一種寡糖在促進(jìn)hUC-MSCs增殖、制備相應(yīng)培養(yǎng)基中的應(yīng)用的制作方法
一種寡糖在促進(jìn)huc-mscs增殖、制備相應(yīng)培養(yǎng)基中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
1.本發(fā)明屬于干細(xì)胞領(lǐng)域，涉及寡糖在促進(jìn)huc-mscs增殖、制備相應(yīng)培養(yǎng)基中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(uc-mscs)是一種存在于新生兒臍帶組織中的多功能干細(xì)胞，可以在特定條件下持續(xù)增殖并分化成一種或多種細(xì)胞類型。uc-mscs具有易于獲得、分離、培養(yǎng)和純化等優(yōu)點(diǎn)。多次傳代和擴(kuò)增后，uc-mscs仍可保持原有的細(xì)胞表型和分化特性。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(huc-mscs)具有非侵入性獲得特性和低免疫原性特點(diǎn)，使其在臨床應(yīng)用中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。近年來，huc-mscs已廣泛應(yīng)用于臨床疾病并取得一些進(jìn)展。比如，huc-mscs能夠靶向炎癥組織、調(diào)節(jié)過度免疫和炎癥、發(fā)揮抗炎作用，具有促進(jìn)組織修復(fù)等功能，在aid、ns、代謝性疾病、cvds等難治疾病中具有廣闊應(yīng)用前景。
3.瓊膠寡糖作為一種新型的海洋功能性低聚糖，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、美白和保濕等生物活性，已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。根據(jù)還原性末端的不同，瓊膠寡糖可分為瓊寡糖(aos)和新瓊寡糖(naos)。新瓊四糖就是一種naos。
4.現(xiàn)有技術(shù)沒有新瓊四糖對(duì)huc-mscs體外增殖的影響報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
5.本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種寡糖在促進(jìn)huc-mscs增殖、制備相應(yīng)培養(yǎng)基中的應(yīng)用，以提高h(yuǎn)uc-mscs的增殖效率。
6.本發(fā)明目的通過下面的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
7.一種寡糖在促進(jìn)huc-mscs體外增殖中的應(yīng)用，所述寡糖為新瓊四糖。具體實(shí)施例中，從表1的a值可以看出，20μma值＞10μma值＞0μma值，說明新瓊四糖有效促進(jìn)huc-mscs增殖，且新瓊四糖濃度越高，對(duì)huc-mscs的促增殖作用越強(qiáng)；從圖1中c圖可以看出，20μm克隆數(shù)量＞10μm克隆數(shù)量＞0μm克隆數(shù)量，說明新瓊四糖有效促進(jìn)huc-mscs增殖，且新瓊四糖濃度越高，對(duì)huc-mscs的促增殖作用越強(qiáng)。
8.一種寡糖在制備促進(jìn)huc-mscs增殖的培養(yǎng)基中的應(yīng)用，所述寡糖為新瓊四糖。
9.優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和活性成分，所述活性成分為新瓊四糖。
10.優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基還包括胎牛血清。
11.優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基還包括青鏈霉素。
12.優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基。
13.一種huc-mscs增殖培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基dmem/f12培養(yǎng)基中添加新瓊四糖配制而成。進(jìn)一步地，該增殖培養(yǎng)基中可以預(yù)添加胎牛血清、青鏈霉素，也可以臨用時(shí)再將胎牛血清、青鏈霉素加入到含有新瓊四糖的dmem/f12培養(yǎng)基中。
14.本發(fā)明取得的有益效果：
15.本發(fā)明通過mtt實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)證明，新瓊四糖可以有效促進(jìn)huc-mscs增殖，
且新瓊四糖濃度越高，對(duì)huc-mscs的促增殖作用越強(qiáng)。本發(fā)明進(jìn)一步通過westernblot實(shí)驗(yàn)證明，新瓊四糖干預(yù)培養(yǎng)在促進(jìn)huc-mscs增殖的同時(shí)，并不會(huì)比常規(guī)培養(yǎng)明顯降低huc-mscs的干細(xì)胞特性。
附圖說明
16.圖1中：a為流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的cd105、cd90、cd73、cd34、cd45表達(dá)，cd105、cd90、cd73表達(dá)陽性，cd34、cd45表達(dá)陰性；b為酶標(biāo)儀測(cè)定的490nm波長處光密度(a)值，20μma值＞10μma值＞0μma值；c為克隆形成結(jié)果，20μm克隆數(shù)量＞10μm克隆數(shù)量＞0μm克隆數(shù)量；d為westernblot測(cè)定的干性轉(zhuǎn)錄因子nanog、oct4、sox2的表達(dá)水平，10μm、20μm新瓊四糖干預(yù)培養(yǎng)與0μm新瓊四糖干預(yù)培養(yǎng)的huc-mscs中的干性轉(zhuǎn)錄因子nanog、oct4、sox2表達(dá)水平并無明顯差異。
具體實(shí)施方式
17.為了更好地介紹本發(fā)明，下面通過具體實(shí)施例詳細(xì)闡述本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但需要注意并不以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
18.實(shí)施例1：
19.一、實(shí)驗(yàn)材料
20.dmem/f12培養(yǎng)基購自gibco公司。
21.胎牛血清(fbs)購自gibco公司。
22.雙抗購自sigma-aldrich公司。
23.胰酶購自sigma-aldrich公司。
24.新瓊四糖(hplc≥98％)購自源葉生物。
25.mtt購自sigma-aldrich公司。
26.結(jié)晶紫sigma-aldrich公司。
27.一抗、二抗購自武漢博歐特生物科技有限公司。
28.二、實(shí)驗(yàn)方法
29.1、huc-mscs分離與培養(yǎng)
30.收集正常分娩產(chǎn)婦的臍帶標(biāo)本，pbs清洗去除臍動(dòng)脈和靜脈及羊膜，獲得華通氏膠，剪碎成約1mm3大小的組織塊，接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，用含10％fbs、1％雙抗的dmem/f12培養(yǎng)基于37℃、5％co2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)約85％時(shí)接種于25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每2～3天換液1次，待細(xì)胞融合達(dá)80％，胰酶消化傳代。取第3代細(xì)胞重懸后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)cd105、cd90、cd73、cd34、cd45。
31.2、mtt檢測(cè)huc-mscs增殖
32.取生長狀態(tài)良好的第3代huc-mscs，胰酶消化，用含10％fbs、1％雙抗的dmem/f12培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5
×
104個(gè)/ml后鋪至96孔板，每孔100μl。12h后，每孔分別加入100μl含有不同濃度新瓊四糖的完全培養(yǎng)基，使新瓊四糖終濃度分別為0μm、10μm、20μm，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔中加入20μl新制備0.5％mtt溶液，靜置4h，棄去培養(yǎng)基，pbs沖洗，每孔中加入150μldmso溶液，震蕩15min使結(jié)晶充分溶解，靜置2h，取上清，酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長處光密度(a)值。
33.3、克隆形成檢測(cè)huc-mscs增殖
34.取生長狀態(tài)良好的第3代huc-mscs，胰酶消化，用含10％fbs、1％雙抗的dmem/f12培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)重懸，以2
×
103個(gè)/孔接種至12孔板，每孔1ml。24h后，每孔分別加入1ml含有不同濃度新瓊四糖的完全培養(yǎng)基，使新瓊四糖終濃度分別為0μm、10μm、20μm，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5％co2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)9d后(每2～3d更換一次含對(duì)應(yīng)濃度新瓊四糖的完全培養(yǎng)基)，棄去上清液，pbs洗滌3次，無水乙醇固定30min，棄去固定液，10mg/ml結(jié)晶紫染液染30min，pbs洗滌3次，空氣干燥，觀察拍照比較新瓊四糖不同濃度組的克隆數(shù)量。
35.4、westernblot檢測(cè)huc-mscs干性
36.取生長狀態(tài)良好的第3代huc-mscs，胰酶消化，用含10％fbs、1％雙抗的dmem/f12培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)重懸，以2
×
103個(gè)/孔接種至12孔板，每孔1ml。24h后，每孔分別加入1ml含有不同濃度新瓊四糖的完全培養(yǎng)基，使新瓊四糖終濃度分別為0μm、10μm、20μm，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5％co2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)9d后(每2～3d更換一次含對(duì)應(yīng)濃度新瓊四糖的完全培養(yǎng)基)，收集細(xì)胞，pbs洗滌，裂解，小心吸取上清，采用bca試劑盒進(jìn)行定量。分別取35μg總蛋白質(zhì)樣品，進(jìn)行含10％sds聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移至pvdf膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，50g/l脫脂奶粉室溫封閉2h后，加入nanog、oct4、sox2、gapdh(內(nèi)參)稀釋一抗，4℃孵育過夜，tbts漂洗，加稀釋二抗，常溫孵育2h，tbts漂洗，加入ecl發(fā)光液顯影、拍照。
37.5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
38.所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)
±
標(biāo)準(zhǔn)差(x
±
s)表示，多組之間比較采用anova分析方法，兩組間差異的比較采用t檢驗(yàn)方法，p＜0.05具有顯著差異，采用spss20.0進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
39.三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
40.1、huc-mscs分離與培養(yǎng)
41.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞呈梭形旋渦狀特點(diǎn)；流式細(xì)胞術(shù)顯示cd105、cd90、cd73表達(dá)陽性，cd34、cd45表達(dá)陰性(圖1中a圖)。這表明已經(jīng)成功分離培養(yǎng)huc-mscs。
42.2、huc-mscs增殖
43.酶標(biāo)儀測(cè)定的490nm波長處光密度(a)值見表1和圖1中b圖，a值與細(xì)胞數(shù)量成正比例相關(guān)。從表1的a值可以看出，20μma值＞10μma值＞0μma值，說明新瓊四糖有效促進(jìn)huc-mscs增殖，且新瓊四糖濃度越高，對(duì)huc-mscs的促增殖作用越強(qiáng)。
44.表1 490nm波長處光密度(a)值
45.濃度a值顯著性分析0μm0.683
±
0.022/10μm0.949
±
0.027v.s.0μm，p＜0.0520μm1.371
±
0.024v.s.0μm，p＜0.05
46.克隆形成結(jié)果比較見圖1中c圖。從圖1中c圖可以看出，20μm克隆數(shù)量＞10μm克隆數(shù)量＞0μm克隆數(shù)量，說明新瓊四糖有效促進(jìn)huc-mscs增殖，且新瓊四糖濃度越高，對(duì)huc-mscs的促增殖作用越強(qiáng)。
47.3、huc-mscs干性
48.干性轉(zhuǎn)錄因子nanog、oct4、sox2是表征huc-mscs干細(xì)胞特性的重要標(biāo)志物，通過跟蹤nanog、oct4、sox2表達(dá)水平的變化可以半定量分析huc-mscs是否依然維持良好的干細(xì)胞特性。westernblot測(cè)定的nanog、oct4、sox2表達(dá)水平結(jié)果見圖1中d圖。從圖1中d圖可以看出，10μm、20μm新瓊四糖干預(yù)培養(yǎng)與0μm新瓊四糖干預(yù)培養(yǎng)的huc-mscs中的干性轉(zhuǎn)錄因子nanog、oct4、sox2表達(dá)水平并無明顯差異。這表明，新瓊四糖干預(yù)培養(yǎng)在促進(jìn)huc-mscs增殖的同時(shí)，并不會(huì)比常規(guī)培養(yǎng)明顯降低huc-mscs的干細(xì)胞特性。
49.實(shí)施例2：
50.一種huc-mscs增殖培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基dmem/f12培養(yǎng)基中添加新瓊四糖配制而成。進(jìn)一步地，該增殖培養(yǎng)基中可以預(yù)添加胎牛血清、青鏈霉素，也可以臨用時(shí)再將胎牛血清、青鏈霉素加入到含有新瓊四糖的dmem/f12培養(yǎng)基中。
51.上述實(shí)施例的作用是為了詳細(xì)闡述本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但需要強(qiáng)調(diào)的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員不應(yīng)將本發(fā)明的保護(hù)范圍局限于上述具體實(shí)施例。
