用于細胞捕獲的丙烯酰胺水凝膠微球及其制備方法與流程
1.本發明屬于生物技術領域，具體涉及用于細胞捕獲的丙烯酰胺水凝膠微球及其制備方法。
背景技術：
2.水凝膠是一類由親水分子通過物理或化學交聯形成的三維網狀且富水結構的聚合物，類似于生物軟組織，由于其優異的力學性能及良好的生物相容性，在生物醫學、生物工程、智能仿生材料及柔性電子器件等領域具有潛在的應用前景。將水凝膠做成微球尺寸最初是在10xgenomic公司旗下單細胞測序產品的mrna捕獲，其原理是在水凝膠微膠珠表面偶聯核酸標簽序列及捕獲序列，利用核酸的反向互補原理捕獲細胞釋放的mrna，而目前沒有技術將水凝膠微球未用于細胞富集。
技術實現要素：
3.本發明的目的在于提供用于細胞捕獲的丙烯酰胺水凝膠微球及其制備方法，以解決上述背景技術中提出的問題。
4.為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：用于細胞捕獲的丙烯酰胺水凝膠微球，具體包括如下組分：40％丙烯酰胺溶液2.58ml、40％甲叉雙丙烯酰胺溶液3.6ml、無酶水3.82ml；tris-鹽酸緩沖液10ml、nacl 137ml、kcl0.9ml、edta緩沖液20ml、無酶水832.1ml；10％過硫酸銨1ml、氫凝膠珠用丙烯酰胺混合物4ml、1％span80-hexane20ml、20％fto 4.8ml、微液滴生成油-temed 4ml；
5.所述氫凝膠珠用丙烯酰胺混合物由4x acrylamide/bis-acrylamide solution1000μl、1x tris-edta-na+k+buffer、無酶水2480μl配置而成。
6.優選的，所述10％過硫酸銨由1g的過硫酸銨、10ml的無酶水配置而成。
7.優選的，所述微液滴生成油-temed由in hef7500 surf-600p 2％4ml、temed 40μl配置而成。
8.本發明還公開了用于細胞捕獲的丙烯酰胺水凝膠微球的制備方法，具體包括以下步驟：
9.s1、生成水凝膠微膠珠：調節注射泵流速，膠項流速：25μl/min；油相流速：60μl/min，注射泵啟動后2分鐘內生成的膠珠液滴棄掉，從第三分鐘開始將生成的油包水微液滴收集在裝有carrier oil的收集容器內，直至膠項流動結束；
10.s2、水凝膠膠珠凝固：將收集容器封閉后，置于70℃烘箱內進行加速凝固，凝固時間至少大于8小時；
11.s3、將容器從烘箱內取出，使用移液器盡量除去上層的油相與下層的carrier油相；
12.s4、加入1ml 1xpbs，其ph值為7.2，緩沖液以及2ml的20％pfo，震蕩混勻使其乳化，靜置3min，除去下層pfo，重復3次；
13.s5、加入2ml 1％span80-hexane,充分混勻，靜置5min，棄上層hexane，重復3次至hydogel beads曾略透明狀態；
14.s6、加入5ml 1x tris-edta-na+k+buffer,充分混勻，靜置3min，棄上清，重復3-5次，至hydogel beads曾透明狀態，完成制備。
15.與現有技術相比，本發明的有益效果是：根據偶聯捕獲抗體類型不同，該水凝膠微球可以實現不同類型細胞的捕獲；以極大程度保護目標細胞，及剩余樣本細胞的活性，對細胞分選準確率高。
附圖說明
16.圖1對膠珠固相進行了基于cd45-af568的抗體染結果圖。
具體實施方式
17.下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。
18.本發明提供了用于細胞捕獲的丙烯酰胺水凝膠微球，具體包括如下組分：40％丙烯酰胺溶液2.58ml、40％甲叉雙丙烯酰胺溶液3.6ml、無酶水3.82ml；tris-鹽酸緩沖液10ml、nacl 137ml、kcl 0.9ml、edta緩沖液20ml、無酶水832.1ml；10％過硫酸銨1ml、氫凝膠珠用丙烯酰胺混合物4ml、1％span80-hexane20ml、20％fto 4.8ml、微液滴生成油-temed 4ml；
19.所述氫凝膠珠用丙烯酰胺混合物由4x acrylamide/bis-acrylamide solution1000μl、1x tris-edta-na+k+buffer、無酶水2480μl配置而成。
20.所述10％過硫酸銨由1g的過硫酸銨、10ml的無酶水配置而成。
21.所述微液滴生成油-temed由in hef7500 surf-600p 2％4ml、temed 40μl配置而成。
22.本發明還公開了用于細胞捕獲的丙烯酰胺水凝膠微球的制備方法，具體包括以下步驟：
23.s1、生成水凝膠微膠珠：調節注射泵流速，膠項流速：25μl/min；油相流速：60μl/min，注射泵啟動后2分鐘內生成的膠珠液滴棄掉，從第三分鐘開始將生成的油包水微液滴收集在裝有carrier oil的收集容器內，直至膠項流動結束；
24.s2、水凝膠膠珠凝固：將收集容器封閉后，置于70℃烘箱內進行加速凝固，凝固時間至少大于8小時；
25.s3、將容器從烘箱內取出，使用移液器盡量除去上層的油相與下層的carrier油相；
26.s4、加入1ml 1xpbs，其ph值為7.2，緩沖液以及2ml的20％pfo，震蕩混勻使其乳化，靜置3min，除去下層pfo，重復3次；
27.s5、加入2ml 1％span80-hexane,充分混勻，靜置5min，棄上層hexane，重復3次至hydogel beads曾略透明狀態；
28.s6、加入5ml 1x tris-edta-na+k+buffer,充分混勻，靜置3min，棄上清，重復3-5次，至hydogel beads曾透明狀態，完成制備。
29.免疫細胞jurkat的分選富集實驗
30.制備混合細胞樣本：100wc666-1細胞+100whone-1細胞，1w jurkat細胞(4ml)
31.目的：特異性抓取jurkat細胞
32.方法：使用一次性吸管取約500μl用于特異性分選jurkat細胞的hydogel beads溶液，加入待分選的細胞樣本，封閉反應容器，置于搖床：轉速為50-80rpm，反應0.5h；將其轉移至3cm細胞培養皿內繼續在細胞培養箱內培養1h；使用一次性吸管吸取培養皿內液相置于5ml離心管內，靜置3min，使用移液器除去上清；加入2mlpbs或細胞培養液清洗hydrogel beads沉淀，靜置3min，除去上清，重復2次。此時目標細胞jurkat便被hydrogel吸附，為了檢測hydrogel吸附特異性。實驗對膠珠固相進行了基于cd45-af568的抗體染，染結果圖1所示。
33.結果分析：白光20x視野下hydrogelbeads表面吸附的細胞均被cd45-af568抗體標記，證明該方法制備的hydrogel beads細胞分選試劑的特異性良好。
34.最后應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換,凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
技術特征：
1.用于細胞捕獲的丙烯酰胺水凝膠微球，其特征在于，具體包括如下組分：40％丙烯酰胺溶液2.58ml、40％甲叉雙丙烯酰胺溶液3.6ml、無酶水3.82ml；tris-鹽酸緩沖液10ml、nacl 137ml、kcl 0.9ml、edta緩沖液20ml、無酶水832.1ml；10％過硫酸銨1ml、氫凝膠珠用丙烯酰胺混合物4ml、1％span80-hexane20ml、20％fto 4.8ml、微液滴生成油-temed 4ml；所述氫凝膠珠用丙烯酰胺混合物由4x acrylamide/bis-acrylamide solution1000μl、1x tris-edta-na+k+buffer、無酶水2480μl配置而成。2.根據權利要求1所述的用于細胞捕獲的丙烯酰胺水凝膠微球，其特征在于：所述10％過硫酸銨由1g的過硫酸銨、10ml的無酶水配置而成。3.根據權利要求1所述的用于細胞捕獲的丙烯酰胺水凝膠微球，其特征在于：所述微液滴生成油-temed由in hef7500 surf-600p 2％4ml、temed 40μl配置而成。4.一種如權利要求1-3任一項所述的用于細胞捕獲的丙烯酰胺水凝膠微球的制備方法，其特征在于：具體包括以下步驟：s1、生成水凝膠微膠珠：調節注射泵流速，膠項流速：25μl/min；油相流速：60μl/min，注射泵啟動后2分鐘內生成的膠珠液滴棄掉，從第三分鐘開始將生成的油包水微液滴收集在裝有carrier oil的收集容器內，直至膠項流動結束；s2、水凝膠膠珠凝固：將收集容器封閉后，置于70℃烘箱內進行加速凝固，凝固時間至少大于8小時；s3、將容器從烘箱內取出，使用移液器盡量除去上層的油相與下層的carrier油相；s4、加入1ml 1xpbs，其ph值為7.2，緩沖液以及2ml的20％pfo，震蕩混勻使其乳化，靜置3min，除去下層pfo，重復3次；s5、加入2ml 1％span80-hexane,充分混勻，靜置5min，棄上層hexane，重復3次至hydogel beads曾略透明狀態；s6、加入5ml 1x tris-edta-na+k+buffer，充分混勻，靜置3min，棄上清，重復3-5次，至hydogel beads曾透明狀態，完成制備。
技術總結
本發明公開了用于細胞捕獲的丙烯酰胺水凝膠微球，具體包括如下組分：40％丙烯酰胺溶液2.58mL、40％甲叉雙丙烯酰胺溶液3.6mL、無酶水3.82mL；Tris-鹽酸緩沖液10mL、aCl 137mL、KCl 0.9mL、EDTA緩沖液20mL、無酶水832.1mL；10％過硫酸銨1mL、氫凝膠珠用丙烯酰胺混合物4mL、1％Span80-hexane20mL、20％FTO 4.8mL、微液滴生成油-TEMED 4mL；所述氫凝膠珠用丙烯酰胺混合物由4X Acrylamide/Bis-acrylamide solution1000μL、1X Tris-EDTA-a+K+buffer、無酶水2480μL配置而成。無酶水2480μL配置而成。無酶水2480μL配置而成。
