一種采用激光促進氣道基底細胞增殖的系統和方法與流程
1.本發明涉及細胞培養技術領域，具體涉及一種采用激光促進氣道基底細胞增殖的系統和方法。
背景技術：
2.隨著組織干細胞功能缺陷與慢性肺病(慢性阻塞性肺病、閉塞性細支氣管炎、間質性肺病、肺纖維化等)的發生與進展關系的逐步明確，干細胞療法在慢性肺病以及急性肺損傷的臨床中獲得越來越多的關注。
3.氣道基底干細胞(bcs)因位于氣道上皮基底層而得名，在人類傳導氣道的上皮和終末細支氣管上皮中廣泛存在。目前bcs的氣道原位移植技術已獲臨床成功應用，在各類慢性肺病的中已經實現了干細胞對肺部病變組織的修復替代，取得了良好的效果。其臨床應用主要源于自身突出的自我更新和分化能力：能夠在氣道或肺泡上皮組織受損時，激活自我更新和向其他氣道上皮細胞分化功能，補充損失的細胞來維持氣道和肺泡上皮的完整性，保持肺臟的正常功能。
4.bcs氣道移植技術在各類慢性肺病的臨床中具有優良的應用前景，但目前bcs氣道移植技術尚存一定缺陷：需要經過bcs在體取材、分離提取與培養、體外擴增、細胞特性與安全檢測、在體回輸等一系列過程，過程繁瑣、歷時較長，特別是bcs的體外培養條件要求苛刻，且需要長期的體外培養，可能導致bcs功能異常，導致效果的不確定性。因此，一種全新的、安全的、具有直接在體調控細胞功能潛力的bcs增殖調控技術手段，對實現bcs增殖的可控性誘導，解決臨床上bcs數量不足等問題具有重要意義。
5.目前激光技術與生物醫學的交叉應用，為神經科學、癌癥、細胞信號與功能調控等領域提供了全新的精確可控、安全高效的研究技術手段，在諸如神經細胞離子通道與細胞信號的調控、誘導癌細胞凋亡、干細胞組織修復等科學問題上取得了重要進展，顯示了激光技術對生物醫學研究的積極推動作用。其中激光技術憑借高精度、高安全性以及可直接在體調控等優勢，在干細胞的基礎研究領域獲得了廣泛應用，顯示了在干細胞臨床中的廣闊應用前景，但在誘導與調控bcs增殖方面未有相關報道。
技術實現要素：
6.為了克服現有技術中的缺陷，本發明通過利用激光刺激提供了一種非接觸、高時空精度、高激活效率和精密可控的bcs功能調控技術，在不需要向細胞內轉染任何外源性的光敏蛋白或使用其它生化材料的情況下促進bcs的增殖能力，同時還具有鼠氣道組織原位bcs增殖的誘導與調控作用，具有極高的臨床應用價值。
7.為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
8.本發明的第一方面是提供一種采用激光促進氣道基底細胞增殖的系統，其是基于共聚焦顯微鏡搭建的，在共聚焦顯微鏡系統中的掃描光路中耦合入一飛秒激光(famtosecond laser)光路，并在飛秒激光光路中設置機械快門(shutter)用以控制飛秒激
光的開關；該系統通過明場觀察或使用熒光探針標記相應的細胞分子標志物，在對氣道基底細胞進行實時監測的同時完成飛秒激光在時間與空間上對氣道基底細胞的精確刺激，實現對氣道基底細胞生理活動的活化從而促進其增殖。
9.進一步地，上述共聚焦顯微鏡為奧林巴斯fv1200激光掃描共聚焦顯微鏡，其包括熒光倒置顯微鏡ix83、半導體激光器、成像檢測系統、控制軟件等。
10.進一步地，上述系統采用的飛秒激光器為光纖飛秒激光器、鈦寶石飛秒激光器或飛秒激光泵浦的光學參量振蕩器。
11.進一步地，上述系統基于奧林巴斯fv1200/ix83激光掃描共聚焦顯微鏡搭建，光纖飛秒激光器的光路經一個可旋轉的半波片(1/2λ)、偏振分光棱鏡(pbs)與一個機械快門后，經由數個鍍膜反射鏡耦合進入奧林巴斯fv1200/ix83激光掃描共聚焦顯微鏡的掃描光路。
12.進一步地，上述光纖飛秒激光器主要參數為：波長1030nm，脈沖寬度220fs，重復頻率1mhz，最大輸出功率10w，刺激細胞的平均功率使用約15mw。
13.進一步地，上述系統在共聚焦成像掃描過程中設置掃描振鏡的工作方式，包括固定振鏡的偏轉角度以及設置特定的掃描區域，同步配合機械快門開關，實現掃描刺激模式或點刺激模式；在掃描刺激模式下，機械快門在掃描至定義的刺激區域時開啟，在點刺激模式下，機械快門在掃描振鏡固定的時刻開啟。
14.進一步地，上述系統適用激發光光譜范圍為《700nm的熒光染料或熒光蛋白作為檢測細胞信號的標記物。
15.本發明的第二方面是提供一種采用上述系統的促進氣道基底細胞增殖的方法，包括如下步驟：
16.步驟一，對離體氣道基底細胞進行熒光染：采用鈣離子染料fluo-4用以標記氣道基底細胞內鈣離子信號，采用anti-igta6抗體用以標記氣道基底細胞膜表面的蛋白分子igta6，采用anti-ki67一抗與相應的二抗用以標記氣道基底細胞內的增殖標志物ki67分子；
17.步驟二，將離體氣道基底細胞或氣管組織培養于共聚焦顯微鏡專用的玻底培養皿中，然后置于上述系統中，通過明場觀察或熒光成像確定細胞位置以及刺激位置；
18.步驟三，選擇合適的飛秒激光刺激模式對氣道基底細胞進行光刺激，對鈣離子進行實時監測，光刺激后將氣道基底細胞或氣道組織重新培養一定的時間；
19.步驟四，通過共聚焦成像中熒光變化觀察細胞內相應的生理活動以及增殖能力的改變。
20.本發明采用以上技術方案，與現有技術相比，具有如下技術效果：
21.本發明提供的系統可在共聚掃描成像的同時隨時對單細胞或多細胞施加非接觸的飛秒激光局部刺激并及時記錄之后的細胞活動變化，可促進離體培養bcs增殖能力提升，也可進一步對氣管組織中的bcs進行原位刺激，從而促進其在組織中增殖能力的提升。此外，除可以用于激活bcs細胞活性以促進bcs增殖外，該系統還可廣泛應用在受光刺激引發或調控的細胞分子信號產生與傳遞、基因表達、精確細胞手術以及細胞器功能變化等研究領域。
附圖說明
22.圖1是本發明一實施例中促進氣道基底細胞增殖的激光掃描共聚焦顯微成像系統的結構光路圖；
23.圖2是本發明一實施例中掃描刺激模式的示意圖；
24.圖3是本發明一實施例中點刺激模式的示意圖；
25.圖4顯示了本發明一實施例中飛秒激光掃描刺激模式下激活bcs內鈣離子信號；
26.圖5顯示了本發明一實施例中飛秒激光點刺激模式下激活bcs內鈣離子信號；
27.圖6顯示了本發明一實施例中飛秒激光刺激后bcs增殖能力標志物ki67表達比率上升；
28.圖7顯示了本發明一實施例中飛秒激光刺激后bcs的克隆團顯著增大；
29.圖8顯示了本發明一實施例中飛秒激光對氣管組織中的bcs進行原位刺激后ki67表達比率上升。
具體實施方式
30.本發明提供了一種采用激光促進氣道基底細胞增殖的激光掃描共聚焦顯微成像系統和方法。下面通過具體實施例和附圖對本發明進行詳細和具體的介紹，以使更好的理解本發明，但是下述實施例并不限制本發明范圍。
31.實施例中方法如無特殊說明的采用常規方法，使用的試劑如無特殊說明的使用常規市售試劑或按常規方法配制的試劑。
32.實施例1
33.本實施例提供了一種促進氣道基底細胞增殖的激光掃描共聚焦顯微成像系統，用于對bcs的精確定位以及細胞生理活動的實時監測。如圖1所示，該系統基于奧林巴斯fv1200/ix83激光掃描共聚焦顯微鏡搭建，光纖飛秒激光器的光路經一個可旋轉的半波片(1/2λ)，偏振分光棱鏡與一個機械快門后，經由數個鍍膜反射鏡耦合進入顯微鏡的掃描光路；該系統使用奧林巴斯fv1200系統操控軟件進行刺激模式(掃描刺激模式和點刺激模式)與刺激參數(刺激區域或位置以及刺激時間)的設定，以及成像分析，通過對bcs內相應分子標志物進行化學染料染或免疫熒光染后，通過共聚焦成像中熒光變化反應細胞內相應的生理活動以及增殖能力的改變。
34.上述光纖飛秒激光器的主要參數為波長1030nm，脈沖寬度220fs，重復頻率1mhz，最大輸出功率10w，刺激細胞的平均功率使用約15mw。該系統使用倍率為60x的浸水物鏡，數值孔徑1.2或倍率為30x的浸油物鏡30x，數值孔徑1.15，并使用fv1200配套的405nm、473nm與543nm半導體激光器作為熒光與明場成像的激發光源。
35.通過機械快門控制飛秒激光對細胞的曝光刺激時間，快門時間分辨率為10ms，快門的開關與掃描振鏡(galvo mirror)同步，在掃描刺激模式下，快門在掃描至定義的刺激區域時開啟，在點刺激模式下，快門在掃描振鏡固定的時刻開啟。在掃描刺激模式下曝光時間為定義刺激區域掃描一幀的時間，點刺激模式下一般選擇0.1～0.2s的曝光時間。
36.如圖2所示，掃描刺激模式下的掃描區域通過共聚焦顯微鏡控制軟件進行設定，共聚焦成像區域像素點數目為512
×
512，刺激區域根據成像范圍內目標細胞分布進行設置，一般為共聚焦成像區域中的任意部分或全部。相應的刺激為掃描一次刺激區域內所有像素
點所需的時間。
37.該模式下，設定掃描每個像素點時間為2μs。刺激區域一般選擇半個成像區域(像素點數512
×
256)或全部區域(512
×
512)，相應的刺激時間為0.55s或1.1s。當掃描進行至刺激區域時，飛秒激光光路的機械快門同步開啟，對刺激區域進行一幀掃描刺激后快門關閉，完成對區域內bcs的光刺激。
38.如圖3所示，點刺激模式下的刺激點通過共聚焦顯微鏡控制軟件進行設定，共聚焦成像區域像素點數目為512
×
512，刺激點根據成像范圍內目標細胞位置進行設置，可設置為成像區域內的任意一點，一般選擇為目標細胞內內質網區域的任意一點。當掃描進行至刺激點時，掃描振鏡固定，飛秒激光光路的機械快門同步開啟，對刺激點進行0.1s～0.2s的曝光后快門關閉，完成對目標bc的光刺激，之后掃描振鏡恢復掃描成像模式。
39.實施例2
40.本實施例提供了一種采用實施例1的系統的促進氣道基底細胞增殖的方法并對該方法進行了驗證，包括如下步驟：
41.1.細胞培養
42.離體的氣道基底干細胞在專用細胞培養系統中培養，培養環境為37℃，5％二氧化碳。
43.氣管組織取材自c57bl/6小鼠，解剖小鼠，提取主氣管，縱向剖開，展平，使用組織膠水將其固定于帶微刻度的細胞爬片上，置于專用細胞培養系統中培養，培養環境為37℃，5％二氧化碳。
44.2.細胞熒光染
45.鈣離子染料fluo-4用以標記bcs內鈣離子信號，用以監測bcs內鈣離子信號變化；anti-igta6抗體用以標記bcs細胞膜表面的蛋白分子igta6，從而對bcs進行熒光成像定位；anti-ki67一抗與相應的二抗用以標記bcs內的增殖標志物ki67分子，從而確定bcs的增值能力。標記規程按照相應的產品手冊進行。
46.3.激光共聚焦顯微成像以及飛秒激光刺激
47.離體bcs以及氣管組織培養于共聚焦顯微鏡專用的玻底培養皿中，實驗前進行fluo-4熒光染料或anti-igta6免疫熒光抗體染，以便對bcs進行精確定位。實驗中顯微鏡物鏡一般選擇為數值孔徑1.2的60x浸水物鏡，或數值孔徑1.15的30x浸油物鏡。
48.對離體bcs或氣道組織進行熒光標記后，將bcs或氣道組織置于上述共聚焦顯微成像與飛秒激光刺激系統中，選擇合適的飛秒激光刺激模式對bcs進行光刺激，對鈣離子進行實時監測，光刺激后將bcs或氣道組織重新置于37℃，5％二氧化碳的培養環境中進行培養一定的時間。
49.4.bcs增殖能力的檢測
50.光刺激后的離體bcs或氣道組織，通過對增殖標志物ki67進行免疫熒光染，免疫熒光染規程按照相應的產品手冊進行。染后使用共聚焦顯微鏡進行熒光成像檢測。
51.5.結果
52.由圖4和圖5可知，兩種飛秒激光刺激模式均可激活離體bcs的鈣離子信號。
53.由圖6可知，光刺激后24小時與48小時后，光激活的bcs中ki67表達陽性的比率要顯著高于未被進行光激活的離體bcs，顯示了飛秒激光刺激可顯著促進離體bcs的增殖能
力。
54.由圖7可知，光刺激后3-5天內離體bcs形成的細胞克隆團直徑相比未被進行光刺激的bcs有顯著增大，說明其克隆團內細胞數量顯著提升，表明光刺激可顯著促進離體bcs的增殖能力。
55.由圖8可知，光刺激后1天與7天后，對氣道組織中bcs進行原位光刺激后ki67表達陽性的比率要顯著高于未被進行光激活的bcs，顯示了飛秒激光刺激也可顯著促進氣道原位bcs的增殖能力。
56.以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只作為范例，本發明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發明進行等同修改和替代也都在本發明的范疇之中。因此，在不脫離本發明精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的范圍內。
技術特征：
1.一種采用激光促進氣道基底細胞增殖的系統，其特征在于，是基于共聚焦顯微鏡搭建的，在共聚焦顯微鏡系統中的掃描光路中耦合入一飛秒激光光路，并在飛秒激光光路中設置機械快門用以控制飛秒激光的開關；所述系統通過明場觀察或使用熒光探針標記相應的細胞分子標志物，在對氣道基底細胞進行實時監測的同時完成飛秒激光在時間與空間上對氣道基底細胞的精確刺激，實現對氣道基底細胞生理活動的活化從而促進其增殖。2.根據權利要求1所述的系統，其特征在于，所述共聚焦顯微鏡為奧林巴斯fv1200激光掃描共聚焦顯微鏡。3.根據權利要求1所述的系統，其特征在于，所述系統采用的飛秒激光器為光纖飛秒激光器、鈦寶石飛秒激光器或飛秒激光泵浦的光學參量振蕩器。4.根據權利要求1所述的系統，其特征在于，所述系統基于奧林巴斯fv1200/ix83激光掃描共聚焦顯微鏡搭建，光纖飛秒激光器的光路經一個可旋轉的半波片、偏振分光棱鏡與一個機械快門后，經由數個鍍膜反射鏡耦合進入奧林巴斯fv1200/ix83激光掃描共聚焦顯微鏡的掃描光路。5.根據權利要求4所述的系統，其特征在于，所述光纖飛秒激光器主要參數為：波長1030am，脈沖寬度220fs，重復頻率1mhz，最大輸出功率10w，刺激細胞的平均功率使用約15mw。6.根據權利要求1所述的系統，其特征在于，所述系統在共聚焦成像掃描過程中設置掃描振鏡的工作方式，包括固定振鏡的偏轉角度以及設置特定的掃描區域，同步配合機械快門開關，實現掃描刺激模式或點刺激模式；在掃描刺激模式下，機械快門在掃描至定義的刺激區域時開啟，在點刺激模式下，機械快門在掃描振鏡固定的時刻開啟。7.根據權利要求1所述的系統，其特征在于，所述系統適用激發光光譜范圍為<700nm的熒光染料或熒光蛋白作為檢測細胞信號的標記物。8.一種采用如權利要求1-7任一項所述系統的促進氣道基底細胞增殖的方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟一，對離體氣道基底細胞進行熒光染：采用鈣離子染料fluo-4用以標記氣道基底細胞內鈣離子信號，采用anti-igta6抗體用以標記氣道基底細胞膜表面的蛋白分子igta6，采用anti-ki67一抗與相應的二抗用以標記氣道基底細胞內的增殖標志物ki67分子；步驟二，將離體氣道基底細胞或氣管組織培養于共聚焦顯微鏡專用的玻底培養皿中，然后置于所述系統中，通過明場觀察或熒光成像確定細胞位置以及刺激位置；步驟三，選擇合適的飛秒激光刺激模式對氣道基底細胞進行光刺激，對鈣離子進行實時監測，光刺激后將氣道基底細胞或氣道組織重新培養一定的時間；步驟四，通過共聚焦成像中熒光變化觀察細胞內相應的生理活動以及增殖能力的改變。
技術總結
本發明提供了一種采用激光促進氣道基底細胞增殖的系統和方法。該系統是基于共聚焦顯微鏡搭建的，在共聚焦顯微鏡系統中的掃描光路中耦合入一飛秒激光光路，并在飛秒激光光路中設置機械快門用以控制飛秒激光的開關；該系統通過明場觀察或使用熒光探針標記相應的細胞分子標志物，在對氣道基底細胞進行實時監測的同時完成飛秒激光在時間與空間上對氣道基底細胞的精確刺激。本發明提供的系統可在共聚掃描成像的同時隨時對單細胞或多細胞施加非接觸的飛秒激光局部刺激并及時記錄之后的細胞活動變化，可促進離體培養BCs增殖能力提升，也可進一步對氣管組織中的BCs進行原位刺激，從而促進其在組織中增殖能力的提升。而促進其在組織中增殖能力的提升。而促進其在組織中增殖能力的提升。
