一種富硒生物絮團的制備方法
1.本發明涉及生物技術，特別涉及一種富硒生物絮團的制備方法。
背景技術：
2.生物絮團技術最初由法國海洋開發研究所于20世紀70年代初提出，如今，在水產養殖模式中生物絮團技術得到了廣泛應用。生物絮團技術(biofloc technology，bft)被譽是應對當前水產養殖業所面臨養殖水污染問題的有效替代技術，甚至做到無水交換。生物絮團以絲狀細菌、菌膠團細菌為核心，通過微生物胞外聚合物(eps)將水體中懸浮的細菌、藻類、原生動植物、有機碎屑等相互絮凝，形成的絮狀的懸浮物，生物絮團的大小形態各異，一般絮體的大小在130-200μm之間。
3.bft運行的原理是通過外加碳源，調控c/n＞15，促使水體異養細菌同化c、n源構建細菌細胞，從而去除水體氨氮、亞硝氮，有助于在養殖中減少水量交換，并且生物絮團可供養殖對象攝食，能夠代替部分餌料，減少殘餌、糞便對養殖水體的污染，同時節約養殖成本、提高養殖收益。
4.常見的生物絮團主要由菌類、藻類相互絮凝組成，在實際生產過程中，生物絮團的培育始終難以形成穩定的生態系統，并且由于水產動物的發育過程中對各種微量元素的需求在不斷的變化，所以養殖過程中的實際操作很難確定。
5.納米硒是納米級的單質硒，具有較高的生物安全性、抗氧化活性和抑菌性能，利用微生物合成的納米硒，具有綠安全、環保無污染、產量高、成本低、低毒性等多種優勢。硒也被應用于動物飼料添加中，而且硒元素具有保護腸道、肝臟的作用，而肝臟和腸道是正是水產動物的重要器官。水產動物攝入硒元素同時可以抵抗水體中有害菌體，增強其自身免疫力，從而提高存活率，增加養殖產量。
技術實現要素：
6.發明目的：本發明的目的在于提供一種制備富硒生物絮團的方法。
7.技術方案：富硒生物絮團的制備方法，包括以下步驟
8.1)培養富硒微生物培養物：
9.(1)所述富硒微生物培養物通過具有納米硒合成功能的微生物還原亞硒酸鈉得到，本專利采用副蕈狀芽孢桿菌1805(保藏號為cgmcc no.24522)；
10.(2)副蕈狀芽孢桿菌1805菌株將亞硒酸鈉充分還原成納米硒單質；
11.(3)該菌株在24h內將2mmol/l的亞硒酸鈉充分還原成納米硒單質。
12.2)培養普通小球藻，具體方法如下：
13.(1)將多次劃線純化后的普通小球藻接入已滅菌的bg11液體培養基中，于溫度25-30℃，光照強度6500-9000lux，光照培養箱中培養2-5d使其達到對數生長期；
14.(2)普通小球藻能在144h完全去除濃度為10mg/l的亞硝態氮和濃度為6mg/l的氨氮。
15.3)培養光合細菌，具體方法如下：
16.(1)將凍存的沼澤紅假單胞菌菌種活化，劃線于一級種子培養基中，活化后再將其接種于液體種子培養基中培養(種子培養基121℃滅菌)。
17.(2)沼澤紅假單胞菌可在3d內去除81.88％的濃度為29.69mmol/l的氨氮，完全去除濃度為19.12mmol/l的硝氮，完全去除濃度為5mmol/l的亞硝氮。
18.4)培養枯草芽孢桿菌，具體方法如下：
19.(1)將分離純化得到的枯草芽孢桿菌置于lb液體種子培養基中培養，調ph、滅菌。配置固體培養基，則滅菌前加入瓊脂。
20.5)采用向水體中投入培養好的富硒微生物培養物、普通小球藻、光合細菌和枯草芽孢桿菌的方式，并且水體中設置曝氣裝置進行曝氣。所述生物絮團中各組分的重量比例如下：富硒微生物5份-10份、普通小球藻10份-40份、光合細菌30份-50份、枯草芽孢桿菌20份-50份。
21.優選以葡萄糖和紅糖的混合物為外源碳源、氯化銨為氮源，對養殖水體的c/n比控制在(15-20)∶1。采用稀釋后的紅糖對養殖水體的c/n進行調節控制。
22.溶解氧(do)維持在3.0-5.0mg/l不間斷持續供氧氣，同時對水體形成攪拌作用。水體曝氣是連續操作3天，其目的是為了提供溶解氧，以及通過曝氣對水體形成攪拌作用，使得富硒微生物培養物及菌、藻在攪拌狀態下絮凝混合，從而形成絮團。
23.納米硒是納米級的單質硒，具有較高的生物安全性、抗氧化活性和抑菌性能，利用微生物合成的納米硒，具有綠安全、環保無污染、產量高、成本低、低毒性等多種優勢，硒也被應用于動物飼料添加中，水產動物攝入硒元素可以抵抗水體中有害菌體，增強其自身免疫力，從而提高存活率，增加養殖產量。
24.光合細菌能夠凈化養殖環境，促進水生植物生長，在水產養殖中，擁有廣闊的發展前景。光合細菌可以在厭氧光照或者好氧黑暗的情況下，利用有機物、硫化物、氨氮等進行光合作用。光合細菌體內富含生物素、蛋白質、多種維生素、輔酶q、類胡蘿卜素等生理活性物質。并且光合細菌具有改善養殖水環境、天然餌料添加劑、預防水產動物疾病、降解食品生產有機污水和生物制氫等特性。
25.枯草芽孢桿菌可以改善水質，該菌能快速定植于水體中，通過位點競爭或營養競爭排斥有害病菌的生長繁殖，形成優勢菌，以達到改善水質的目的。并且該菌具有極強的分泌功能，能夠產生多種胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等活性物質，在動物腸道酸性條件下具有很好的穩定性，能夠用促進飼料中營養素的降解，提高飼料利用率。
26.微藻中豐富而均衡的營養成分(蛋白、脂肪酸、碳水化合物)和各種生物活性物質(pufa、維生素、甾醇)，可滿足水產動物在幼苗期生長發育的營養需求。微藻對富營養水體的氮吸收效率極高，通過吸收固定作用將有害物質轉化藻類的營養物質，高效降低水體中的氨氮、亞硝態氮等有害氮素，增加水體溶解氧，為水生動物的健康生長提供優質的水環境。
27.有益效果：本發明與現有技術相比，具有如下優勢：
28.1、本發明制備的富硒生物絮團可應用于水產養殖中，尤其是南美白對蝦養殖中，有利于凈化養殖水體水質、增強養殖對象免疫力。
29.2、本發明以持續微量添加納米硒及菌類、藻類，以稀釋后的紅糖水控制水體c/n比
為15-20∶1，并且對水體中持續曝氣供氧，有利于生物絮團的快速形成。
30.3、本發明能夠在較短的時間內形成生物絮團，通過合理調控，控制生物絮團的穩定，降低水體中氨氮和亞硝酸鹽等有害物質。
31.4、本發明創新點在于在常見生物絮團的基礎上增添了納米硒，以滿足面對水產動物的發育過程中對各種微量元素的需求不斷變化，提供了更多的可能性。同時可以抑制養殖水體有害菌對養殖對象的侵害，保護養殖對象的肝臟和腸道等器官，可以有效提升養殖對象的成活率。
32.5、本發明的富硒的生物絮團，在菌藻絮凝的基礎上添加了納米硒和生物硒，以滿足水產動物發育過程中對各種微量元素的需求，提供了更充足的營養。
33.6、本發明的富硒的生物絮團，可以有效去除養殖水體中氨氮和亞硝氮等有害物質，同時抑制水體有害菌，代替部分餌料，增強和提高養殖動物的免疫力及存活率。
附圖說明
34.圖1是單質硒質量的標準曲線圖；
35.圖2是6株高效合成菌株對亞硒酸鈉的還原效率結果圖；
36.圖3是副蕈狀芽孢桿菌1805革蘭氏染結果圖；
37.圖4是掃描電鏡表征副蕈狀芽孢桿菌1805合成的紅納米硒；
38.圖5是副蕈狀芽孢桿菌1805掃描電鏡eds成分分析圖；
39.圖6是模擬污水中普通小球藻對不同濃度nh
4+-n的去除率(r)及藻液濃度(od680)變化，普通小球藻對nh
4+-n的去除率(a)，藻液生物量變化情況(b)；圖7是模擬污水中普通小球藻對不同濃度no
2-?
n的去除率(r)及藻液濃度(od680)變化，普通小球藻對亞硝態氮的去除率(a)，藻液生物量變化情況(b)。
具體實施方式
40.以下實施方式中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
41.實施例1：
42.富硒微生物培養物的制備及分析實驗
43.一、材料與方法
44.1.菌株：從淮安的洪澤湖養殖塘采集肥沃的底泥中分離純化得到一株高效合成納米硒的菌株。
45.2.培養基：胰蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、氯化鈉10.0g，以上培養基所用試劑均為分析純(ar)。用5mol/lnaoh調ph至7.0、121℃、20min高壓蒸汽滅菌。配置固體培養基，則滅菌前加入15g瓊脂。
46.3.na2seo3還原力測定
47.具體步驟為：單質硒標準曲線的繪制：精準稱取不同質量單質硒粉放入試管中，然后各加入九水硫化鈉溶液，震蕩使其充分溶解，以未加硒粉的九水硫化鈉溶液做對照，在分光光度計500nm波長下測其吸光度值。重復3組，繪制標曲，過標準曲線計算還原單質硒的含量。
48.4.菌株的鑒定
49.通過觀察菌落的大小、顏、干濕情況、高度、形態、透明程度、邊緣形態、氣味等方面進行初步鑒定菌種。
50.菌的革蘭氏染按照phygene life sciences公司購買染試劑盒操作，細胞形態觀察采用1000
×
相差顯微鏡觀察，按照伯杰氏手冊進行操作。
51.5.副蕈狀芽孢桿菌1805合成納米硒的形貌表征分析
52.(1)納米顆粒粒徑分析
53.(2)掃描電鏡sem-eds聯用的測定
54.二、實驗結果
55.1.na2seo3還原力的測定
56.通過na2s顯法測定合成的單質硒質量標準曲線。如圖1所示，硒單質在500nm波長處吸光值較好，呈現出較高的相關性。通過此還原率標曲，可以測量其具體還原能力的大小與強弱。
57.通過測量6株高效合成納米硒的最優菌株還原能力，以還原能力最高的菌株為后續研究對象。如圖2所示，副蕈狀芽孢桿菌1805在24h時就可將2mmol/l的亞硒酸鈉中15.92mg的硒單質充分還原，納米硒的合成效率高達65.7％。
58.2.菌株副蕈狀芽孢桿菌1805的鑒定
59.經革蘭氏染、顯微鏡觀察發現，菌株1805的細胞呈直桿狀，常以成對或鏈狀排列，有芽孢，無莢膜，如圖3。
60.3.副蕈狀芽孢桿菌1805合成納米硒的形貌表征
61.本研究采用sem-eds聯用的方法對副蕈狀芽孢桿菌1805合成的紅納米硒進行表征。如圖4所示，該納米硒呈球狀，粒徑顆粒均勻，成分單一。eds結果表明，該納米硒的組成分別為：硒的含量73.7％、氯的含量是14.7％、鈉為8.8％，鉭金屬大致為2.8％如圖5。
62.實施例2：
63.普通小球藻的培養及去除亞硝態氮和氨氮能力實驗
64.一、材料與方法
65.1.使用藻種為普通小球藻。
66.2.培養基：改良后bg11培養基，磷酸二氫鉀40mg、硫酸鎂75mg、氯化鈣36mg、碳酸鈉20mg、檸檬酸6mg、微量元素1mg、去離子水1000ml。ph值為7.1，試劑純度均為分析純(ar)。
67.3.藻種制備
68.將多次劃線純化后的普通小球藻接入已滅菌的bg11液體培養基中，于25-30℃，光照強度6500-9000lux，光照培養箱中培養2-5d，達到對數生長期后，再轉到另一瓶滅菌的bg11液體培養基中，培養至對數生長期，如此反復轉接培養2-5次，使微藻處于對數生長期。取對數生長期的藻液，轉速2000-4000r/min的離心機中離心，棄掉上清液，用改良液體bg11反復洗滌3次，消除原培養基中氮元素的影響。
69.4.實驗方法
70.按照2-10％的接種量，使水體初始藻液od
680
值為0.08
±
0.01，總體積為100ml，置于25-30℃，光照強度6500-9000lux，光照培養箱中培養。將培養基中硝酸鹽分別換為氯化銨和亞硝酸鈉，精確稱量氯化銨、亞硝酸鈉使用去離子水定容，使nh
4+-n和no
2-?
n的質量濃度分別為2、4、6、8、10mg/l，每個質量濃度設置3個平行，分別采用生物比濁法、納氏試劑分
光光度法、α-萘胺分光光度法檢測藻細胞密度與nh
4+-n和no
2-?
n的質量濃度，并記錄數據。
71.二、實驗結果
72.1.普通小球藻對氨氮的去除效果
73.在5個nh
4+-n質量濃度去除實驗中，普通小球藻處理不同濃度nh
4+-n模擬污水168h，nh
4+-n的去除率(r)和藻液生物量(od
680
)變化如圖6所示。
74.普通小球藻處理nh
4+-n模擬污水，當實驗進行48h的nh
4+-n去除率迅速增大，當實驗進行至96h時，nh
4+-n質量濃度為2mg/l組的去除率達到100％。隨著實驗的繼續，分別在120h和144h處nh
4+-n質量濃度4mg/l和6mg/l組的去除率均達到100％，說明普通小球藻能在144h完全去除6mg/l的nh
4+-n，并且8mg/l和10mg/l組的去除率分別為75.6％和56.99％(圖6a)。
75.當實驗進行至48h時，普通小球藻開始迅速擴增，隨著反應時間的增加，普通小球藻保持穩定持續的增長，nh
4+-n質量濃度最大時，普通小球藻的od
680
值也最大，nh
4+-n質量濃度為4mg/l組的od
680
值僅次于最大值。而其他nh
4+-n濃度組次的od
680
值差異不大(圖6b)。結果表明：普通小球藻能夠在144h內完全去除6mg/l的nh
4+-n，并且8mg/l和10mg/l組的去除率分別達到75.6％和56.99％，去除效率最高。
76.2.普通小球藻對亞硝態氮的去除效果
77.在5個no
2-?
n質量濃度去除實驗中，普通小球藻處理不同濃度no
2-?
n模擬污水144h，no
2-?
n的去除率(r)和藻液生物量(od
6g0
)變化如圖7所示。
78.普通小球藻處理no
2-?
n模擬污水，當實驗進行48h，no
2-?
n去除率迅速增大，當實驗進行至96h時，no
2-?
n質量濃度為2mg/l和4mg/l組的去除率達到100％。隨著實驗的繼續，在120h處no
2-?
n質量濃度6mg/l和8mg/l組的去除率均達到100％，當實驗進行至144h，no
2-?
n質量濃度為10mg/l組的去除率達到100％，說明普通小球藻能在144h完全去除10mg/l的no
2-?
n(圖7a)。
79.當實驗進行至72h時，普通小球藻開始迅速擴增，隨著反應時間的增加，普通小球藻保持穩定持續的增長，no
2-?
n質量濃度最大時，普通小球藻的od
680
值也最大，且普通小球藻的od
680
值隨著no
2-?
n質量濃度的遞增而遞增(圖7b)。結果表明：普通小球藻能夠在120h內完全去除10mg/l的no
2-?
n，去除效率最高。
80.實施例3：
81.光合細菌的培養實驗
82.三、材料與方法
83.1.菌株：沼澤紅假單胞菌。
84.2.培養基：乙酸鈉2.46g、磷酸氫二鉀0.9g、磷酸二氫鉀0.6g、硫酸鎂0.2g、氯化鈣0.075g、硫酸鐵0.018g、微量元素1ml、生長因子1ml、去離子水1000ml。
85.3.菌種制備
86.取沼澤紅假單胞菌，該菌株具有在3d內去除81.88％的濃度為29.69mmol/l的氨氮，完全去除濃度為19.12mmol/l的硝氮，完全去除濃度為5mmol/l的亞硝氮的能力。在無菌操作臺上，接種于培養基中，培養基上方加入無菌液體石蠟，置于26-35℃，2500-4000lx的光照培養箱中培養一周。
87.二、實驗結果
88.1.觀察發現培養基底部出現鐵紅培養物，然后取1ml紅培養物轉移到另一瓶液體培養基中，加入無菌液體石蠟，置于光照培養箱中培養，如此反復富集3-4次，得到顏深紅的富集培養液。
89.2.取對數期菌液于溫度4℃，轉速5500-8000r/min的超低溫離心機中離心，棄掉上清液，用改良無氮光合細菌培養基反復洗滌2-5次，消除原培養基中氮元素的影響，收集菌體制成菌懸液。
90.實施例4：
91.枯草芽孢桿菌培養
92.1.菌種：枯草芽孢桿菌。
93.2.菌種活化：將已保存的菌種轉接至lb固體培養基中，37℃靜止培養24h后待用。
94.3.培養基：胰蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、氯化鈉10.0g，以上培養基所用試劑均為分析純(ar)。用5mol/lnaoh調ph至7.0、121℃、20min高壓蒸汽滅菌。
95.4.種子液制備：挑取活化的菌株單菌落于含50ml種子培養基的250ml三角瓶中，150-250r/min，30-37℃搖床振蕩16-18h后待用。
96.5.菌液發酵：取一定量的種子液，按2％的比例接入含50ml發酵培養基的三角瓶中，然后置于30-37℃的搖床中，振蕩培養24h，轉速為200r/min。
97.實施例5：
98.富硒生物絮團的制備
99.1.將實施例1、2、3、4中所獲得的富硒微生物培養物、普通小球藻、光合細菌和枯草芽孢桿菌按照質量比例分別為10％、20％、30％和40％關系，投入充分曝氣的水體中，并進行持續曝氣。
100.2.以葡萄糖和紅糖的混合物為外源碳源、氯化銨為氮源，對養殖水體的c/n比控制在(15-20)∶1。采用稀釋后的紅糖對養殖水體的c/n進行調節控制。
101.3.水體ph值控制在6.5-8.5之間，溫度：20-25℃。
102.4.溶解氧(do)維持在3.0-5.0mg/l不間斷持續供氧氣，同時對水體形成攪拌作用。水體曝氣是連續操作3天，其目的是為了提供溶解氧，以及通過曝氣對水體形成攪拌作用，使得富硒微生物、普通小球藻、光合細菌和枯草芽孢桿菌在攪拌狀態下絮凝混合，從而形成絮團。
103.實施例6：
104.富硒微生物培養物、普通小球藻、光合細菌和枯草芽孢桿菌質量比例分別為5％、20％、30％和45％，其余步驟同實施例5。
105.實施例7：
106.富硒微生物培養物、普通小球藻、光合細菌和枯草芽孢桿菌質量比例分別為5％、10％、50％和35％，其余步驟同實施例5。
107.實施例8：
108.富硒微生物培養物、普通小球藻、光合細菌和枯草芽孢桿菌質量比例分別為10％、30％、40％和20％，其余步驟同實施例5。
109.實施例9：
110.富硒微生物培養物、普通小球藻、光合細菌和枯草芽孢桿菌質量比例分別為10％、
20％、20％和50％，其余步驟同實施例5。
111.針對上述實施例，分析檢測研究了本發明所述方法制備的富硒生物絮團納米硒含量及對氨氮和亞硝態氮的去除效果。結果表明，本發明所述方法制備出可以高效去除水體中氨氮和亞硝態氮的富硒生物絮團。
112.表1是實施例5、6、7、8、9制備的生物絮團中納米硒的含量。結果表明本發明所述的方法成功制備出富硒生物絮團。上述實施例5、6、7、8、9制備的生物絮團中納米硒的含量分別為650
±
12mg/kg、340
±
8mg/kg、351
±
5mg/kg、664
±
9mg/kg和653
±
17mg/kg。
113.表1實施例5、6、7、8、9制備生物絮團中納米硒的含量(mg/kg)
[0114] 施例5施例6施例7施例8施例9納米硒含量650
±
12340
±
8351
±
5664
±
9653
±
17
[0115]
表2是實施例5、6、7、8、9制備的生物絮團對氨氮及亞硝態氮的去除效果。結果表明本發明所述方法制備出的富硒生物絮團，能夠高效去除模擬污水中氨氮和亞硝態氮。模擬污水中，初始氨氮和亞硝態氮濃度均為4mg/l，富硒生物絮團處理模擬污水3天后，對水體中的氨氮達到99％以上，對亞硝態氮去除率達到95％以上。
[0116]
表2實施例5、6、7、8、9制備生物絮團對氨氮和亞硝態氮去除率(％)
[0117]
技術特征：
1.一種富硒生物絮團的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：1)培養富硒微生物培養物副蕈狀芽孢桿菌1805(保藏號為cgmcc no.24522)：富硒微生物培養物通過具有納米硒合成功能的微生物還原亞硒酸鈉得到，將富硒微生物培養物、普通小球藻、光合細菌和枯草芽孢桿菌按一定比例投入水中，水體中設置曝氣裝置進行曝氣；2)水體的c/n比控制在(15-20)∶1；3)水體ph值控制在6.5-8.5之間，溫度：20-25℃；4)溶解氧(do)維持在3.0-5.0mg/l不間斷持續供氧氣，同時進行攪拌。2.根據權利要求1所述的富硒生物絮團的制備方法，其特征在于，所述生物絮團中各組分的重量比例如下：富硒微生物5份-10份、普通小球藻10份-40份、光合細菌30份-50份、枯草芽孢桿菌20份-50份。3.根據權利要求1所述的富硒生物絮團的制備方法，其特征在于，步驟1)中制備富硒微生物培養物的方法如下：1)土壤中分離純化得到高效合成納米硒的菌株，通過生理生化鑒定和16s rdna基因序列比對，將此高效合成納米硒的菌株命名為：副蕈狀芽孢桿菌1805(bacillus paramycoides 1805)；2)副蕈狀芽孢桿菌1805最佳生長條件均為30℃、ph 6、200r/min，可在24h內將2mmol/l的亞硒酸鈉充分合成單質納米硒。4.根據權利要求1所述的富硒生物絮團的制備方法，其特征在于，步驟2)中培養普通小球藻的方法如下：普通小球藻多次劃線純化后的微藻接入已滅菌的bg11液體培養基中，于溫度25-30℃，光照強度6500-9000lux，光照培養箱中培養2-5d使其達到對數生長期。5.根據權利要求1所述的富硒生物絮團的制備方法，其特征在于，步驟2)中培養光合細菌的方法如下：1)取沼澤紅假單胞菌菌株，凍存；2)將凍存的菌種活化，劃線于一級種子培養基中，活化后再將其接種于液體種子培養基中培養，即得。6.根據權利要求1所述的富硒生物絮團的制備方法，其特征在于，步驟2)中培養枯草芽孢桿菌的方法如下：1)將草芽孢桿菌菌種置于lb液體種子培養基中培養，調ph，滅菌，配置固體培養基，滅菌前加入瓊脂；2)挑取活化的菌株單菌落于種子培養基中，搖床培養，制得種子液；3)將種子液接入發酵培養基中個，搖床培養。
技術總結
本發明公開一種富硒生物絮團的制備方法，將具有合成納米硒功能的微生物在適宜的含亞硒酸鹽培養基中培養，亞硒酸被充分還原成納米硒后，將富硒微生物培養物與普通小球藻、光合細菌和枯草芽孢桿菌按照以下質量比例混合培養：富硒微生物5份-10份、普通小球藻10份-40份、光合細菌30份-50份、枯草芽孢桿菌20份-50份。經分析檢測，本發明所述方法制備的生物絮團具有富硒特性，同時還具有去除水體中氨氮和亞硝態氮等有害物的凈水功能。亞硝態氮等有害物的凈水功能。亞硝態氮等有害物的凈水功能。
