一種具有降鎘和固氮作用的固氮-降鎘微生物菌劑及其制備方法和應用與流程
7.6。
13.進一步的，發酵培養液中的總接種量為2％。
14.進一步的，生物質材料包括稻殼粉，生物質材料與混合的發酵培養液的固液比為1g:2-10ml。
15.一種采用上述制備方法制備的固氮-降鎘微生物菌劑。
16.固氮-降鎘微生物菌劑的應用，用于降低土壤中有效態鎘含量和提高土壤中的速效氮的含量。
17.本發明的固氮-降鎘微生物菌劑，能夠降低土壤中有效態鎘含量和提高土壤中的速效氮的含量，從而達到減少作物吸收鎘的作用，而且也能夠在一定程度上代替肥料的作用和化學鈍化劑的作用，能夠明顯的提高土壤中的速效氮的含量，也帶來了體系中其它養分的變化，可以速效鉀與速效氮的變化趨勢基本一致，速效磷在投加菌劑前期也有顯著提高。
18.本專利菌劑制作方式簡單，利用吸附方式將微生物固定化，省去了其它微生物固定化方式復雜的制作過程；本專利借助價廉易得的生物質材料作為載體，利用微生物修復土壤鎘污染，與其它處理方式相比，投入成本小；本專利較其它化學處理方式相比，所選材料對環境的擾動性小，在降低土壤有效態鎘的同時也降低了植物對鎘的吸收，而且也能夠在一定程度上代替肥料的作用，具有推廣應用價值。
附圖說明
19.圖1為固氮微生物降鎘功能曲線；
20.圖2為制備的固氮-降鎘微生物菌劑的照片；
21.圖3為土壤體系有效態鎘變化圖(圖中a、b、c、d標準代表是否出現顯著性差異)；
22.圖4為土壤鎘形態分析圖(cd(f1)-酸可提取態鎘cd(f2)-可還原態鎘cd(f3)-可氧化態鎘cd(f4)-殘渣態鎘，ck為空白組，dn為菌劑組)；
23.圖5為土壤體系中養分的測定結果圖(分別是易于植物吸收利用的速效氮、速效磷、速效鉀)；
24.圖6為植株體內鎘含量與植株生長狀況監測圖(*代表顯著性差異)；
25.圖7為植株體內鎘含量測定結果圖(大田試驗，p《0.01，**代表具有顯著性差異)。
具體實施方式
26.以下是本發明的具體實施例并結合附圖，對本發明的技術方案作進一步的描述，但本發明并不限于這些實施例。
27.固氮微生物的富集
28.稱取10g新鮮土壤置于裝有90ml無菌水的三角錐形瓶中，150r/min振蕩2h后，靜置后取上清液制得土壤菌懸液。使用固氮培養基對土壤菌懸液進行富集，得到目的富集產物。菌用甘油放置在-80℃冰箱保存。富集培養基成分見表1。
29.表1固氮培養基成分
[0030][0031]
固氮微生物的降鎘功能驗證
[0032]
配置牛肉膏蛋白胨培養基，一部分用于活化菌，一部分用于降鎘功能驗證實驗。降鎘功能驗證實驗體系中，培養基中含有5mg/lcd
2+
。按照時間梯度(0、1、2、3、4、5、6、7)對樣品進行取樣。采用火焰原子分光光度計測定體系中的cd
2+
。實驗結果見圖1，ck為空白組，n為菌劑組，實驗數據表明，富集的固氮微生物具有很好的降鎘功能，在體系中，1d前后反應即可達到平衡，去除體系中鎘的效率達到70％左右。
[0033]
制備固氮微生物菌劑
[0034]
配置牛肉膏蛋白胨培養基：分別稱取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g，用氫氧化鈉溶液調節至7.4-7.6。
[0035]
將活化后的菌株進行隔夜擴大培養，待培養基體系中od
600
達到1.0-1.2，停止培養。在冷凍離機中(設置離心條件：8000r/min，5min)進行離心，棄上清液，然后用滅菌的去離子水在渦旋儀上進行重懸，收集菌體。
[0036]
將上述菌體與滅菌的稻殼粉進行混合，在搖床上進行振蕩(設置條件180r/min，24h)，使稻殼粉對微生物進行吸附固定，完成微生物菌劑的制備。參見附圖2，為本實施技術方案制備的解磷微生物菌劑。
[0037]
土壤有效態鎘監測
[0038]
按照國家標準《土壤質量有效態鉛和鎘的測定原子吸收法》gb/t23739-2009對盆栽實驗體系中有效態鎘進行監測。測定結果見圖3，可以看出，固氮菌劑的添加能夠降低土壤中有效態鎘含量，在第25d前后趨于穩定。實驗組與空白處理組出現顯著性差異，有效態下降達到27.99％。
[0039]
土壤鎘形態監測
[0040]
按照國際上常用的bcr連續提取法對體系中的鎘形態進行監測，測定方法見表2，測定結果見圖4。
[0041]
表2bcr連續提取法
[0042][0043]
實驗結果表明，體系中酸可提取態鎘、可還原態鎘在固氮菌劑的作用下，含量出現下降，下降比例分別達到25.89％、18.33％；可氧化態鎘、殘渣態鎘在菌劑的作用下，含量出現上升，上升比例分別達到45.23％、》100％，且上升與下降均出現顯著性變化。殘渣態鎘的變化趨勢最為明顯。鎘的生物有效性從酸可提取態到殘渣態依次降低。上述實驗數據表明，鎘的形態從不穩定狀態向穩定狀態發生了轉化，這解釋了上述實驗有效態鎘含量出現下降的原因。
[0044]
土壤養分的測定
[0045]
按照《土壤農業化學分析方法》對體系的n-p-k進行測定。
[0046]
如圖5所示，固氮微生物菌劑的添加，能夠明顯的提高土壤中的速效氮的含量，各個處理時間段均出現顯著性差異，值得注意的是，雖然添加的是固氮微生物菌劑，但由于添加的是微生物菌，菌也帶來了體系中其它養分的變化，可以速效鉀與速效氮的變化趨勢基本一致，速效磷在投加菌劑前期也有顯著提高。這些表明，投加的微生物菌劑不僅能夠起到降低土壤中有效態鎘的作用，也能夠在一定程度上代替肥料的作用。
[0047]
植株體內鎘含量與植株生長狀況監測
[0048]
按照國家標準《食品安全國家標準食品中鎘的測定》gb5009.15-2014對生菜體內鎘含量進行監測，使用直尺測定植株株高，使用天平測定植株鮮重。實驗結果如下圖6，固氮微生物菌劑的添加能夠降低植株體內鎘含量，降幅達到21.07％，并且出現顯著性差異。在降低植株體內鎘含量的同時，固氮微生物菌劑能夠促進植株的生長，在一個生長周期中，植株的鮮重增幅達到23.45％，植株的高度增幅達到25.59％。數據表明，植株的鮮重與植株的高度有一定的正相關關系。植株的生長狀況得到改善，與植株體內鎘含量下降有關，表明微生物菌劑緩解了重金屬鎘對植株的毒害作用，這也有微生物菌劑促進了體系中養分含量的升高有關。
[0049]
野外大田應用試驗探究
[0050]
將制備得到的固氮微生物菌劑應用到野外鎘污染土壤(浙江省金華市永康縣芝英鎮)，測定種植生菜植株體內鎘含量。測定結果見圖7，數據表明，固氮微生物菌劑在野外環境同樣具有效果，且效果明顯，出現顯著性差異，植株體內鎘含量下降比例達到21.63％。
[0051]
以上未涉及之處，適用于現有技術。
[0052]
雖然已經通過示例對本發明的一些特定實施例進行了詳細說明，但是本領域的技術人員應該理解，以上示例僅是為了進行說明，而不是為了限制本發明的范圍，本發明所屬技術領域的技術人員可以對所描述的具體實施例來做出各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，但并不會偏離本發明的方向或者超越所附權利要求書所定義的范圍。本領域的技術人員應該理解，凡是依據本發明的技術實質對以上實施方式所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍。
技術特征：
1.一種具有降鎘和固氮作用的固氮-降鎘微生物菌劑的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：s1:微生物發酵液的制備：配置發酵培養液；s2:微生物的擴大培養：將固氮-降鎘微生物菌劑添加到發酵培養液中；s3:微生物菌劑的制備：待上述發酵液發酵培養18h后，將投入生物質材料進行混合，混合后，前8個小時，每隔2小時對菌劑進行攪拌，使得混合物內各組分狀態均一，8小時后，待其自然穩定到24h，完成菌劑的制作；其中，固氮-降鎘微生物菌劑的富集過程如下：稱取新鮮土壤置于裝有無菌水中振蕩，靜置后取上清液制得土壤菌懸液；使用固氮-降鎘培養基對土壤菌懸液進行富集，得到目的富集產物固氮-降鎘微生物菌劑。2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述固氮-降鎘培養基成分如下，甘露醇10g/l；caso
4 0.20g/l；k2hpo40.20g/l；caco35g/l；mgso
4 0.20g/l；namoo4·
2h2o 20ul/l；nacl 0.02g/l；fecl320ul/l。3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述配置發酵培養液為牛肉膏：3g、蛋白胨：10g、氯化鈉：5g、ph：7.4-7.6。4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：發酵培養液中的總接種量為2％。5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：生物質材料包括稻殼粉，生物質材料與混合的發酵培養液的固液比為1g:2-10ml。6.一種采用權利要求1-5任一項所述制備方法制備的固氮-降鎘微生物菌劑。7.如權利要求6所述的固氮-降鎘微生物菌劑的應用，其特征在于：用于降低土壤中有效態鎘含量和提高土壤中的速效氮的含量。
技術總結
本發明公開了一種具有降鎘和固氮作用的固氮-降鎘微生物菌劑及其制備方法和應用。制備方法包括如下步驟：S1:微生物發酵液的制備：配置發酵培養液；S2:微生物的擴大培養：將固氮-降鎘微生物菌劑添加到發酵培養液中；S3:微生物菌劑的制備：待上述發酵液發酵培養18h后，將投入生物質材料進行混合，攪拌一段時間后穩定，完成菌劑的制作；其中，固氮-降鎘微生物菌劑的富集過程如下：稱取新鮮土壤置于裝有無菌水中振蕩，靜置后取上清液制得土壤菌懸液；使用固氮-降鎘培養基對土壤菌懸液進行富集，得到目的富集產物固氮-降鎘微生物菌劑。本發明的固氮-降鎘微生物菌劑，能夠降低土壤中有效態鎘含量和提高土壤中的速效氮的含量。態鎘含量和提高土壤中的速效氮的含量。態鎘含量和提高土壤中的速效氮的含量。
