一種樺木醇-卡洛芬衍生物及其自組裝納米顆粒和在制備抗肺癌藥物中的用途的制作方法
1.本發(fā)明屬于天然藥物領域，特別涉及一種樺木醇-卡洛芬衍生物及其自組裝納米顆粒和在制備抗肺癌藥物中的用途。
背景技術：
2.肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，已成為我國城市人口惡性腫瘤死亡原因的第1位；其中非小細胞型肺癌(nsclc)約占肺癌的80％，包括鱗癌、腺癌、大細胞癌；約75％患者處于中晚期發(fā)現(xiàn)，目前化療是主要手段，5年生存率很低。化療對患者的正常細胞存在巨大破壞，肺癌易產(chǎn)生藥物耐藥性，且局部復發(fā)率和全身轉移率高，疾病預后差。因此，有靶向性地抑制肺癌細胞生長的方法，仍然是nsclc的希望所在。
3.樺木醇(betulin，be；c
30h50
o2；mw，442.72)是一種屬難溶性的五環(huán)三萜類化合物，廣泛存在于如中國油茶、白樺樹、在酸棗仁、白樺樹、滇刺棗等多種植物中，尤其是申請人課題組新發(fā)現(xiàn)be在油茶餅中高含量富集存在，具有油茶副產(chǎn)物二次深入開發(fā)價值。研究發(fā)現(xiàn)，be的毒性非常小，對腫瘤、艾滋病病毒、炎癥免疫、細菌/寄生蟲等方面具有廣泛活性(中草藥,2014；45(14):2118-24.)，是具有前途的藥物前體之一。非常有趣地是，be類化合物可選擇性地殺傷癌細胞，而對正常細胞無明顯毒性，兩者之間選擇性差10倍。鑒于其非常特別的選擇性差異，be母核顯示出其良好的抗腫瘤藥物開發(fā)前景；但由于溶解性差導致其生物利用度低和靶細胞的內吞不足，限制其作為藥物系統(tǒng)的應用。因此，借助納米技術和化學修飾改善這類化合物的成藥性十分必要。
4.隨著對be類化合物母核構效關系研究，發(fā)現(xiàn)修飾主要集中在三個位置：c-3位、c-20位和c-28位；如cn104387440a，cn200610119542，cn104271550b，cn106589046a，cn107892709a，cn108026139a，cn200610067268等專利公開了包括樺木醇、樺木酸等五環(huán)三萜類化合物的修飾藥物研究。其中，化合物dsb(yk-fh312)，rpr103611，pa457(bevirimat)和nvx-207已經(jīng)處于抗hiv或抗癌的臨床試驗階段；但由于其水溶性太差，仍然存在生物利用度低和體內藥代/搖動等方面的缺點。
[0005][0006]
卡洛芬(carprofen,cp；c
15h12
clno2；mw：273.71)是一種強效消炎、鎮(zhèn)痛和解熱作用的關節(jié)炎/風濕用藥物，具有口服吸收快、達峰時間短、血漿蛋白結合率高達99％、副作用小的特點。分子機理為抑制前列腺素的合成，阻斷炎癥介質而起作用。
[0007][0008]
近年來，抗炎已是抗腫瘤協(xié)同的一種手段之一。基于腫瘤細胞內特異高表達的碳酸酯酶和對碳酸酯鍵特異響應的設計原理(int j cancer.2013；133(2):408-15.；br j pharmacol.2013；168(8):1989-99.；j clin invest.2021；131(11):e137845.；)，本發(fā)明從靶向抗癌前體be出發(fā)，將be上的oh偶聯(lián)2分子cp成前藥bp，促進cp被腫瘤細胞內吞，達到抗炎增效抗癌和強脂溶性組裝成納米顆粒，利用腫瘤細胞的增強滲透和滯留(epr)效應，實現(xiàn)其納米顆粒被用于肺癌靶向。
技術實現(xiàn)要素：
[0009]
為了克服現(xiàn)有技術中存在的缺點和不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種樺木醇-卡洛芬衍生物(bp)。
[0010]
本發(fā)明的再一目的在于提供一種上述樺木醇-卡洛芬衍生物的制備方法。
[0011]
本發(fā)明的另一目的在于提供一種上述樺木醇-卡洛芬衍生物的自組裝納米顆粒。
[0012]
本發(fā)明的又一目的在于提供一種上述樺木醇-卡洛芬衍生物或其自組裝納米顆粒在制備抗肺癌藥物中的用途。
[0013]
本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn)：
[0014]
一種樺木醇-卡洛芬衍生物，所述樺木醇-卡洛芬衍生物具有如下結構式：
[0015][0016]
上述的樺木醇-卡洛芬衍生物的制備方法，包括以下操作步驟：在無水二氯甲烷溶劑中用草酰氯使卡洛芬(cp)的羧基轉化，得到酰氯卡洛芬；在無水二氯甲烷和室溫條件下，三乙胺作縛酸劑，將酰氯卡洛芬與樺木醇(be)反應，得到目標產(chǎn)物樺木醇-卡洛芬衍生物(bp)。
[0017]
上述的制備方法，具體包括以下操作步驟：
[0018]
(1)室溫下，取卡洛芬加入無水二氯甲烷溶劑中，磁力攪拌均勻后，滴加dmf作為催化劑，再加入草酰氯，用帶干燥器的塞子封閉進行反應6～12小時；減壓濃縮，除去溶劑以及多余的草酰氯，得到的濃縮液，即得到中間產(chǎn)物酰氯卡洛芬；
[0019]
(2)立即將中間產(chǎn)物酰氯卡洛芬用二氯甲烷溶解攪拌均勻，加入無水三乙胺作為去酸劑，然后加入樺木醇，tlc監(jiān)測反應進程，反應5～12小時完成后，用乙酸乙酯稀釋，然后用稀鹽酸和飽和氯化鈉水溶液分別洗滌三次，經(jīng)減壓濃縮，干燥后，得到目標化合物樺木醇-卡洛芬衍生物。
[0020]
步驟(1)所述室溫是指20-30℃；所述卡洛芬的用量為0.5～1.0mmol，所述無水二氯甲烷溶劑的用量為20ml，所述dmf的用量為1-4滴，所述草酰氯的用量為10mmol；
[0021]
步驟(2)所述二氯甲烷的用量為20ml，所述無水三乙胺的用量為2-4ml，所述樺木醇的用量為0.6mmol；所述乙酸乙酯的用量為100～200ml；所述洗滌是每次使用100ml稀鹽酸或飽和氯化鈉水溶液。
[0022]
一種樺木醇-卡洛芬衍生物的自組裝納米顆粒，該自組裝納米顆粒是由權上述的樺木醇-卡洛芬衍生物自組裝而成。
[0023]
上述的樺木醇-卡洛芬衍生物或其藥學上可接受的鹽在制備抗肺癌藥物中的用途。
[0024]
一種具有抗肺癌活性的藥物組合物，其中含有有效量的上述的樺木醇-卡洛芬衍生物或其藥學上可接受的鹽。
[0025]
上述的樺木醇-卡洛芬衍生物的自組裝納米顆粒在制備抗肺癌藥物中的用途。
[0026]
本發(fā)明在具體實施方式中對樺木醇-卡洛芬衍生物的合成、體外和體內藥理活性會做進一步闡述。
[0027]
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點及有益效果：
[0028]
(1)基于碳酸酯酶特異高表達和降解碳酸酯鍵，本發(fā)明將樺木醇和卡洛芬通過碳酸酯偶聯(lián)成bp，結合了抗炎藥物和抗腫瘤藥物的優(yōu)勢基團，二者協(xié)同發(fā)揮抗癌/抗炎效應，該技術尚未見相關報道。
[0029]
(2)本發(fā)明利用bp組合樺木醇-卡洛芬衍生物的疏水/親水基團，使其具有自組裝納米藥物特性；其對肺癌(a549、h1299、h460和ltep-78細胞系)的增殖具有顯著抑制作用，而對正常細胞系無生長抑制作用；皮下移植a549荷瘤裸鼠的抑制效應表明，bp顯著抑制a549細胞的生長，且未見毒性。
附圖說明
[0030]
圖1為bp的化學合成制備流程；
[0031]
圖2為bp自組裝納米顆粒的透射電鏡圖；
[0032]
圖3為bp在肺癌細胞裂解液和碳酸酯酶孵化的釋放情況(**，p《0.01)；
[0033]
圖4為be、cp及bp抑制a549腫瘤體積生長的曲線(**，p《0.01)；
[0034]
圖5為be、cp及bp抑制a549荷瘤組織體重的比較(**，p《0.01)；
[0035]
圖6為be、cp及bp對a549荷瘤小鼠的體重影響曲線(*，p《0.05)；
[0036]
圖7為be、cp及bp對a549荷瘤小鼠的主要器官影響(ns，無統(tǒng)計差異)。
具體實施方式
[0037]
下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0038]
實施例1：bp的合成(合成制備流程如圖1所示)
[0039]
(1)室溫下，取卡洛芬(cp)(1.0mmol)，加入20ml的無水二氯甲烷溶劑中，磁力攪拌均勻后，加入3滴dmf為催化劑，再緩慢加入草酰氯(1.0ml，10mmol)，用帶干燥器的塞子封閉進行反應8小時；減壓濃縮，除去溶劑以及多余的草酰氯，得到的濃縮液，即得到如下結構式
的中間產(chǎn)物酰氯卡洛芬；
[0040][0041]
(2)立即將中間產(chǎn)物酰氯卡洛芬用20ml二氯甲烷溶解攪拌均勻，加入2ml無水三乙胺作為去酸劑，然后加入樺木醇(be)(0.6mmol)，tlc監(jiān)測反應進程，反應5～12小時完成后，用200ml乙酸乙酯稀釋，然后用稀鹽酸和飽和氯化鈉水溶液洗滌三次(每次洗滌采用100ml稀鹽酸或飽和氯化鈉水溶液進行洗滌)，經(jīng)減壓濃縮，干燥后，得到白目標化合物樺木醇-卡洛芬衍生物(bp)(產(chǎn)率～70％)。
[0042]
目標產(chǎn)物bp的質譜和光譜數(shù)據(jù)如下：
[0043]
esi-ms(m/z)：[m+h]
+
為955.0，[m+na]
+
為978.1；1h-nmr：δ：11.78，2nh；8.13，2h；7.60～7.67，8h；7.11，2h；5.11，1h(ch＝)；4.93，1h(ch＝)；4.43，1h；4.09，1h；3.82，1h；3.71，2h；2.11，1h；1.78～1.81，4h；1.35～1.65，25h；0.85～1.01，19h。從而確定目標產(chǎn)物bp的分子式為c
60h70
cl2n2o4，理論分子量應為954.1；具體結構如下所示：
[0044][0045]
實施例2：bp的自組裝制備及粒徑表征
[0046]
室溫下，將50ml去離子水于磁力攪拌器上攪拌均勻，將20mg實施例1合成所得的bp溶于dmso溶劑中；然后，在磁力攪拌的條件下，用20μl的移液器吸取后進行緩慢滴加，然后用mw～1000的透析袋裝載，在5000ml大燒杯中用去離子水透析24小時，即得尺寸均一的自組裝納米顆粒。用dls測定儀檢測其水合粒徑約為200nm，pdi＝0.28；其干燥后的粒徑形態(tài)，通過高分辨透射電鏡進行表征鑒定，約100nm左右(圖2所示)。
[0047]
實施例3：肺癌細胞裂解液和羧酸酯酶對實施例1所得bp的釋放響應特性研究
[0048]
首先，測定細胞內羧酸酯酶的方法，對肺癌細胞a549和h1299，正常肝臟細胞lo2和健康志愿者的外周血淋巴細胞(pbmc)中羧酸酯酶(ce)的活力進行測定，具體參考文獻的方法進行實驗(wu x,wang r,qi s,kwon n,han j,kim h,li h,yu f,yoon j.rational design of a highly selective near-infrared two-photon fluorogenic probe for imaging orthotopic hepatocellular carcinoma chemotherapy.angew chem int ed engl.2021；60(28):15418-15425.)，比較ce在正常細胞和肺癌細胞中的含量區(qū)別(圖3中的a所示)，結果表明：ce在肺癌細胞中具有顯著性高表達，可作為肺癌前藥釋放的響應酶。
[0049]
然后，將20μm的bp加或不加20μm碳酸酯酶抑制劑(is-p-nitrophenyl phosphate，
bnpp)，與購買的羧酸酯酶ce(2u/ml；sigma)和不同細胞裂解液ce酶在生理鹽水中進行37℃孵化不同時間點，分別對其釋放的cp片段在235nm和210nm波長下分別對cp和be進行hplc檢測；實驗結果表明，bp前藥設計具有顯著的肺癌響應特性(圖3中的b和c所示)。
[0050]
實施例4：bp抗癌細胞增殖的研究
[0051]
購于上海細胞庫的肺癌細胞株a549、h1299、h460和ltep-78；前列腺癌pc-3，肝癌細胞hepg2，胃癌細胞mgc-803，乳腺癌mcf-7和結直腸癌細胞hct-116及健康志愿者來源的肝臟細胞系lo2，正常胚腎細胞hek293t，采用10％的胎牛血清和dmem或1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)增殖；通過淋巴細胞分離液獲取健康志愿者外周血淋巴細胞(pbmc)，用20％的胎牛血清和1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)和藥物毒性評價；所述細胞均由本發(fā)明人課題組進行復蘇、傳代、培養(yǎng)及凍存等。
[0052]
5％co2，37℃培養(yǎng)箱中(相對濕度90％)培養(yǎng)環(huán)境；取對數(shù)生長期的細胞，分別接種2
×
104肺癌細胞/孔于96孔板上待生長6小時后，離心棄上清；然后按以下分組給藥：腫瘤細胞設不加藥組和bp加藥組，每組設5個復孔，培養(yǎng)24或72小時，棄上清，加入100μl含0.5mg/ml的mtt(四氮唑鹽)無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)4小時，加入100μl二甲亞砜(dmso)，放置于酶標儀上進行60s自動振蕩，再用570nm處檢測od值。pbmc按6
×
104/孔直接與藥物進行孵化。結果按照以下抑制率公式計算每種情況下腫瘤細胞生長的抑制率，具體結果見表1。
[0053]
抑制率(％)＝(1-加藥組od值/對照組od值)
×
100％
[0054]
表1為be、cp、be+2cp(be和cp按照摩爾比1:2混合)和bp給藥作用不同細胞不同時間后的ic
50
。從表中，我們可以發(fā)現(xiàn)，bp用于肺癌細胞的選擇性更好。
[0055]
表1作用不同癌細胞系和正常細胞抑制率
[0056][0057]
實施例5：bp抗肺癌a549皮下瘤的體內效應
[0058]
將balb/c裸鼠適應spf動物房環(huán)境條件7天(6周齡，體重(17.8
±
g)，雌性，由斯萊克實驗動物技術有限公司提供)，自由飲水飲食，室溫(22
±
1)℃，濕度(40
±
10)％，光照周期12小時/12小時(白夜交替)。
[0059]
取0.1ml的肺癌a549細胞，用消毒酒精棉球擦拭干凈，1ml注射器抽取腫瘤細胞，將其接種于裸鼠左腋皮下，待裸鼠移植瘤長至體積100
±
mm3時，隨機分組。腹腔注射給藥，末
次給藥后停藥2天處理；每2天稱量裸鼠體重和測量移植瘤體積一次，每次測量移植瘤的長徑(l)和與之垂直的短徑(w)，根據(jù)tv＝l
×
w2/2計算腫瘤體積，繪制各組移植瘤的生長曲線。同時，記錄化合物對荷瘤裸鼠體內腫瘤生長的影響，分析用藥前后分別稱取各組荷瘤裸鼠腫瘤組織的重量，比較各組主要器官的差異情況。
[0060]
實驗結果如圖4-7所示，荷瘤裸鼠口服5％玉米油(溶媒組和溶解藥物)和10mg/kg/天的bp及等摩爾的be和cp化合物干預14天后，第15天麻醉處死小鼠，結果表明，只有bp明顯抑制a549腫瘤生長(圖4)，腫瘤體積和重量的抑制率均大于50％(圖5)，對小鼠體重和主要器官重量的影響無顯著性變化(圖6和圖7)，與其他組比較，bp在體內對肺癌具有顯著抑瘤效應，且尚未發(fā)現(xiàn)毒副作用。
[0061]
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
技術特征：
1.一種樺木醇-卡洛芬衍生物，其特征在于：所述樺木醇-卡洛芬衍生物具有如下結構式：2.根據(jù)權利要求1所述的樺木醇-卡洛芬衍生物的制備方法，其特征在于包括以下操作步驟：在無水二氯甲烷溶劑中用草酰氯使卡洛芬的羧基轉化，得到酰氯卡洛芬；在無水二氯甲烷和室溫條件下，三乙胺作縛酸劑，將酰氯卡洛芬與樺木醇反應，得到目標產(chǎn)物樺木醇-卡洛芬衍生物。3.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于具體包括以下操作步驟：(1)室溫下，取卡洛芬加入無水二氯甲烷溶劑中，磁力攪拌均勻后，滴加dmf作為催化劑，再加入草酰氯，用帶干燥器的塞子封閉進行反應6～12小時；減壓濃縮，除去溶劑以及多余的草酰氯，得到的濃縮液，即得到中間產(chǎn)物酰氯卡洛芬；(2)立即將中間產(chǎn)物酰氯卡洛芬用二氯甲烷溶解攪拌均勻，加入無水三乙胺作為去酸劑，然后加入樺木醇，tlc監(jiān)測反應進程，反應5～12小時完成后，用乙酸乙酯稀釋，然后用稀鹽酸和飽和氯化鈉水溶液分別洗滌三次，經(jīng)減壓濃縮，干燥后，得到目標化合物樺木醇-卡洛芬衍生物。4.根據(jù)權利要求3的制備方法，其特征在于：步驟(1)所述室溫是指20-30℃；所述卡洛芬的用量為0.5～1.0mmol，所述無水二氯甲烷溶劑的用量為20ml，所述dmf的用量為1-4滴，所述草酰氯的用量為10mmol；步驟(2)所述二氯甲烷的用量為20ml，所述無水三乙胺的用量為2-4ml，所述樺木醇的用量為0.6mmol；所述乙酸乙酯的用量為100～200ml；所述洗滌是每次使用100ml稀鹽酸或飽和氯化鈉水溶液。5.一種樺木醇-卡洛芬衍生物的自組裝納米顆粒，其特征在于：該自組裝納米顆粒是由權利要求1所述的樺木醇-卡洛芬衍生物自組裝而成。6.根據(jù)權利要求1所述的樺木醇-卡洛芬衍生物或其藥學上可接受的鹽在制備抗肺癌藥物中的用途。7.一種具有抗肺癌活性的藥物組合物，其中含有有效量的權利要求1所述的樺木醇-卡洛芬衍生物或其藥學上可接受的鹽。8.根據(jù)權利要求5所述的樺木醇-卡洛芬衍生物的自組裝納米顆粒在制備抗肺癌藥物中的用途。
技術總結
本發(fā)明屬于天然藥物領域，公開了一種樺木醇-卡洛芬衍生物及其自組裝納米顆粒和在制備抗肺癌藥物中的用途。該樺木醇-卡洛芬衍生物具有如下結構式，其具有納米自組裝特性，對肺癌細胞系具有明顯抑制作用，而對正常細胞系未見明顯毒性。皮下移植A549荷瘤小鼠藥效表明，該化合物可顯著抑制肺癌細胞的生長，無明顯毒副作用。副作用。副作用。副作用。
