一種煙曲霉半乳甘露聚糖模擬肽的制作方法
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技術(shù)實現(xiàn)要素：
[0022]
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種曲霉半乳甘露聚糖模擬肽，該模擬肽所制備的試劑用于診斷侵襲性曲霉病具有高特異性、高靈敏度的優(yōu)點。
[0023]
本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案如下：
[0024]
一種曲霉半乳甘露聚糖模擬肽，其特征在于，該模擬肽的氨基酸序列為ser ala ala thr met arg gly asp gln ser val arg ile phe gly gly(seq id no.1)。
[0025]
上述模擬肽可按seq id no.1所示序列采用多肽合成儀合成得到。
[0026]
上述seq id no.1所示模擬肽雖然可與商業(yè)化抗半乳甘露聚糖大鼠單克隆抗體特異性結(jié)合，但是其僅由16個氨基酸組成，屬于分子量小的半抗原，免疫原性不理想，在免疫動物過程難以誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生相對應(yīng)的抗體，因此建立侵襲性曲霉病抗原檢測體系存在一定的困難。
[0027]
為解決上述難題，本發(fā)明進一步提供一種模擬煙曲霉半乳甘露聚糖表位的抗原，該抗原由牛血清白蛋白(bovine serum albumin，bsa)與seq id no.1所示模擬肽依次偶聯(lián)構(gòu)成。所述的抗原可用于制備診斷侵襲性曲霉病的試劑。
[0028]
由于本發(fā)明所述的模擬肽能很好地模擬半乳甘露聚糖表位，因此可解決天然半乳甘露聚糖抗原提取、純化及合成困難等問題。更進一步地，本發(fā)明將所述的模擬肽與牛血清白蛋白偶聯(lián)構(gòu)成模擬半乳甘露聚糖表位的抗原。利用本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)手段，所述的抗原可制備成特異性高、靈敏度高的侵襲性曲霉病血清學(xué)抗原檢測試劑。
附圖說明
[0029]
圖1為本發(fā)明所述模擬肽與抗半乳甘露聚糖大鼠單克隆抗體結(jié)合的特異性曲線圖。
[0030]
圖2為本發(fā)明所述模擬肽偶聯(lián)bsa的偶聯(lián)物與兔抗煙曲霉多克隆抗體結(jié)合的靈敏度曲線圖。
具體實施方式
[0031]
下述多肽及偶聯(lián)物委托上海吉爾多肽有限公司按seq id no.1所示序列合成。
[0032]
實施例1
[0033]
1.酶聯(lián)免疫吸附法檢測半乳甘露聚糖模擬肽與抗半乳甘露聚糖大鼠單克隆抗體的結(jié)合
[0034]
往包被抗半乳甘露聚糖大鼠單克隆抗體的板條中加入稀釋至不同濃度(50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0μg/ml)的半乳甘露聚糖模擬肽，100μl/孔，37℃孵育1h，0.1％pbst洗板5次。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗半乳甘露聚糖大鼠單克隆抗體，100μl/孔，37℃孵育40min。0.1％pbst洗滌10次。tmb顯液避光顯10min，1m h2so4終止顯，酶標(biāo)儀檢測od450值。酶聯(lián)免疫吸附實驗結(jié)果顯示：seq.id no.1所示半乳甘露聚糖模擬肽(以下簡稱sp2)能與商業(yè)化抗半乳甘露聚糖大鼠單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合(圖1)。
[0035]
2.半乳甘露聚糖模擬肽的抗原性預(yù)測
[0036]
經(jīng)dnastar及bepipred linear epitope prediction 2.0生物信息學(xué)工具預(yù)測，核心序列sp2為堿性親水性多肽，二級結(jié)構(gòu)以β折疊及α螺旋為主，β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)位于第5～8氨基酸殘基處，其表面可及性、柔韌性、抗原指數(shù)均大于0，經(jīng)預(yù)測其可能b細胞表位為第5～12氨基酸殘基處(表1)。在mhc ii類抗原表位，選取hla-dr的6個表位(drb1*0101、0301、0401、0701、1101和1501)進行syfpeithi在線預(yù)測，結(jié)果顯示sp2具有與mhc ii分子的結(jié)合位點，
提示存在th細胞表位，可輔助b細胞的免疫應(yīng)答(表2)。
[0037]
表1半乳甘露聚糖模擬肽的抗原性指標(biāo)預(yù)測
[0038][0039]
注：以上抗原預(yù)測指標(biāo)均為均值。pi：等電點；hydrophilicity：親水性；surface probability：表面可及性；antigenic index：抗原指數(shù)；flexibility：柔韌性。其中加粗劃線部分為dnastar及bepipred linear epitope prediction 2.0預(yù)測的b細胞抗原表位。
[0040]
表2半乳甘露聚糖模擬肽sp2的th細胞表位預(yù)測
[0041][0042][0043]
注：黑體劃線加粗部分為錨定氨基酸。分值越高，具有th細胞表位的可能性越大。
[0044]
實施例2
[0045]
曲霉半乳甘露聚糖模擬肽sp2與大分子載體蛋白bsa偶聯(lián)，以提高模擬肽的免疫原性，以引起有效免疫應(yīng)答產(chǎn)生高特異性的抗體，可用于ia的血清學(xué)檢測。所述抗原(以下簡稱bsa-sp2)由模擬半乳甘露聚糖抗原表位的sp2及大分子載體蛋白bsa組成。
[0046]
1、兔抗煙曲霉多克隆抗體的制備
[0047]
利用煙曲霉粗提抗原多次皮下免疫新西蘭兔，獲取煙曲霉粗提抗原免疫兔血清，經(jīng)辛酸-硫酸銨法純化得到相應(yīng)的兔多克隆抗體。兔抗煙曲霉多克隆抗體同樣具有半乳甘露聚糖結(jié)合表位。
[0048]
2、酶聯(lián)免疫吸附法檢測bsa-sp2與兔抗煙曲霉多克隆抗體結(jié)合的靈敏度
[0049]
取bsa-sp2包被，包被濃度為1μg/ml，4℃包被過夜。0.25％酪蛋白封閉液，4度封閉過夜。加入稀釋至不同濃度(200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.2、0μg/ml)的兔抗煙曲霉多克隆抗體，相同濃度的正常兔多克隆抗體作為陰性對照。100μl/孔，37℃孵育1h。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔igg 1:2000，100μl/孔，37℃孵育40min。0.1％pbst洗板10次后拍干。tmb顯液避光顯10min，1m h2so4終止顯，酶標(biāo)儀檢測
od450值。酶聯(lián)免疫吸附實驗結(jié)果顯示：bsa-sp2可與兔抗煙曲霉多克隆抗體呈劑量依賴性結(jié)合，以bsa-sp2檢測兔抗煙曲霉多克隆抗體的最低檢測值為0.2μg/ml(圖2)，說明bsa-sp2同樣可模擬半乳甘露聚糖抗原表位。
技術(shù)特征：
1.一種煙曲霉半乳甘露聚糖模擬肽，該模擬肽的氨基酸序列為ser ala ala thr met arg gly asp gln ser val arg ile phe gly gly。2.一種模擬煙曲霉半乳甘露聚糖表位的抗原，該抗原由牛血清白蛋白與權(quán)利要求1所述模擬肽依次偶聯(lián)構(gòu)成。3.權(quán)利要求2所述的抗原在制備診斷侵襲性曲霉病試劑中的應(yīng)用。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種煙曲霉半乳甘露聚糖模擬肽，該模擬肽的核心序列為：Ser-Ala-Ala-Thr-Met-Arg-Gly-Asp-Gln-Ser-Val-Arg-Ile-Phe-Gly-Gly(SEQ IDO.1)。本發(fā)明所述的半乳甘露聚糖模擬肽能分別與兩種不同的抗煙曲霉抗體特異性結(jié)合，因此可制成侵襲性曲霉感染的診斷試劑。此可制成侵襲性曲霉感染的診斷試劑。
