硝酸還原酶基因及其作為植物抗逆調控靶標的應用
1.本發明屬于植物品種改良和抗逆領域，更具體地，本發明涉及硝酸還原酶基因及其作為植物抗逆調控靶標的應用。
背景技術：
2.隨著世界城市化、工業化進程不斷加快，人口持續增長，水土流失、土地鹽堿化的發生，全球耕地數量不斷減少。糧食短缺問題是大家共同面臨的挑戰。利用分子遺傳學的理論方法深入研究作物品種改良、增強作物對不同環境脅迫的適應性，實現作物高產穩產，是本領域的重要方面。
3.作物在生長發育過程中經常受到諸如干旱、高鹽、高溫等環境脅迫，對作物產量造成重大影響。如何在提高作物產量的同時提高作物對環境脅迫的抗性，實現作物高產穩產，是科學家及育種家面對的重大課題。
4.禾本科植物水稻是世界上最重要的糧食作物之一，被廣為播種，為世界一半人口提供主食。然而，為了更廣泛地實現水稻培育以及提高其種植效率，如何實現在不同的環境下提高其環境適應性是本領域的重中之重。
5.一些糧食生產數據顯示，在保持了化肥高投入的情況下，大面積的糧食單產并未顯著提高。由于植物養分利用效率呈下降趨勢，導致化肥的施用量逐漸增加，使得生產成本大大增加，從而導致在農業生產中普遍出現增產不增收現象。另一方面，由于作物氮肥利用效率低下，農業生產中施用的大部分氮肥進入環境，會直接導致水系富營養化、土壤酸化、水資源與土壤重金屬積累等環境污染問題。迄今為止，影響植物氮素利用效率的分子機制仍然存在很多謎團，仍有許多參與植物氮素利用效率的關鍵組分亟待被發現。
6.在自然界條件下，由于不同的地理位置、氣候條件以及人類活動等多方面原因，造成了各種不良環境，超出了植物正常生長、發育所能忍受的范圍，致使植物受到傷害，甚至死亡。這些對植物產生傷害的環境稱為逆境，或脅迫。逆境包括但不限于：凍、低溫、高溫、干旱、鹽漬、土壤過濕和病害等各種逆境。植物雖經受逆境影響，但它通過生理反應而抵抗逆境，如果超過可忍范圍，超出植物自身修復能力，損傷將變成不可逆的，植物將受害甚至死亡。
7.干旱會導致葉片和嫩莖萎蔫，氣孔開度減小甚至關閉等生理生態變化，給植物的正常萌發、生長、成熟造成極大的影響。植物的耐干旱性是一個多基因控制的復雜性狀，其中涉及多種機制與信號通路共同參與。涉及干旱脅迫的信號轉導過程比較復雜，往往還與抗熱、冷凍以及氧化脅迫的信號途徑相互交叉。
8.一直以來，提高植物的耐干旱能力是本領域的重要課題。本領域亟待探索更多的提高植物的耐干旱能力的有效途徑。
技術實現要素：
9.本發明的目的在于提供一種新的調控植物對氮素利用效率的硝酸還原酶基因。
10.本發明的目的還在于提供一種硝酸還原酶基因及其作為植物抗逆調控靶標的應用。
11.本發明的目的還在于提供所述硝酸還原酶基因在增強植物氮素利用效率的方面的潛在應用。
12.在本發明的第一方面，提供一種調節植物的性狀的方法，包括：靶向下調植物中nr1.2的表達或活性，所述性狀包括：增強植物的耐旱能力；和/或降低植物苗期的地上部高度(植株株高)。
13.在一個優選例中，所述降低植物中nr1.2的表達或活性包括：在植物中敲除或沉默nr1.2的編碼基因，或抑制nr1.2的活性；優選地，所述在植物中敲除或沉默nr1.2的編碼基因包括：以crispr系統進行基因編輯從而敲除nr1.2的編碼基因；以同源重組的方法敲除nr1.2的編碼基因；以特異性干擾nr1.2的編碼基因表達的干擾分子來沉默nr1.2；在含有nr1.2的植物中將nr1.2進行功能喪失性突變；或，以特異性抑制nr1.2參與的信號通路的化學抑制劑進行nr1.2的抑制。
14.在另一優選方式中，所述方法包括：以crispr方法進行基因編輯從而敲除nr1.2的編碼基因，包括：靶向于nr1.2的編碼序列的第511位，將c進行刪除；或，在nr1.2的編碼序列的第513～514之間的位置插入至少一個堿基、優選地插入a，使編碼序列發生移位。
15.在另一優選方式中，以seq id no:3～6所示的引物、基于crispr體系，靶向于nr1.2的編碼基因，進行基因敲除。
16.在本發明的另一方面，提供一種nr1.2的下調劑的用途，用于調節植物的性狀，包括：增強植物的耐旱能力，或制備增強植物耐旱能力的制劑。
17.在本發明的另一方面，提供一種nr1.2的下調劑的用途，用于降低植物苗期的地上部高度，或制備降低植物苗期的地上部高度的制劑。
18.在另一優選方式中，所述下調劑包括：敲除或沉默nr1.2的編碼基因的試劑，抑制nr1.2活性的試劑；優選地，所述下調劑包括：所述下調劑包括：針對nr1.2的crispr基因編輯試劑、同源重組試劑或定點突變試劑，所述試劑將nr1.2進行功能喪失性突變，特異性干擾nr1.2的編碼基因表達的干擾分子，特異性抑制nr1.2參與的信號通路的化學抑制劑。
19.在另一優選方式中，所述的增強包括提高、促進等，其為顯著性的增強、提高或促進，如耐旱能力增強、提高或促進5％、10％、15％、20％、40％、60％、80％、90％或更高(如存活率提高5％、10％、15％、20％、40％、60％、80％、90％或更高)。
20.在另一優選方式中，所述的降低表達包括缺失表達。
21.在另一優選方式中，所述的降低表示顯著性的降低，如降低20％、40％、60％、80％、90％或更低。
22.在另一優選方式中，所述降低植物苗期的地上部高度，其是具有統計學意義的降低，如降低5％、8％、10％、12％、15％、20％、40％、60％、80％、90％或更低。
23.在另一優選方式中，所述的植物為或所述nr1.2來自禾本科植物；優選地包括(但不限于)：水稻(oryza sativa)，玉米(zea mays)，小米(setaria italica)，小麥(triticum aestivum)，黍(panicum miliaceum)，大麥(hordeum vulgare)，燕麥(avena sativa l.)，高粱(sorghum bicolor)，二穗短柄草(brachypodium distachyum)，黑麥(secale cereale)。
24.在另一優選方式中，所述降低植物苗期的地上部高度(植株株高)，是降低低氮條件下植物苗期的地上部高度。
25.在另一優選方式中，下調植物中nr1.2的活性后，所述的植物通過在苗期降低氮的利用效率來提高對干旱的抵抗能力。
26.在另一優選方式中，所述的旱/干旱包括(但不僅限于)以下情形導致的旱/干旱：土壤水分不足形成的干旱，植物的蒸騰失水超過根部吸水形成的干旱，土壤中缺乏氧氣形成的干旱，鹽堿土壤環境形成的干旱。
27.在另一優選方式中，所述的nr1.2的多肽的氨基酸序列選自下組：(i)具有seq id no:2所示氨基酸序列的多肽；(ii)將如seq id no:2所示的氨基酸序列經過一個或幾個(如1-20個，1-15個，1-10個，1-5個，1-3個或1-2個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述調控性狀功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列與seq id no:2所示氨基酸序列的同源性≥85％(較佳地≥90％，≥95％，≥98％或≥99％)，具有所述調控性狀功能的多肽；(iv)seq id no:2所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或(v)在seq id no:2所示氨基酸序列的多肽的n或c末端添加標簽序列或酶切位點序列，或在其n末端添加信號肽序列后形成的多肽。
28.在本發明的另一方面，提供一種用于增強植物耐旱能力的nr1.2的下調劑，其為crispr基因編輯試劑；優選地，靶向于nr1.2的編碼序列的第511位，將c進行刪除；或，在nr1.2的編碼序列的第513～514之間的位置插入至少一個堿基、優選地插入a，使編碼序列發生移位。
29.在另一優選方式中，所述的crispr基因編輯試劑可以是sgrna構建體。
30.在本發明的另一方面，提供一種植物細胞、組織或器官，其中含有有外源的所述的下調劑。
31.在一個優選方式中，所述的植物細胞、組織或器官不具有繁殖能力。
32.在本發明的另一方面，提供一種nr1.2或編碼其的基因的應用，用于作為硝酸還原酶；優選地，所述硝酸還原酶為nadh依賴型硝酸還原酶。
33.在本發明的另一方面，提供一種nr1.2或編碼其的基因的應用，用于促進植物對硝酸鹽的吸收利用，或制備促進植物對硝酸鹽的吸收利用的制劑。
34.在本發明的另一方面，提供一種nr1.2或編碼其的基因的應用，用于提高植物的氮利用效率，或制備提高植物的氮利用效率的制劑；優選地，所述植物為禾本科植物。
35.在本發明的另一方面，提供一種促進植物對硝酸鹽的吸收利用或提高植物的氮利用效率的方法，包括在植物中提高nr1.2的表達或活性；優選地，包括將nr1.2的編碼基因或含有該編碼基因的表達構建物或載體轉入植物中；對nr1.2進行功能獲得性突變；以表達增強型啟動子或組織特異性啟動子促進nr1.2表達；或，以增強子促進nr1.2表達；優選地，所述植物為禾本科植物。
36.在本發明的另一方面，提供一種nr1.2作為篩選標記的應用，包括用于作為特異性篩選具有耐旱能力的植物的分子標記物，或用于作為鑒定植物耐旱能力的分子標記。
37.在本發明的另一方面，提供一種特異性選擇或鑒定植物的方法，包括：鑒定測試植物中的nr1.2的表達或序列特征或活性；若是該測試植物的nr1.2高表達或高活性，則其為對硝酸鹽的吸收利用高或氮利用效率高的植物；若是該測試植物的nr1.2低表達或不表達、
低活性或沒有活性，則其為耐旱能力高的植物。
38.在另一優選方式中，所述高表達或高活性，是指與同類或同種植物的表達或活性的平均值相比，表達或活性具有統計學意義的提高，如提高10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高。
39.在另一優選方式中，所述低表達或低活性，是指與同類或同種植物的表達或活性的平均值相比，表達或活性具有統計學意義的降低，如降低10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低。
40.在另一優選方式中，所述耐旱能力高是指與同類或同種植物的耐旱能力相比，有統計學意義的耐旱能力的增強，如存活率提高5％、10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高。
41.在本發明的另一方面，提供一種篩選增強植物耐旱能力的物質(包括潛在物質)的方法，包括：(1)將候選物質加入到表達nr1.2的體系中；和(2)檢測所述體系，觀測其中nr1.2的表達或活性，若其表達或活性降低(顯著降低，如降低10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低)，則表明該候選物質為可用于增強植物耐旱能力的物質。
42.在另一優選方式中，所述方法還包括：設置不添加所述候選物質的對照組，從而明確分辨測試組中nr1.2表達或活性與對照組的差異。
43.在另一優選方式中，所述的候選物質包括(但不限于)：針對nr1.2或其編碼基因或其上游或下游蛋白或基因設計的調控分子(如上調劑、下調劑、小分子化合物基因編輯構建物等。
44.本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
附圖說明
45.圖1、水稻nr1.2的轉基因敲除材料的基因型鑒定。
46.圖2、zh11與nr1.2的轉基因敲除材料osnr1.2-19，osnr1.2-29對硝酸有毒類似物chlorate的耐受性反應。
47.圖3、正常氮/低氮條件下，轉基因osnr1.2敲除植株與野生型生長情況比較。
48.圖4、zh11與nr1.2的轉基因敲除材料osnr1.2-19和osnr1.2-29中硝酸還原酶活性的測定結果。
49.圖5、體外表達純化osnr1.2蛋白，鑒定nr1.2蛋白為一個nadh依賴型硝酸還原酶而非nadph依賴型硝酸還原酶。
50.圖6、peg 4000模擬干旱環境下野生型zh11以及轉基因敲除材料osnr1.2-19和osnr1.2-29的抗旱表型比較。
51.圖7、土壤干旱環境下野生型zh11以及轉基因敲除材料osnr1.2-19和osnr1.2-29的抗旱表型比較。
具體實施方式
52.本發明中，披露了一種新的調控植物對氮素利用效率的硝酸還原酶基因，稱為nr1.2，其編碼的蛋白稱為nr1.2。本發明人意外地發現，nr1.2與植物的耐旱性性狀密切相
關，在植物中降低nr1.2的表達/活性后、植物苗期的株高降低、從而植物的耐旱性增強。因此，可以以nr1.2為調控植物耐旱性狀的靶點，下調nr1.2的材料或方法可應用于實現植物品種的改良。
53.如本文所用，所述的“耐旱能力/耐旱性”與“抗旱能力/抗旱性”可互換使用。
54.如本文所用，所述的“植物”為基因組中包含有本發明的nr1.2或其同源物(同源基因/同源多肽(蛋白))的植物，所述的植物可包括單子葉植物或多子葉植物；如：禾本科植物、十字花科植物、豆科植物等。優選地包括禾本科植物。在一些優選方式中，所述的植物為作物，較佳地為禾谷類作物。較佳地，所述禾本科植物如禾本科稻屬植物水稻，禾本科小麥屬植物如小麥，禾本科玉米屬植物如玉米等。例如包括：水稻、高粱、玉米、大麥、小麥、燕麥、黑麥。本領域技術人員應理解，適用于本發明的技術方案的植物不僅限于上述列舉的，可通過鑒定其中nr1.2同源物的存在情況來確定適當的植物。
55.如本文所用，所述的“苗期”是指植物萌芽期之后、成熟期之前的生長階段；例如對于水稻這一植物，通常其苗期是從水稻種子萌芽到移栽插秧前，一共大約需要35天時間，插秧10天后進入到分蘗期。
56.如本文所用且本領域人員能夠理解，選擇合適的“對照植物”是實驗設計的例行部分，可以包括對應的野生型植物或無目的基因的相應轉基因植物。對照植物一般是相同的植物物種或甚至是與待評估植物相同或屬于同一類的品種。對照植物也可以是因分離而丟失轉基因植物的個體。如本文所用的對照植物不僅指完整植物，也指植物部分，包括種子和種子部分。
57.如本文所用，所述的“地上部”也稱為“地上部分”是指植物植株的部分組織，當植株種植于土地中或培養于培養液中時，該部分組織位于植株的地面或培養液面以上的部分。本發明中，所述的“地上部”的高度與植株株高代表相同的意義。
58.如本發明所用，所述的nr1.2或其編碼基因的“下調劑”可以是蛋白水平的調控試劑/制劑，也可以是基因水平的調控試劑/制劑，包括了抑制劑、拮抗劑、阻滯劑、阻斷劑等，它們之間可被互換使用。
59.本發明中，通過改變植物的遺傳組成，使其可更能耐受脅迫條件。本發明公開的方法/用途是通過調節植物的硝酸還原酶或其編碼基因來實現改善植物的脅迫耐受性。
60.nr1.2基因的功能尚未由本領域技術人員進行分析研究，本發明人首次發現nr1.2基因對植物耐旱性具有作用。
61.本發明中，來源于水稻的“osnr1.2”包括具有loc_os08g36500中所示序列的基因及其編碼的多肽。對于氨基酸序列，技術人員可以理解，對多肽或蛋白質序列作出的會改變、添加或缺失所編碼的序列中的單個氨基酸或一小部分氨基酸的各個置換、缺失或添加，在該變更導致氨基酸為化學類似的氨基酸所置換時，為“保守修飾的變體”。因而，還可變更選自1至30的整數的任何數目的氨基酸殘基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7、10、15、20或25個變更。保守修飾的變體通常提供與它們所源自的未經修飾的多肽序列類似的生物活性。例如，酶活通常為天然蛋白質對于其天然底物的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，優選60-90％。提供功能上相似的氨基酸的保守置換表是本領域所熟知的。
62.任何與本發明中所具體引用的nr1.2同源性高(比如同源性為70％或更高；優選地同源性為80％或更高；更優選地同源性為90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具
有所述nr1.2相同功能的多肽/基因也包括在本發明內。本發明中，所述的nr1.2也包括其同源物，也即存在于水稻以外的其它物種中、與本發明上述的序列具有同源性且功能與本發明中nr1.2相同的多肽/基因、或在同樣或相近的信號通路中發揮同樣或相近作用的多肽/基因。由于nr1.2在多種物種中保守性地存在，應理解，盡管優選本發明實施例中所提出的該nr1.2基因，本發明中并不僅限于實施例中具體列舉的該基因。
63.本發明發現，所述nr1.2在植物的氮素利用效率方面有作用，而其缺失表達則可使得植物在苗期氮素利用效率降低、株高降低。本發明通過調節nr1.2的表達或活性，調節植物硝酸還原能力，進而影響植物氮素利用效率，可為農作物氮素高效利用育種提供基因資源和技術支持。
64.硝酸鹽的類似物氯酸鹽(chlorate)被植物吸收到體內經過同化作用變為亞次氯酸鹽后對植物有非常明顯的毒害效用，因此chlorate抗性常被用來指征植物對硝酸根的吸收或還原效率。本發明人發現，用chlorate對osnr1.2基因功能缺失突變體及野生型進行處理，突變體對chlorate毒性具有更強的耐受性，這表明該osnr1.2基因涉及植物氮素利用途徑。此外，在植物中敲除osnr1.2基因能顯著降低植物中硝酸還原酶的活性。為此，本發明人研究了該基因功能，通過體外表達純化osnr1.2蛋白進行檢測，發現與osnr1.2蛋白為一個nadh依賴型硝酸還原酶而非nadph依賴型硝酸還原酶。田間試驗顯示，與zh11相比osnr1.2基因敲除植物在低氮條件下相對分蘗數和產量降低更多。
65.令人意外的是，當osnr1.2基因能顯著降低植物中硝酸還原酶的活性是具有針對性的，本發明觀測到其在苗期植物中的影響最為顯著，使得苗期植物的株高降低，從而有利于其耐旱能力的增強，有效提高干旱環境下苗期植物的存活率。這一下調osnr1.2基因對于苗期植物的影響作用，在低氮條件下表現得尤其顯著。所述低氮條件如土壤氮素含量降低至20％以下、15％以下、10％以下、5％以下、2％以下、1％以下、0.8％以下、05％或更低。
66.在閱讀了本發明中所提出的所述nr1.2的功能后，可以采用本領域人員熟知的或本領域正在發展的多種方法來調節所述的nr1.2的表達或活性，尤其是降低nr1.2表達或使之缺失表達。發明還提供了用于下調所述的nr1.2的物質(如生物分子或生物制劑，化學小分子或其制劑等)，其通過下調nr1.2從而發揮改良植物的性狀的功能。
67.如本發明所用，所述的nr1.2或其編碼基因的下調劑是指任何可降低nr1.2或其編碼基因的穩定性、下調nr1.2的表達、降低nr1.2蛋白的活性、減少nr1.2蛋白的有效作用時間、或抑制nr1.2基因的轉錄和翻譯的物質，這些物質均可用于本發明，作為對于下調nr1.2有用的物質，從而可用于增強植物耐旱性。例如，所述的下調劑是：特異性干擾nr1.2基因表達的干擾rna分子或反義核苷酸；是特異性與nr1.2基因編碼的蛋白結合的抗體或配體；等等。它們可以是化合物、化學小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括dna、rna)的，也可以是蛋白水平的，也可以設計為兩種水平的組合調控。
68.作為本發明的一種優選的方式，采用靶向的基因編輯技術進行nr1.2基因敲除/敲低，這通?？梢岳胏rispr/cas(如cas9)系統。常見的敲除/敲低nr1.2基因的方法包括：將sgrna或能形成所述sgrna的核酸、cas9 mrna或能形成所述cas9 mrna的核酸共轉到靶向區域或靶向細胞中。在確定了待突變的靶基因/靶位點之后，可以采用已知的方法來將sgrna及cas9引入到靶細胞內。例如，所述的能形成所述sgrna的核酸為核酸構建體或表達載體，或所述的能形成所述cas9 mrna的核酸為核酸構建體或表達載體，將這些表達載體導入到
靶細胞內，從而在細胞內形成有活性的sgrna及cas9mrna。本發明的實施例中提供了經優選的靶向性基因編輯試劑，其可適當且高效地對nr1.2進行靶向性地突變，從而實現適當而有效的下調(例如下調20～30％，30～40％，下調40～50％，下調50～60％，下調60～70％，下調80～90％，或下調90～100％)。
69.作為本發明的一種可選的方式，可采用同源重組的方法，特異性地靶向于nr1.2，進行nr1.2基因敲除/敲低。也可應用cre和loxp方法使動物或細胞的基因組中相關基因選擇性的敲除，表達降低或失活。
70.作為一種可選方式，所述的下調劑可以是nr1.2特異性的干擾rna分子(如shrna、sirna、mirna等)，可根據本發明中提供的nr1.2序列信息制備獲得此類干擾rna分子。對干擾rna分子的制備方法可以是但并不限于：體外轉錄法，人工合成法等。所述的干擾rna可通過采用適當的轉染試劑被輸送到細胞內。rnai用于抑制nr1.2。rnai是一種進化上保守的細胞防御機制，用于控制包括人在內的大多數真核生物中外源基因的表達。rnai通常由雙鏈rna(dsrna)觸發，并引起單鏈靶rna的序列特異性mrna降解。mrna降解的介體是小干擾rna雙鏈體(sirnas)，通常由長dsrna在細胞內酶切產生。sirnas的長度通常約為21個核苷酸(例如21-23個核苷酸)。在將干擾rna導入細胞后，該序列被傳遞到稱為risc(rna誘導沉默復合物)的酶復合物。risc識別目標并用核酸內切酶切割它。如果較大的rna序列被傳遞到細胞，rna酶iii酶(dicer)會將較長的dsrna轉化為21-23nt的ds-sirna片段。作為另一種可選方式，可利用shrna技術進行干擾作用。shrna是一種rna序列，它可以使一個緊密的發夾旋轉，可以用來沉默基因表達通過rna干擾。shrna使用導入細胞的載體并利用啟動子來確保shrna始終被表達。這種載體通常傳遞給子細胞，使基因沉默得以遺傳。shrna發夾結構被細胞機制切割成sirna，然后與rna誘導沉默復合物(risc)結合。這種復合物結合并切割與它結合的sirna相匹配的mrnas。shrna由rna聚合酶iii轉錄。
71.作為其它可選的實施方式，使用與編碼nr1.2的一個或多個核酸特異性雜交的反義化合物來調節nr1.2表達。寡聚物與其靶核酸的特異性雜交干擾了核酸的正常功能。這種通過與靶核酸特異性雜交的化合物對靶核酸功能的調節通常被稱為“反義”。
72.作為一種可選方式，所述的下調劑是針對nr1.2的小分子化合物?？梢圆捎眠m于小分子化合物的篩選的方法，來進行這類小分子化合物的篩選。所述的篩選可以依托本領域現有的或將要開發的各種化合物庫，或自行建立一些新化合物庫。
73.作為本發明的一種優選的實施方式，利用基因工程技術構建crispr-cas9敲除表達載體，通過農桿菌侵入法轉入野生型植物愈傷組織中，使nr1.2在野生型中缺失表達。缺失突變體植株表現為低氮敏感。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，轉化載體具有抗性的抗生素標記物(卡那霉素、潮霉素)。攜帶有本發明osnr1.2基因的crispr-cas9敲除載體可通過使用ti質粒、ri質粒、農桿菌介導浸花法等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物經組織培育成植株。
74.本發明還提供了包含以上任一種具有下調活性的生物分子的表達載體，優選植物表達載體；更優選適合于進行后續轉基因操作(如應用農桿菌的轉基因操作)的表達載體?？梢赃\用本領域已知的方法來構建表達載體，一般其含有啟動子和目的基因序列。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點、轉錄終止子等。
75.本發明還提供遺傳工程化的宿主細胞，其含有基因編輯分子(如crispr/cas編輯
試劑)、干擾分子或沉默體序列或含有包含干擾分子或沉默體序列的載體。宿主細胞通常是植物細胞。轉化植物一般可使用農桿菌轉化或基因轉化等方法，例如葉盤法、幼胚轉化法等。
76.本領域此前的研究中，nr1.2基因的功能未被分析研究，本發明人首次發現nr1.2基因對植物耐旱性具有作用。在本發明人作出這一發現的基礎上，本發明還涉及利用nr1.2作為分子標記的應用，其可作為基因轉化植株后代的追蹤標記。本發明也包括早期確定植物的耐旱性能的方法，這通過檢測植物中nr1.2的表達情況或活性來進行。
77.本發明的特異性鑒定植物的耐旱性的方法包括：鑒定待測植物的nr1.2，若是該測試植物的nr1.2低表達或不表達，則其為具有耐旱性的植物。同時，這一植物在苗期的地上部高度低于常規的野生型植株，這種株型上的差異也可作為本發明所述鑒定方法的輔助性手段。此外，也可采用本領域已知的或正在發展的多種技術來進行核酸序列分析或蛋白分析。
78.在種植早期或種植前就能夠鑒定出植物的耐旱性，可為植物育種工作帶來便利；例如，可以在種子階段即進行鑒定，決定種子的優劣，根據鑒定結果加以合適的選擇。
79.在得知了nr1.2的功能及其分子機制以后，也可以基于此進行植物的定向篩選。也可基于該新發現來篩選通過調節nr1.2從而靶向調控植物耐旱性的潛在物質。
80.本發明提供了一種篩選提高植物耐旱性的潛在物質的方法，所述方法包括：(1)用候選物質處理一表達體系，該體系表達nr1.2；和(2)檢測所述體系中nr1.2的表達或活性；若所述候選物質在統計學上降低nr1.2的表達或活性，則表明該候選物質是提高植物耐旱性的潛在物質。
81.以蛋白或基因或其上特定的區域作為靶點，來篩選作用于該靶點的物質的方法是本領域人員所熟知的，這些方法均可用于本發明。所述的候選物質可以選自：肽、聚合肽、擬肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗體或抗體片段、配體、有機小分子、無機小分子和核酸序列等。根據待篩選的物質的種類，本領域人員清楚如何選擇適用的篩選方法。
82.經過大規模的篩選，可以獲得一類特異性作用于nr1.2或其參與的信號途徑或其上下游途徑相關基因有調控作用的物質。
83.下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如j.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
84.試劑和溶液
85.1000x yoshida母液分別為：
[0086][0087]
序列信息
[0088]
loc_os08g36500(seq id no:1)
[0089]
atggccgcttccgtgcagccgcggcagttcggccacctcgagccgggctccgcgccggtgtgcggcgccgcatcctcgaacggcgccaaggcgtaccctcccgcgaacggcatcccgcgccgcgccgactcaccggtgcgcgggtgcggcttccctcccctcgtctcgccaccttcgcggaagccgcccagcgatgggtcggacgacgaggaggaggagcaggaggactggcgggagctgtacggctcgcacctgcagctggaggtggaaccgtcggtgcgcgacgcgcgcgacgagggcaccgccgacgcgtggatcgagcgcaacccgttgctgatccggctcaccgggaaacacccgctgaactgcgaggcgccgctggcgaggctcatgcaccacggcttcatcaccccggctgcgctgcacttcgtgcgcaaccacggcgcagtgccgcggggtgactggtcgacgtggaccgtcgaggtgacggggctcgtcaagcgtcccatgcggctcaccgtggacgagctggtcaacggcttccccgccgtggaggtccccgtcacgctggcctgctcggggaaccgccgcaaggagcagaacatggtgcagcagactgtggggttcaactttggcgccgccgccgtgtccacgtcggtgtggcacggcgcccgcctccgcgacgtgctccggcggtgcggcatcatgcccagcaagggcggtgcgctcaacgtgtgcttcgagggcgccgaggacctccccggcggcggcggctccaagtacggcaccagcatcacacgccagtgggcgctggacccgtcgcgggacatcatgctcgcctacatgcagaatggcgagccgctgctccccgaccacggcttccccgtccgcgccatcatccccggctgcaccggcggccgcatggtcaagtgggtcaagcgcatcatcgtcaccaccgccgagtccgacaactactaccattacaaggacaaccgcgtcttcccgtcccatgtcgacgccgagctcgccaacgccgatgcgtggtggtacaagccggagtacatcatcaacgagctgaacgtgaactcggtgatcacggcgcccgggcacgacgagatcctgcccatcaacggcatcaccacgcagcgcggctacaccatgaagggatacgcctactccggcggcggcaagaggatcacgcgggtggaggtgacgctggacggcggcgagacatggctggtgtgcgtgctggacctcccggagaagcccaccaagtacggcaagcactggtgctggtgcttctggtccgtcgaggtcgaggtgctcgacctcctcggcgccaaggagatcgccgtgcgcgcctgggaccagtcgcacaacacccagcccgagaagctcatctggaatctcatggggatgatgaacaactgctggttcaaggtgaaggtgaacgtgtgccggccgcacaagggtgagatcgggctggtgttcgagcacccgacgcagcccgggaaccagaccggcgggtggatggcgaggcagaagcacctggagacggcggaggcggccgcaccggggctgaagcggagcacgtcgacgccgttcatgaacaccaccgacggcaagcagtttaccatgtccgaggtgcgcaagcactcgtcgcaggactcggcgtggatcgtcgtc
cacggtcacgtctacgactgcacggccttcctcaaggaccaccccggcggcgccgacagcatcctcatcaacgccggcaccgactgcaccgaggagttcgacgccatccactccgacaaggccaaggcgctcctcgacacctaccgcatcggcgagctcatcaccaccggcgccgggtacagctccgacaactccgtccacggcgcgtccaacctctcccagctcgcccccatccgcgaggccatcaaggcgccggcgcccgtcgcgctctccagcccgcgcgacaaggtcccctgccaactcgtcgacaagaaggagctctcccgcgacgtccgcctcttccgcttcgcgctgccgtcctccgaccaggtgctcggcctccccgtcggcaagcacatcttcgtgtgcgccagcatcgaagggaagctgtgcatgcgggcgtacacgccgacgagcatggtcgacgaggtcggccacttcgacctcctcatcaaggtgtacttcaagaacgagcaccccaagttccccgatggcgggctcatgacgcagtacctggactcgctccccgtgggcgcctacatcgacgtcaaggggccactcggccacgtcgagtacaccggccgcggcgagttcgtcatcaacggcaagccgcggaacgcgcggcggctggcgatgatcgccggcgggagcgggatcacgcccatgtaccaggtcatccagtcggtgctgcgcgaccagccggaggacacgacggagatgcacctggtgtacgcgaaccggacggaggacgacatcctcctccgcgacgagctcgaccggtgggcggcggagtacccggacaggctcaaggtgtggtacgtcatcgaccaggtgaagcggccggaggaagggtggaagtacggcgtcgggttcgtcacggaggaggtgctgcgggagcacgtgccggagggcggcgacgacacgctcgcgctcgcctgcgggccgccgccgatgatcaagttcgccgtctcgccgaacctggagaagatgaagtacgacatggccaattctttcatcgtgttctaa
[0090]
osnr1.2蛋白(seq id no:2)
[0091]
maasvqprqfghlepgsapvcgaassngakayppangiprradspvrgcgfpplvsppsrkppsdgsddeeeeqedwrelygshlqlevepsvrdardegtadawiernpllirltgkhplnceaplarlmhhgfitpaalhfvrnhgavprgdwstwtvevtglvkrpmrltvdelvngfpavevpvtlacsgnrrkeqnmvqqtvgfnfgaaavstsvwhgarlrdvlrrcgimpskggalnvcfegaedlpggggskygtsitrqwaldpsrdimlaymqngepllpdhgfpvraiipgctggrmvkwvkriivttaesdnyyhykdnrvfpshvdaelanadawwykpeyiinelnvnsvitapghdeilpingittqrgytmkgyaysgggkritrvevtldggetwlvcvldlpekptkygkhwcwcfwsvevevldllgakeiavrawdqshntqpekliwnlmgmmnncwfkvkvnvcrphkgeiglvfehptqpgnqtggwmarqkhletaeaaapglkrststpfmnttdgkqftmsevrkhssqdsawivvhghvydctaflkdhpggadsilinagtdcteefdaihsdkakalldtyrigelittgagyssdnsvhgasnlsqlapireaikapapvalssprdkvpcqlvdkkelsrdvrlfrfalpssdqvlglpvgkhifvcasiegklcmraytptsmvdevghfdllikvyfknehpkfpdgglmtqyldslpvgayidvkgplghveytgrgefvingkprnarrlamiaggsgitpmyqviqsvlrdqpedttemhlvyanrteddillrdeldrwaaeypdrlkvwyvidqvkrpeegwkygvgfvteevlrehvpeggddtlalacgpppmikfavspnlekmkydmansfivf*
[0092]
實施例1、osnr1.2 crispr-cas9敲除的轉基因突變體植物的建立
[0093]
1、突變載體的構建與純合突變體的鑒定
[0094]
(1)osnr1.2敲除突變載體的構建。
[0095]
設計點突變體載體的引物：
[0096][0097]
以稀釋100倍的pcbc-dt1t2(獲自中國農業大學生物學院)為模板進行四引物pcr擴增。osnr1.2-dt1-bsf/osnr1.2-dt2-bsr為正常引物濃度(濃度為10μm)；osnr1.2-dt1-f0/os-nr1.2-dt2-r0稀釋20倍。純化回收pcr產物，建立酶切-連接體系將目的片段連入表達載體phee401(獲自中國農業大學生物學院)中。
[0098]
(2)將酶連正確的載體轉入農桿菌備用。
[0099]
(3)osnr1.2突變體的鑒定：基因擴增引物
[0100]
osnr1.2-crispr-f：gccaaagttgaaccccacag(seq id no:7)；
[0101]
osnr1.2-crispr-r：aggaggagcaggaggactg(seq id no:8)。
[0102]
(4)提取植物葉片的總dna，以dna為模板，利用設計的突變體引物進行兩輪pcr驗證突變體的純合性。
[0103]
(5)將鑒定出的純合突變體提取rna進行熒光定量pcr鑒定基因osnr1.2的表達量。
[0104]
(6)純合突變體命名為osnr1.2。
[0105]
2、轉基因苗的分子鑒定
[0106]
提取轉基因材料不同株系葉片的總rna，反轉錄總cdna，進行熒光定量pcr鑒定。所述鑒定包括：進行總rna的提取，總cdna的合成，定量pcr。
[0107]
經過篩選，本發明人得沉默效果明顯的植株，稱為osnr1.2-19和osnr1.2-29轉基因株系(圖1)。
[0108]
其中，osnr1.2-19轉基因株系中，在osnr1.2基因(cds序列)的第511位，刪除1bp堿基，即刪除1個c，從而導致該基因所編碼的蛋白質從該密碼子起發生移位突變；
[0109]
其中，osnr1.2-29轉基因株系中，從osnr1.2基因(cds序列)的第513位之后，插入1bp堿基，即插入1個a，從而導致該基因所編碼的蛋白質從該密碼子起發生移位突變。
[0110]
實施例2、野生型及轉基因植物的氯酸鈉(chlorate)耐受性分析
[0111]
硝酸鹽的類似物氯酸鹽(chlorate)被水稻吸收到體內經過同化作用變為亞次氯酸鹽后對水稻有非常明顯的毒害效用，因此chlorate抗性可被用來指征植物對硝酸根的吸收或還原效率。
[0112]
本實施例中，就zh11及前述構建的osnr1.2 crispr-cas9敲除突變體植株，進行chlorate的耐受性分析。
[0113]
chlorate耐受性分析的處理方法如下：
[0114]
(1)水稻種子發芽后，自來水培養3天；
[0115]
(2)yoshida培養液培養5～7天；
[0116]
(3)將母液a中的nh4no3換為2mm kno3培養2天；
[0117]
(4)然后用2mm氯酸鈉(chlorate)處理1～2天，隨時觀察表型。
[0118]
步驟(4)處理后的2天后，zh11與nr1.2的轉基因敲除材料osnr1.2-19和osnr1.2-29對硝酸有毒類似物chlorate的耐受性反應如圖2所示，可見，處于苗期的野生型zh11在2mm氯酸鈉后葉子、莖干枯黃，不能存活；而處于苗期的轉基因osnr1.2敲除植株則盡管與未處理組相比葉子顏有變淺，但仍能保持存活。
[0119]
轉基因敲除突變體植株更為耐受chlorate毒性，說明其對chlorate的吸收利用少，這一結果說明其對硝酸鹽的吸收利用少，氮利用效率變低。
[0120]
實施例3、苗期株高分析
[0121]
同時，本技術人在正常氮(2mm kno3)以及低氮(0.01mm kno3)條件下水培培養野生型以及轉基因osnr1.2敲除植株，觀測它們的生長情況。
[0122]
本技術人觀察到，正常氮條件下，轉基因osnr1.2敲除植株與野生型生長情況相近。但是，在低氮條件下，苗期的轉基因osnr1.2敲除植株的株高變矮、地上部的鮮重下降，如圖3所示。這種株高的顯著下降有利于植物抵抗干旱環境。
[0123]
進一步的生長觀測可見，轉基因株系進入成熟期后，其株高與野生型接近，也即轉基因植物在苗期這一易于受到干旱影響的階段增強對干旱
[0124]
上述結果提示，轉基因株系通過在苗期降低氮的利用效率來提高對干旱的抵抗能力。
[0125]
實施例4、硝酸還原酶(nr)活性測定
[0126]
將水稻水培3周后，取地上部進行硝酸還原酶的測定，根據購自上海優選生物公司的硝酸還原酶活性檢測試劑盒操作完成。每個樣品一個測定管和對照管，同時加標準管及空白管，加樣過程中保證各組分按照順序依次加入。
[0127]
zh11與nr1.2的轉基因敲除材料osnr1.2-19和osnr1.2-29中硝酸還原酶活性的測定結果如圖4。結果顯示，野生型zh11中硝酸還原酶活性高；而轉基因osnr1.2敲除植株中則硝酸還原酶活性發生顯著性下降。
[0128]
因此，osnr1.2編碼的蛋白質為一種硝酸還原酶。
[0129]
實施例5、osnr1.2為nadh依賴型硝酸還原酶
[0130]
osnr1.2原核表達表達載體的構建與大腸桿菌轉化：
[0131]
根據osnr1.2的cdna序列，分別設計去掉終止密碼子的特異引物，以cdna全長為模板利用高保真酶kodplus(toyobo公司)進行pcr擴增。pcr產物經電泳回收后通過同源重組的方法克隆到原核表達載體pgex4t-1中。陽性克隆進行測序驗證正確后保存。
[0132]
將所獲得的重組質粒轉入到感受態的大腸桿菌bl21菌株中，經過蛋白表達及純化，獲得純化的osnr1.2蛋白。隨后委托上海優選生物公司進行osnr1.2純化蛋白的硝酸還原酶活性測定及nadh、nadph依賴性檢測。
[0133]
結果如圖5。結果顯示，體外表達純化osnr1.2蛋白鑒定該蛋白為一個nadh依賴型硝酸還原酶而非nadph依賴型硝酸還原酶。
[0134]
實施例6、peg 4000模擬干旱環境下植物的抗旱表型
[0135]
本實施例中，以20％peg 4000來模擬干旱環境，測定zh11及osnr1.2crispr-cas9敲除突變體對干旱的耐受性。實驗步驟如下：
[0136]
1)水稻種子發芽后，自來水培養3天；
[0137]
2)yoshida培養液培養3周；
[0138]
3)用20％peg 4000處理20天，隨后再換回yoshida培養液恢復10天，隨時觀察表型。
[0139]
結果如圖6。根據該圖所示，野生型zh11對于干旱的耐受性低；而轉基因osnr1.2敲除植株則對于干旱的耐受性顯著地提高；尤其是osnr1.2-29轉基因osnr1.2敲除對于干旱的耐受性更為理想。
[0140]
實施例7、土壤干旱環境下植物抗旱表型研究
[0141]
將水稻種在土壤中直接進行干旱處理，測定zh11及osnr1.2crispr-cas9敲除突變體對干旱的耐受性。實驗步驟如下：
[0142]
1)水稻種子發芽后，自來水培養3天；
[0143]
2)直接種到土壤中正常培養(正常給水)2周；
[0144]
3)停止給水，干旱處理10天，隨時觀察表型。
[0145]
結果如圖7。根據該圖所示，野生型zh11對于干旱的耐受性低；而轉基因osnr1.2敲除植株則對于干旱的耐受性顯著地高于野生型植株。
[0146]
在本發明提及的所有文獻都在本技術中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本技術所附權利要求書所限定的范圍。
技術特征：
1.一種調節植物的性狀的方法，包括：靶向下調植物中nr1.2的表達或活性，所述性狀包括：增強植物的耐旱能力；和/或降低植物苗期的地上部高度。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述降低植物中nr1.2的表達或活性包括：在植物中敲除或沉默nr1.2的編碼基因，或抑制nr1.2的活性；優選地，所述在植物中敲除或沉默nr1.2的編碼基因包括：以crispr系統進行基因編輯從而敲除nr1.2的編碼基因；以同源重組的方法敲除nr1.2的編碼基因；以特異性干擾nr1.2的編碼基因表達的干擾分子來沉默nr1.2；在含有nr1.2的植物中將nr1.2進行功能喪失性突變；或，以特異性抑制nr1.2參與的信號通路的化學抑制劑進行nr1.2的抑制。3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：以crispr方法進行基因編輯從而敲除nr1.2的編碼基因，包括：靶向于nr1.2的編碼序列的第511位，將c進行刪除；或，在nr1.2的編碼序列的第513～514之間的位置插入至少一個堿基、優選地插入a，使編碼序列發生移位。4.一種nr1.2的下調劑的用途，用于調節植物的性狀，包括：增強植物的耐旱能力，或制備增強植物耐旱能力的制劑；和/或降低植物苗期的地上部高度，或制備降低植物苗期的地上部高度的制劑。5.如權利要求4所述的用途，其特征在于，所述下調劑包括：敲除或沉默nr1.2的編碼基因的試劑，抑制nr1.2活性的試劑；優選地，所述下調劑包括：所述下調劑包括：針對nr1.2的crispr基因編輯試劑、同源重組試劑或定點突變試劑，所述試劑將nr1.2進行功能喪失性突變，特異性干擾nr1.2的編碼基因表達的干擾分子，特異性抑制nr1.2參與的信號通路的化學抑制劑。6.如權利要求1～5任一所述，其特征在于，所述的植物為或所述nr1.2來自禾本科植物；優選地包括：水稻(oryza sativa)，玉米(zea mays)，小米(setaria italica)，小麥(triticum aestivum)，黍(panicum miliaceum)，大麥(hordeum vulgare)，燕麥(avena sativa l.)，高粱(sorghum bicolor)，二穗短柄草(brachypodium distachyum)，黑麥(secale cereale)；或所述降低植物苗期的地上部高度，是降低低氮條件下植物苗期的地上部高度；或下調植物中nr1.2的活性后，所述的植物通過在苗期降低氮的利用效率來提高對干旱的抵抗能力。7.如權利要求1～5任一所述，其特征在于，所述的nr1.2的多肽的氨基酸序列選自下組：(i)具有seq id no:2所示氨基酸序列的多肽；(ii)將如seq id no:2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述調控性狀功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列與seq id no:2所示氨基酸序列的同源性≥85％，具有所述調控性狀功能的多肽；(iv)seq id no:2所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或(v)在seq id no:2所示氨基酸序列的多肽的n或c末端添加標簽序列或酶切位點序列，
或在其n末端添加信號肽序列后形成的多肽。8.一種用于增強植物耐旱能力的nr1.2的下調劑，其為crispr基因編輯試劑；優選地，靶向于nr1.2的編碼序列的第511位，將c進行刪除；或，在nr1.2的編碼序列的第513～514之間的位置插入至少一個堿基、優選地插入a，使編碼序列發生移位。9.一種植物細胞、組織或器官，其中含有有外源的權利要求8所述的下調劑。10.一種nr1.2或編碼其的基因的應用，用于：作為硝酸還原酶；優選地，所述硝酸還原酶為nadh依賴型硝酸還原酶；促進植物對硝酸鹽的吸收利用，或制備促進植物對硝酸鹽的吸收利用的制劑；提高植物的氮利用效率，或制備提高植物的氮利用效率的制劑；優選地，所述植物為禾本科植物。11.一種促進植物對硝酸鹽的吸收利用或提高植物的氮利用效率的方法，包括在植物中提高nr1.2的表達或活性；優選地，包括將nr1.2的編碼基因或含有該編碼基因的表達構建物或載體轉入植物中；對nr1.2進行功能獲得性突變；以表達增強型啟動子或組織特異性啟動子促進nr1.2表達；或，以增強子促進nr1.2表達；優選地，所述植物為禾本科植物。12.一種nr1.2作為篩選標記的應用，包括用于：作為特異性篩選具有耐旱能力的植物的分子標記物；或作為鑒定植物耐旱能力的分子標記。13.一種特異性選擇或鑒定植物的方法，包括：鑒定測試植物中的nr1.2的表達或序列特征或活性；若是該測試植物的nr1.2高表達或高活性，則其為對硝酸鹽的吸收利用高或氮利用效率高的植物；若是該測試植物的nr1.2低表達或不表達、低活性或沒有活性，則其為耐旱能力高的植物。14.一種篩選增強植物耐旱能力的物質的方法，包括：(1)將候選物質加入到表達nr1.2的體系中；和(2)檢測所述體系，觀測其中nr1.2的表達或活性，若其表達或活性降低，則表明該候選物質為可用于增強植物耐旱能力的物質。
技術總結
本發明提供了一種硝酸還原酶基因及其作為植物抗逆調控靶標的應用。本發明揭示了一種新的調控植物對氮素利用效率的硝酸還原酶基因，稱為R1.2。R1.2與植物的耐旱性性狀密切相關，在植物中降低R1.2的表達/活性后、植物苗期的株高降低、同時植物的耐旱性增強。因此，可以以R1.2作為調控植物耐旱性狀的靶點，下調R1.2的材料或方法可應用于實現植物品種的改良。改良。
