一種適用于獼猴桃根組織單細胞測序的植物細胞核制備以及懸液優(yōu)化方法與流程
1.本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及植物細胞核的制備方法，具體涉及一種獼猴桃根組織的細胞核制備方法及其在植物單細胞測序中的應(yīng)用和使用方法。
背景技術(shù)：
2.單細胞測序技術(shù)通過測定單個細胞的轉(zhuǎn)錄組，以“單細胞分辨力”來解析生命現(xiàn)象背后的分子機制，是生命科學(xué)研究的尖端技術(shù)手段，得到了廣泛應(yīng)用。然而，由于細胞壁的存在，植物組織進行單細胞測序“困難重重”，必須先將植物細胞解離為原生質(zhì)體才能進行單細胞測序。細胞壁的主要成分是纖維素等多糖類物質(zhì)，這些大分子結(jié)構(gòu)多變，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是最難于降解的物質(zhì)之一。因此，目前多數(shù)植物組織很難制備到滿足單細胞測序要求的原生質(zhì)體，極大的限制了植物單細胞測序研究。另外，制備原生質(zhì)體對植物細胞造成非常大的改變，會誘發(fā)轉(zhuǎn)錄變化，導(dǎo)致測序結(jié)果可靠性嚴重降低，數(shù)據(jù)無法反映真實的生物學(xué)變化。
3.為了規(guī)避組織分離細胞困難以及解離過程造成的數(shù)據(jù)失真等問題，動物組織會采用單細胞核測序來開展實驗，收到了非常好的效果。因此，借鑒動物組織中的方式，通過制備植物細胞核來開展植物單細胞測序是突破當(dāng)前技術(shù)難題的有效手段。但當(dāng)前植物組織制備細胞核的方法，都是應(yīng)用于擬南芥的相關(guān)研究，不適用于獼猴桃根組織研究，獼猴桃根組織制備細胞核后，細胞核數(shù)量、細胞碎片比例等指標(biāo)無法滿足單細胞測序的要求，亟需開發(fā)一種新的適用于獼猴桃根組織植物單細胞測序研究的細胞核制備方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
4.擬南芥雖然有成熟的細胞核制備技術(shù)方案，如《identification of open chromatin regions in plant genomes using atac-seq》與《isolation of plant root nuclei for single cell rna sequencing》中所述實驗步驟，前者主要應(yīng)用于擬南芥的基因組測序研究，后者主要應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組測序研究，兩種方法可以分別制備擬南芥葉和根組織的細胞核懸液。獼猴桃為大型落葉藤本，與擬南芥的組織相似性極低，細胞壁組成成分差異較大，且由于生長環(huán)境不同，組織和細胞的組成也有較大差異。使用擬南芥制備細胞核的方法無法制備滿足單細胞測序的獼猴桃根組織細胞核懸液。
5.針對現(xiàn)有技術(shù)的空白和存在的不足，本發(fā)明在大量的深入研究和實驗的基礎(chǔ)上，提供了一種適用于單細胞測序的獼猴桃根組織細胞核的制備方法，及相應(yīng)的裂解液配方和細胞核懸液優(yōu)化方法(其中，本發(fā)明所述細胞核懸液優(yōu)化方法，主要優(yōu)化的內(nèi)容為，去除獼猴桃根組織/細胞中沉積的草酸鈣晶體、去除提取獼猴桃根組織過程中釋放到懸液中的mrna、去除細胞核懸液中的組織碎片)。
6.本發(fā)明提供的適用于單細胞測序的獼猴桃根組織細胞核的制備方法，包括如下具體步驟：
7.1)配置kr裂解液：首先配置kr裂解液，并將配置好的溶液預(yù)冷。
8.2)破碎樣本：將新鮮取材或者凍存的獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入離心管，加入所預(yù)冷的kr裂解液及鋼珠，依照儀器操作說明置于破碎儀上對組織進行破碎。
9.3)裂解細胞：破碎后將離心管置于冰上孵育裂解。
10.4)篩網(wǎng)過濾：將步驟3)裂解后的組織裂解液轉(zhuǎn)入離心管中，加入預(yù)冷的pbs。冰上靜置1分鐘。吸出組織裂解液，加入濾網(wǎng)中進行過濾。
11.5)篩網(wǎng)過濾：使用濾網(wǎng)對步驟4)中的過濾液再進行一次過濾。
12.6)離心收集沉淀：將步驟5)中的過濾液進行離心。丟棄上清，沉淀使用pbs進行重懸。
13.7)過濾：將步驟6)中的沉淀重懸液全部加入分選柱中進行過濾。
14.8)離心收集沉淀：將步驟7)中的過濾液進行離心，丟棄上清，沉淀使用100μlpbs進行重懸。
15.步驟(1)中，所述kr裂解液包含以下成份(終濃度)：
16.2％～3％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15～25mm檸檬酸鈉、0.2～0.4％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2～0.4u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)；優(yōu)選地，為3％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、25mm檸檬酸鈉、0.4％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.4u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)。
17.步驟(1)中，l-酒石酸常用作飲料和其他食品的酸味劑，在本發(fā)明中作用為中和組織和細胞破碎后釋放的細胞內(nèi)容物，穩(wěn)定裂解液ph，保持細胞核完整；同時l-酒石酸作為裂解液中的還原劑，發(fā)揮保持rnase inhibitor(rna酶抑制劑)的活性的作用。
18.步驟(1)中，皂素主要作用是醫(yī)藥原料，同時也被用于防腐材料、乳化劑成分，在本發(fā)明中，皂素作為裂解液的成分發(fā)揮裂解細胞膜，釋放細胞核的作用。
19.步驟(1)中，配置kr裂解液時需要先加入2％～3％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)，將溶液充分混勻并置于冰上預(yù)冷后再加入0.2～0.4u/ml rnase inhibitor。其目的是2％～3％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)可以保持0.2～0.4u/ml rnase inhibitor的活性。
20.步驟(1)中，所述預(yù)冷溫度為0～5℃；優(yōu)選地，為放置于4℃冰箱預(yù)冷。
21.步驟(2)中，所述離心管為 2.0ml maxyclear snaplock microcentrifuge tube，rnase-/dnase-free and nonpyrogenic(axygen,mct-200-c)(愛思進2.0ml無核酸酶透明離心管)。
22.步驟(2)中，破碎儀常用于核酸抽提工作，在本發(fā)明中的作用是通過鋼珠充分破壞植物組織，輔助kr裂解液完成粗細胞核懸液的制備。
23.步驟(2)中，所述鋼珠的直徑為5mm。
24.步驟(2)中，所述破碎儀為萬柏生物高通量組織破碎儀(onebio-48p)。
25.步驟(2)中，所述破碎的條件為1200～1300rpm，170～180s；優(yōu)選地，為1200rpm，180s。
26.步驟(2)中，所述獼猴桃根可指任意品種獼猴桃的根尖組織，包括分生區(qū)、伸長區(qū)、
成熟區(qū)。
27.步驟(2)中，所述獼猴桃根組織，其鮮重為50～100mg；優(yōu)選地，為100mg。
28.步驟(3)中，所述孵育的目的是在保持細胞核內(nèi)信使rna(mrna)完整性的溫度下，使用kr裂解液去除細胞核外的細胞膜等結(jié)構(gòu)。
29.步驟(3)中，所述孵育的時間為7～8分鐘；優(yōu)選地，為7min。
30.步驟(4)中，所述濾網(wǎng)為falcon 40μm cell strainer(falcon,352340)，孔徑40μm。
31.步驟(4)中，所述pbs為gibco pbs ph7.4(1
×
)(gibco,10010-031)。
32.步驟(4)中，所述離心管為corning centristar 15ml離心管(corning,430790)。
33.步驟(4)中，所述過濾全程在0～5℃操作；優(yōu)選地，為放置冰上操作。
34.步驟(4)中冰上靜置1分鐘的目的是使大的組織塊沉降至離心管底部，靜置時間過短組織塊沉降不完全，造成篩網(wǎng)過濾時篩網(wǎng)堵塞，導(dǎo)致細胞核損失；靜置時間過長則存在mrna降解的風(fēng)險，mrna的降解將直接導(dǎo)致實驗的失敗。組織塊沉降的時間為1min可以確保沉降完全且無mrna降解的風(fēng)險。
35.步驟(5)中，所述濾網(wǎng)為falcon 40μm cell strainer(falcon,352340)，孔徑40μm。
36.步驟(6)中，所述離心的溫度為4-6℃；優(yōu)選地，為4℃。
37.步驟(6)中，所述離心的時間為10-15分鐘；優(yōu)選地，為10分鐘。
38.步驟(6)中，所述離心的離心力為300～500
×
g，優(yōu)選地，為300
×
g。
39.步驟(6)中，所述pbs為提前30min置于4℃冰箱中預(yù)冷后的pbs。
40.步驟(7)中，所述分選柱為miltenyi ms column(miltenyi,130-042-201)。
41.步驟(7)中，所述分選柱通常用于磁場下，通過帶有磁珠的抗體結(jié)合目的細胞膜表面的特異性抗原，從而用于動物特定細胞類型的分選，在本發(fā)明中，在非磁場下，利用草酸鈣晶體的針狀形態(tài)特征和分選柱中納米材料的堆疊的特點，體積小的細胞核可以伴隨液流穿過分選柱，針狀草酸鈣晶體則會被留在分選柱中，無法伴隨液流穿過，達到純化細胞核的目的。
42.步驟(7)中，所述過濾全程在0～5℃操作；優(yōu)選地，為放置冰上操作。
43.步驟(8)中，所述離心的溫度為4-6℃；優(yōu)選地，為4℃。
44.步驟(8)中，所述離心的時間為10-15分鐘；優(yōu)選地，為10分鐘。
45.步驟(8)中，所述離心的離心力為300～500
×
g；優(yōu)選地，為300
×
g。
46.步驟(8)中，所述pbs為冰上預(yù)冷后的pbs。
47.本發(fā)明還提供了由上述方法得到的適用于單細胞測序的獼猴桃根組織細胞核。
48.本發(fā)明還提供了所述獼猴桃根組織細胞核在單細胞測序中的應(yīng)用。
49.在一個具體的實施方式中，本發(fā)明所述方法的具體步驟為：
50.1)配置kr裂解液。
51.依照以下成分配置裂解液：
52.2％～3％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15～25mm檸檬酸鈉、0.2～0.4％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2～0.4u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)。
53.將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷。
54.2)破碎樣本。
55.將新鮮取材或者凍存的獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml，加入打碎用的鋼珠。將離心管置于打碎用夾板并擰緊扳手，調(diào)節(jié)儀器轉(zhuǎn)速為1200～1300rpm，170～180秒。啟動儀器進行組織破碎。
56.3)裂解細胞。
57.待儀器完全停止后，將離心管取出后插于冰中，靜置孵育7分鐘。
58.4)過濾。
59.用移液器將步驟(3)中的組織裂解液轉(zhuǎn)移到一個新的15ml離心管(corning,430790)中。向離心管中加入9ml冰上預(yù)冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上靜置1分鐘。
60.使用移液器將裂解液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。過濾液收集到一新的50ml離心管(corning,430828)中。
61.5)過濾。
62.使用移液器，將步驟(4)中的過濾液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。將過濾液收集到一新的15ml離心管中。
63.6)離心收集沉淀。
64.將步驟(5)中的離心管置于離心機中，4℃下，300
×
g離心10分鐘。
65.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上預(yù)冷的pbs進行重懸。
66.7)過濾。
67.將步驟(6)中的3ml重懸液全部加入ms column(miltenyi,130-042-201)中，將過濾液收集到一新的15ml離心管中，于冰上靜置過濾，待液體完全過濾到15ml離心管中為止。
68.8)離心收集沉淀。
69.將步驟(7)中的離心管置于離心機中，4℃下，300
×
g離心10分鐘。
70.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用100μl冰上預(yù)冷的pbs進行重懸
71.9)鏡檢計數(shù)。
72.取5μl步驟(8)中的重懸液，與dapi染液1:1進行混勻。使用血球計數(shù)板計數(shù)細胞核總量和濃度。
73.10)單細胞測序上機。
74.依照10x genomics試劑盒說明書操作，上機進行單細胞測序。
75.本發(fā)明還提供了一種kr裂解液，所述kr裂解液包含以下成份(終濃度)：2％～3％(v/v)l-酒石酸、15～25mm檸檬酸鈉、0.2～0.4％(m/v)皂素、0.2～0.4u/ml重組型rnase抑制劑。
76.本發(fā)明還提供了一種試劑/試劑盒，其特征在于，其包含如上所述的kr裂解液。
77.本發(fā)明還提供了所述的kr裂解液或所述的試劑/試劑盒在制備適用于單細胞測序的獼猴桃根組織細胞核的方法、獼猴桃根組織細胞核轉(zhuǎn)錄組測序、獼猴桃根組織細胞核atac測序研究中的應(yīng)用。
78.與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明取得的有益效果如下：
79.第一，填補了目前的技術(shù)空白：目前缺少適用于單細胞測序?qū)嶒灥墨J猴桃根組織細胞核的制備方法，嚴重阻礙了單細胞測序技術(shù)在獼猴桃根組織研究中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的技術(shù)方案解決了這一問題，將有力的促進獼猴桃根組織單細胞測序研究的開展和廣泛應(yīng)用。
80.第二，獼猴桃根細胞核懸液質(zhì)量提升。獼猴桃根組織中含有大量雜質(zhì)、多糖等，裂解后的懸液中存在大量碎片、細胞內(nèi)晶體等雜質(zhì)，其質(zhì)量完全無法滿足10x genomics上機要求，嚴重阻礙了獼猴桃根組織的研究進程。而根據(jù)本發(fā)明技術(shù)方案制備得到的細胞核質(zhì)量很高(樣本質(zhì)量從細胞核數(shù)量3
×
105個，碎片率大于70％，提升到2.26
×
106～4.12
×
106個，碎片率3～5％。)，細胞碎片、細胞內(nèi)晶體等雜質(zhì)基本被完全去除，可以順利的開展后續(xù)的單細胞實驗。
81.第三，成本低廉，耗時較短。本發(fā)明提供的技術(shù)方案使用的裂解液組分僅有4種，與現(xiàn)有技術(shù)中6～7種組分相比有著顯著的減少；實驗流程在30分鐘內(nèi)即可完成細胞核的制備。避免了蔗糖沉積等步驟，節(jié)約了試劑、耗材，降低了成本，同時大大縮短了時間，提高了效率，便于大量樣本實驗的開展。
附圖說明
82.圖1是細胞核鏡檢圖。圖示為經(jīng)本發(fā)明技術(shù)方法制備得到的細胞核。圖中可見細胞碎片、草酸鈣晶體等雜質(zhì)被完全去除，僅存在占比很低的小于細胞核的雜質(zhì)。
83.圖2是本發(fā)明實施例1～4單細胞轉(zhuǎn)錄組測序cdna質(zhì)檢結(jié)果(安捷倫4150生物分析儀)。
84.圖3是組織中草酸鈣針狀晶體圖示。
具體實施方式
85.下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。
86.實施例1
87.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
88.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷。
89.2)破碎樣本。
90.將50mg獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml，加入打碎用的鋼珠。將離心管置于打碎用的夾板并擰緊扳手，調(diào)節(jié)儀器轉(zhuǎn)速為1200rpm，170秒。啟動儀器進行組織破碎。
91.3)裂解細胞。
92.待儀器完全停止后，將離心管取出后插于冰中，靜置孵育7分鐘。
93.4)過濾。
94.用移液器將步驟(3)中的組織裂解液轉(zhuǎn)移到一個新的15ml離心管(corning,430790)中。向離心管中加入9ml冰上預(yù)冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上靜置1分鐘。
95.使用移液器將裂解液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。過濾液收集到一新的50ml離心管(corning,430828)中。
96.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
97.5)過濾。
98.使用移液器，將步驟(4)中的過濾液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。將過濾液收集到一新的15ml離心管中。
99.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
100.6)離心收集沉淀。
101.將步驟(5)中的離心管置于離心機中，4℃下，300
×
g離心10分鐘。
102.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上預(yù)冷的pbs進行重懸。
103.7)過濾。
104.將步驟(6)中的3ml重懸液全部加入ms column(miltenyi,130-042-201)中，將過濾液收集到一新的15ml離心管中，于冰上靜置過濾，待液體完全過濾到15ml離心管中為止。
105.8)離心收集沉淀。
106.將步驟(7)中的離心管置于離心機中，4℃下，300
×
g離心10分鐘。
107.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用10ml冰上預(yù)冷的pbs進行重懸
108.9)洗滌沉淀
109.將步驟(8)中的離心管置于離心機中，4℃下，300
×
g離心10分鐘。
110.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用100μl冰上預(yù)冷的pbs進行重懸。
111.10)質(zhì)檢、鏡檢計數(shù)。
112.吸取上清液使用nanodrop微量分光光度計和熒光分光光度計測量懸液中rna的濃度。
113.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算活細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：取5μl步驟(9)中的重懸液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
114.11)單細胞測序上機。
115.依照10x genomics公司說明書：chromiumnext gem single cell 3’reagent kit v3.1，cg000204 rev c，進行單細胞測序操作。
116.結(jié)果及分析：結(jié)果見表1；活細胞比例、細胞結(jié)團比例、碎片比例和細胞濃度均能達到10x genomics公司單細胞測序要求(表1，圖1)、cdna長度正常(圖2)。文庫構(gòu)建結(jié)果顯示凍存樣本提取細胞核懸液進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序效果良好。
117.實施例2
118.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
119.3％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、25mm檸檬酸鈉、0.4％(m/v)
皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.4u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷。
120.2)破碎樣本。
121.將50mg獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml，加入打碎用的鋼珠。將離心管置于打碎用夾板并擰緊扳手，調(diào)節(jié)儀器轉(zhuǎn)速為1300rpm，180秒。啟動儀器進行組織破碎。
122.3)裂解細胞。
123.待儀器完全停止后，將離心管取出后插于冰中，靜置孵育8分鐘。
124.4)過濾。
125.用移液器將步驟(3)中的組織裂解液轉(zhuǎn)移到一個新的15ml離心管(corning,430790)中。向離心管中加入9ml冰上預(yù)冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上靜置1分鐘。
126.使用移液器將裂解液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。過濾液收集到一新的50ml離心管(corning,430828)中。
127.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
128.5)過濾。
129.使用移液器，將步驟(4)中的過濾液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。將過濾液收集到一新的15ml離心管中。
130.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
131.6)離心收集沉淀。
132.將步驟(5)中的離心管置于離心機中，4℃下，500
×
g離心10分鐘。
133.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上預(yù)冷的pbs進行重懸。
134.7)過濾。
135.將步驟(6)中的3ml重懸液全部加入ms column(miltenyi,130-042-201)中，將過濾液收集到一新的15ml離心管中，于冰上靜置過濾，待液體完全過濾到15ml離心管中為止。
136.8)離心收集沉淀。
137.將步驟(7)中的離心管置于離心機中，4℃下，500
×
g離心10分鐘。
138.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用10ml冰上預(yù)冷的pbs進行重懸
139.9)洗滌沉淀
140.將步驟(8)中的離心管置于離心機中，4℃下，500
×
g離心10分鐘。
141.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用100μl冰上預(yù)冷的pbs進行重懸。
142.10)質(zhì)檢、鏡檢計數(shù)。
143.吸取上清液使用nanodrop微量分光光度計和熒光分光光度計測量懸液中rna的濃度。
144.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算活細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：取5μl步驟(9)中的重懸液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
145.11)單細胞測序上機。
146.依照10x genomics公司說明書：chromiumnext gem single cell 3’reagent kit v3.1，cg000204rev c，進行單細胞測序操作。
147.結(jié)果及分析：結(jié)果見表1；懸液中rna含量極低；活細胞比例、細胞結(jié)團比例、碎片比例和細胞濃度均能達到10x genomics公司單細胞測序要求、cdna長度正常，文庫構(gòu)建結(jié)果顯示凍存樣本提取細胞核懸液進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序效果良好(圖2)。
148.實施例3
149.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
150.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷。
151.2)破碎樣本。
152.將50mg獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml，加入打碎用的鋼珠。將離心管置于打碎用夾板并擰緊扳手，調(diào)節(jié)儀器轉(zhuǎn)速為1200rpm，170秒。啟動儀器進行組織破碎。
153.3)裂解細胞。
154.待儀器完全停止后，將離心管取出后插于冰中，靜置孵育7分鐘。
155.4)過濾。
156.用移液器將步驟(3)中的組織裂解液轉(zhuǎn)移到一個新的15ml離心管(corning,430790)中。向離心管中加入9ml冰上預(yù)冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上靜置1分鐘。
157.使用移液器將裂解液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。過濾液收集到一新的50ml離心管(corning,430828)中。
158.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
159.5)過濾。
160.使用移液器，將步驟(4)中的過濾液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。將過濾液收集到一新的15ml離心管中。
161.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
162.6)離心收集沉淀。
163.將步驟(5)中的離心管置于離心機中，4℃下，300
×
g離心10分鐘。
164.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上預(yù)冷的pbs進行重懸。
165.7)過濾。
166.將步驟(6)中的3ml重懸液全部加入ms column(miltenyi,130-042-201)中，將過濾液收集到一新的15ml離心管中，于冰上靜置過濾，待液體完全過濾到15ml離心管中為止。
167.8)離心收集沉淀。
168.將步驟(7)中的離心管置于離心機中，4℃下，300
×
g離心10分鐘。
169.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用10ml冰上預(yù)冷的pbs進行重懸
170.9)洗滌沉淀
171.將步驟(8)中的離心管置于離心機中，4℃下，300
×
g離心10分鐘。
172.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用100μl冰上預(yù)冷的pbs進行重懸。
173.10)質(zhì)檢、鏡檢計數(shù)。
174.吸取上清液使用nanodrop微量分光光度計和熒光分光光度計測量懸液中rna的濃度。
175.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算活細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：取5μl步驟(9)中的重懸液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
176.11)單細胞測序上機。
177.依照10x genomics公司說明書：chromiumnext gem single cell 3’reagent kit v3.1，cg000204rev c，進行單細胞測序操作。
178.結(jié)果及分析：結(jié)果見表1；活細胞比例、細胞結(jié)團比例、碎片比例和細胞濃度均能達到10x genomics公司單細胞測序要求(表1，圖1)、cdna長度正常(圖2)。文庫構(gòu)建結(jié)果顯示凍存樣本提取細胞核懸液進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序效果良好。
179.實施例4
180.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
181.3％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、25mm檸檬酸鈉、0.4％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.4u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷。
182.2)破碎樣本。
183.將100mg獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml，加入打碎用的鋼珠。將離心管置于打碎用夾板并擰緊扳手，調(diào)節(jié)儀器轉(zhuǎn)速為1300rpm，180秒。啟動儀器進行組織破碎。
184.3)裂解細胞。
185.待儀器完全停止后，將離心管取出后插于冰中，靜置孵育8分鐘。
186.4)過濾。
187.用移液器將步驟(3)中的組織裂解液轉(zhuǎn)移到一個新的15ml離心管(corning,430790)中。向離心管中加入9ml冰上預(yù)冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上靜置1分鐘。
188.使用移液器將裂解液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。過濾液收集到一新的50ml離心管(corning,430828)中。
189.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
190.5)過濾。
191.使用移液器，將步驟(4)中的過濾液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。將過濾液收集到一新的15ml離心管中。
192.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
193.6)離心收集沉淀。
194.將步驟(5)中的離心管置于離心機中，4℃下，500
×
g離心10分鐘。
195.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上預(yù)冷的pbs進
行重懸。
196.7)過濾。
197.將步驟(6)中的3ml重懸液全部加入ms column(miltenyi,130-042-201)中，將過濾液收集到一新的15ml離心管中，于冰上靜置過濾，待液體完全過濾到15ml離心管中為止。
198.8)離心收集沉淀。
199.將步驟(7)中的離心管置于離心機中，4℃下，500
×
g離心10分鐘。
200.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用10ml冰上預(yù)冷的pbs進行重懸
201.9)洗滌沉淀
202.將步驟(8)中的離心管置于離心機中，4℃下，500
×
g離心10分鐘。
203.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用100μl冰上預(yù)冷的pbs進行重懸。
204.10)質(zhì)檢、鏡檢計數(shù)。
205.吸取上清液使用nanodrop微量分光光度計和熒光分光光度計測量懸液中rna的濃度。
206.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算活細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：取5μl步驟(9)中的重懸液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
207.11)單細胞測序上機。
208.依照10x genomics公司說明書：chromiumnext gem single cell 3’reagent kit v3.1，cg000204 rev c，進行單細胞測序操作。
209.結(jié)果及分析：結(jié)果見表1；活細胞比例、細胞結(jié)團比例、碎片比例和細胞濃度均能達到10x genomics公司單細胞測序要求(表1，圖1)、cdna長度正常(圖2)。文庫構(gòu)建結(jié)果顯示凍存樣本提取細胞核懸液進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序效果良好。
210.對比實施例1
211.本實施例依照《identification of open chromatin regions in plant genomes using atac-seq》進行擬南芥葉片細胞核制備。
212.1)配置裂解液。
213.依照以下成分配置細胞核純化緩沖液
214.20mm mops ph 7,40mm nacl,90mm kcl,2mm edta,0.5mm egta,0.5mm spermidine,0.2mm spermine,and 1
×
roche complete protease inhibitors.
215.依照以下成分配置細胞核提取液1：
216.0.25m sucrose,10mm tris
–
hcl ph 8,10mm mgcl2,1％triton x-100,and 1
×
roche complete protease inhibitors.
217.依照以下成分配置細胞核提取液2：
218.1.7m sucrose,10mm tris
–
hcl ph 8,2mm mgcl2,and 0.15％triton x-100,1
×
roche complete protease inhibitors.
219.將配置好的溶液置于冰上進行預(yù)冷。
220.2)破碎樣本。
221.將50mg擬南芥葉片組織樣本轉(zhuǎn)入研缽中，倒入一定量液氮進行研磨，至組織全部變?yōu)榉勰橹埂Ｆ陂g注意添加液氮，以保持低溫。
222.3)裂解細胞。
223.將研磨的粉末轉(zhuǎn)入一個新的含有10ml冰上預(yù)冷的細胞核純化緩沖液的研缽中。使用研棒將粉末攪拌重懸。
224.4)過濾。
225.用移液器將步驟(3)中的組織裂解液逐次吸出，于70μm濾網(wǎng)進行過濾，濾液收集到一個新的15ml離心管中。注意離心管應(yīng)插于冰中。
226.5)離心收集沉淀。
227.將步驟(4)中的離心管，于離心機中以1200
×
g、4℃離心10分鐘。
228.小心的取出離心管，將上清吸出棄去。
229.6)離心收集沉淀。
230.使用1ml預(yù)冷的細胞核提取液1將步驟(5)中的細胞核沉淀重懸。
231.將重懸液吸出，加入一個新的1.5ml離心管中。將離心管置于離心機中，以12000
×
g、4℃離心10分鐘。
232.小心的取出離心管，將上清吸出棄去。
233.7)離心收集沉淀。
234.向一個新的1.5ml離心管中加入300μl細胞核提取液2。
235.使用300μl預(yù)冷的細胞核提取液2將步驟(6)中的細胞核沉淀重懸。將重懸液小心的加入到含有細胞核提取液2的離心管中，使溶液分層。
236.將離心管置于離心機中，以16000
×
g、4℃離心10分鐘。
237.小心的取出離心管，將上清吸出棄去。
238.使用1ml預(yù)冷的細胞核純化緩沖液重懸沉淀。
239.8)鏡檢計數(shù)。
240.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：取5μl步驟(8)中的重懸液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
241.9)結(jié)果及分析
242.結(jié)果顯示細胞核數(shù)量為2
×
106個，碎片雜質(zhì)占比28％。滿足單細胞轉(zhuǎn)錄組測序?qū)τ跇颖镜淖畹鸵蟆?br/>243.對比實施例2
244.本實施例依照《identification of open chromatin regions in plant genomes using atac-seq》進行獼猴桃葉片組織細胞核制備。其余操作步驟與對比實施例1相同。
245.結(jié)果見表2。
246.對比實施例3
247.本實施例依照《identification of open chromatin regions in plant genomes using atac-seq》進行獼猴桃根組織細胞核制備。其余操作步驟與對比實施例1相同。
248.結(jié)果見表2。
249.對比實施例4
250.本實施例依照依照《isolation of plant root nuclei for single cell rna sequencing》中植物組織細胞核提取試劑盒(cellytic
tm pn分離/提取試劑盒，sigma，編號為cellytpn1-1kt)進行擬南芥根組織細胞核制備。
251.1)準(zhǔn)備裂解液
252.將500μlnib裂解液倒入新的、無菌且預(yù)冷藏的60mm培養(yǎng)皿中。
253.2)取材
254.將7日齡的擬南芥植物的根部用雙面刀片切下，收集新鮮根部。
255.3)轉(zhuǎn)移材料
256.用鑷子將新鮮根部樣品轉(zhuǎn)移到60mm培養(yǎng)皿中，并將根全部浸入nib裂解液中。
257.4)組織切碎
258.將取到的根部樣本用雙面刀片切碎約5分鐘。
259.5)組織裂解
260.在4℃環(huán)境中輕輕水平搖動孵育15分鐘進行裂解。
261.6)過濾
262.在低溫環(huán)境下，先使用500μlnib將40μm過濾器潤濕，隨后用一次性大口徑吸頭吸取根裂解后的核懸液，緩慢進行過濾，再使用500μlnib對過濾器進行沖洗，收集剩余細胞核。
263.7)篩網(wǎng)過濾
264.再將過濾后的核懸液用同步驟7的方法，使用30μm過濾器進行二次過濾，再使用500μlnib對過濾器進行沖洗，收集剩余細胞核，并去除碎片。
265.8)鏡檢計數(shù)
266.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：取5μl步驟(8)中的重懸液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
267.結(jié)果見表2
268.對比實施例5
269.本實施例依照依照《isolation of plant root nuclei for single cell rna sequencing》中植物組織細胞核提取試劑盒(cellytic
tm pn分離/提取試劑盒，sigma，編號為cellytpn1-1kt)進行獼猴桃葉片組織細胞核制備。其余操作步驟與對比實施例4相同。
270.結(jié)果見表2。
271.對比實施例6
272.本實施例依照依照《isolation of plant root nuclei for single cell rna sequencing》中植物組織細胞核提取試劑盒(cellytic
tm pn分離/提取試劑盒，sigma，編號為cellytpn1-1kt)進行獼猴桃根組織細胞核制備。其余操作步驟與對比實施例4相同。
273.結(jié)果見表2。
274.對比實施例7
275.本實施例使用st1緩沖液進行獼猴桃根組織細胞核制備。
276.1)配置st1緩沖液。依照以下成分配置緩沖液：
277.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)。將配置好的緩沖液置于冰上進行預(yù)冷。
278.2)破碎樣本。
279.將50mg獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入研缽中，倒入一定量液氮進行研磨，至組織全部變?yōu)榉勰橹埂Ｆ陂g注意添加液氮，以保持低溫。
280.3)裂解細胞。
281.將研磨的粉末轉(zhuǎn)入一個新的含有10ml冰上預(yù)冷的緩沖液的15ml離心管中。上下顛倒15次重懸。
282.4)鏡檢計數(shù)。
283.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：取5μl步驟(3)中的細胞核懸液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
284.5)參數(shù)測量。
285.使用ph計(mettler toledo fe28-cn，30595013)測量步驟(3)中緩沖液ph。
286.結(jié)果見表2。
287.對比實施例8
288.本實施例使用st2緩沖液成分為15mm檸檬酸鈉進行獼猴桃根組織細胞核制備，其余操作步驟與對比實施例7相同。
289.結(jié)果見表2。
290.對比實施例9
291.本實施例使用st3緩沖液成分為2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、20mm tris-hcl(ph＝7.5)進行獼猴桃根組織細胞核制備，其余操作步驟與對比實施例7相同。
292.對比實施例10
293.本實施例使用st4緩沖液成分為15mm檸檬酸鈉,20mm mops(3-(n-啉)丙磺酸,sigma-aldrich，1132-61-2)進行獼猴桃根組織細胞核制備，其余操作步驟與對比實施例7相同。
294.結(jié)果見表2。
295.對比實施例11
296.本實施例使用st緩沖液成分為2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉進行獼猴桃根組織細胞核制備，其余操作步驟與對比實施例7相同。
297.結(jié)果見表2。
298.對比實施例12
299.本實施例使用st5緩沖液成分為1.5％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、10mm檸檬酸鈉進行獼猴桃根組織細胞核制備，其余操作與對比實施例7相同。
300.結(jié)果見表2。
301.對比實施例13
302.本實施例使用st6緩沖液成分為4％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、30mm檸檬酸鈉進行獼猴桃根組織細胞核制備，其余操作與對比實施例7相同。
303.結(jié)果見表2。
304.對比實施例14
305.本實施例依照使用kr1裂解液進行獼猴桃根組織細胞核制備。
306.1)配置kr1裂解液。依照以下成分配置裂解液：
307.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)sds(十二烷基硫酸鈉，sigma,151-21-3)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷。
308.2)破碎樣本。
309.將50mg獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml，在裂解液中使用滅菌剪刀將獼猴桃根剪碎。
310.3)裂解細胞。
311.將離心管插于冰中，靜置孵育8分鐘。
312.4)鏡檢計數(shù)。
313.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：取5μl步驟(3)中的裂解液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
314.結(jié)果見表2。
315.對比實施例15
316.本實施例依照使用kr2裂解液組分為2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)脫氧膽酸鈉(sigma,302-95-4)，進行獼猴桃根組織細胞核制備，其余操作步驟與對比實施例14相同。
317.結(jié)果見表2。
318.對比實施例16
319.本實施例依照使用kr3裂解液組分為2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)洋地黃皂苷(sigma,11024-24-1)，進行獼猴桃根組織細胞核制備，其余操作步驟與對比實施例14相同。
320.結(jié)果見表2。
321.對比實施例17
322.本實施例依照使用kr4裂解液組分為2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(v/v)triton x-100(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇，sigma,9036-19-5)，進行獼猴桃根組織細胞核制備，其余操作步驟與對比實施例14相同。
323.結(jié)果見表2。
324.對比實施例18
325.本實施例依照使用kr5裂解液組分為2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)，進行獼猴
桃根組織細胞核制備，其余操作步驟與對比實施例14相同。
326.結(jié)果見表2。
327.對比實施例19
328.本實施例依照使用kr6裂解液組分為2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.1％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)，進行獼猴桃根組織細胞核制備，其余操作步驟與對比實施例14相同。
329.結(jié)果見表2。
330.對比實施例20
331.本實施例依照使用kr7裂解液組分為2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.4％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)，進行獼猴桃根組織細胞核制備，其余操作步驟與對比實施例14相同。
332.結(jié)果見表2。
333.對比實施例21
334.本實施例依照使用雙面刀片切碎獼猴桃根組織，kr5裂解液裂解。
335.1)配置kr5裂解液。依照以下成分配置裂解液：
336.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷
337.2)破碎樣本。
338.將50mg獼猴桃根組織樣本放置于冰上的培養(yǎng)皿中，使用雙面刀片將根切為0.5mm的小段，轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml。
339.3)裂解細胞。
340.將離心管插于冰中，靜置孵育8分鐘。
341.4)鏡檢計數(shù)。
342.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：取5μl步驟(3)中的裂解液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
343.結(jié)果見表3。
344.對比實施例22
345.本實施例依照使用剪刀剪碎獼猴桃根組織，kr5裂解液裂解，操作與對比實施例17相同。
346.結(jié)果將表3。
347.對比實施例23
348.本實施例依照使用玻璃勻漿器勻漿破碎獼猴桃根組織，kr5裂解液裂解。
349.1)配置kr4裂解液。依照以下成分配置裂解液：
350.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷。
351.2)破碎樣本。
352.將50mg獼猴桃根組織樣本，轉(zhuǎn)入1ml玻璃勻漿器(solarbio,ya0850)中，加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml，使用玻璃勻漿器搗20次破碎組織。將勻漿器中的液體轉(zhuǎn)移至
2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。
353.3)裂解細胞。
354.將離心管插于冰中，靜置孵育8分鐘。
355.4)鏡檢計數(shù)。
356.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：取5μl步驟(3)中的裂解液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
357.結(jié)果見表3。
358.對比實施例24
359.本實施例依照使用破碎儀破碎獼猴桃根組織，kr5裂解液裂解。
360.1)配置kr4裂解液。依照以下成分配置裂解液：
361.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷
362.2)破碎樣本。
363.將50mg獼猴桃根組織樣本，轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml。快速組織低溫破碎勻漿儀(上海凈信，jxfstprp-i-02)。加入打碎用的鋼珠。將離心管置于打碎用夾板并擰緊扳手，調(diào)節(jié)儀器轉(zhuǎn)速為1200rpm，180秒。啟動儀器進行組織破碎。
364.3)裂解細胞。
365.將離心管插于冰中，靜置孵育8分鐘。
366.4)鏡檢計數(shù)。
367.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：取5μl步驟(3)中的裂解液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
368.結(jié)果見表3。
369.對比實施例25
370.本實施例依照使用液氮研磨破碎獼猴桃根組織，kr5裂解液裂解。
371.1)配置kr4裂解液。依照以下成分配置裂解液：
372.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷
373.2)破碎樣本。
374.將50mg獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入研缽中，倒入一定量液氮進行研磨，至組織全部變?yōu)榉勰橹埂Ｆ陂g注意添加液氮，以保持低溫，將研磨的粉末移至2ml離心管(axygen,mct-200-c)中，加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml。
375.3)裂解細胞。
376.將離心管插于冰中，靜置孵育8分鐘。
377.4)鏡檢計數(shù)。
378.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：取5μl步驟(3)中的裂解液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中
計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
379.結(jié)果見表3。
380.對比實施例26
381.本實施例依照使用破碎儀破碎獼猴桃根組織，kr8裂解液裂解。
382.1)配置kr8裂解液。依照以下成分配置裂解液：
383.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.1u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷。
384.2)破碎樣本。
385.將50mg獼猴桃根組織樣本，轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml。萬柏生物高通量組織研磨儀(onebio-48p)。加入打碎用的鋼珠。將離心管置于打碎用夾板并擰緊扳手，調(diào)節(jié)儀器轉(zhuǎn)速為1200rpm，180秒。啟動儀器進行組織破碎。
386.3)裂解細胞。
387.將離心管插于冰中，靜置孵育8分鐘。
388.4)鏡檢計數(shù)。
389.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：取5μl步驟(3)中的裂解液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
390.5)rna質(zhì)檢。
391.使用植物總rna提取試劑盒(天根生化科技有限公司，dp432)抽提步驟3中細胞核總rna。使用agilent 2100生物分析儀質(zhì)檢rna。
392.結(jié)果見表4
393.對比實施例27
394.本實施例依照使用破碎儀破碎獼猴桃根組織，kr9裂解液裂解。
395.1)配置kr9裂解液。依照以下成分配置裂解液：
396.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.4u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷。
397.2)破碎樣本。
398.將50mg獼猴桃根組織樣本，轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml。快速組織低溫破碎勻漿儀(上海凈信，jxfstprp-i-02)。加入打碎用的鋼珠。將離心管置于打碎用夾板并擰緊扳手，調(diào)節(jié)儀器轉(zhuǎn)速為1200rpm，180秒。啟動儀器進行組織破碎。
399.3)裂解細胞。
400.將離心管插于冰中，靜置孵育8分鐘。
401.4)鏡檢計數(shù)。
402.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：取5μl步驟(3)中的裂解液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中
計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
403.5)rna質(zhì)檢。
404.使用植物總rna提取試劑盒(天根生化科技有限公司，dp432)抽提步驟3中細胞核總rna。使用agilent 2100生物分析儀質(zhì)檢rna。
405.結(jié)果見表4
406.對比實施例28
407.本實施例依照使用破碎儀破碎獼猴桃根組織，kr10裂解液裂解成分為2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.6u/mlrnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)。其余操作與對比實施例25相同。
408.結(jié)果見表5
409.對比實施例29
410.本實施例依照使用70μm(falcon,352350)篩網(wǎng)過濾兩次細胞核懸液。
411.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
412.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷。
413.2)破碎樣本。
414.將50mg獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml，加入打碎用的鋼珠。將離心管置于打碎用夾板并擰緊扳手，調(diào)節(jié)儀器轉(zhuǎn)速為1200rpm，180秒。啟動儀器進行組織破碎。
415.3)裂解細胞。
416.待儀器完全停止后，將離心管取出后插于冰中，靜置孵育7分鐘。
417.4)過濾。
418.用移液器將步驟(3)中的組織裂解液轉(zhuǎn)移到一個新的15ml離心管(corning,430790)中。向離心管中加入9ml冰上預(yù)冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上靜置1分鐘。
419.使用移液器將裂解液逐次吸出，于70μm濾網(wǎng)(falcon,352350)進行過濾。過濾液收集到一新的50ml離心管(corning,430828)中。
420.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
421.5)過濾。
422.使用移液器，將步驟(4)中的過濾液逐次吸出，于70μm濾網(wǎng)(falcon,352350)進行過濾。將過濾液收集到一新的15ml離心管中。
423.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
424.6)鏡檢計數(shù)。
425.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：取5μl步驟(5)中的濾液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
426.結(jié)果見表5
427.對比實施例30
428.本實施例依照使用30μm(miltenyi biotec,130-110-915)篩網(wǎng)過濾細胞核懸液1次，其余操作與對比實施例29相同。
429.結(jié)果見表5
430.對比實施例31
431.本實施例依照使用30μm(miltenyi biotec,130-110-915)篩網(wǎng)過濾細胞核懸液兩次，其余操作與對比實施例29相同。
432.結(jié)果見表5
433.對比實施例32
434.本實施例依照使用40μm(falcon,352340)篩網(wǎng)過濾細胞核懸液，其余操作與對比實施例29相同。
435.結(jié)果見表5
436.對比實施例33
437.本實施例依照使用40μm(falcon,352340)篩網(wǎng)過濾細胞核懸液兩次，其余操作與對比實施例29相同。
438.結(jié)果見表5
439.對比實施例34
440.本實施例依照使用70μm(falcon,352350)篩網(wǎng)過濾去除草酸鈣晶體。
441.1)配置裂解液。依照以下成分配置kr裂解液：
442.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷。
443.2)破碎樣本。
444.將50mg獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml，加入打碎用的鋼珠。將離心管置于打碎用夾板并擰緊扳手，調(diào)節(jié)儀器轉(zhuǎn)速為1200rpm，180秒。啟動儀器進行組織破碎。
445.3)裂解細胞。
446.待儀器完全停止后，將離心管取出后插于冰中，靜置孵育7分鐘。
447.4)過濾。
448.用移液器將步驟(3)中的組織裂解液轉(zhuǎn)移到一個新的15ml離心管(corning,430790)中。向離心管中加入9ml冰上預(yù)冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上靜置1分鐘。
449.使用移液器將裂解液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。過濾液收集到一新的50ml離心管(corning,430828)中。
450.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
451.5)過濾。
452.使用移液器，將步驟(4)中的過濾液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。將過濾液收集到一新的15ml離心管中。
453.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
454.6)過濾。
455.將步驟(5)中的濾液全部使用70μm(falcon,352350)篩網(wǎng)過濾，將過濾液收集到一
新的15ml離心管中，于冰上靜置過濾，待液體完全過濾到15ml離心管中為止。
456.7)鏡檢計數(shù)。
457.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：取5μl步驟(6)中的濾液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
458.結(jié)果見表6
459.對比實施例35
460.本實施例依照使用40μm(falcon,352340)篩網(wǎng)過濾去除草酸鈣晶體，其余操作與對比實施例32相同。
461.結(jié)果見表6
462.對比實施例36
463.本實施例依照使用30μm(miltenyi biotec,130-110-915)篩網(wǎng)過濾去除草酸鈣晶體，其余操作與對比實施例32相同。
464.結(jié)果見表6
465.對比實施例37
466.本實施例依照使用100
×
g差速離心法去除草酸鈣晶體。
467.1)配置裂解液。依照以下成分配置kr裂解液：
468.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷。
469.2)破碎樣本。
470.將50mg獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml，加入打碎用的鋼珠。將離心管置于打碎用夾板并擰緊扳手，調(diào)節(jié)儀器轉(zhuǎn)速為1200rpm，180秒。啟動儀器進行組織破碎。
471.3)裂解細胞。
472.待儀器完全停止后，將離心管取出后插于冰中，靜置孵育7分鐘。
473.4)過濾。
474.用移液器將步驟(3)中的組織裂解液轉(zhuǎn)移到一個新的15ml離心管(corning,430790)中。向離心管中加入9ml冰上預(yù)冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上靜置1分鐘。
475.使用移液器將裂解液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。過濾液收集到一新的50ml離心管(corning,430828)中。
476.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
477.5)過濾。
478.使用移液器，將步驟(4)中的過濾液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。將過濾液收集到一新的15ml離心管中。
479.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
480.6)差速離心。
481.將步驟(5)中的濾液補充預(yù)冷的pbs至10ml，4℃、100
×
g、10min離心。離心結(jié)束后，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，沉淀使用3ml預(yù)冷的pbs重懸。
482.8)鏡檢計數(shù)。
483.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：分別取5μl步驟(6)中的上清液與重懸液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
484.結(jié)果見表6
485.對比實施例38
486.本實施例依照使用密度梯度離心法去除草酸鈣晶體。
487.1)配置裂解液。依照以下成分配置kr裂解液：
488.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷。
489.2)破碎樣本。
490.將50mg獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml，加入打碎用的鋼珠。將離心管置于打碎用夾板并擰緊扳手，調(diào)節(jié)儀器轉(zhuǎn)速為1200rpm，180秒。啟動儀器進行組織破碎。
491.3)裂解細胞。
492.待儀器完全停止后，將離心管取出后插于冰中，靜置孵育7分鐘。
493.4)過濾。
494.用移液器將步驟(3)中的組織裂解液轉(zhuǎn)移到一個新的15ml離心管(corning,430790)中。向離心管中加入9ml冰上預(yù)冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上靜置1分鐘。
495.使用移液器將裂解液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。過濾液收集到一新的50ml離心管(corning,430828)中。
496.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
497.5)過濾。
498.使用移液器，將步驟(4)中的過濾液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。將過濾液收集到一新的15ml離心管中。
499.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
500.6)密度梯度離心。
501.分別配置50％(m/v)蔗糖溶液、40％(m/v)蔗糖溶液、20％(m/v)蔗糖溶液、15％(m/v)蔗糖溶液。
502.將步驟(5)所得濾液，4℃、500
×
g、10min離心，離心結(jié)束后棄去上清液，使用6ml 15％(m/v)蔗糖溶液重懸細胞核沉淀。
503.在polyallomer離心管(beckman,355631)內(nèi)從下到上依次加入50％(m/v)蔗糖溶液、40％(m/v)蔗糖溶液、20％(m/v)蔗糖溶液，之后將6ml細胞核溶液緩緩加在最上層，形成密度梯度。
504.18000rpm離心90min，分別取50％(m/v)蔗糖溶液層、40％(m/v)蔗糖溶液層和20％(m/v)蔗糖溶液層于三個新的離心管中。
505.7)鏡檢計數(shù)。
506.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：分別取5μl步
驟(6)中的50％(m/v)蔗糖溶液層、40％(m/v)蔗糖溶液層和20％(m/v)蔗糖溶液層，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
507.結(jié)果見表6
508.對比實施例39
509.本實施例依照使用流式細胞術(shù)去除草酸鈣晶體。
510.1)配置裂解液。依照以下成分配置kr裂解液：
511.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷。
512.2)破碎樣本。
513.將50mg獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml，加入打碎用的鋼珠。將離心管置于打碎用夾板并擰緊扳手，調(diào)節(jié)儀器轉(zhuǎn)速為1200rpm，180秒。啟動儀器進行組織破碎。
514.3)裂解細胞。
515.待儀器完全停止后，將離心管取出后插于冰中，靜置孵育7分鐘。
516.4)過濾。
517.用移液器將步驟(3)中的組織裂解液轉(zhuǎn)移到一個新的15ml離心管(corning,430790)中。向離心管中加入9ml冰上預(yù)冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上靜置1分鐘。
518.使用移液器將裂解液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。過濾液收集到一新的50ml離心管(corning,430828)中。
519.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
520.5)過濾。
521.使用移液器，將步驟(4)中的過濾液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。將過濾液收集到一新的15ml離心管中。
522.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
523.6)流式細胞儀分選。
524.在步驟(5)所得濾液中加入dapi染液，dapi的終濃度為5μg/ml。設(shè)置分選條件為紫外激發(fā)光下，藍熒光信號(+)收集。
525.7)鏡檢計數(shù)。
526.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：分別取5μl步驟(6)中收集液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
527.結(jié)果見表6
528.對比實施例40
529.本實施例依照使用ms分選柱去除草酸鈣晶體。
530.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
531.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠
源)，accurate biology,ag11613)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷。
532.2)破碎樣本。
533.將50mg獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml，加入打碎用的鋼珠。將離心管置于打碎用夾板并擰緊扳手，調(diào)節(jié)儀器轉(zhuǎn)速為1200rpm，180秒。啟動儀器進行組織破碎。
534.3)裂解細胞。
535.待儀器完全停止后，將離心管取出后插于冰中，靜置孵育7分鐘。
536.4)過濾。
537.用移液器將步驟(3)中的組織裂解液轉(zhuǎn)移到一個新的15ml離心管(corning,430790)中。向離心管中加入9ml冰上預(yù)冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上靜置1分鐘。
538.使用移液器將裂解液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。過濾液收集到一新的50ml離心管(corning,430828)中。
539.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
540.5)過濾。
541.使用移液器，將步驟(4)中的過濾液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。將過濾液收集到一新的15ml離心管中。
542.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
543.6)離心收集沉淀。
544.將步驟(5)中的離心管置于離心機中，4℃下，300
×
g離心10分鐘。
545.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上預(yù)冷的pbs進行重懸。
546.7)過濾。
547.將步驟(6)中的3ml重懸液全部加入ms column(miltenyi,130-042-201)中，將過濾液收集到一新的15ml離心管中，于冰上靜置過濾，待液體完全過濾到15ml離心管中為止。
548.8)鏡檢計數(shù)。
549.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：分別取5μl步驟(6)中收集液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
550.結(jié)果見表6
551.對比實施例41
552.本實施例依照使用ls分選柱去除草酸鈣晶體。
553.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
554.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷。
555.2)破碎樣本。
556.將50mg獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml，加入打碎用的鋼珠。將離心管置于打碎用夾板并擰緊扳手，調(diào)節(jié)儀器轉(zhuǎn)速為1200rpm，180秒。啟動儀器進行組織破碎。
557.3)裂解細胞。
558.待儀器完全停止后，將離心管取出后插于冰中，靜置孵育7分鐘。
559.4)過濾。
560.用移液器將步驟(3)中的組織裂解液轉(zhuǎn)移到一個新的15ml離心管(corning,430790)中。向離心管中加入9ml冰上預(yù)冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上靜置1分鐘。
561.使用移液器將裂解液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。過濾液收集到一新的50ml離心管(corning,430828)中。
562.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
563.5)過濾。
564.使用移液器，將步驟(4)中的過濾液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。將過濾液收集到一新的15ml離心管中。
565.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
566.6)離心收集沉淀。
567.將步驟(5)中的離心管置于離心機中，4℃下，300
×
g離心10分鐘。
568.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上預(yù)冷的pbs進行重懸。
569.7)過濾。
570.將步驟(6)中的3ml重懸液全部加入ls column(miltenyi,130-042-401)中，將過濾液收集到一新的15ml離心管中，于冰上靜置過濾，待液體完全過濾到15ml離心管中為止。
571.9)鏡檢計數(shù)。
572.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：分別取5μl步驟(6)中收集液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
573.結(jié)果見表6
574.對比實施例42
575.本實施例洗滌條件為100
×
g、4℃、10min洗滌一次。
576.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
577.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷。
578.2)破碎樣本。
579.將50mg獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml，加入打碎用的鋼珠。將離心管置于打碎用夾板并擰緊扳手，調(diào)節(jié)儀器轉(zhuǎn)速為1200rpm，180秒。啟動儀器進行組織破碎。
580.3)裂解細胞。
581.待儀器完全停止后，將離心管取出后插于冰中，靜置孵育7分鐘。
582.4)過濾。
583.用移液器將步驟(3)中的組織裂解液轉(zhuǎn)移到一個新的15ml離心管(corning,430790)中。向離心管中加入9ml冰上預(yù)冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上靜置1分鐘。
584.使用移液器將裂解液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。過濾液收集到一新的50ml離心管(corning,430828)中。
585.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
586.5)過濾。
587.使用移液器，將步驟(4)中的過濾液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。將過濾液收集到一新的15ml離心管中。
588.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
589.6)離心收集沉淀。
590.將步驟(5)中的離心管置于離心機中，4℃下，300
×
g離心10分鐘。
591.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上預(yù)冷的pbs進行重懸。
592.7)過濾。
593.將步驟(6)中的3ml重懸液全部加入ms column(miltenyi,130-042-201)中，將過濾液收集到一新的15ml離心管中，于冰上靜置過濾，待液體完全過濾到15ml離心管中為止。
594.8)離心收集沉淀。
595.將步驟(7)中的離心管置于離心機中，4℃下，100
×
g離心10分鐘。
596.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用100μl冰上預(yù)冷的pbs進行重懸。
597.9)質(zhì)檢、鏡檢計數(shù)。
598.吸取上清液使用nanodrop微量分光光度計和熒光分光光度計測量上清液中rna的濃度。
599.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算活細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：取5μl步驟(8)中的重懸液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
600.結(jié)果見表7
601.對比實施例43
602.本實施例洗滌條件為1000
×
g、4℃、10min洗滌一次。
603.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
604.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷。
605.2)破碎樣本。
606.將50mg獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml，加入打碎用的鋼珠。將離心管置于打碎用夾板并擰緊扳手，調(diào)節(jié)儀器轉(zhuǎn)速為1200rpm，180秒。啟動儀器進行組織破碎。
607.3)裂解細胞。
608.待儀器完全停止后，將離心管取出后插于冰中，靜置孵育7分鐘。
609.4)過濾。
610.用移液器將步驟(3)中的組織裂解液轉(zhuǎn)移到一個新的15ml離心管(corning,
430790)中。向離心管中加入9ml冰上預(yù)冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上靜置1分鐘。
611.使用移液器將裂解液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。過濾液收集到一新的50ml離心管(corning,430828)中。
612.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
613.5)過濾。
614.使用移液器，將步驟(4)中的過濾液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。將過濾液收集到一新的15ml離心管中。
615.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
616.6)離心收集沉淀。
617.將步驟(5)中的離心管置于離心機中，4℃下，300
×
g離心10分鐘。
618.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上預(yù)冷的pbs進行重懸。
619.7)過濾。
620.將步驟(6)中的3ml重懸液全部加入ms column(miltenyi,130-042-201)中，將過濾液收集到一新的15ml離心管中，于冰上靜置過濾，待液體完全過濾到15ml離心管中為止。
621.8)離心收集沉淀。
622.將步驟(7)中的離心管置于離心機中，4℃下，1000
×
g離心10分鐘。
623.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用100μl冰上預(yù)冷的pbs進行重懸。
624.9)質(zhì)檢、鏡檢計數(shù)。
625.吸取上清液使用nanodrop微量分光光度計和熒光分光光度計測量上清液中rna的濃度。
626.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算活細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：取5μl步驟(8)中的重懸液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
627.結(jié)果見表7。
628.對比實施例44
629.本實施例洗滌條件為300
×
g、4℃、10min洗滌一次。
630.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
631.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷。
632.2)破碎樣本。
633.將50mg獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml，加入打碎用的鋼珠。將離心管置于打碎用夾板并擰緊扳手，調(diào)節(jié)儀器轉(zhuǎn)速為1200rpm，180秒。啟動儀器進行組織破碎。
634.3)裂解細胞。
635.待儀器完全停止后，將離心管取出后插于冰中，靜置孵育7分鐘。
636.4)過濾。
637.用移液器將步驟(3)中的組織裂解液轉(zhuǎn)移到一個新的15ml離心管(corning,430790)中。向離心管中加入9ml冰上預(yù)冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上靜置1分鐘。
638.使用移液器將裂解液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。過濾液收集到一新的50ml離心管(corning,430828)中。
639.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
640.5)過濾。
641.使用移液器，將步驟(4)中的過濾液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。將過濾液收集到一新的15ml離心管中。
642.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
643.6)離心收集沉淀。
644.將步驟(5)中的離心管置于離心機中，4℃下，300
×
g離心10分鐘。
645.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上預(yù)冷的pbs進行重懸。
646.7)過濾。
647.將步驟(6)中的3ml重懸液全部加入ms column(miltenyi,130-042-201)中，將過濾液收集到一新的15ml離心管中，于冰上靜置過濾，待液體完全過濾到15ml離心管中為止。
648.8)離心收集沉淀。
649.將步驟(7)中的離心管置于離心機中，4℃下，300
×
g離心10分鐘。
650.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用100μl冰上預(yù)冷的pbs進行重懸。
651.9)質(zhì)檢、鏡檢計數(shù)。
652.吸取上清液使用nanodrop微量分光光度計和熒光分光光度計測量上清液中rna的濃度。
653.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算活細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：取5μl步驟(8)中的重懸液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
654.結(jié)果見表7
655.對比實施例45
656.本實施例洗滌條件為300
×
g、4℃、10min洗滌三次。
657.1)配置裂解液。依照以下成分配置裂解液：
658.2％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15mm檸檬酸鈉、0.2％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)。將配置好的裂解液置于冰上進行預(yù)冷。
659.2)破碎樣本。
660.將50mg獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入2ml離心管(axygen,mct-200-c)中。加入步驟(1)中冰上預(yù)冷的裂解液1ml，加入打碎用的鋼珠。將離心管置于打碎用夾板并擰緊扳手，調(diào)節(jié)儀器轉(zhuǎn)速為1200rpm，180秒。啟動儀器進行組織破碎。
661.3)裂解細胞。
662.待儀器完全停止后，將離心管取出后插于冰中，靜置孵育7分鐘。
663.4)過濾。
664.用移液器將步驟(3)中的組織裂解液轉(zhuǎn)移到一個新的15ml離心管(corning,430790)中。向離心管中加入9ml冰上預(yù)冷的pbs(gibco,10010-031)。于冰上靜置1分鐘。
665.使用移液器將裂解液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。過濾液收集到一新的50ml離心管(corning,430828)中。
666.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
667.5)過濾。
668.使用移液器，將步驟(4)中的過濾液逐次吸出，于40μm濾網(wǎng)(falcon,352340)進行過濾。將過濾液收集到一新的15ml離心管中。
669.注意操作均應(yīng)在冰上進行。
670.6)離心收集沉淀。
671.將步驟(5)中的離心管置于離心機中，4℃下，300
×
g離心10分鐘。
672.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用3ml冰上預(yù)冷的pbs進行重懸。
673.7)過濾。
674.將步驟(6)中的3ml重懸液全部加入ms column(miltenyi,130-042-201)中，將過濾液收集到一新的15ml離心管中，于冰上靜置過濾，待液體完全過濾到15ml離心管中為止。
675.8)離心收集沉淀。
676.將步驟(7)中的離心管置于離心機中，4℃下，300
×
g離心10分鐘。
677.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用10ml冰上預(yù)冷的pbs進行重懸。
678.9)離心收集沉淀。
679.將步驟(8)中的離心管置于離心機中，4℃下，300
×
g離心10分鐘。
680.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用10ml冰上預(yù)冷的pbs進行重懸。
681.10)離心收集沉淀。
682.將步驟(9)中的離心管置于離心機中，4℃下，300
×
g離心10分鐘。
683.離心完成后，小心取出離心管，將上清小心的倒出，沉淀使用100μl冰上預(yù)冷的pbs進行重懸。
684.11)質(zhì)檢、鏡檢計數(shù)。
685.吸取上清液使用nanodrop微量分光光度計和熒光分光光度計測量上清液中rna的濃度。
686.通過dapi染液，顯微鏡下鏡檢計算活細胞核濃度、結(jié)團比例、雜質(zhì)比例：取5μl步驟(10)中的重懸液，與dapi染液1:1進行混勻，用移液器吸取10ul加到血球計數(shù)板的加樣孔中計數(shù)，顯微鏡觀察計數(shù)區(qū)的細胞核個數(shù)。熒光顯示為細胞核。
687.結(jié)果見表7
688.對比實施例46
689.本實施例實驗樣本為50mg擬南芥葉片，具體操作與實施例1相同。
690.結(jié)果見表8
691.對比實施例47
692.本實施例實驗樣本為50mg擬南芥根，具體操作與實施例1相同。
693.結(jié)果見表8
694.對比實施例48
695.本實施例實驗樣本為50mg玉米胚，具體操作與實施例1相同。
696.結(jié)果見表8
697.表1實施例1～4結(jié)果
[0698][0699]
本發(fā)明描述了一種適用于獼猴桃根組織單細胞核測序的方法，包括獼猴桃根組織細胞核提取的方法以及細胞核懸液優(yōu)化方法。本發(fā)明所提供的技術(shù)方法可以將單細胞測序技術(shù)引入獼猴桃分子機制及育種的相關(guān)研究中，可以有效且高效的促進研究的進程。
[0700]
本發(fā)明設(shè)計的一種適用于獼猴桃根組織的單細胞核制備方法主要包括一種裂解液，其成分為2％～3％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15～25mm檸檬酸鈉、0.2～0.4％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2～0.4u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)。通過破碎樣本、裂解細胞從組織中提取細胞核，再經(jīng)篩網(wǎng)過濾、離心洗滌等懸液優(yōu)化處理后得到數(shù)量大于1
×
106個、碎片率小于10％、結(jié)團率小于4％的細胞核懸液，滿足10
×
單細胞測序?qū)τ诩毎藨乙旱馁|(zhì)量要求。達到了使用高通量單細胞測序技術(shù)進行獼猴桃根組織研究的目的。
[0701]
為了得到本發(fā)明中的一種適用于獼猴桃根組織單細胞核測序的方法，進行了從裂解液配方、實驗操作步驟、優(yōu)化方法等方面的一系列探索，通過查閱資料與驗證最終得到了本發(fā)明中的內(nèi)容。首先通過對比實施例1～3，使用《identification ofopen chromatin regions in plant genomes usingatac-seq》中的方法分別進行了擬南芥葉片、獼猴桃葉片、獼猴桃根組織細胞核懸液制備，結(jié)果顯示該文獻中的方法僅可以完成擬南芥葉片組織細胞核懸液的制備，無法完成獼猴桃葉片與獼猴桃根組織的細胞核懸液制備；且制備得擬南芥葉片細胞核懸液中雜質(zhì)占比稍高，雖滿足單細胞測序?qū)颖镜淖畹鸵螅M行單細胞測序存在風(fēng)險。在對比實施例4～6中，使用《isolation of plant root nuclei for single cell rna sequencing》的方法使用現(xiàn)有商業(yè)化試劑盒提取細胞核實驗進行了擬南芥根組織、獼猴桃葉片組織、獼猴桃根組織的細胞核懸液制備實驗，結(jié)果顯示，文獻中所屬方法僅可以完成擬南芥根組織細胞核懸液制備，無法完成獼猴桃葉片組織細胞核懸液制備，結(jié)果顯示現(xiàn)有的商業(yè)化試劑盒提取得到的獼猴桃根細胞核數(shù)量極少，無法成功制備滿
足單細胞測序的獼猴桃根組織細胞核懸液。上述的兩種方法均表現(xiàn)出，制備出細胞核數(shù)量少，雜質(zhì)極多的現(xiàn)象。裂解液充分裂解組織的同時有合適的緩沖液保障細胞核完整性是保障提取細胞核數(shù)量關(guān)鍵。
[0702]
首先通過對比實施例7～20，對適合獼猴桃根組織的緩沖體系進行了探索，結(jié)果如表1所示，現(xiàn)有方案中的緩沖體系無法適用于獼猴桃根組織細胞核提取實驗；獼猴桃生長于野外，細胞生長機制與模式生物大不相同，獼猴桃根細胞中會富集草酸鈣、醛類等。相比與模式生物擬南芥等需要更強緩沖能力的緩沖組分，在常用的緩沖組分中，tris-hcl、mops等均不適用。提高濃度會促進tris與溶液中醛以及各種酶的反應(yīng)，導(dǎo)致裂解體系不穩(wěn)定。最終經(jīng)過探索選擇了l-酒石酸與檸檬酸鈉一起構(gòu)建的緩沖體系。l-酒石酸常用于飲料和其他食品的酸味劑，有強的緩沖能力，在本發(fā)明中起主要緩沖作用；同時酒石酸還有較強的還原性，在本發(fā)明中發(fā)揮著對細胞核內(nèi)核酸的保護作用。對比實施例結(jié)果顯示緩沖組分濃度低時，無法保持緩沖液ph穩(wěn)定，細胞核由于緩沖液ph變化而破碎；緩沖組分濃度高時，細胞核因為緩沖液中離子濃度高而發(fā)生結(jié)團，導(dǎo)致實驗失敗。因此本發(fā)明中細胞核制備緩沖組分為2％～3％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15～25mm檸檬酸鈉。
[0703]
提取植物細胞核需要破壞細胞膜，細胞膜的基本結(jié)構(gòu)是磷脂雙分子層，常用的是使用去污劑破壞磷脂雙分子層可以達到釋放細胞核的目的。在對比實施例7～10中進行了裂解液配方的探索，通過不同性質(zhì)不同工作原理的裂解組分進行實驗，結(jié)果顯示sds(十二烷基硫酸鈉)、脫氧膽酸鈉強去污劑作為裂解成分時，大量細胞核破碎，無法收集到足量完整的細胞核；洋地黃皂苷弱去污劑作為裂解成分時，由于洋地黃皂苷無法溶解膜蛋白，細胞膜結(jié)構(gòu)無法得到充分破壞，可以收集到相對多一些的細胞核但仍無法滿足單細胞測序?qū)毎藬?shù)量的要求。triton x-100屬于溫和的去污劑來源于聚氧乙烯，并含有一個烷苯基疏水基團，結(jié)合脂分子的能力介于十二烷基硫酸鈉和洋地黃皂苷之間，且可以作為膜蛋白的助溶劑，裂解得到的細胞核數(shù)量較于洋地黃皂更多，但triton x-100作用于細胞膜的同時還會對核膜造成損傷，仍無法得到足量的細胞核進行單細胞核測序?qū)嶒灐３Ｓ玫娜ノ蹌┤芙饧毎ぶ苽浼毎说姆椒ú贿m用于獼猴桃根組織的細胞核制備實驗，皂素常用于醫(yī)藥原料，主要用于激素類藥物的合成。皂素是由皂苷和糖、糖醛酸或其他有機酸所組成，皂苷賦予了皂素乳化脂分子的功能。對比實施例結(jié)果顯示，皂素作為裂解組分時，細胞核產(chǎn)量相比于sds、triton x-100等有極其顯著的提升；同時因為皂素不會導(dǎo)致蛋白變性，所以皂素作為裂解組分是對細胞核核膜不會有損傷。對比實施例結(jié)果顯示，皂素濃度低于2％時，細胞核數(shù)量會明顯下降，因為皂素本身含有糖于有機酸等，皂素濃度高于4％時，會影響裂解體系的穩(wěn)定性，細胞核數(shù)量減少。因此本發(fā)明裂解液中皂素的濃度范圍是2％～4％(m/v)。
[0704]
表2對比實施例1～20
[0705]
[0706]
[0707]
[0708]
[0709][0710]
植物細胞膜外還有細胞壁包裹，細胞壁是由纖維素、半纖維素、果膠等成分構(gòu)成，獼猴桃植株為大型落葉藤本，細胞壁的支撐強度要遠遠高于擬南芥，因此在破碎細胞壁的方法上，需要更強的破碎條件來幫助得到更多的細胞核。接下來通過對比實施例21～25，通過比較不同的處理方法包括刀片切碎、剪刀剪碎、勻漿化、破碎儀破碎、研缽研磨等對細胞核釋放的影響，結(jié)果顯示，刀片切碎、剪刀剪碎、研缽研磨的實驗方法得到的細胞核數(shù)量都低于勻漿方法，研缽液氮研磨是組織破碎最充分的辦法，但是研缽研磨破環(huán)細胞壁的同時對細胞核也造成了破壞。分析對比實施例結(jié)果得出，破碎儀破碎的方式輔助裂解液充分釋放細胞核的同時對細胞核破壞更少，是提取獼猴桃根組織細胞核的最佳方法。
[0711]
表3對比實施例21～25
[0712][0713]
植物細胞核進行單細胞轉(zhuǎn)錄組實驗時，需要保障細胞內(nèi)mrna完整，而細胞破碎后，胞質(zhì)中的rna酶釋放到緩沖體系中會降解mrna，因此需要rna酶抑制劑和還原劑保護細胞核mrna，不同物種、組織中的rna酶含量差異較大，對比實施例26～28結(jié)果顯示，針對50～100mg獼猴桃根組織，0.2～0.4u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biology,ag11613)可以很好的保護mrna完整性，提高rna酶抑制劑得到的結(jié)果無明顯差異，還會造成成本提高和試劑的浪費，因此kr裂解液中rna酶抑制劑的濃度為0.2～0.4u/ml。
[0714]
表4.對比實施例26～28
[0715][0716]
組織經(jīng)過裂解液處理后提取得到的粗細胞核懸液含有大量的細胞碎片等雜質(zhì)和細胞破碎釋放的mrna、細胞器等。這種條件下的細胞核懸液存在大的碎片無法進行單細胞測序?qū)嶒灒枰コ蟮乃槠蟛拍軡M足單細胞測序的要求，首先過濾去除較大的組織和細胞碎片，通過對比實施例29～33，驗證了不同孔徑篩網(wǎng)、不同過濾次數(shù)，過濾粗細胞核懸液的得率與除雜效率，對比實施例29結(jié)果顯示70μm篩網(wǎng)不能很好的達到除雜的目的，經(jīng)70μm篩網(wǎng)過濾后的懸液雜質(zhì)減少不明顯，兩次過濾仍然無明顯效果。破碎儀破碎的樣本大于70μm的碎片較少，在對比實施例30～31中，驗證了30μm孔徑篩網(wǎng)過濾獼猴桃根粗細胞核懸液的效果，結(jié)果顯示，30μm的細胞篩會導(dǎo)致細胞核的大量損失，且過濾過程受碎片率高的影響，過濾所需時間長，加大了細胞核內(nèi)rna降解的風(fēng)險，因此30μm篩網(wǎng)不能作為獼猴桃根粗細胞核懸液純化的方法。通過對比實施例32～33結(jié)果可知，40μm細胞篩網(wǎng)可以快速的去除粗細胞核懸液中的雜質(zhì)，純化獼猴桃根粗細胞核懸液最好的方法是40μm細胞篩網(wǎng)過濾兩次，除雜效率高達80％，同時細胞核得率大于70％，這個選擇既快速有效降低了碎片率，又有著更高的細胞核得率。
[0717]
表5對比實施例29～33
[0718][0719]
獼猴桃植株在生長過程中，會在細胞/組織內(nèi)富集大量的草酸鈣針狀晶體，這些草酸鈣針狀晶體是構(gòu)成植物防御和自我保護的重要組成部分。而這些草酸鈣晶體在組織破碎后會釋放到細胞核懸液中(圖3所示為細胞核懸液中草酸鈣針狀晶體)，篩網(wǎng)過濾后的細胞懸液中還存在針狀結(jié)晶體，在篩網(wǎng)過濾中，無論是30μm還是70μm都無法有效的完成對該類雜質(zhì)的過濾。而草酸鈣晶體的存在會導(dǎo)致無法開展單細胞測序，草酸鈣晶體在獼猴桃根組織中以針狀晶體存在，粗細長短不一，根據(jù)顯微鏡觀察可知草酸鈣晶體長度大于70μm。通過對比實施例34驗證70μm細胞篩網(wǎng)去除草酸鈣晶體的效果，結(jié)果顯示70μm細胞篩無法有效去除草酸鈣針狀晶體。通過對比實施例35～36驗證了40μm、30μm篩網(wǎng)去除草酸鈣晶體的效果，結(jié)果顯示，減小篩網(wǎng)孔徑仍然不能去除草酸鈣晶體。草酸鈣針狀晶體很容易伴隨液流穿過篩網(wǎng)，因此篩網(wǎng)過濾的方法無法去除草酸鈣針狀晶體。接下來通過對比實施例37～39，分別驗證了差速離心法、密度梯度離心法、流式細胞術(shù)方法去除草酸鈣晶體的效果，結(jié)果顯示，差速離心法無法達到去除草酸鈣晶體的作用，且會導(dǎo)致細胞核大量損失；密度梯度離心會導(dǎo)致細胞核的大量損失，繼續(xù)進行單細胞核測序存在風(fēng)險，雜質(zhì)的比重與細胞核相近導(dǎo)致了密度梯度離心不能很好的純化細胞核，差速離心法和密度梯度離心法都不能達到純化的細胞核的目的。而草酸鈣針狀晶體的存在會直接導(dǎo)致流式細胞儀堵塞，無法收集足量的細胞核進行實驗。對比實施例40～41使用macs分選柱進行細胞核懸液優(yōu)化的探索，分選柱(macs)通常用于磁場下，通過帶有磁珠的抗體結(jié)合目的細胞膜表面的特異性抗原，從而用于動物特定細胞類型的分選，在本發(fā)明中，在非磁場下，利用草酸鈣晶體的針狀形態(tài)特征和
分選柱中納米材料的堆疊的特點，體積小的細胞核可以伴隨液流穿過分選柱，針狀草酸鈣晶體則會被留在分選柱中，無法伴隨液流穿過，達到純化細胞核的目的可以達到除雜目的的同時保障細胞核得率，解決了單細胞核懸液優(yōu)化的問題。結(jié)果顯示，通過ms分選柱過濾單細胞核懸液得到的濾液各項指標(biāo)都滿足10
×
genmics平臺對于單細胞測序的要求。
[0720]
表6.對比實施例34～41
[0721]
[0722][0723]
完成草酸鈣晶體去除后，需要通過洗滌去除細胞核懸液中游離的mrna提高數(shù)據(jù)質(zhì)量，同時需要對細胞核懸液的濃度進行調(diào)整，對比實施例42～45中，進行了對洗滌條件的驗證。結(jié)果顯示，過小的離心力會導(dǎo)致細胞核損失較大，過大的離心力會導(dǎo)致細胞核損傷，過多的洗滌次數(shù)會導(dǎo)致細胞核破碎；洗滌條件為4℃下，300
×
g～500
×
g離心10分鐘，洗滌2次，細胞核懸液中游離的mrna基本去除干凈，同時細胞核得率高于其它方法，是適合獼猴桃根組織細胞核懸液的洗滌條件。
[0724]
表7.對比實施例42～45
[0725][0726][0727]
不同物種、不同組織的植物細胞壁構(gòu)成不同，細胞內(nèi)容物的構(gòu)成也不同，對比實施例46～48驗證了kr裂解液與本專利中的細胞核提取、優(yōu)化方法制備擬南芥葉片、擬南芥根
尖、玉米胚細胞核懸液的結(jié)果。結(jié)果顯示，本專利中的細胞核制備方法，及相應(yīng)的裂解液配方和細胞核優(yōu)化方法與獼猴桃根組織一一對應(yīng)，需要按照步驟先后進行才能完成獼猴桃根組織的細胞核懸液制備，對其它物種和組織不適用。
[0728]
表8.對比實施例46～48
[0729]
綜上所述，本發(fā)明描述的一種適用于單細胞測序的獼猴桃根組織細胞核制備方法，通過對比實施例1～28得出了kr裂解液其成分為2％～3％(v/v)l-酒石酸(nanjing reagent,c0681014023)、15～25mm檸檬酸鈉、0.2～0.4％(m/v)皂素(nanjing reagent,8047-15-2)、0.2～0.4u/ml rnase inhibitor(重組型rnase抑制劑(鼠源)，accurate biolo；輔助獼猴桃根細胞核釋放的方式為破碎儀破碎。通過對比實施例29～41得出了優(yōu)化細胞核懸液的實驗方法：40μm篩網(wǎng)過濾兩遍去除大的碎片，ms分選柱去除草酸鈣針狀晶體；通過對比實施例42～45驗證了一種細胞核高得率，去除環(huán)境rna的獼猴桃根組織細胞核懸液洗滌方法，為300～500
×
g、4℃、10min洗滌兩次。對比實施例46～48結(jié)果顯示本發(fā)明所述的kr裂解液、細胞核懸液過濾操作、細胞核懸液洗滌操作僅適用于獼猴桃根組織細胞核懸液制備。
[0730]
本發(fā)明描述的一種適用于單細胞測序的獼猴桃根組織細胞核制備方法可有效制備開展10x genomics平臺單細胞轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒炈璧募毎藨乙骸１景l(fā)明所述的一種適用于單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的獼猴桃細胞核懸液制備方法中獼猴桃根、kr裂解液、細胞核懸液過濾操作、細胞核懸液洗滌操作、單細胞轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果之間是一一對應(yīng)關(guān)系的，即獼猴桃根、kr裂解液、細胞核懸液過濾操作、細胞核懸液洗滌操作、單細胞轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果存在配伍關(guān)系。如，本發(fā)明實施例1～4提到的獼猴桃根、kr裂解液、細胞核懸液過濾操作，應(yīng)當(dāng)按照本發(fā)明中所指出的方法使用，才能有效的制備細胞核懸液，且制備得到的細胞核懸液各項指標(biāo)能夠達到單細胞轉(zhuǎn)錄組測序要求。本發(fā)明所述的一種適用于單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的獼猴桃根細胞核懸液制備方法操作科學(xué)嚴謹，重復(fù)性高，能夠有效地、高效地從獼猴桃根組織中分離得到數(shù)量足夠多、雜質(zhì)率低、極低環(huán)境rna的細胞核懸液，且得到的細胞核懸液能夠達到10x genomics平臺單細胞轉(zhuǎn)錄組測序各項指標(biāo)。
[0731]
本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以上實施例。在不背離本發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護范圍。
技術(shù)特征：
1.一種適用于單細胞測序的獼猴桃根組織細胞核的制備方法，其特征在于，包括如下具體步驟：1)配置kr裂解液：首先配置kr裂解液，并將配置好的溶液預(yù)冷；2)破碎樣本：將新鮮取材或者凍存的獼猴桃根組織樣本轉(zhuǎn)入離心管，加入預(yù)冷的所述kr裂解液及鋼珠，依照儀器操作說明置于破碎儀上對組織進行破碎；3)裂解細胞：破碎后將離心管置于冰上孵育裂解；4)篩網(wǎng)過濾：將裂解后的組織裂解液轉(zhuǎn)入離心管中，加入預(yù)冷的pbs，冰上靜置1分鐘，吸出組織裂解液，加入濾網(wǎng)中進行過濾得到過濾液；5)篩網(wǎng)過濾：使用濾網(wǎng)對步驟4)中的過濾液再進行一次過濾；6)離心收集沉淀：將步驟5)中的過濾液進行離心，丟棄上清，沉淀使用pbs進行重懸；7)過濾：將步驟6)中的沉淀重懸液全部加入分選柱中進行過濾；8)離心收集沉淀：將步驟7)中的過濾液進行離心，丟棄上清，沉淀使用pbs進行重懸。2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述kr裂解液包含以下成份(終濃度)：2％～3％(v/v)l-酒石酸、15～25mm檸檬酸鈉、0.2～0.4％(m/v)皂素、0.2～0.4u/ml重組型rnase抑制劑。3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述破碎儀為萬柏生物高通量組織破碎儀；所述破碎的條件為1200～1300rpm，170～180s；所述1ml的kr裂解液中添加50～100mg獼猴桃根組織。4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述孵育的時間為7～8分鐘。5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，所述濾網(wǎng)為falcon 40μm cell strainer，孔徑40μm；所述過濾全程在0～5℃操作。6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(6)中，所述離心的溫度為4-6℃，離心的時間為10-15分鐘，離心力為300～500
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g。7.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(7)中，所述分選柱為miltenyi ms column；所述過濾，全程在0～5℃操作。8.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(8)中，所述離心的溫度為4-6℃，離心的時間為10-15分鐘，離心力為300～500
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g。9.一種kr裂解液，其特征在于，所述kr裂解液包含以下成份(終濃度)：2％～3％(v/v)l-酒石酸、15～25mm檸檬酸鈉、0.2～0.4％(m/v)皂素、0.2～0.4u/ml重組型rnase抑制劑。10.一種試劑/試劑盒，其特征在于，其包含如權(quán)利要求9所述的kr裂解液。11.如權(quán)利要求9所述的kr裂解液或如權(quán)利要求10所述的試劑/試劑盒在制備適用于單細胞測序的獼猴桃根組織細胞核的方法、獼猴桃根組織細胞核轉(zhuǎn)錄組測序、獼猴桃根組織細胞核atac測序研究中的應(yīng)用。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種適用于單細胞測序的獼猴桃根組織細胞核的制備方法，通過獨創(chuàng)的裂解液配方和細胞核懸液優(yōu)化方法制備得到細胞核質(zhì)量很高。與現(xiàn)有技術(shù)中6～7種組分的裂解液配方相比，本發(fā)明裂解液配方顯著減少；實驗流程在30分鐘內(nèi)即可完成細胞核的制備。本發(fā)明所述方法避免蔗糖沉積等步驟，節(jié)約試劑、耗材，降低成本，同時大大縮短時間，提高效率，便于大量樣本實驗的開展。本發(fā)明還公開了一種KR裂解液，試劑/試劑盒及其在制備適用于單細胞測序的獼猴桃根組織細胞核的方法中的應(yīng)用。猴桃根組織細胞核的方法中的應(yīng)用。
