一種多核苷酸、試劑盒、等溫檢測方法及預測早產的方法與流程
1.本發明涉及生物技術及醫學領域，具體涉及一種多核苷酸、試劑盒、等溫檢測方法及預測早產的方法。
背景技術：
2.早產定義為胎齡小于37周分娩，世界范圍內，早產的發生率約為10％，每年約有1500萬產婦發生早產，在中國，早產約占所有新生兒的7.3％。早產可導致新生兒多種并發癥，是導致新生兒死亡最常見的原因之一，帶來了沉重的家庭開銷與社會醫療負擔，但目前對早產的病因與發病機制并不清晰，缺乏對早產的針對性和有效的預防與措施，以及有效的、安全的孕早期的篩查手段。
3.傳統的早產篩查方法包括宮頸長度、胎兒纖連蛋白、白介素、胰島素樣生長因子結合蛋白1等。孕24周使用宮頸長度小于25mm預測早產風險靈敏度約為37.3％，特異度為92.2％。胎兒纖連蛋白為由胎兒羊膜細胞與滋養層細胞分泌的蛋白，可在22周之前在子宮陰道分泌物中發現胎兒纖連蛋白，而其在24到34周出現表明有早產風險，其靈敏度與特異度在產婦有早產相關臨床表現時較高，對無癥狀的自發性早產預測效果較差，對無癥狀孕周小于34周的早產，roc曲線下面積為0.61。胰島素樣生長因子結合蛋白1在胎盤的生長與發育過程中發揮重要作用，而發育的異常則可能導致該蛋白被分泌到宮頸液中，為早期診斷提供可能，通過在24～34周檢測宮頸粘液中的胰島素樣生長因子結合蛋白1可預測早產，對無癥狀產婦預測靈敏度約在14～47％，特異性約在76～93％，對有臨床表現的早產孕婦預測靈敏度約60-68％,特異度約為77～81％。炎性因子與前列腺素的合成有關，其中白介素6(il-6)在宮頸液的出現與早產有關，對有早產表現的人，il-6靈敏度約為69.4％，特異度約為68.2％。
4.傳統的早產預測的方法靈敏度或特異度均不盡如人意，難以滿足臨床需求，這些方法通常對有臨床表現的早產人預測較好，但對于無表現的人預測效能較差。而且大部分的檢測都需要陰道或者宮頸口檢測取樣，對孕婦體驗不友好。
技術實現要素：
5.根據第一方面，在一實施例中，提供一種多核苷酸，所述多核苷酸包含包含串聯連接的第一錨定序列以及第一向導序列，所述第一錨定序列可與核酸酶結合，所述第一向導序列對目標核酸分子具有特異性，可以特異性結合目標核酸分子，所述第一錨定序列與所述核酸酶結合，所述第一向導序列與目標核酸分子結合后，導致所述目標核酸分子上的靶核酸分子被切割。
6.根據第二方面，在一實施例中，提供一種試劑盒，所述試劑盒包含第一方面所述多核苷酸。
7.根據第三方面，在一實施例中，提供表1所示基因中的至少一種作為生物標志物在制備和/或篩選胎齡預測試劑中的用途。
8.根據第四方面，在一實施例中，提供一種預測早產的方法，包括：分析母體樣本中的任意一種或至少兩種基因的組套的表達譜，根據所述表達譜預測受試者是否早產。
9.根據第五方面，在一實施例中，提供一種等溫酶切檢測方法，包括：將待測模板在等溫條件下進行酶切反應，在酶切反應過程中和/或結束時采集熒光值。
10.根據第六方面，在一實施例中，提供一種預測早產的系統，包括：早產分析裝置，用于分析母體樣本中的任意一種或至少兩種基因的組套的表達譜，根據所述表達譜預測受試者是否早產。
11.根據第七方面，在一實施例中，提供一種裝置，包括：
12.存儲器，用于存儲程序；
13.處理器，用于通過執行所述存儲器存儲的程序以實現第四方面所述的方法。
14.根據第八方面，在一實施例中，提供一種計算機可讀存儲介質，所述介質上存儲有程序，所述程序能夠被處理器執行以實現如第四方面所述的方法。
15.依據上述實施例的多核苷酸、試劑盒、等溫檢測方法及預測早產的方法，本發明首次檢測孕婦血清中有標志作用的基因表達量，用于無臨床癥狀的孕婦的早產風險預測。主要優勢在于血清學檢測，無須像超聲一樣提前預約，無創檢測，不需要陰道或者宮頸口取樣，檢測流程體驗好。使用本發明的方法進行檢測，簡單，成本低。檢測靈敏度，特異性高，可多次監測，相對于傳統方法具有更好的臨床應用前景。
附圖說明
16.圖1為轉錄組測序所用的母體樣本的早產分娩時間分布圖；
17.圖2為轉錄組測序所用的母體樣本的足月分娩時間分布圖；
18.圖3為轉錄組測序所用的母體樣本的早產收樣時間分布圖；
19.圖4為轉錄組測序所用的母體樣本的足月收樣時間分布圖；
20.圖5為lmcd1、snapc1與retsat基因表達量統計圖；
21.圖6為建模時的訓練集roc曲線圖；
22.圖7為建模時的測試集roc曲線圖；
23.圖8為臨床樣本驗證時的足月分娩孕周分布圖；
24.圖9為臨床樣本驗證時的早產分娩孕周分布圖；
25.圖10為臨床樣本驗證時的足月采樣孕周分布圖；
26.圖11為臨床樣本驗證時的早產采樣孕周分布圖；
27.圖12為臨床樣本驗證時的訓練集roc曲線圖；
28.圖13為臨床樣本驗證時的測試集roc曲線圖；
29.圖14為酶切反應原理圖。
具體實施方式
30.下面通過具體實施方式結合附圖對本發明作進一步詳細說明。其中不同實施方式中類似元件采用了相關聯的類似的元件標號。在以下的實施方式中，很多細節描述是為了使得本技術能被更好的理解。然而，本領域技術人員可以毫不費力的認識到，其中部分特征在不同情況下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情況下，本申
請相關的一些操作并沒有在說明書中顯示或者描述，這是為了避免本技術的核心部分被過多的描述所淹沒，而對于本領域技術人員而言，詳細描述這些相關操作并不是必要的，他們根據說明書中的描述以及本領域的一般技術知識即可完整了解相關操作。
31.另外，說明書中所描述的特點、操作或者特征可以以任意適當的方式結合形成各種實施方式。同時，方法描述中的各步驟或者動作也可以按照本領域技術人員所能顯而易見的方式進行順序調換或調整。因此，說明書和附圖中的各種順序只是為了清楚描述某一個實施例，并不意味著是必須的順序，除非另有說明其中某個順序是必須遵循的。
32.本文中為部件所編序號本身，例如“第一”、“第二”等，僅用于區分所描述的對象，不具有任何順序或技術含義。而本技術所說“連接”、“聯接，”如無特別說明，均包括直接和間接連接(聯接)。
33.定義
34.如本文所用，術語“無細胞rna”或“cfrna”是指由母體、胎兒和/或胎盤的細胞表達且可從母體血液的非細胞部分回收的rna，尤其是mrna，并且包含全長rna轉錄物的片段。在一些實施方案中，“cfrna”不包含rrna。在一些實施方案中，“cfrna”不包含mirna。在一些實施方案中，“cfrna”是指mrna。cfrna也可以從母體尿液中回收。
35.如本文所用，術語“表達水平”等同于“表達譜，”“表達譜”是指從母體樣本獲得的一種或多種基因產物的表達水平。基因產物可以是cfrna或蛋白。對于從母體血漿中回收的基因產物，表達水平可以表示為每ml母體血漿中特定rna的轉錄物數、每ml母體血漿中特定多肽的質量、由rna-seq計算的轉錄物數或任何其他合適的單位。類似單位可用于從其他母體樣本(如尿液)獲得的基因產物。基因產物的表達可使用任何合適的方法(例如，如下所述)確定。通常對測量值進行歸一化，以解釋樣本數量和質量、逆轉錄效率等方面的變化。當表達譜反映來自多個不同基因產物(例如，不同的cfrna轉錄物)的表達時，在生成或比較表達譜或參考譜時，可以賦予基因產物不同的權重。例如，當將來自孕婦的樣本中包括cfrna 1和cfrna 2的表達譜與參考譜(下文討論)進行比較時，在確定表達譜與參考譜之間相似性或差異程度時，cfrna 1值的2倍差相比cfrna 2的2倍差可以被賦予更大的權重。來自母體(例如，患者)樣本的表達譜有時被稱為“母體表達譜，”而在指定時間收集的樣本中的母體表達譜可以被稱為“[時間]母體表達譜，”例如“24周母體表達譜”。
[0036]
如本文所用，“參考譜”是衍生自參考體的表達譜。為了說明，參考體的示例是孕婦，足月分娩的孕婦或早產的孕婦。在一些實施方案中，參考體是以母體年齡(例如，足月分娩的20-25歲婦女)、種族或民族(例如，足月分娩的歐裔中國人婦女、美裔中國人婦女、非裔中國人婦女等等)為特征的孕婦亞。通過組合體中統計學上顯著數量的婦女的表達譜來生成參考譜，對于指定的基因產物，該參考譜可以反映體中的平均轉錄水平、體中的中位轉錄水平，或者可以使用在流行病學和醫學領域中已知的許多方法中的任何一種來確定。參考體通常將包括至少10個受試者(例如10-200個受試者)，有時50個或更多個受試者，有時1000個或更多個受試者。
[0037]
如本文所用，術語“譜組套”是指在特定測定中測量的基因產物集合。例如，在針對三(3)種不同的cfrna(“r na a-f”)的測定中，這三種cfrna將是譜組套。同樣，在對來自母體血漿或尿液的三(3)種不同蛋白的測定中，這三種蛋白將成為譜組套。作為另一個例證，在一種收集了大量基因的轉錄物(例如整個轉錄組或大量胎盤基因轉錄物)的表達數據的
測定中，用于估算胎齡或分娩時間或者評估早產風險的子集可以稱為譜組套。未包含在組套中的rna或蛋白的測量值可以用作對照，以將樣本內或樣本之間的測量值歸一化，或用于類似用途。在一些實施方案中，譜組套可包含基因產物集合，該集合包含cfrna和蛋白兩者。譜組套有時稱為“組套”。
[0038]
如本文所用，術語“早產、”“足月妊娠”、“足月分娩”和“正常足月妊娠”具有其正常含義。足月是指胎兒達到37周胎齡之后的分娩，而早產是指胎兒達到37周胎齡之前的分娩。在某些情況下，早產是指在16周至35周胎齡或24周至30周胎齡期間的分娩。
[0039]
如本文所用，“母體樣本”是指從孕婦獲得的體液的樣本。體液通常是血清、血漿或尿液，并且通常是血清。在一些實施方案中，可以使用不同體液的樣本，例如唾液、腦脊髓液、胸腔積液等。可以在妊娠期間的多個不同時間點獲得母體樣本，并進行存儲(例如冷凍)直至進行測定。應當理解，母體樣本的收集日期是樣本不可或缺的特性。
[0040]
如本文所用，“分娩時間”是指從懷孕起始時間到分娩日期或預計分娩日期的周數。分娩時間的計算方法是(分娩時的時間)減去(懷孕起始時間)。懷孕起始時間通常是推算得到，例如，懷孕之前的最后一次月經來潮的第一天起算，作為懷孕的開始時間，也可以通過b超檢查進行推算，也可以通過孕吐出現的時間、胎動出現的時間、子宮底的高度、孕中期超聲等其他方法來推測。本文中樣本的取樣時間的計算方法是(取樣時的時間)減去(懷孕起始時間)，即胎齡。
[0041]
如本文所用，術語“蛋白”和“多肽”可互換使用。提及從母體樣本獲得的蛋白并不一定意味著該蛋白是全長基因表達產物。可以根據本發明檢測和確認部分、片段和切割產物。
[0042]
本文中，如無特別說明，“血清”是指血漿除去纖維蛋白原后的膠狀液體。血漿是指血液的細胞外基質。
[0043]
本文中，“lmcd1基因”的gene id:29995，轉錄本:nm_014583.4。
[0044]
本文中，“snapc1基因”的gene id:6617，轉錄本：nm_003082.4。
[0045]
本文中，“retsat基因”的gene id:54884，轉錄本:nm_017750.4。
[0046]
本文中，“p2ry10基因”的gene id:27334，轉錄本:nm_014499.4。
[0047]
本文中，“tmem159”的gene id:233806，轉錄本:nm_145586.1。“teme159”與“tmem159”可互換使用。
[0048]
本中文，“背景基因”是指等溫熒光檢測時，進行熒光矯正時，矯正公式中分母上所用熒光值對應的基因，該基因通常是在大多數細胞中表達較為恒定的基因。
[0049]
本文中，“gapdh”的gene id:2597，轉錄本:nm_002046.7。
[0050]
鑒于現有技術存在的缺陷，開發新的高性能的早產早篩方法是非常有必要的。
[0051]
根據第一方面，在一實施例中，提供一種多核苷酸，所述多核苷酸包含串聯連接的第一錨定序列以及第一向導序列，所述第一錨定序列可與所述核酸酶結合，所述第一向導序列對目標核酸分子具有特異性，可以特異性結合目標核酸分子，所述第一錨定序列與所述核酸酶結合，所述第一向導序列與目標核酸分子結合后，導致所述目標核酸分子上的靶核酸分子被切割。
[0052]
在一實施例中，所述第一向導序列對表1中所示基因、背景基因中的至少一種具有特異性。
[0053]
在一實施例中，所述第一向導序列對lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因、p2ry10基因、tmem159基因、背景基因中的至少一種具有特異性。
[0054]
在一實施例中，所述第一向導序列對lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因、gapdh基因中的至少一種具有特異性。
[0055]
在一實施例中，所述第一向導序列含有如下堿基序列中的至少一種：
[0056]
1)5
’?
acacaggaauccauuacauu-3’；
[0057]
2)5
’?
aguggaacagaguucacugc-3’；
[0058]
3)5
’?
caagacuugcauauuuuccu-3’；
[0059]
4)5
’?
cugguaugacaacgaauuug-3’。
[0060]
根據第二方面，在一實施例中，提供一種試劑盒，所述試劑盒包含第一方面所述多核苷酸。
[0061]
在一實施例中，所述試劑盒還包含核酸酶以及crrna，所述crrna包含第一方面所述多核苷酸。
[0062]
在一實施例中，所述試劑盒還包含第二向導rna、帶第一空泡序列的第一序列、帶第二空泡序列的第二序列，所述第二向導rna包含依次串聯連接的第二錨定序列、第三結合序列、第四結合序列，所述第二錨定序列包含第一結合序列、第二結合序列，所述第二錨定序列可與核酸酶結合，導致目標核酸分子上的靶核酸分子被切割。
[0063]
在一實施例中，所述第一序列包含第一空泡序列、串聯至所述第一空泡序列一端的第五結合序列、串聯至所述第一空泡序列另一端的第六結合序列；
[0064]
所述第二序列包含第二空泡序列、串聯至所述第二空泡序列一端的第七結合序列、串聯至所述第二空泡序列另一端的第八結合序列；
[0065]
所述錨定序列的第一結合序列可與所述第一序列的第六結合序列反向互補配對，所述錨定序列的第二結合序列與所述第一序列的第五結合序列反向互補配對；
[0066]
所述第二向導rna的第三結合序列與所述第二序列的第八結合序列反向互補配對，所述第二向導rna的第四結合序列與所述第二序列的第七結合序列反向互補配對。
[0067]
在一實施例中，所述第一空泡序列、第二空泡序列的一端獨立地修飾有第一標記分子，所述第一空泡序列、第二空泡序列的另一端獨立地修飾有第二標記分子，所述第一空泡序列、第二空泡序列可以被所述核酸酶從所述第一序列、第二序列上切割。切割前，熒光報告基團與熒光淬滅基團物理靠近，發生熒光淬滅，切割后，熒光報告基團與熒光淬滅基團物理遠離，在熒光報告基團的激發波長下，可以檢測到強熒光信號。
[0068]
在一實施例中，所述第二向導rna上修飾有第三標記分子。
[0069]
在一實施例中，所述第二向導rna為單鏈rna，所述帶第一空泡序列的第一序列、帶第二空泡序列的第二序列獨立地為為單鏈dna。
[0070]
在一實施例中，所述第二向導rna可與帶第一空泡序列的第一序列、帶第二空泡序列的第二序列反應得到可被核酸酶切割的引導rna(即scgrna)。
[0071]
在一實施例中，所述多核苷酸還包含由第二向導rna與帶第一空泡序列的第一序列、帶第二空泡序列的第二序列反應后得到的產物。該產物即為可被核酸酶切割的引導rna(即scgrna)。
[0072]
在一實施例中，所述試劑盒還包含輔助核酸分子。
[0073]
在一實施例中，所述輔助核酸分子包含可與所述第二向導rna中的部分堿基序列反向互補配對的堿基序列。
[0074]
在一實施例中，所述輔助核酸分子包含可與所述第二向導rna的第三結合序列、第四結合序列中的至少一種反向互補配對的堿基序列。
[0075]
在一實施例中，所述輔助核酸分子包含可與所述第二向導rna的第三結合序列、第四結合序列中的全部反向互補配對的堿基序列。
[0076]
在一實施例中，所述輔助核酸分子還包含可供所述核酸酶識別的pam序列。
[0077]
在一實施例中，所述輔助核酸分子為雙鏈dna。
[0078]
在一實施例中，所述第一錨定序列、第二錨定序列獨立地含有如下堿基序列：
[0079]5’?
uaauuucuacuaaguguagau-3’。
[0080]
在一實施例中，所述第一標記分子、第三標記分子為同一種標記分子。
[0081]
在一實施例中，所述第一標記分子、第三標記分子為熒光報告基團。
[0082]
在一實施例中，所述第二標記分子為熒光淬滅基團。
[0083]
在一實施例中，所述第一標記分子與第三標記分子物理靠近時發生熒光能量共振轉移，所述第二標記分子與第三標記分子物理靠近時發生熒光能量共振轉移，具體可以是發生熒光猝滅。
[0084]
在一實施例中，所述熒光報告基團包括但不限于fam、hex、vic、rox、cy5中的至少一種。
[0085]
在一實施例中，所述熒光淬滅基團選自bhq1、bhq2中的至少一種。
[0086]
在一實施例中，所述試劑盒還包含對lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因、p2ry10基因、tmem159基因中的至少一種具有特異性的crrna。
[0087]
在一實施例中，所述試劑盒還包含對背景基因具有特異性的crrna。
[0088]
在一實施例中，所述背景基因包括但不限于gapdh基因。
[0089]
在一實施例中，所述核酸酶包括但不限于cas9蛋白、cas12a蛋白中的至少一種。核酸酶可以從市場上購買得到，也可以通過重組表達、蛋白純化等方式獲得。
[0090]
在一實施例中，所述cas12a蛋白包括但不限于lbcas12a、ascas12a、fncas12a中的至少一種。
[0091]
在一實施例中，所述crrna為單鏈rna。
[0092]
在一實施例中，所述試劑盒還含有酶切反應所需的其他試劑，包括但不限于緩沖液、kcl、mgcl2、dtt(二硫蘇糖醇，dithiothreitol)、甘油、水等等。
[0093]
在一實施例中，所述目標核酸分子含有供所述核酸酶識別的pam序列(protospacer adjacent mot，原始間隔區相鄰結構)。
[0094]
在一實施例中，所述pam序列通常為tttn，切割靶標通常位于pam序列下游。
[0095]
在一實施例中，所述第一錨定序列位于所述第一向導序列的上游。即第一錨定序列的3’端串聯至第一向導序列的5’端。
[0096]
根據第三方面，在一實施例中，提供表1所示基因中的至少一種作為生物標志物在制備和/或篩選胎齡預測試劑中的用途。
[0097]
在一實施例中，所述生物標志物包括但不限于lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因、p2ry10基因、tmem159基因中的至少一種。
[0098]
在一實施例中，所述生物標志物包括但不限于lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因中的至少一種。
[0099]
在一實施例中，所述生物標志物包括lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因中的全部。
[0100]
在一實施例中，所述生物標志物包括相應基因在母體樣本中的表達譜。
[0101]
在一實施例中，所述表達譜包括相應基因在母體樣本中的rna表達量。
[0102]
在一實施例中，所述rna表達量是指mrna表達量。通常是先通過逆轉錄，獲得所有逆轉錄產物的集合，然后計算出mrna表達量。
[0103]
在一實施例中，所述表達譜包括相應基因在母體樣本中的蛋白表達量。
[0104]
在一實施例中，所述表達譜包括待測的母體樣本中相應基因相對于基線過量表達。
[0105]
在一實施例中，所述表達譜包括待測的母體樣本中相應基因相對于基線不足表達。在一些實施例中，可以是待測的母體樣本中一部分生物標志物相對于基線過量表達，另一部分生物標志物相對于基線不足表達。在另一些實施例中，可以是待測的母體樣本中全部生物標志物相對于基線過量表達。在另一些實施例中，可以是待測的母體樣本中全部生物標志物相對于基線不足表達。
[0106]
在一實施例中，所述基線可以是足月分娩的母體樣本中相應基因的表達譜。
[0107]
在一實施例中，所述表達譜通過測量母體樣本中的無細胞rna(cfrna)來確定。
[0108]
在一實施例中，所述表達譜通過測量母體樣本中的蛋白來確定。
[0109]
在一實施例中，所述母體樣本包括但不限于體液樣本、組織樣本中的至少一種。優選為體液樣本。
[0110]
在一實施例中，所述體液樣本包括但不限于母體血液、血漿、血清、尿液中的至少一種。
[0111]
在一實施例中，所述母體樣本的取樣時間為第7～20孕周。
[0112]
在一實施例中，所述生物標志物包括lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因中的全部。
[0113]
在一實施例中，所述生物標志物為相應基因在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光值。
[0114]
在一實施例中，所述酶切反應為等溫反應。即酶切反應過程中，控制反應體系的溫度保持不變。
[0115]
在一實施例中，所述酶切反應的溫度為35～42℃，優選為37℃。
[0116]
在一實施例中，在酶切反應過程中的某一時間點或某一時間段采集熒光值；
[0117]
在一實施例中，采集熒光值的時間點為酶切反應第30～120分鐘中的某一時間點或某一時間段。
[0118]
在一實施例中，采集熒光值的時間點為酶切反應第90分鐘。該時間包含從室溫升至目標溫度的時間。
[0119]
在一實施例中，所述酶切反應的起始點通常是指反應儀啟動時。從室溫(23
±
2℃)升溫至37℃的升溫速率通常可以為4℃/s。
[0120]
在一實施例中，所述生物標志物為母體樣本中相應基因的rna的逆轉錄產物在含
有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光值。
[0121]
在一實施例中，所述酶切反應體系還含有第一方面所述多核苷酸或第二方面所述試劑盒中的組分。
[0122]
在一實施例中，通過母體樣本中相應基因的表達譜計算得到受試者早產的概率值。
[0123]
在一實施例中，通過母體樣本中相應基因的表達譜計算得到受試者早產的概率值，根據所述概率值與閾值的大小關系，預測受試者是否會早產。在一實施例中，可以通過挑選訓練集中靈敏度與特異度之和最大的閾值作為閾值。
[0124]
在一實施例中，所述閾值為0.4～0.7。在一實施例中，所述閾值為0.45。
[0125]
在一實施例中，如果所述概率值≥閾值，則預測受試者為早產，如果所述概率值＜閾值，則預測受試者為足月分娩。
[0126]
在一實施例中，通過相應基因的熒光值計算得到受試者早產的概率值。
[0127]
在一實施例中，通過相應基因的熒光矯正值計算得到受試者早產的概率值。矯正的目的是為了避免計算得到的數值過小。
[0128]
在一實施例中，所述熒光值為熒光矯正值。
[0129]
在一實施例中，母體樣本中相應基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光矯正值的計算方法如下：將母體樣本中相應基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光值除以母體樣本中背景基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光值，得到商值，將所述商值乘以矯正系數，得到所述熒光矯正值。
[0130]
在一實施例中，所述矯正系數包括但不限于10^5。矯正系數可以為其他任意常數，具體可以根據需要而定，旨在避免計算得到的數值過小。
[0131]
在一實施例中，通過母體樣本中相應基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光矯正值計算受試者早產概率值的公式如下：
[0132]
其中，所述f
lmcd1
為母體樣本中lmcd1基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光矯正值，所述f
snapc1
為母體樣本中snapc1基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光矯正值，所述f
retsat
為母體樣本中ret sat基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光矯正值。
[0133]
根據第四方面，在一實施例中，提供一種預測早產的方法，包括：分析母體樣本中的任意一種或至少兩種基因的組套的表達譜，根據所述表達譜預測受試者是否早產。
[0134]
需要說明的是，本發明提供的預測早產的方法所檢測的是離體樣本，并且，預測結果僅僅作為臨床參考，醫生在進行早產檢測和/或診斷時，還需要通過臨床推算(通常是根據以往月經周期進行推算)、超聲檢查(例如，胎兒頭徑、頭圍、腹圍股骨長度與胎齡及體重密切相關，根據超聲測量值可估計孕周與胎兒大小)，胎兒纖維連接蛋白(ffn)棉拭子檢測(胎兒纖維連接蛋白是由羊膜、蛻膜、絨毛膜聯合分泌，存在于蛻膜和絨毛膜之間的糖蛋白，對胎膜起到黏附作用。孕21周以后，絨毛膜與蛻膜的融合阻止了ffn的釋放，因此，正常的孕婦在22～35孕周時，ffn的含量極低。在絨毛膜與蛻膜分離、絨毛膜與蛻膜界面的細胞外基
質遭到機械損傷或蛋白水解酶的降解時，ffn漏入陰道后穹窿分泌物中，孕22～35周宮頸陰道分泌物ffn水平，與早產有很好的相關性)等其他手段，才能得出是否早產的最終結果。因此，本發明的預測結果并非最終結果，而是屬于中間參考結果，不屬于疾病的診斷方法，更不屬于疾病的方法。
[0135]
在一實施例中，所述基因包括表1所示基因中的至少一種。
[0136]
在一實施例中，所述基因包括但不限于lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因、p2ry10基因、tm em159基因中的至少一種；
[0137]
在一實施例中，所述基因包括lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因中的至少一種。
[0138]
在一實施例中，所述基因包括lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因中的全部。
[0139]
在一實施例中，所述表達譜為相應基因在母體樣本中的表達量。
[0140]
在一實施例中，所述表達譜為相應基因經酶切反應后的熒光值。
[0141]
在一實施例中，所述表達譜為相應基因在母體樣本中的rna的逆轉錄產物經過酶切反應后的熒光值。該方法無需對母體樣本構建文庫進行測序分析，無需使用昂貴的測序設備及試劑，并有效簡化檢測流程。無需pcr反應升溫降溫過程，無需復雜的pcr儀，只需要熒光讀取裝置。
[0142]
在一實施例中，所述熒光值為熒光矯正值。
[0143]
在一實施例中，所述酶切反應為等溫反應。等溫反應是指酶切反應過程中溫度保持不變，或者，溫度的波動極小。
[0144]
在一實施例中，酶切反應體系中還含有熒光試劑。
[0145]
在一實施例中，酶切反應體系含有第一方面所述多核苷酸或第二方面所述試劑盒中的組分。
[0146]
根據第五方面，在一實施例中，提供一種等溫酶切檢測方法，包括：將待測模板在等溫條件下進行酶切反應，在酶切反應過程中和/或結束時采集熒光值。該方法可用于目標基因相對表達量的檢測，或者用于靶序列的定性檢測。該酶切檢測方法具有定量檢測、等溫檢測、高靈敏度、操作簡便等優點。
[0147]
在一實施例中，采集熒光值的時間點為第30～120分鐘中的某一時間點或某一時間段。
[0148]
在一實施例中，采集熒光值的時間點為第90分鐘。
[0149]
在一實施例中，所述酶切反應的溫度為35～42℃，包括但不限于35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃等等，優選為37℃。
[0150]
在一實施例中，所述酶切反應體系中含有第一方面所述多核苷酸或第二方面所述試劑盒中的組分。
[0151]
在一實施例中，所述待測模板可以為母體樣本中待測基因的rna的逆轉錄產物。
[0152]
在一實施例中，所述rna包含信使rna(mrna)。
[0153]
根據第六方面，在一實施例中，提供一種預測早產的系統，包括：早產分析裝置，用于分析母體樣本中的任意一種或至少兩種基因的組套的表達譜，根據所述表達譜預測受試者是否早產。
[0154]
根據第七方面，在一實施例中，提供一種裝置，包括：
[0155]
存儲器，用于存儲程序；
[0156]
處理器，用于通過執行所述存儲器存儲的程序以實現第五方面所述的方法。
[0157]
根據第八方面，在一實施例中，提供一種計算機可讀存儲介質，所述介質上存儲有程序，所述程序能夠被處理器執行以實現如第五方面所述的方法。
[0158]
在一實施例中，本發明提供的試劑盒適用于待測模板為母體樣本中待測基因的rna的逆轉錄產物的酶切反應以及熒光檢測。
[0159]
在一實施例中，所述試劑盒為用于孕婦早產預測的試劑盒。
[0160]
在一實施例中，本發明提供了一種基于lmcd1、snapc1與retsat基因表達量進行人類早產早期篩查的的定量檢測方法。
[0161]
在一實施例中，本發明首次檢測孕婦血清中lmcd1、snapc1與retsat基因表達量，用于無臨床癥狀的孕婦的早產風險預測。主要優勢在于血清學檢測，無須像超聲一樣提前預約，無創檢測，不需要陰道或者宮頸口取樣，檢測流程體驗好。采用免疫層析的方法進行檢測，簡單，成本低。檢測靈敏度，特異性高，可多次監測，相對于傳統方法具有更好的臨床應用前景。
[0162]
在一實施例中，本發明根據檢測的mrna標志物的表達量，通過機器學習預測早產的風險高低。檢測陽性的樣本，作為輔助診斷供臨床醫生參考。
[0163]
在一實施例中，本發明的檢測原理如下：孕婦血清中lmcd1、snapc1與retsat基因表達量能夠反映孕婦可能發生早產的風險，該檢測不受孕婦是否有相關臨床癥狀的影響，無檢測禁忌癥，通過監測lmcd1、snapc1與retsat基因表達量即可預測無癥狀早產風險。
[0164]
在一實施例中，本發明提供的檢測試劑針對的檢測樣本為孕婦外周血。
[0165]
在一實施例中，本發明檢測的樣本采樣無禁忌癥，可以多次采樣。
[0166]
在一實施例中，本發明所檢測的mrna是lmcd1，snapc1與retsat。
[0167]
在一實施例中，本發明基于酶切反應的熒光檢測可在固定條件下完成檢測，酶切反應時，升溫至目標溫度后，無需升溫降溫過程。
[0168]
在一實施例中，本發明提供一種小插件用于三個標志物的含量對比分析，自動化出具風險值。所述小插件包含通過母體樣本中相應基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光矯正值計算受試者早產概率值的公式，具體如下：
[0169]
其中，所述f
lmcd1
為母體樣本中lmcd1基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光矯正值，所述f
snapc1
為母體樣本中snapc1基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光矯正值，所述f
retsat
為母體樣本中retsat基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光矯正值。
[0170]
在一實施例中，本發明的高靈敏度、高特異性能夠有效提升孕婦早產篩查的準確性，能夠彌補現有臨床手段的不足。
[0171]
在一實施例中，本發明采用孕婦外周血檢測，無創，不需要進行陰道宮頸口取樣，方便臨床取樣檢測。
[0172]
在一實施例中，本發明采用基于cas12a的等溫高靈敏度檢測方法，對檢測條件要求不高，簡便，成本低廉。
[0173]
在一實施例中，本發明可為無癥狀孕婦提供早產風險評估方法，可篩查出早產高
危孕婦提前進行宮內轉運等措施，從而降低早產的風險或者提高早產兒的存活率，對于提高我國出生人口具有重大意義。
[0174]
以下實施例中，以懷孕之前的最后一次月經來潮的第一天起算，作為懷孕的開始時間。
[0175]
實施例1：采樣與血漿分離
[0176]
edta的抗凝管(紫頭管)收集5ml血液，收集后暫存在4℃環境中，交由相應實驗人員或實驗室在8小時內進行離心，收集血漿與白細胞，迅速凍存于-80℃環境中。
[0177]
血漿分離具體步驟如下：
[0178]
1)上下顛倒10次每支采血管后，放至預冷的大型離心機中。
[0179]
2)4℃，1600
×
g，離心10分鐘。
[0180]
3)小心的將采血管從離心機中取出，放回15ml離心管架上。
[0181]
4)血樣離心后，分為底部紅細胞層，中間白細胞層以及上清血漿層(正常的血漿為淡黃，在該層頂部可能會有些許白絮狀物，為脂類物質)。
[0182]
5)將1000μl移液器量程調至500μl，小心地將血漿轉至1.5ml離心管中，每管500μl，最后將中間層的白細胞轉至1.5ml離心管中。
[0183]
6)將3管血漿放入小型離心機中，室溫，16000
×
g，離心10分鐘(主要目的是去除細胞碎片等)。
[0184]
7)將1000μl移液器量程調至500μl，小心的將血漿轉至1.5ml離心管中。
[0185]
8)血漿與白細胞均置于-80℃長期保存，白細胞在后續實施例中不再使用。
[0186]
實施例2：cfrna提取
[0187]
1)在≥12,000
×
g的離心力下離心血漿樣品15分鐘，以去除細胞雜質和沉淀。
[0188]
2)按照每200μl樣品添加200μl游離rna消化液，放入一個15ml的離心管，混勻。如果樣品體積≥1.5ml，則使用50ml的離心管。游離rna消化液、蛋白酶k溶液、rna溶液1、rna溶液2為一個試劑盒，該試劑盒購自北京天漠科技開發有限公司，貨號tr159-50。
[0189]
3)按照每200μl血漿樣品添加10μl的蛋白酶k溶液，渦旋混勻10秒，37℃下孵育2小時。
[0190]
4)添加等體積的游離rna結合液到消化的樣品中并且渦旋混勻10秒。
[0191]
5)添加1.5倍體積的100％的異丙醇到步驟4)中的混合物中，渦旋混勻10秒。
[0192]
6)將25ml漏斗套到3號柱y(黃)內，連接緊密后放置在負壓多連器上。
[0193]
7)倒入上述步驟6)的混合液，打開真空開關使液體完全通過柱子。確保液體完全通過柱子并且沒有殘留液體下流后，關閉真空泵并拔掉連接的25ml漏斗。
[0194]
8)倒入600μl rna洗滌液1到柱子上，打開真空開關，讓液體完全通過3號柱y(黃)，關閉真空泵。
[0195]
9)將3號柱y(黃)套在2ml收集管上，然后放置在臺式離心機上全速離心2分鐘以去除液體殘留，然后將3號柱y(黃)套在一個干凈的1.5ml離心管內。
[0196]
10)添加200μl的rna回收液到3號柱y(黃)中，室溫放置3分鐘，離心，保存濾出液。
[0197]
11)添加300μl無水乙醇(95-100％)到濾出液中，混勻。
[0198]
12)將1號柱套在一個新的2ml收集管上。添加步驟11)制得的混合物到柱中，離心
去除濾出液。
[0199]
13)添加400μl的rna洗滌液1，離心去除濾出液。
[0200]
14)添加700μl的rna洗滌液2，離心去除濾出液。
[0201]
15)添加400μl的rna洗滌液2到1號柱中，離心2分鐘完全去除柱子上殘留的液體，將1號柱轉移到一個干凈的離心管內。
[0202]
16)添加15μl的rnase-free水到柱基質上，放置2分鐘然后離心，以洗脫游離rna。
[0203]
實施例3：通過轉錄組測序篩選生物標志物
[0204]
1.分別在孕早期(8-20周)收集早產病例39例，收集足月42例外周血樣本，從所有樣本分別提取外周血清游離rna，并進行全轉錄組測序。此處是對細胞內所有轉錄產物的集合，包括信使rna、核糖體rna、轉運rna及非編碼rna等等進行測序，后續再篩選出目標信使rna(mrna)。
[0205]
圖1所示為早產分娩時間分布圖，圖2所示為足月分娩時間分布圖，圖3所示為早產收樣時間分布圖，圖4所示為足月收樣時間圖。
[0206]
2.通過deseq2篩選差異表達基因，以p值小于0.05作為閾值，總計篩選出差異表達基因935個，如表1所示。此處的差異表達是指以足月分娩的樣本為基線，早產分娩的樣本中的相應基因存在差異表達，此處的差異表達包括相對于基線的高表達以及低表達。
[0207]
表1
[0208]
[0209]
[0210]
[0211]
[0212]
[0213][0214]
3.對tpm數據，使用r軟件caret包，通過隨機森林算法，以十折交叉驗證的方式，篩選最重要的rna標志物，最終篩選出5個基因對應的rna標志物(mrna)。5個基因為p2ry10、lmcd1、snapc1、ret sat、tmem159。
[0215]
4.使用logistic回歸對5個基因進行回歸分析，最終確定三個最重要的rna標志物(只包括mrna)，即lmcd1、snapc1與retsat的mrna，可用于早產的預測。
[0216]
圖5所示為各個組中lmcd1、snapc1與retsat基因的表達量統計圖，可見，lmcd1、snapc1基因相對于足月樣本不足表達，retsat基因相對于足月樣本過量表達。
[0217]
圖6所示為訓練集的roc曲線圖(receiver operating characteristic curve，亦稱接收者操作特征曲線)，其中，auc(area under curve，roc曲線下與坐標軸圍成的面積)為0.908。
[0218]
圖7所示為測試集的roc曲線圖，其中，auc(area under curve，roc曲線下與坐標軸圍成的面積)為0.846。
[0219]
實施例4：逆轉錄
[0220]
逆轉錄體系如下：
[0221]
表2
[0222][0223]
可使用表2中兩種體系中的任意一種進行逆轉錄，本實施例中具體選用的是20μl的體系。
[0224]
表2中使用的試劑盒為購自fapon公司的aktaqone-steprt-pcrmix產品編號：md103。
[0225]
處理步驟如下表所示：
[0226]
表3
[0227]
步驟溫度時間142℃5min295℃10s
[0228]
實施例5：等溫熒光檢測
[0229]
本實施例中，等溫熒光檢測所用的核苷酸分子由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0230]
針對需要檢測的基因lmcd1、snapc1與retsat，以ahcb設計并優化相應的cas12a對應的crrna(c rispr-derived rna，一種衍生rna)序列如下：
[0231]
表4
[0232][0233]
表4中，特異性靶向retsat基因的grna用于引導lbcas12a酶切割，具體是切割逆轉錄后的retsat mrna生成的cdna序列，啟動正反饋級聯反應。其他三種grna的作用與retsat基因的grna作用類似。表4中基因的mrna逆轉錄后的cdna上含有pam序列，供lbcas12a酶識別，pam序列具體為tttn。
[0234]
表4中，加粗的堿基為第一錨定序列。未加粗的堿基為可結合至靶基因的第一向導序列。
[0235]
酶切反應原理如圖14所示，靶向靶序列的grna引導cas12a切割靶序列，產生非特異性切割活性，切割空泡產生熒光，同時與兩個idna結合的rna釋放產生針對輔助雙鏈dna的grna，引導cas12a切割輔助雙鏈dna，并激活非特異性切割活性，進一步切割與兩個idna結合的rna(scgrna)，產生熒光，如是產生正反饋放大信號。
[0236]
grna-fam序列：fam序列：fam為一種綠熒光報告基團，英文名稱為6-carboxy-fluorescein，中文名稱為6-羧基熒光素。grna-fam序列用于產生自反饋放大效應。加粗的堿基為第二錨定序列，點-短線下劃線標示的序列為第二錨定序列的第一結合序列，下劃雙直線標示的序列為第二錨定序列的第二結合序列，下劃單直線標示的序列為第三結合序列，下劃單虛線標示的序列為第四結合序列。
[0237]
與grna-fam相結合的帶有空泡的序列1(idna1)：fam相結合的帶有空泡的序列1(idna1)：點-短線下劃線標示的序列(即第六結合序列)可與grna-fam序列中點-短線下劃線標示的序列反向互補配對，雙直下劃線標示的序列(即第五結合序列)可與grna-fam序列中雙直下劃線標示的序列反向互補配對，中部用單波浪線標示的序列為第一空泡序列，不能與grna-fam序列互補配對，用于被切割后產生熒光信號。
[0238]
與grna-fam相結合的帶有空泡的序列2(idna2)：
下劃單直線標示的序列(即第八結合序列)可與grna-fam序列中下劃單直線標示的序列反向互補配對，下劃單虛線標示的序列(即第七結合序列)可與grna-fam序列中下劃單虛線標示的序列反向互補配對。
[0239]
idna1、idna2中，“i6-famdt”是指6-fam(6-羧基熒光素)熒光標記的dt核苷酸(d表示脫氧)，“ibhq1dt”是指帶有bhq1淬滅基團標記的dt核苷酸，dt核苷酸是指脫氧核苷，“d”是英文單詞“deoxidized”的首字母縮寫，“de”是一個前綴，表示脫離、脫去，“oxidize”即氧化作用。bhq1是指黑洞猝滅基團。idna1、idna2用于切割后產生熒光。
[0240]
輔助雙鏈dna(adna)序列：下劃單虛線標示的序列(第九結合序列)可以與grna-fam序列中的下劃單虛線標示的序列反向互補配對，下劃單直線標示的序列(即第十結合序列)可以與grna-fam序列中的下劃單直線標示的序列反向互補配對。
[0241]
idna1、idna2與grna-fam通過以下步驟生成scgrna(自切割的向導rna)：
[0242]
idna1與idna2、grna-fam按照1.2:1的摩爾比(即idna1與grna-fam的摩爾比為1.2:1，idna2與grna-fam的摩爾比也為1.2:1)混合，在退火buffer(20mm tris-hcl(ph 7.5),150mm kcl,1mm ed ta,and 50mm mgcl2)中95℃處理4分鐘，隨后以0.1℃每秒的速度降溫至25℃，得到scgrna，將該產物作為表4的反應物，進行后續反應。
[0243]
然后配制表5所示的體系。
[0244]
表5
[0245]
組分終濃度逆轉錄模板dna500nmgrna-t50nmlbcas12a(購自neb公司)1μmscgrna1μmadna0.5μmtris-hcl(ph 7.5)20mmkcl100mmmgcl25mmdtt(二硫蘇糖醇，dithiothreitol)1mm甘油5％(體積百分比)超純水補足至20μl總體積20μl
[0246]
表5中，grna-t是指表4所示的crrna中的某一種(“t”為target的簡稱，grna-t表示靶向目標基因的grna，即crrna)，共配制4個體系，每個體系裝入一個反應管中，每個體系中含有一種grna，配制得到分別含有四種grna的體系。
[0247]
將上述體系加入pcr管中，分為4管，每一管含有表4中的一種crrna，于美國賽默飛abi 7500實時熒光定量pcr儀(簡稱abi 7500)中反應，設置溫度為37℃，從室溫(23
±
2℃)升溫至37℃的升溫速率為4℃/s，每30s采集熒光值，發射光波長為520nmn，反應時間90分
鐘。
[0248]
實施例六：數據分析
[0249]
在abi 7500中反應90分鐘)后，采集熒光值作為最終的表達量，使用retsat、snapc1與lmcd1的熒光值(由于是在不同的pcr管中反應，因此，可以單獨各rna標志物的熒光值)，除以gapdh的熒光值，再乘以10^5，作為最終的相對表達量。隨著酶切反應的進行，熒光值的增長通常經歷基線期、指數期、線性期、平臺期，本實施例采集熒光值的時間點(即第90分鐘)處于指數增長期。
[0250]
實施例七：臨床樣本驗證性能
[0251]
收集125例足月樣本，123例早產樣本，分娩孕周與收樣孕周如圖8～圖11所示，具體地，圖8所示為足月分娩孕周統計圖，圖9所示為早產分娩孕周統計圖，圖10所示為足月采樣孕周統計圖，圖11所示為早產采樣孕周統計圖。
[0252]
分別提取cfrna進行熒光測定，熒光值如下表所示：
[0253]
表6
[0254]
[0255]
[0256]
[0257]
[0258]
[0259]
[0260][0261]
表5中各樣本基因的熒光值為采集到的原始值(未進行矯正)。
[0262]
將樣本隨機按照7:3的比例分為測試集與訓練集，利用訓練集進行模型的訓練，測
試集進行模型的驗證，圖12所示為訓練集的roc曲線圖，auc為0.838，圖13所示為測試集的roc曲線圖，auc為0.849，在閾值為0.450時，訓練集靈敏度為0.753，特異度為0.765，測試集靈敏度為0.711，特異度為0.889。概率計算公式如下：
[0263]
其中，所述flmcd1為母體樣本中lmcd1基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光矯正值，所述fsnapc1為母體樣本中snapc1基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光矯正值，所述fretsat為母體樣本中retsat基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光矯正值。
[0264]
本領域技術人員可以理解，上述實施方式中各種方法的全部或部分功能可以通過硬件的方式實現，也可以通過計算機程序的方式實現。當上述實施方式中全部或部分功能通過計算機程序的方式實現時，該程序可以存儲于一計算機可讀存儲介質中，存儲介質可以包括：只讀存儲器、隨機存儲器、磁盤、光盤、硬盤等，通過計算機執行該程序以實現上述功能。例如，將程序存儲在設備的存儲器中，當通過處理器執行存儲器中程序，即可實現上述全部或部分功能。另外，當上述實施方式中全部或部分功能通過計算機程序的方式實現時，該程序也可以存儲在服務器、另一計算機、磁盤、光盤、閃存盤或移動硬盤等存儲介質中，通過下載或復制保存到本地設備的存儲器中，或對本地設備的系統進行版本更新，當通過處理器執行存儲器中的程序時，即可實現上述實施方式中全部或部分功能。
[0265]
以上應用了具體個例對本發明進行闡述，只是用于幫助理解本發明，并不用以限制本發明。對于本發明所屬技術領域的技術人員，依據本發明的思想，還可以做出若干簡單推演、變形或替換。
技術特征：
1.一種多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含串聯連接的第一錨定序列以及第一向導序列，所述第一錨定序列可與核酸酶結合，所述第一向導序列對目標核酸分子具有特異性，可以特異性結合目標核酸分子，所述第一錨定序列與所述核酸酶結合，所述第一向導序列與目標核酸分子結合后，導致所述目標核酸分子上的靶核酸分子被切割。2.如權利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述第一向導序列對表1中所示基因、背景基因中的至少一種具有特異性；和/或，所述第一向導序列對lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因、p2ry10基因、tmem159基因、背景基因中的至少一種具有特異性；和/或，所述第一向導序列對lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因、gapdh基因中的至少一種具有特異性；和/或，所述第一向導序列含有如下堿基序列中的至少一種：1)5
’?
acacaggaauccauuacauu-3’；2)5
’?
aguggaacagaguucacugc-3’；3)5
’?
caagacuugcauauuuuccu-3’；4)5
’?
cugguaugacaacgaauuug-3’。3.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權利要求1～2任意一項所述多核苷酸。4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含核酸酶以及crrna，所述crrna包含權利要求1所述多核苷酸；和/或，所述試劑盒還包含第二向導rna、帶第一空泡序列的第一序列、帶第二空泡序列的第二序列，所述第二向導rna包含依次串聯連接的第二錨定序列、第三結合序列、第四結合序列，所述第二錨定序列包含第一結合序列、第二結合序列，所述第二錨定序列可與核酸酶結合，導致目標核酸分子上的靶核酸分子被切割；和/或，所述試劑盒還包含輔助核酸分子；和/或，所述輔助核酸分子包含可與所述第二向導rna中的部分堿基序列反向互補配對的堿基序列；和/或，所述輔助核酸分子為雙鏈dna；和/或，所述第一錨定序列含有如下堿基序列：5
’?
uaauuucuacuaaguguagau-3’；和/或，所述試劑盒還包含對背景基因具有特異性的crrna；和/或，所述核酸酶包括cas9蛋白、cas12a蛋白中的至少一種；和/或，所述cas12a蛋白包括lbcas12a、ascas12a、fncas12a中的至少一種；和/或，所述crrna為單鏈rna；和/或，所述目標核酸分子含有供所述核酸酶識別的pam序列(protospacer adjacent mot，原始間隔區相鄰結構)；和/或，所述第一錨定序列位于所述第一向導序列的上游。5.表1所示基因中的至少一種作為生物標志物在制備和/或篩選胎齡預測試劑中的用途。6.如權利要求5所述的用途，其特征在于，所述生物標志物包括lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因、p2ry10基因、tmem159基因中的至少一種；
和/或，所述生物標志物包括lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因中的至少一種；和/或，所述生物標志物包括lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因中的全部；和/或，所述生物標志物包括相應基因在母體樣本中的表達譜；和/或，所述表達譜包括相應基因在母體樣本中的rna表達量；和/或，所述表達譜包括相應基因在母體樣本中的mrna表達量；和/或，所述表達譜通過測量母體樣本中的無細胞rna(cfrna)來確定；和/或，所述表達譜通過測量母體樣本中的蛋白來確定；和/或，所述母體樣本包括體液樣本、組織樣本中的至少一種；和/或，所述體液樣本包括母體血液、血漿、血清、尿液中的至少一種；和/或，所述母體樣本的取樣時間為第7～28孕周；和/或，所述母體樣本的取樣時間為第7～20孕周；和/或，所述生物標志物為相應基因在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光值；和/或，所述酶切反應為等溫反應；和/或，所述酶切反應的溫度為35～42℃，優選為37℃；和/或，在酶切反應過程中的某一時間點或某一時間段采集熒光值；和/或，采集熒光值的時間點為酶切反應第30～120分鐘中的某一時間點或某一時間段；和/或，采集熒光值的時間點為酶切反應第90分鐘。7.如權利要求5所述的用途，其特征在于，所述生物標志物為母體樣本中相應基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光值；和/或，所述體系還含有權利要求1～2任意一項所述多核苷酸和/或權利要求3～4任意一項所述試劑盒中的組分；和/或，通過母體樣本中相應基因的表達譜計算得到受試者早產的概率值；和/或，通過母體樣本中相應基因的表達譜計算得到受試者早產的概率值，根據所述概率值與閾值的大小關系，預測受試者是否會早產；和/或，如果所述概率值≥閾值，則預測受試者為早產，如果所述概率值＜閾值，則預測受試者為足月分娩；和/或，所述閾值為0.4～0.7；和/或，所述閾值為0.45；和/或，通過相應基因的熒光值計算得到受試者早產的概率值；和/或，通過相應基因的熒光矯正值計算得到受試者早產的概率值；和/或，母體樣本中相應基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光矯正值的計算方法如下：將母體樣本中相應基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光值除以母體樣本中背景基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光值，得到商值，將所述商值乘以矯正系數，得到所述熒光矯正值；和/或，所述矯正系數為10^5；和/或，通過母體樣本中相應基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反
應后的產物熒光矯正值計算受試者早產概率值的公式如下：其中，所述flmcd1為母體樣本中lmcd1基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光矯正值，所述fsnapc1為母體樣本中snapc1基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光矯正值，所述fretsat為母體樣本中retsat基因的rna的逆轉錄產物在含有熒光試劑的體系中酶切反應后的產物熒光矯正值；和/或，所述表達譜包括待測的母體樣本中相應基因相對于基線過量表達；和/或，所述表達譜包括待測的母體樣本中相應基因相對于基線不足表達；和/或，所述基線是足月分娩的母體樣本中相應基因的表達譜。8.一種預測早產的方法，其特征在于，包括：分析母體樣本中的任意一種或至少兩種基因的組套的表達譜，根據所述表達譜預測受試者是否早產。9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述基因包括表1所示基因中的至少一種；和/或，所述基因包括lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因、p2ry10基因、tmem159基因中的至少一種；和/或，所述基因包括lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因中的至少一種；和/或，所述基因包括lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因中的全部；和/或，所述表達譜為相應基因經酶切反應后的熒光值；和/或，所述表達譜為相應基因在母體樣本中的rna的逆轉錄產物經過酶切反應后的熒光值；和/或，所述熒光值為熒光矯正值；和/或，所述酶切反應為等溫反應；和/或，酶切反應體系含有權利要求1～2任意一項所述核苷酸和/或權利要求3～4任意一項所述試劑盒中的組分。10.一種等溫酶切反應方法，其特征在于，包括：將待測模板在等溫條件下進行酶切反應，在酶切反應過程中和/或結束時采集熒光值。11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，采集熒光值的時間點為第30～120分鐘中的某一時間點或某一時間段；和/或，采集熒光值的時間點為第90分鐘；和/或，所述酶切反應的溫度為35～42℃，優選為37℃；和/或，所述酶切反應體系中含有權利要求1～2任意一項所述核苷酸和/或權利要求3～4任意一項所述試劑盒中的組分。12.一種預測早產的系統，其特征在于，包括：早產分析裝置，用于分析母體樣本中的任意一種或至少兩種基因的組套的表達譜，根據所述表達譜預測受試者是否早產。
技術總結
一種多核苷酸、試劑盒、等溫檢測方法及預測早產的方法，預測早產的方法包括：分析母體樣本中的任意一種或至少兩種基因的組套的表達譜，根據所述表達譜預測受試者是否早產。本發明首次檢測孕婦血清中有標志作用的基因表達量，用于無臨床癥狀的孕婦的早產風險預測。主要優勢在于血清學檢測，無須像超聲一樣提前預約，無創檢測，不需要陰道或者宮頸口取樣，檢測流程體驗好。測流程體驗好。測流程體驗好。
