高效轉化葡萄糖生產四氫嘧啶重組菌的構建方法及其應用
1.本發明具體涉及高效轉化葡萄糖生產四氫嘧啶重組菌的構建方法及其應用，屬于基因工程技術領域。
背景技術：
2.四氫嘧啶屬于雜環氨基酸，是一種極性、易溶且生理ph范圍內不帶電荷的相容性溶質，能夠穩定細胞膨脹壓力但不影響細胞正常生理功能。由于四氫嘧啶易于在蛋白質表面形成水化層，可以緩解高滲、高溫、凍融、干燥、輻射和化學試劑對dna雙螺旋結構和蛋白質、生物膜及整個細胞的毒害作用，能夠穩定細胞膨脹壓力但不影響細胞正常生理功能，是微生物細胞的能源物質、滲透壓調節物質和細胞及大分子物質的生物保護劑，因此，在化妝品、生物技術和醫藥行業等領域應用廣泛。
3.四氫嘧啶的生產方法是微生物發酵法和細胞轉化法。目前，發酵法主要是以葡萄糖為底物利用嗜鹽微生物采用“細菌擠奶”工藝進行生產，通過高鹽誘導合成、低鹽刺激促進釋放，滲透壓多次循環沖擊實現四氫嘧啶的胞內積累和分泌?！凹毦鷶D奶法”雖然可以獲得較高的產量，但復雜的工藝流程對生產設備的要求高，高鹽濃度的培養基不僅會腐蝕設備而且會增加下游純化的難度，導致生產成本居高不下。細胞轉化法是以l-天冬氨酸鹽和甘油為底物利用重組微生物或者靜息細胞進行催化合成，然而以l-天冬氨酸鹽為底物，雖然避免了“細菌擠奶法”的一些弊端，但由于四氫嘧啶的生物合成過程中需要大量谷氨酸和乙酰輔酶a作為輔因子，細胞轉化法得率低，生產成本較高。利用大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌在低鹽條件下發酵葡萄糖合成四氫嘧啶，由于代謝途徑長，碳代謝流分配不均，碳原子經濟性差，產量不高，嚴重制約了重組菌用于發酵葡萄糖生產四氫嘧啶的工業化生產和大規模應用。因此，構建新型的四氫嘧啶高產菌株，平衡葡萄糖的碳流分配，提高碳原子經濟性，降低生產成本，對四氫嘧啶的應用有重要的實踐意義，同時也是生產四氫嘧啶的重要研究方向。
4.專利號為zl201510410080.2的中國專利公開了一種產生四氫嘧啶的基因工程菌及其構建方法與應用，具體公開了利用lysa、thra、iclr三個基因缺陷的大腸桿菌表達來源于伸長鹽單胞菌ectabc基因簇，并利用lac啟動子強化谷氨酸棒狀桿菌lysc基因的表達，trc啟動子增強ppc基因的表達，但是重組菌發酵 20-28h后，四氫嘧啶產量為12-18g/l；公開號為cn109182236a的中國專利公開了一種重組大腸桿菌及合成四氫嘧啶的應用，具體公開了重組大腸桿菌是將大腸桿菌e.coli mg1655的二氨基庚二酸脫羧酶lysa基因敲出，并導入核苷酸序列為seq id no.1所示四氫嘧啶合成基因簇ectabc獲得的，并將重組大腸桿菌應用在轉化合成四氫嘧啶中，以l-天冬氨酸鈉為底物，生物轉化制備四氫嘧啶，但是利用該專利的基因重組構建大腸桿菌，進行四氫嘧啶合成的最高轉化率僅為35％。
技術實現要素：
5.本發明目的在于提供高效轉化葡萄糖生產四氫嘧啶重組菌的構建方法，并將其應
用在四氫嘧啶的生產中，能夠實現四氫嘧啶的高產量、高轉化率、低成本且生產工藝簡單，為后續工業化生產四氫嘧啶奠定基礎。
6.本發明的技術方案如下：
7.本發明目的之一在于提供高效轉化葡萄糖生產四氫嘧啶重組菌的構建方法，將二氨基丁酸氨基轉移酶、二氨基丁酸乙?；D移酶和四氫嘧啶合成酶的編碼基因通過重組載體導入受體菌得到高產四氫嘧啶的重組菌；所述受體菌為突變型大腸桿菌或野生型大腸桿菌；
8.所述二氨基丁酸氨基轉移酶(ectb)基因編碼氨基酸序列是seq id no.1 的蛋白質或者在seq id no.1所示的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有二氨基丁酸氨基轉移酶活性的衍生的蛋白質；
9.所述二氨基丁酸乙酰基轉移酶(ecta)基因編碼氨基酸序列是seq id no.2 的蛋白質或者在seq id no.2所示的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有二氨基丁酸乙?；D移酶活性的衍生的蛋白質；
10.所述四氫嘧啶合成酶(ectc)基因編碼氨基酸序列是seq id no.3的蛋白質或者在seq id no.3所示的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有四氫嘧啶合成酶活性的衍生的蛋白質；
11.進一步的，所述突變型大腸桿菌為對野生型大腸桿菌進行下述d1和d2中任一種基因改造得到的所述野生型大腸桿菌的突變體：
12.d1、將丙酮酸激酶i基因pykf敲除，該改造以“δpykf”表示；
13.d2、將丙酮酸激酶ii基因pyka敲除，該改造以“δpyka”表示。
14.進一步的，所述丙酮酸激酶i基因編碼氨基酸序列seq id no.4所示的蛋白質；所述丙酮酸激酶ii基因編碼氨基酸序列seq id no.5所示的蛋白質；
15.其中，所述丙酮酸激酶i基因為d11-d13中的任一種dna分子：
16.d11、其編碼序列是seq id no.10的cdna分子或基因組dna；
17.d12、在嚴格條件下與d11限定的dna分子雜交且編碼所述丙酮酸激酶i 的cdna分子或基因組dna；
18.d13、與d11或d12限定的dna分子具有90％或90％以上同一性且編碼所述丙酮酸激酶i的cdna分子或基因組dna；
19.所述丙酮酸激酶ii基因為d21-d23中的任一種dna分子：
20.d21、其編碼序列是seq id no.14的cdna分子或基因組dna；
21.d22、在嚴格條件下與d21限定的dna分子雜交且編碼所述丙酮酸激酶ii 的cdna分子或基因組dna；
22.d23、與d21或d22限定的dna分子具有90％或90％以上同一性且編碼所述丙酮酸激酶ii的cdna分子或基因組dna；
23.進一步的，所述突變型大腸桿菌還為對野生型大腸桿菌進行下述d3、d4和 d5中任一種基因改造或任意兩種基因改造集合得到的所述野生型大腸桿菌的突變體：
24.d3、將l-天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶雙功能酶i基因thra截短得到保留 l-天冬氨酸激酶活性的突變體i基因(thra*)，該改造以“δthra*”表示；
25.d4、將二氨基庚二酸脫羧酶基因lysa替換為谷氨酸脫氫酶基因gdha，該改造以“δ
lysa::gdha”表示；
26.d5、將l-天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶雙功能酶ii基因metl截短得保留 l-天冬氨酸激酶活性的突變體ii基因(metl
*
)，該改造以“δmetl
*”表示。
27.進一步的，保留l-天冬氨酸激酶活性的突變體i基因編碼氨基酸序列seq id no.6所示的蛋白質；
28.保留l-天冬氨酸激酶活性的突變體ii基因編碼氨基酸序列seq id no.7所示的蛋白質；
29.所述二氨基庚二酸脫羧酶基因編碼氨基酸序列為seq id no.8的蛋白質；
30.所述谷氨酸脫氫酶基因編碼氨基酸序列為seq id no.9的蛋白質；
31.其中，所述l-天冬氨酸激酶突變體i基因為d31-d33中的任一種dna分子：
32.d31、其編碼序列是seq id no.11的cdna分子或基因組dna；
33.d32、在嚴格條件下與d31限定的dna分子雜交且編碼所述天冬氨酸激酶突變體i的cdna分子或基因組dna；
34.d33、與d31或d32限定的dna分子具有90％或90％以上同一性且編碼所述天冬氨酸激酶突變體i的cdna分子或基因組dna；
35.所述二氨基庚二酸脫羧酶基因為d41-d43中的任一種dna分子：
36.d41、其編碼序列是seq id no.12的cdna分子或基因組dna；
37.d42、在嚴格條件下與d41限定的dna分子雜交且編碼所述二氨基庚二酸脫羧酶的cdna分子或基因組dna；
38.d44、與d41或d42限定的dna分子具有90％或90％以上同一性且編碼所述二氨基庚二酸脫羧酶的cdna分子或基因組dna；
39.所述谷氨酸脫氫酶基因為d51-d53中的任一種dna分子：
40.d51、其編碼序列是seq id no.13的cdna分子或基因組dna；
41.d52、在嚴格條件下與d51限定的dna分子雜交且編碼所述谷氨酸脫氫酶的cdna分子或基因組dna；
42.d53、與d51或d52限定的dna分子具有90％或90％以上同一性且編碼所述谷氨酸脫氫酶的cdna分子或基因組dna；
43.所述天冬氨酸激酶突變體ii基因為d61-d63中的任一種dna分子：
44.d61、其編碼序列是seq id no.15的cdna分子或基因組dna；
45.d62、在嚴格條件下與d61限定的dna分子雜交且編碼所述天冬氨酸激酶突變體ii的cdna分子或基因組dna；
46.d63、與d61或d62限定的dna分子具有90％或90％以上同一性且編碼所述天冬氨酸激酶突變體ii的cdna分子或基因組dna；
47.所述嚴格條件是在2
×
ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2 次，每次5min，又于0.5
×
ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2 次，每次15min；所述90％以上的同一性可為至少91％、92％、95％、96％、 98％、99％或100％的同一性；
48.經過上述改造后得到的所述突變型大腸桿菌如下所示：
49.所述突變型大腸桿菌d1為對所述野生型大腸桿菌進行d1、d3和d4改造得到的野生型大腸桿菌突變體，將大腸桿菌的丙酮酸激酶i基因(pykf基因)敲除， l-天冬氨酸激酶/高
絲氨酸脫氫酶雙功能酶i基因(thra基因)截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突變體i基因(thra
*
基因)，并將二氨基庚二酸脫羧酶基因(lysa 基因)替換為谷氨酸脫氫酶基因(gdha基因)，該改造以“δpykfδthra
*
δlysa::gdha”表示；
50.所述突變型大腸桿菌d2為對所述野生型大腸桿菌進行d2、d5和d4改造得到的野生型大腸桿菌突變體，將大腸桿菌的丙酮酸激酶ⅱ基因(pyka基因)敲除， l-天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶雙功能酶ⅱ基因(metl基因)截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突變體ⅱ基因(metl
*
基因)，并將二氨基庚二酸脫羧酶基因 (lysa基因)替換為谷氨酸脫氫酶基因(gdha基因)，該改造以“δpykaδmetl
*
δlysa::gdha”表示；
51.所述突變型大腸桿菌d3為對所述野生型大腸桿菌進行d2、d3和d4改造得到的野生型大腸桿菌突變體，將大腸桿菌的丙酮酸激酶ⅱ基因(pyka基因)敲除， l-天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶雙功能酶i基因(thra基因)截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突變體i基因(thra
*
基因)，并將二氨基庚二酸脫羧酶基因(lysa 基因)替換為谷氨酸脫氫酶基因(gdha基因)，該改造以“δpykaδthra
*
δlysa::gdha”表示；
52.所述突變型大腸桿菌d4為對所述野生型大腸桿菌進行d1、d5和d4改造得到的野生型大腸桿菌突變體，將大腸桿菌的丙酮酸激酶i基因(pykf基因)敲除， l-天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶雙功能酶ⅱ基因(metl基因)截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突變體ⅱ基因(metl
*
基因)，并將二氨基庚二酸脫羧酶基因 (lysa基因)替換為谷氨酸脫氫酶基因(gdha基因)，該改造以“δpykfδmetl
*
δlysa::gdha”表示；
53.所述突變型大腸桿菌d5為對所述野生型大腸桿菌進行d1和d3改造得到的野生型大腸桿菌突變體，將大腸桿菌的丙酮酸激酶i基因(pykf基因)敲除，將大腸桿菌的丙酮酸激酶i基因(pykf基因)敲除，l-天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶雙功能酶i基因(thra基因)截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突變體i基因 (thra
*
基因)，該改造以“δpykfδthra
*”表示，具體可將突變型大腸桿菌d11中的l-天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶雙功能酶i基因(thra基因)截短得到保留l
??
天冬氨酸激酶活性的突變體i基因(thra*基因)得到突變型大腸桿菌d5；
54.所述突變型大腸桿菌d6為對所述野生型大腸桿菌進行d2和d3改造得到的野生型大腸桿菌突變體，將大腸桿菌的丙酮酸激酶ⅱ基因(pyka基因)敲除，l
??
天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶雙功能酶i基因(thra基因)截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突變體i基因(thra
*
基因)該改造以“δpykaδthra
*”表示；具體可將突變型大腸桿菌d12中的l-天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶雙功能酶i基因 (thra基因)截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突變體i基因(thra*基因)得到突變型大腸桿菌d6；
55.所述突變型大腸桿菌d7為對所述野生型大腸桿菌進行d1和d5改造得到的野生型大腸桿菌突變體，將大腸桿菌的丙酮酸激酶i基因(pykf基因)敲除，將大腸桿菌的丙酮酸激酶i基因(pykf基因)敲除，l-天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶雙功能酶ⅱ基因(metl基因)截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突變體ⅱ基因 (metl
*
基因)，該改造以“δpykfδmetl
*”表示，具體可將突變型大腸桿菌d11 中的l-天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶雙功能酶ⅱ基因(metl基因)截短得到保留 l-天冬氨酸激酶活性的突變體ⅱ基因(metl
*
基因)得到突變型大腸桿菌d7；
56.所述突變型大腸桿菌d8為對所述野生型大腸桿菌進行d2和d5改造得到的野生型
大腸桿菌突變體，將大腸桿菌的丙酮酸激酶ⅱ基因(pyka基因)敲除，l
??
天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶雙功能酶ⅱ基因(metl基因)截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突變體ⅱ基因(metl
*
基因)，該改造以“δpykaδmetl
*”表示，具體可將突變型大腸桿菌d12中的l-天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶雙功能酶ⅱ基因(metl基因)截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突變體ⅱ基因(metl
*
基因)得到突變型大腸桿菌d8；
57.所述突變型大腸桿菌d9為對所述野生型大腸桿菌進行d1和d4改造得到的野生型大腸桿菌突變體，將大腸桿菌的丙酮酸激酶i基因(pykf基因)敲除，將二氨基庚二酸脫羧酶基因(lysa基因)替換為谷氨酸脫氫酶基因(gdha基因)，該改造以“δpykfδlysa::gdha
*”表示；具體可為將d11所述突變型大腸桿菌中的二氨基庚二酸脫羧酶基因(lysa基因)替換為谷氨酸脫氫酶基因(gdha基因)得到的突變型大腸桿菌d9；
58.所述突變型大腸桿菌d10為對所述野生型大腸桿菌進行d2和d4改造得到的野生型大腸桿菌突變體，將大腸桿菌的丙酮酸激酶ⅱ基因(pyka基因)敲除，將二氨基庚二酸脫羧酶基因(lysa基因)替換為谷氨酸脫氫酶基因(gdha基因)，該改造以“δpykaδlysa::gdha
*”表示；具體可為將d12所述突變型大腸桿菌中的二氨基庚二酸脫羧酶基因(lysa基因)替換為谷氨酸脫氫酶基因(gdha基因)得到的突變型大腸桿菌d10；
59.所述突變型大腸桿菌d11為對所述野生型大腸桿菌進行d1改造得到的野生型大腸桿菌突變體，將大腸桿菌的丙酮酸激酶i基因(pykf基因)敲除，該改造以“δpykf”表示；
60.所述突變型大腸桿菌d12為對所述野生型大腸桿菌進行d1改造得到的野生型大腸桿菌突變體，將大腸桿菌的丙酮酸激酶ⅱ基因(pyka基因)敲除，該改造以“δpyka”表示；
61.上述基因敲除、基因替換和基因截短均可通過同源重組實現。
62.進一步的，所述重組載體含有二氨基丁酸氨基轉移酶、二氨基丁酸乙酰基轉移酶和四氫嘧啶合成酶的編碼基因；所述重組載體中啟動二氨基丁酸氨基轉移酶、二氨基丁酸乙?；D移酶和四氫嘧啶合成酶的編碼基因轉錄的啟動子是 ara啟動子，終止二氨基丁酸氨基轉移酶、二氨基丁酸乙?；D移酶和四氫嘧啶合成酶基因轉錄的終止子是rrnb終止子。
63.進一步的，所述重組載體是將核苷酸序列為seq id no.16的dna分子替換載體pbadhisb的xhoi和bglⅱ識別位點間的片段、核苷酸序列為seq idno.17的dna分子替換載體pbadhisb的psti和kpni識別位點間的片段以及核苷酸序列為seq id no.18的dna分子替換載體pbadhisb的ecori和hind
?ⅲ
識別位點間的片段進行重組，進而得到重組載體psse。
64.本發明的目的之一還在于提供高效轉化葡萄糖生產四氫嘧啶重組菌的構建方法構建得到的重組菌。
65.本發明的目的之一還在于提供上述構建方法構建的重組菌在以葡萄糖為底物直接發酵生產四氫嘧啶中的應用。
66.相較于現有技術，本發明的有益效果在于：
67.1、本發明構建了新型的能夠根據四氫嘧啶的生物合成途徑，平衡碳代謝流構建出的以葡萄糖為底物直接發酵生產四氫嘧啶的重組菌，在常規發酵條件下， 56小時發酵液中能夠積累36-53g/l四氫嘧啶，單位細胞的產率達到 1.21-1.91g/gdcw，葡萄糖摩爾轉化率達到0.31-0.38mol/mol，產量、產率和轉化率均高于現有工藝。
68.2、本發明中利用構建的重組菌進行以葡萄糖為底物的直接發酵產四氫嘧啶，整個
發酵過程的控制與現有的發酵法和全細胞催化法生產四氫嘧啶鹽工藝相比，原料成本較低，培養條件簡單，設備損耗小，發酵周期短，操作簡便，無需收集菌體提取酶液，且生產效率較高。
附圖說明
[0069][0070]
圖1為本發明實施例中重組菌epk01、epk02、epk03、epk04、epk05、 epk06、epk07、epk08、epk09、epk10、epk11、epk12、epk13和大腸桿菌k12轉化葡萄糖生成四氫嘧啶的產量示意圖；
[0071]
圖2為本發明實施例中重組菌epk09在10l發酵中培養合成四氫嘧啶的示意圖。
具體實施方式
[0072]
下面結合附圖和較佳實施例對本發明做進一步的說明，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。
[0073]
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到；
[0074]
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；
[0075]
本發明中野生型大腸桿菌為大腸桿菌k12；下述實施例中的大腸桿菌 k12(tomoya baba，takeshi ara，miki hasegawa，yuki takai，yoshiko okumura， miki baba，kirilla datsenko，masaru tomita，barry l wanner and hirotada mori1. construction of escherichia coli k-12in-frame，single-gene knockout mutants：the keio collection.molecular systems biology.(2006):1-11)，公眾可從福建師范大學獲得，該生物材料只為重復本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用；
[0076]
下述實施例中載體pbad/hisb為invitrogen公司產品，產品目錄號為 v430-01；
[0077]
下述實施例中的t4連接酶為thermo公司產品，產品目錄號為el0011；
[0078]
下述實施例中的限制性內切酶xhoi、bglⅱ、psti、kpni、ecori、hindⅲ和 dpni均為neb公司產品，產品目錄號分別為r0146、r0144、r0140、r3142、 r3101、r3104和r0176；
[0079]
下述實施例中的dh5α感受態細胞為takara公司產品，產品目錄號為 d9057a；
[0080]
下述實施例中的pcas質粒購自addgene，產品編號為plasmid#62225(jiang y，chen b，duan c，sun b，yang j，yang s:multigene editing in the escherichia coli genome via the crispr-cas9 system.appl environ microbiol 2015， 81:2506-2514)；
[0081]
下述實施例中的ptargetf質粒購自addgene，產品編號為plasmid #62226(jiang y，chen b，duan c，sun b，yang j，yang s:multigene editing in the escherichia coli genome via the crispr-cas9 system.appl environ microbiol 2015，81:2506-2514)；
[0082]
下述實施例中應用到的crispr技術參見現有技術(jiang y，chen b，duan c，sun b，yang j，yang s:multigene editing in the escherichia coli genome via the crispr-cas9 system.appl environ microbiol 2015，81:2506-2514)；
[0083]
實施例1高效轉化葡萄糖生產四氫嘧啶重組菌的構建
[0084]
一、構建表達二氨基丁酸氨基轉移酶(ectb)、二氨基丁酸乙?；D移酶 (ecta)和四氫嘧啶合成酶(ectc)編碼基因的重組載體
[0085]
將pbadhisb載體的xhoi和bglⅱ識別位點間的dna序列替換為seq idno.16所示的用于編碼二氨基丁酸氨基轉移酶的dna序列；將psti和kpni識別位點間dna序列替換為seq id no.17所示的用于編碼二氨基丁酸乙?；D移酶的dna序列；將ecori和hindⅲ識別位點間的dna序列替換為seq idno.18所示的用于編碼四氫嘧啶合成酶的dna序列，其它dna序列保持不變，得到重組載體psse；從酶切鑒定證明ectb、ecta和ectc基因成功插入到 pbadhisb載體的xhoi和hindⅲ識別位點間；重組載體psse可表達seq idno.1所示的二氨基丁酸氨基轉移酶，seq id no.2所示的二氨基丁酸乙?；D移酶，seq id no.3所示的四氫嘧啶合成酶。
[0086]
二、構建弱化乙酰輔酶a(accoa)合成的突變型大腸桿菌d11菌株 k12δpykf和突變型大腸桿菌d12菌株k12δpyka
[0087]
(1)制備電轉感受態細胞：將pcas質粒利用化學轉化法轉化大腸桿菌 k12，在含卡那霉素的lb平板(卡那霉素濃度為50μg/ml)上30℃培養篩選陽性克隆，陽性克隆接種在含2g/l阿拉伯糖的lb液體培養基中30℃培養至od
600
約為0.6后，制備電轉感受態細胞；
[0088]
(2)構建ptarget質粒：利用網站https://crispy.secondarymetabolites.org選取敲除pykf和pyka基因的n20，設計引物構建ptarget質粒，以ptargetf為模板，分別用引物對ptarget-pykf-f和ptarget-pyka-r、ptarget-pykf-f’和 ptarget-pyka-r’進行pcr擴增，獲得大小約為2100bp的片段，用dpni甲基化酶消化約3h后，直接利用化學轉化法轉化大腸桿菌dh5感受態，在含鏈霉素的lb平板(鏈霉素濃度為50μg/ml)上篩選陽性克隆，并用引物ptarget-cexu-f 測序驗證，測序正確后命名為ptarget-pykf和ptarget-pyka；
[0089]
所用引物序列如下(下劃線所示為n20的序列)：
[0090]
ptarget-pykf-f：5
’?
gacggcatcatggttgcgcggttttagagctagaaatagc-3’；
[0091]
ptarget-pykf-r：5
’?
cgcgcaaccatgatgccgtcactagtattatacctaggac-3’；
[0092]
ptarget-pykf-f’：5
’?
tgcgcgtcagctaaaccgaggttttagagctagaaatagc-3’； ptarget-pyka-r’：5
’?
ctcggtttagctgacgcgcaactagtattatacctaggac-3’；
[0093]
(3)擴增打靶片段：分別用引物對pykf-up-f和pykf-up-r，pykf-down-f 和pykf-down-r，或pyka-up-f和pyka-up-r，pyka-down-f和pyka-down-r進行pcr擴增，分別得到大小約為500bp的片段；分別以上述兩個片段的混合物為模板，用引物對pykf-up-f和pykf-down-r，或pyka-up-f和pyka-down-r進行pcr擴增，分別得到大小約為1000bp的pykf或pyka打靶片段，回收打靶片段，打靶片段從上游到下游依次包含500bp上游同源臂，只剩21bp的pykf 或pyka突變基因和500bp下游同源臂：
[0094]
所用引物序列如下：
[0095]
pykf-up-f：5
’?
agcacaactttaccgacaactct-3’；
[0096]
pykf-up-r：5
’?
gacgtgaacagatgccatgacagtcttagtctttaagttgagaagga-3’；
[0097]
pykf-down-f：5
’?
taagactgtcatggcatctgttcacgtcctgtaatattg-3’；
[0098]
pykf-down-r：5
’?
catctttagcagcctgaacgt-3’；
[0099]
pyka-up-f：5
’?
tccggtggtgtactccgatg-3’；
[0100]
pyka-up-r：5
’?
tactctaccgttaaaatacgcatgtaatactccgttgactgaaacaac-3’；
[0101]
pykf-down-f：5
’?
gagtattacatgcgtattttaacggtagagtaagtacgttgc-3’；
[0102]
pykf-down-r：5
’?
acggtattaaaccattcatccagtcg-3’；
[0103]
(4)電轉化：將200ng的ptarget-pykf或ptarget-pyka質粒，400ng的pykf 或pyka打靶片段與100μl步驟(1)制備的電轉化感受態細胞混合，置于2mm 的電轉杯中，2.5kv電擊，加入1ml lb液體培養基30℃復蘇后涂布在含卡那霉素和鏈霉素的lb平板上(卡那霉素濃度為50μg/ml，鏈霉素濃度為50μg/ml)， 30℃培養，篩選陽性克隆，用引物對pykf-up-f和pykf-down-r，或pyka-up-f 和pykf-down-r進行pcr擴增，將擴增片段測序驗證；
[0104]
(5)消除ptarget質粒：將測序驗證正確的含有pcas質粒的突變型大腸桿菌菌株k12δpykf和k12δpyka接種在lb液體培養基中，37℃培養過夜以消除 pcas質粒；將過夜培養后的菌株在lb固體平板上劃線，37℃過夜培養，得到突變型大腸桿菌d11菌株k12δpykf和突變型大腸桿菌d12菌株k12δpyka。
[0105]
三、構建弱化賴氨酸合成代謝途徑的突變型大腸桿菌d9菌株 k12δpykfδlysa::gdha和突變型大腸桿菌d10菌株k12δpykfδlysa::gdha
[0106]
(1)將經過上述步驟(5)獲得的含有pcas質粒的突變型大腸桿菌d11菌株k12δpykf和突變型大腸桿菌d12菌株k12δpyka接種在含2g/l阿拉伯糖的 lb液體培養基中30℃培養至od
600
約為0.6后，制備電轉感受態細胞；
[0107]
(2)構建ptarget質粒：利用網站https://crispy.secondarymetabolites.org 選取敲除lysa基因的n20，設計引物構建ptarget質粒；以ptargetf為模板，分別用引物對ptarget-lysa-f和ptarget-lysa-r進行pcr擴增，獲得大小約為 2100bp的片段，用dpni甲基化酶消化約3h后，直接利用化學轉化法轉化大腸桿菌dh5感受態，在含鏈霉素的lb平板(鏈霉素濃度為50μg/ml)上篩選陽性克隆，并用引物ptarget-cexu-f測序驗證，測序正確后命名為ptarget-lysa：
[0108]
所用引物序列如下(下劃線所示為n20的序列)：
[0109]
ptarget-lysa-f：5
’?
gtgtggtgctatggtgcgtcgttttagagctagaaatagc-3’；
[0110]
ptarget-lysa-r：5
’?
gacgcaccatagcaccacacactagtattatacctaggac-3’；
[0111]
ptarget-cexu-f：5
’?
ctttcctgcgttatcccctg-3’；
[0112]
(3)擴增打靶片段：分別用引物對lysa-up-f和lysa-up-r，gdha-f和 gdha-r，lysa-down-f和lysa-down-r進行pcr擴增，分別得到大小約為 500bp，1300bp和500bp的片段，以三個片段的混合物為模板，用引物對 lysa-up-f和lysa-down-r進行pcr擴增，得到大小約為2300bp的lysa::gdha 打靶片段，回收打靶片段，打靶片段從上游到下游依次包含500bp上游同源臂，gdha基因和500bp下游同源臂：
[0113]
所用引物序列如下：
[0114]
lysa-up-f：5
’?
tcttcaagtagcggtgattcctgg-3’；
[0115]
lysa-up-r：5
’?
gaatatgtctgatccataacaaactccagataagtgcttttttatgattacg-3’；
[0116]
gdha-f：5
’?
gcacttatctggagtttgttatggatcagacatattctctggagtca-3’；
[0117]
gdha-r：5
’?
ccagcgactaaccgcagttaaatcacaccctgcgccag-3’；
[0118]
lysa-down-f：5
’?
ctggcgcagggtgtgatttaactgcggttagtcgctgg-3’；
[0119]
lysa-down-r：5
’?
ccgcattggttatctgtgctctaac-3’；
[0120]
(4)電轉化：將200ng的ptarget-lysa質粒，400ng的lysa::gdha打靶片段與100μl步驟(1)制備的電轉化感受態細胞混合，置于2mm的電轉杯中， 2.5kv電擊，加入1ml lb液體培養基30℃復蘇后涂布在含卡那霉素和鏈霉素的 lb平板上(卡那霉素濃度為50μg/ml，鏈
霉素濃度為50μg/ml)，30℃培養，篩選陽性克隆，用引物對lysa-up-f和lysa-down-r進行pcr擴增，將擴增片段測序驗證；
[0121]
(5)消除ptarget質粒：將測序驗證正確的陽性克隆接種在含有0.1mm iptg和卡那霉素的lb液體培養基中30℃培養過夜以消除ptarget-lysa質粒；過夜培養后的菌株在含有卡那霉素的lb固體平板上劃線，30℃培養過夜，得到含有pcas質粒的突變型大腸桿菌d9菌株k12δpykfδlysa::gdha或突變型大腸桿菌d10菌株k12δpykaδlysa::gdha；
[0122]
(6)消除pcas質粒：將測序驗證正確的含有pcas質粒的大腸桿菌突變體 k12δpykfδlysa::gdha或k12δpykaδlysa::gdha接種在lb液體培養基中，37℃培養過夜以消除pcas質粒，將過夜培養后的菌株在lb固體平板上劃線，37℃培養過夜培養，得到突變型大腸桿菌d9菌株k12δpykfδlysa::gdha或突變型大腸桿菌d10菌株k12δpykaδlysa::gdha。
[0123]
四、構建弱化高絲氨酸合成代謝途徑的突變型大腸桿菌d5菌株 k12δpykfδthra
*
、突變型大腸桿菌d6菌株k12δpykaδthra
*
、突變型大腸桿菌 d7菌株k12δpykfδmetl
*
和突變型大腸桿菌d8菌株k12δpykaδmetl
*
[0124]
(1)構建ptarget質粒：利用網站https://crispy.secondarymetabolites.org 選取截斷thra和metl基因的n20，設計引物構建ptarget質粒；以ptargetf 為模板，分別用引物對ptarget-thra-f和ptarget-thra-r，ptarget-metl-f和 ptarget-metl-r進行pcr擴增，獲得大小約為2100bp的片段；用dpni甲基化酶消化約3h后，直接利用化學轉化法轉化大腸桿菌dh5α感受態，在含鏈霉素的lb平板(鏈霉素濃度為50μg/ml)上篩選陽性克隆，并用引物 ptarget-cexu-f測序驗證，測序正確后命名為ptarget-thra和ptarget-metl；
[0125]
所用引物序列如下(下劃線所示為n20的序列)：
[0126]
ptarget-thra-f：5
’?
cgaaggcatgagtttctccggttttagagctagaaatagc-3’；
[0127]
ptarget-thra-r：5
’?
cggagaaactcatgccttcgactagtattatacctaggac-3’；
[0128]
ptarget-metl-f：5
’?
tggctgttcctgcaattcgagttttagagctagaaatagc-3’； ptarget-metl-r：5
’?
tcgaattgcaggaacagccaactagtattatacctaggac-3’；
[0129]
(2)擴增打靶片段：分別用引物對thra-up-f和thra-up-r，thra-down-f 和thra-down-r，或metl-up-f和metl-up-r，metl-down-f和metl-down-r 進行pcr擴增，分別得到大小約為500bp的片段；分別以上述兩個片段的混合物為模板，分別用引物對thra-up-f和thra-down-r，或metl-up-f和 metl-down-r進行pcr擴增，分別得到大小約為1000bp的thra或metl打靶片段，回收打靶片段；打靶片段從上游到下游依次包含500bp上游同源臂，只剩1413bp的thra或1392bp的metl突變基因和500bp下游同源臂；
[0130]
所用引物序列如下：
[0131]
thra-up-f：5
’?
tcctacttcggcgctaaagttct-3’；
[0132]
thra-up-r：5
’?
cggggcataaactttaaccatgtcacacaaacacttcgataacctgatcgg-3’；
[0133]
thra-down-f：5
’?
ccgatcaggttatcgaagtgtttgtgtgacatggttaaagtttatgccccg-3’；
[0134]
thra-down-r：5
’?
aatagcaggcgtgaatgaagcc-3’；
[0135]
metl-up-f：5
’?
aggttccacgcgcattgaac-3’；
[0136]
metl-up-r：5
’?
taaatttctgaaattacaataccaggccgatgcgt-3’；
[0137]
metl-down-f：5
’?
gtattgtaatttcagaaatttaataatgcccggtactcatgt-3’；
[0138]
metl-down-r：5
’?
gcaagtaagatgcggtgccg-3’；
[0139]
(3)電轉化：將200ng的ptarget-thra或ptarget-metl質粒，400ng的 thra或metl打靶片段與100μl步驟(1)制備的電轉化感受態細胞混合，置于2mm的電轉杯中，2.5kv電擊，加入1ml lb液體培養基30℃復蘇后涂布在含卡那霉素和鏈霉素的lb平板上(卡那霉素濃度為50μg/ml，鏈霉素濃度為50μg/ml)，30℃培養，篩選陽性克?。挥靡飳hra-up-f和thra-down-r，或metl-up-f和metl-down-r進行pcr擴增，將擴增片段測序驗證；
[0140]
(4)消除ptarget質粒：將測序驗證正確的陽性克隆接種在含有0.1mm iptg和卡那霉素的lb液體培養基中30℃培養過夜以消除ptarget-thra或 ptarget-metl質粒；過夜培養后的菌株在含有卡那霉素的lb固體平板上劃線， 30℃培養過夜，得到含有pcas質粒的突變型大腸桿菌d5菌株、突變型大腸桿菌d6菌株、突變型大腸桿菌d7菌株和突變型大腸桿菌d8菌株；
[0141]
(6)消除pcas質粒：將測序驗證正確的含有pcas質粒的突變型大腸桿菌 d5菌株、d6菌株、d7菌株和d8菌株接種在lb液體培養基中，37℃培養過夜以消除pcas質粒；將過夜培養后的菌株在lb固體平板上劃線，37℃培養過夜培養，得到突變型大腸桿菌d5菌株k12δpykfδthra
*
、突變型大腸桿菌d6菌株k12δpykaδthra
*
、突變型大腸桿菌d7菌株k12δpykfδmetl
*
和突變型大腸桿菌d8菌株k12δpykaδmetl
*
。
[0142]
五、構建積累asa的突變型大腸桿菌d1菌株k12δpykfδthra
*
δlysa::gdha、突變型大腸桿菌d2菌株k12δpykaδmetl
*
δlysa::gdha、突變型大腸桿菌d3菌株k12δpykaδthra
*
δlysa::gdha、突變型大腸桿菌d4菌株
[0143]
k12δpykaδthra
*
δlysa::gdha
[0144]
(1)消除ptarget質粒：從構建弱化高絲氨酸合成代謝途徑的突變型大腸桿菌菌株的步驟中步驟(4)的平板上挑取單克隆的突變體k12δpykfδthra
*
、 k12δpykaδmetl
*
、k12δpykaδthra
*
和k12δpykaδthra*，制備電轉感受態細胞，按照構建弱化賴氨酸合成代謝途徑的突變型大腸桿菌菌株的步驟中步驟(2)和(3)獲得的ptarget-lysa質粒和lysa::gdha打靶片段混合，并重復構建弱化賴氨酸合成代謝途徑的突變型大腸桿菌菌株的步驟中步驟(4)和(5)，得到含有pcas質粒的突變型大腸桿菌d1菌株、d2菌株、d3菌株和d4菌株；
[0145]
(2)消除pcas質粒：將測序驗證正確的含有pcas質粒的突變型大腸桿菌 d1菌株、d2菌株、d3菌株和d4菌株接種在lb液體培養基中，37℃培養過夜以消除pcas質粒，將過夜培養后的菌株在lb固體平板上劃線，37℃培養過夜，最終得到d1菌株k12δpykfδthra
*
δlysa::gdha、突變型大腸桿菌d2菌株 k12δpykaδmetl
*
δlysa::gdha、突變型大腸桿菌d3菌株
[0146]
k12δpykaδthra
*
δlysa::gdha、突變型大腸桿菌d4菌株
[0147]
k12δpykaδthra
*
δlysa::gdha。
[0148]
六、構建轉化葡萄糖生產四氫嘧啶的重組菌
[0149]
采用氯化鈣法將獲得的重組載體psse導入構建的突變型大腸桿菌d11菌株、突變型大腸桿菌d12菌株、突變型大腸桿菌d9菌株、突變型大腸桿菌d10 菌株、突變型大腸桿菌d5菌株、突變型大腸桿菌d7菌株、突變型大腸桿菌d6 菌株、突變型大腸桿菌d8菌株、突變型
大腸桿菌d1菌株、突變型大腸桿菌d4 菌株、突變型大腸桿菌d3菌株、突變型大腸桿菌d2菌株和野生型大腸桿菌k12 中，在含有氨卞青霉素的平板上篩選陽性克隆子，將得到的陽性克隆子分別命名為psse/k12δpykf(菌株編號為epk01)、psse/k12δpyka(菌株編號為 epk02)、psse/k12δpykfδlysa::gdha(菌株編號為epk03)、 psse/k12δpykaδlysa::gdha(菌株編號為epk04)、psse/k12δpykfδthra
*
(菌株編號為epk05)、psse/k12δpykfδmetl
*
(菌株編號為epk06)、 psse/k12δpykaδthra
*
(菌株編號為epk07)、psse/k12δpykaδmetl
*
(菌株編號為epk08)、psse/k12δpykfδthra
*
δlysa::gdha(菌株編號為epk09)、 psse/k12δpykfδmetl
*
δlysa::gdha(菌株編號為epk10)、 psse/k12δpykaδthra
*
δlysa::gdha(菌株編號為epk11)、 psse/k12δpykaδmetl
*
δlysa::gdha(菌株編號為epk12)和psse/k12(菌株編號為epk13)。
[0150]
實施例2
[0151]
一、轉化葡萄糖生產四氫嘧啶的重組菌的誘導培養分別將經過實施例1獲得的高產四氫嘧啶的重組菌epk01、epk02、epk03、 epk04、epk05、epk06、epk07、epk08、epk09、epk10、epk11、epk12、 epk13和大腸桿菌k12劃線到含有質量濃度為1.5％的瓊脂和質量濃度為 100μg/ml的氨卞青霉素的lb平板上，37℃培養12h；挑取平板上的單菌落，接種到含有質量濃度為100μg/ml的液體lb培養基中，37℃過夜振蕩培養，轉速為220rpm；將過夜培養物以1％(體積百分比)的接種量接種至自誘導培養基zym中，在轉速為200rpm，30℃條件下振蕩16h，分別獲得誘導后的epk01菌株、epk02菌株、epk03菌株、epk04菌株、epk05菌株、epk06 菌株、epk07菌株、epk08菌株、epk09菌株、epk10菌株、epk11菌株、 epk12菌株、epk13菌株和k12菌株，其中，k12菌株培養過程中沒有添加抗生素
[0152]
二、重組菌轉化葡萄糖產四氫嘧啶
[0153]
分別將經過實施例1獲得的高產四氫嘧啶的重組菌epk01、epk02、 epk03、epk04、epk05、epk06、epk07、epk08、epk09、epk10、epk11、 epk12、epk13和大腸桿菌k12于4℃，8000g條件下離心10min，收集菌體；再用濃度為10mm的氯化鈉水溶液洗滌菌體1次后以相同的離心條件再次收集菌體，分別獲得洗滌后的epk01、epk02、epk03、epk04、epk05、epk06、 epk07、epk08、epk09、epk10、epk11、epk12、epk13和大腸桿菌；分別將洗滌后的上述菌株重懸于含有濃度為100mm葡萄糖的pbs緩沖液中(ph為 7.0)，獲得上述菌株的轉化液，轉化液中菌體含量以濕重計為15g/l；最后將轉化液在30℃，轉速為100rpm的條件下進行葡萄糖到四氫嘧啶的轉化，轉化時間為9h；
[0154]
不同菌株的四氫嘧啶產量參見圖1，從圖中可以看出，陽性對照株epk13 轉化9h，四氫嘧啶產量僅為3.69mm；大腸桿菌k12轉化9h，仍然檢測不到四氫嘧啶的產生；菌株epk01和epk02轉化9h，四氫嘧啶產量分別為4.79mm 和4.14mm，分別比比epk13提高了29.81％和12.20％；菌株epk03和epk04 轉化9h，四氫嘧啶產量分別為9.87mm和8.29mm，分別比epk01和epk02 菌株提高了106.05％和100.24％；菌株epk05和epk06轉化9h，四氫嘧啶產量分別為11.46mm和8.13mm，分別比epk01提高了139.25％和69.73％；菌株 epk07和epk08轉化9h，四氫嘧啶產量分別為10.26mm和7.62mm，分別比 epk02提高了147.83％和84.06％；菌株epk09、epk10、epk11和epk12轉化 9h，四氫嘧啶產量分別為19.74mm、13.73mm、17.94mm和12.82mm，分別比epk05、epk06、epk07和epk08菌株提高了72.25％、68.88％、74.85％和 68.24％；其中，菌株epk09的產量最高，提高了葡萄糖的摩爾轉化率。
[0155]
實施例3高密度培養重組菌株epk09產四氫嘧啶
[0156]
從-80℃冰箱的保種管中吸取1.2ml的epk09菌液接種到120ml含有質量濃度為100μg/ml氨卞青霉素的液體lb培養基中，37℃振蕩培養8h，轉速 220rpm；將培養物以2％(體積百分比)的接種量接種至裝有6l基礎培養基的 10l發酵罐中，培養溫度為37℃，通過流加氨水將ph維持在7.0左右，通氣比為0.8-1vvm，轉速與溶氧關聯，維持溶氧不低于20％；發酵12h后開始流加補料培養基，維持發酵液中葡萄糖濃度在0.5-1g/l；培養od
600
到50時降溫至30℃，加入阿拉伯糖至質量終濃度為20％進行誘導，間隔取樣測量生物量和罐中四氫嘧啶產量，發酵周期56h；
[0157]
10l發酵罐的發酵過程曲線參見圖2，發酵12h菌體od
600
值達到18.6，殘糖濃度降到0.1g/l以下開始補糖，隨著葡萄糖的流加，發酵液的菌濃穩步增長， 18h菌體od
600
值達到51.7，加入阿拉伯糖開始誘導，菌體開始大量合成四氫嘧啶，發酵56h共消耗葡萄糖201.67g/l，四氫嘧啶產量達到53.22g/l，葡萄糖摩爾轉化率為0.36mol/mol；菌體密度od
600
達到99.8，細胞干重約為29.74g/l，單位菌體的四氫嘧啶產量達到1.79g/g dcw；而對照菌株epk13采用同樣的培養條件發酵56h四氫嘧啶的產量僅為7.24g/l。
[0158]
實施例4高密度培養重組菌株epk10、epk11和epk12產四氫嘧啶
[0159]
按照實施例3所述的培養方法在10l發酵罐中培養重組菌株epk10、epk11 和epk12；重組菌株epk10發酵56h共消耗葡萄糖168.32g/l，四氫嘧啶產量達到41.27g/l，葡萄糖摩爾轉化率為0.31mol/mol，菌體密度od
600
達到113.2，細胞干重約為33.64g/l，單位菌體的四氫嘧啶產量達到1.23g/g dcw，其中，對照菌株epk13采用同樣的培養條件發酵56h四氫嘧啶的產量僅為6.93g/l；重組菌株epk11發酵56h共消耗葡萄糖156.18g/l，四氫嘧啶產量達到46.83g/l，葡萄糖摩爾轉化率為0.38mol/mol，菌體密度od
600
達到85.6，細胞干重約為24.48 g/l，單位菌體的四氫嘧啶產量達到1.91g/g dcw，其中，對照菌株epk13采用同樣的培養條件發酵56h四氫嘧啶的產量僅為7.07g/l；重組菌株epk12發酵 56h共消耗葡萄糖145.34g/l，四氫嘧啶產量達到36.45g/l，葡萄糖摩爾轉化率為0.32mol/mol；菌體密度od
600
達到100.7，細胞干重約為30.21g/l，單位菌體的四氫嘧啶產量達到1.21g/g dcw，其中，對照菌株epk13采用同樣的培養條件發酵56h四氫嘧啶的產量僅為7.16g/l。
[0160]
以上所述僅為本發明的實施例，并非因此限制本發明的專利范圍，凡是利用本發明說明書內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的技術領域，均同理包括在本發明的專利保護范圍內。
技術特征：
1.高效轉化葡萄糖生產四氫嘧啶重組菌的構建方法，其特征在于：將二氨基丁酸氨基轉移酶、二氨基丁酸乙?；D移酶和四氫嘧啶合成酶的編碼基因通過重組載體導入受體菌得到用于產四氫嘧啶的重組菌；所述受體菌為突變型大腸桿菌或野生型大腸桿菌；所述二氨基丁酸氨基轉移酶基因編碼氨基酸序列為seq id no.1的蛋白質或者由seq id no.1所示的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有二氨基丁酸氨基轉移酶活性的衍生蛋白；所述二氨基丁酸乙?；D移酶基因編碼氨基酸序列為seq id no.2的蛋白質或者由seq id no.2所示的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有二氨基丁酸乙?；D移酶活性的衍生蛋白；所述四氫嘧啶合成酶基因編碼氨基酸序列為seq id no.3的蛋白質或者由seq id no.3所示的氨基酸序列中經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有四氫嘧啶合成酶活性的衍生蛋白。2.如權利要求1所述的高效轉化葡萄糖生產四氫嘧啶重組菌的構建方法，其特征在于：所述突變型大腸桿菌為對野生型大腸桿菌進行下述d1和d2中任一種基因改造得到的所述野生型大腸桿菌的突變體：d1、將丙酮酸激酶i基因pykf敲除；d2、將丙酮酸激酶ii基因pyka敲除。3.如權利要求2所述的高效轉化葡萄糖生產四氫嘧啶重組菌的構建方法，其特征在于：所述突變型大腸桿菌還為對野生型大腸桿菌進行下述d3、d4和d5中任一種基因改造或任意兩種基因改造集合得到的所述野生型大腸桿菌的突變體：d3、將l-天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶雙功能酶i基因截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突變體i基因；d4、將二氨基庚二酸脫羧酶基因替換為谷氨酸脫氫酶基因；d5、將l-天冬氨酸激酶/高絲氨酸脫氫酶雙功能酶ii基因截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突變體ii基因。4.如權利要求2所述的高效轉化葡萄糖生產四氫嘧啶重組菌的構建方法，其特征在于：所述丙酮酸激酶i基因編碼氨基酸序列seq id no.4所示的蛋白質；所述丙酮酸激酶ii基因編碼氨基酸序列seq id no.5所示的蛋白質。5.如權利要求3所述的一種高產四氫嘧啶的重組大腸桿菌的構建方法，其特征在于：保留l-天冬氨酸激酶活性的突變體i基因編碼氨基酸序列seq id no.6所示的蛋白質；保留l-天冬氨酸激酶活性的突變體ii基因編碼氨基酸序列seq id no.7所示的蛋白質；所述二氨基庚二酸脫羧酶基因編碼氨基酸序列為seq id no.8的蛋白質；所述谷氨酸脫氫酶基因編碼氨基酸序列為seq id no.9的蛋白質。6.如權利要求1所述的高效轉化葡萄糖生產四氫嘧啶重組菌的構建方法，其特征在于：所述重組載體含有二氨基丁酸氨基轉移酶、二氨基丁酸乙?；D移酶和四氫嘧啶合成酶的編碼基因；所述重組載體中啟動二氨基丁酸氨基轉移酶、二氨基丁酸乙?；D移酶和四氫嘧啶合成酶的編碼基因轉錄的啟動子是ara啟動子，終止二氨基丁酸氨基轉移酶、二氨基丁酸乙?；D移酶和四氫嘧啶合成酶基因轉錄的終止子是rrnb終止子。
7.如權利要求6所述的高效轉化葡萄糖生產四氫嘧啶重組菌的構建方法，其特征在于：所述重組載體是將核苷酸序列為seq id no.16的dna分子替換載體pbadhisb的xhoi和bglⅱ識別位點間的片段、核苷酸序列為seq id no.17的dna分子替換載體pbadhisb的psti和kpni識別位點間的片段以及核苷酸序列為seq id no.18的dna分子替換載體pbadhisb的ecori和hindⅲ識別位點間的片段進行重組，進而得到重組載體psse。8.一種按照權利要求1至7任一所述的高效轉化葡萄糖生產四氫嘧啶重組菌的構建方法構建得到的重組菌。9.如權利要求8所述的重組菌在以葡萄糖為底物直接發酵生產四氫嘧啶中的應用。
技術總結
本發明公開高效轉化葡萄糖生產四氫嘧啶重組菌的構建方法及應用，重組菌是根據四氫嘧啶的生物合成途徑，平衡磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸和丙酮酸的碳代謝流分配構建出的以葡萄糖為底物直接發酵生產四氫嘧啶的重組菌株，在常規發酵條件下，56小時發酵液中能夠積累36-53g/L四氫嘧啶，單位細胞的產率達到1.21-1.91g/g DCW，葡萄糖摩爾轉化率達到0.31-0.38mol/mol，產量、產率和轉化率均高于現有工藝；本發明提供的重組菌用于發酵產四氫嘧啶的過程控制與現有的發酵法和全細胞催化法生產四氫嘧啶鹽工藝相比，原料成本較低，培養條件簡單，設備損耗小，發酵周期短，操作簡便，無需收集菌體提取酶液，四氫嘧啶生產效率較高。四氫嘧啶生產效率較高。四氫嘧啶生產效率較高。
