖；（3）將步驟2）中所述竹節參多糖溶解后上樣于凝膠排阻層析柱，用0.15 m氯化鈉溶液洗脫后，收集有效的譜峰對應的洗脫溶液，經除鹽和凍干，得到精制的竹節參多糖。4.根據權利要求3所述竹節參多糖的制備方法，其特征在于，步驟1）中所述醇沉時體系中乙醇的終濃度為體積百分含量50%~80%。5.根據權利要求3所述竹節參多糖的制備方法，其特征在于，步驟2）中離子交換層析柱的上樣線性流速為15~30 ml/min，洗脫線性流速為15 ~60 ml/min；每升離子交換層填料的載樣量不超過50 g。6.根據權利要求3~5任意一項所述竹節參多糖的制備方法，其特征在于，步驟3）中所述凝膠排阻層析柱的上樣線性流速為2.5 ~5 ml/min，洗脫線性流速為0.3~0.5 ml/min；上樣溶液的體積不超過凝膠排阻層析柱體積的2%。7.權利要求1或2所述竹節參多糖或權利要求3~6任意一項所述竹節參多糖的制備方法制備得到竹節參多糖在制備預防和/或新型冠狀病毒感染的藥物中的應用。8.根據權利要求7所述竹節參多糖或所述竹節參多糖的制備方法制備得到竹節參多糖在制備預防和/或新型冠狀病毒感染的藥物中的應用，其特征在于，所述新型冠狀病毒包括野生型毒株和/或變異型毒株。9.一種新型冠狀病毒增殖抑制劑，其特征在于，包括權利要求1或2所述竹節參多糖和輔料。10.一種抗新型冠狀病毒藥物，其特征在于，包括權利要求1或2所述竹節參多糖和藥學上可接受的輔料。
技術總結
本發明提供了一種竹節參多糖及其制備方法和應用，屬于天然提取物技術領域。本發明以竹節參為原料，經水提醇沉的方法提取總多糖，再依次經過離子交換層析柱（Cl-型）和凝膠排阻層析柱分離純化，獲得分子量在50.0 kDa~100.0 kDa之間的多糖。細胞水平實驗表明，所述竹節參多糖具有抑制包括野生型和變異型在內的多種新型冠狀病毒SARS-CoV-2毒株的增殖復制的作用。竹節參多糖從中藥中提取得到，屬于天然活性物質，毒副作用小，具有較高的使用安全性。具有較高的使用安全性。具有較高的使用安全性。
