一株降解四溴雙酚A的嗜麥芽窄食單胞菌及其應用的制作方法
一株降解四溴雙酚a的嗜麥芽窄食單胞菌及其應用
技術領域
1.本發明涉及微生物領域，更具體地，涉及嗜麥芽窄食單胞菌在降解四溴雙酚a中的應用。
背景技術：
2.四溴雙酚a(tetrabromobisphenol a，tbbpa)是一種溴代芳香族化合物，由雙酚a(bpa)溴化合成，為灰白粉末，是溴代阻燃劑的典型代表，阻燃劑常用于電器、家具、紡織等材料中的添加型阻燃劑，應用非常廣泛。當含tbbpa的產品在生產、使用以及廢棄回收處理過程中，tbbpa從這些產品中逃逸揮發并進入周圍環境中，在室溫下具有熱穩定性和親脂性強的特點，熔點184℃，沸點為316℃，240℃左右開始分解。可溶于甲醇、乙醇和丙酮等有機溶劑，亦可溶于氧氧化鈉水溶液。但微溶于水，由于其低水溶性、高脂溶性的特點，極易在土壤、河流底泥及污泥等環境樣品中累積。
3.目前已發現tbbpa在全球各種環境介質、生物體及人體內被廣泛檢出。相關毒理研究表明，tbbpa對動植物細胞具有毒性，特別對動物顯示出包括甲狀腺激素干擾、神經毒性、肝臟和腎臟毒性、免疫毒性、雌雄性干擾等廣泛的致毒效應。
4.tbbpa具有疏水性和持久性的特點，目前污染物環境修復可以用非生物方式和生物方式。生物降解也是天然環境中去除有機污染物一種重要途徑，是利用生物對環境污染物的吸收、代謝和降解等功能，加速去除環境中污染物的過程。因其能耗低、效率高、工藝過程簡單并無二次污染等優點而被廣泛而深入的研究，成為污染環境修復很有前途的方法。
技術實現要素：
5.本技術提供了一種嗜麥芽窄食單胞菌在四溴雙酚a污染土壤或水體治理中的應用。
6.本發明提供的菌株表現出比較強的去除低濃度tbbpa的性能，可用于tbbpa污染的水體和土壤的生物修復。
附圖說明
7.圖1是嗜麥芽窄食單胞菌(stenotrophomonas maltophilia.)在mha培養基上的形態圖。
8.圖2是嗜麥芽窄食單胞菌(stenotrophomonas maltophilia.)在無機鹽培養基上的形態圖。
9.圖3是嗜麥芽窄食單胞菌(stenotrophomonas maltophilia.)在顯微鏡(10*100)下的形態。
10.圖4示出了菌株mpeb0011984 16s rdna序列系統發育樹。
11.圖5示出了不同ph值下培養16h的菌株od值。
12.圖6示出了菌體添加量對tbbpa降解率的影響。
13.圖7示出了tbbpa的初始濃度對tbbpa降解率的影響。
14.本發明提供的去除tbbpa的菌，屬于黃單胞菌目的黃單胞菌科，為嗜麥芽窄食單胞菌stenotrophomonas maltophilia mpeb0011984，分類學名稱為stenotrophomonas maltophilia，于2022年6月21日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)，保藏號為：gdmcc no：62558；保藏地址為：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓。
具體實施方式
15.下面的實施例可以使本領域技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
16.本發明提供了一株嗜麥芽窄食單胞菌(stenotrophomonas maltophilia.)，該菌分離自廣東清遠電子廠周邊土壤。
17.mhb培養基：酪蛋白水解物17.5g，牛肉浸粉5.0g，淀粉1.5g，無菌水定容至1l，調節ph至7.2，固體培養基(mha)在mhb的基礎上加瓊脂15g。
18.無機鹽液體培養基成分為：葡萄糖3g；nacl-0.2g；cacl
2-0.015g；(nh4)so
4-1g；mgso
4.
7h2o-0.2g；feso
4-0.01g；mnso
4-0.01g；k2hp04-3g；kh2p0
4-1.5g；加水到1l。無機鹽固體培養基：每升液體培養基中加瓊脂15-20g。
19.首先用無機鹽培養基(msl)對沉積物進行富集培養，本發明的嗜麥芽窄食單胞菌的分離方法包括如下步驟：
20.取5g土壤加入裝有30ml無機鹽培養基的50ml離心管中，添加tbbpa至10mg/l，放置搖床，25℃，120rpm培養7天后。按體積比為10％比例轉接至新的濃度為30mg/l無機鹽培養基中，培養7天后轉入tbbpa的50mg/l的無機鹽培養液中，培養7天后再次轉接至濃度更高的tbbpa溶液中，直至tbbpa的濃度為100mg/l，獲得穩定的無泥tbbpa降解混菌體系。取1ml上述的無泥tcep降解混菌體系，稀釋10倍后用無機鹽培養基進行梯度稀釋后，在100mg/l tbbpa的msl平板上涂布，將涂布后的平板放置25℃培養。待菌落長出后，挑取單菌。將純化的單菌落在mhb溶液中培養，25℃培養過夜，取菌液與50％的甘油水溶液以1：1混合，-80℃條件下保藏。
21.經過分離純化，篩選得到菌株，菌株編號為mpeb0011984。菌株mpeb0011984的特征描述如下：
22.形態：該菌株在mha(牛肉粉6g/l，可溶性淀粉1.5g/l，酸水解酪蛋白17.5g/l，瓊脂17g/l，ph 7.3)平板上35℃培養24h觀察菌落呈淡黃，表面光滑，有光澤(圖1)；該菌株在無機鹽平板上35℃，培養24h觀察菌落呈透明，表面光滑，無光澤(圖2)；菌株的個體呈桿狀，兩端鈍圓，不規則分散排列(圖3)；對該菌株進行革蘭氏染，顯示為革蘭氏陰性菌。
23.16s分析：從本發明所述菌株純培養物中提取基因組dna，利用通用軟件27f和1492r進行擴增和測序，進一步通過mega軟件構建系統進化樹(圖4)。結果顯示該菌為嗜麥芽窄食單胞菌(stenotrophomonas maltophilia.)。
24.菌株抗生素抗性反應(表1)，結果顯示菌株對氯霉素、頭孢他啶、替加環素、環丙沙星、左氧氟沙星都敏感。
25.表1
26.抗生素抗性結果
氯霉素s頭孢他啶s替加環素s環丙沙星s左氧氟沙星s
27.ph值對菌株生長的影響：將活化16h的細菌以6％的接種量加在ph＝3-11的溶液中的mhb中，所有樣品分成3份，150rpm搖床培養16h。用分光光度計檢測，培養基校零。ph在5-9時細菌生長差值較小，ph在4以下時細菌無法生長，如圖5所示。
28.菌株對tbbpa的降解效果
29.菌懸液的制備：將甘油保存的菌株取1環至mha上劃線培養1天，挑取單菌落于mhb溶液中，在35℃、160r/min中培養16小時，制備為種子液。在mhb培養基中按2％的接種量接入mpeb0011984的種子液，35℃，150rpm恒溫搖床培養18h。8000r/min離心10min收集菌體，用超純水洗滌菌體3次，將濕菌體作為生物吸附劑。
30.菌株的吸附能力計算：菌株對tbbpa的降解率r的計算方法：
[0031][0032]
其中，r為tbbpa的降解率，c0為tbbpa的初始濃度(mg/l)，ce為平衡時溶液中tbbpa的濃度(mg/l)。
[0033]
將tbbpa溶液配置成下表的濃度。將濕菌體以2％的體積比加入含tbbpa的無機鹽溶液中。35℃、150rpm恒溫搖床培養5d。離心取上清，測定tbbpa的降解率。檢測方法為：hplc-1260高效液相譜檢測(安捷倫公司，uv-vis檢測器)。高效液相譜(hplc)測量tbbpa濃度的儀器條件見下表2：
[0034]
表2
[0035][0036]
菌體添加量的影響：在無機鹽溶液中，菌株對初始濃度為20mg/l的tbbpa的降解率能達到100％。且添加量為2％和4％的情況下，其去除效果均為100％，如圖6所示。因此選擇添加量為2％的體積濃度。
[0037]
初始濃度的影響：菌株對初始濃度為20mg/l的tbbpa的降解率能達到100％。tbbpa濃度為60mg/l時，降解率也達到64％。有較好的降解效果。菌株對濃度在20mg/l以下的tbbpa的降解效率是最高的。
[0038]
因此，本發明提供的菌株在35℃、150rpm恒溫搖床培養5d的情況下，對20mg/l以及以下濃度的tbbpa的降解率能達到100％，在tbbpa的濃度達到60mg/l時，其對tbbpa的降解率也達到60％以上。
[0039]
本領域技術人員應理解，以上實施例僅是示例性實施例，在不背離本發明的精神和范圍的情況下，可以進行多種變化、替換以及改變。
技術特征：
1.嗜麥芽窄食單胞菌在四溴雙酚a污染土壤或水體治理中的應用。
技術總結
本申請提供了一株降解四溴雙酚A的嗜麥芽窄食單胞菌及其應用，提供了嗜麥芽窄食單胞菌在四溴雙酚A污染土壤或水體治理中的應用。本發明提供的菌株表現出比較強的去除TBBPA的性能，可用于TBBPA污染的水體和土壤的生物修復。可用于TBBPA污染的水體和土壤的生物修復。可用于TBBPA污染的水體和土壤的生物修復。
