靶向促進(jìn)tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合體及其應(yīng)用
1.本發(fā)明涉及藥物化學(xué)和化學(xué)生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種靶向促進(jìn)tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2.阿爾茨海默病(alzheimer’s disease,ad)是最常見的神經(jīng)退行性疾病，其典型臨床表現(xiàn)是進(jìn)行性記憶喪失和癡呆。隨著人口老齡化，ad的患病率呈急劇升高趨勢(shì)，預(yù)計(jì)到2050年中國將有約4000萬ad患者。目前臨床用于ad的藥物只能短暫緩解癥狀，不能治愈疾病或延緩病情的進(jìn)展。因此，全球迫切期待針對(duì)ad病理、能延緩ad進(jìn)展或治愈ad的新藥。
3.ad的兩個(gè)特征性腦病理變化是老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)，二者分別由β-淀粉樣蛋白(aβ)及過度磷酸化的tau蛋白形成；其中，只有tau蛋白病變與ad患者的癡呆程度呈正相關(guān)。大量研究顯示，過度磷酸化的tau蛋白可介導(dǎo)aβ的神經(jīng)毒性，為aβ發(fā)揮神經(jīng)毒性所必需；過度磷酸化的tau是朊脘病毒樣蛋白，可通過在不同腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞之間傳播，從而導(dǎo)致tau蛋白病變的擴(kuò)散。這些研究提示，tau蛋白是ad藥物研發(fā)的有效靶點(diǎn)。
4.過度磷酸化的tau蛋白聚集也見于原發(fā)性年齡相關(guān)性tau病(primary age-related tauopathy,part)、連鎖于17號(hào)染體伴帕金森病的額顳葉癡呆(frontotemporal dementia linked to chromosome-17 parkinsonism,ftdp-17)、老化相關(guān)tau星形膠質(zhì)細(xì)胞病(aging-related tau astrogliopathy,artag)、球形膠質(zhì)細(xì)胞tau病變(globular glial tauopathy,ggt)、皮克病(pick’s disease,pid)、進(jìn)行性核上麻痹(progressive supranuclear palsy,psp)、皮質(zhì)基底節(jié)變性(corticobasal degeneration,cbd)、嗜銀顆粒病(argyrophilic grain disease,agd)、慢性創(chuàng)傷性腦病(chronic traumatic encephalopathy,cte)、帕金森病(parkinson’s disease,pd)、亨廷頓病(huntington’s disease,hd)等一系列神經(jīng)退行性相關(guān)疾病。這類疾病包括ad被統(tǒng)稱為tau病(tauopathies)。過度磷酸化的tau蛋白在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)聚集是引起這類疾病的重要原因；此外，tau蛋白磷酸化和聚集還參與癲癇、腦卒中、嗅覺障礙、視網(wǎng)膜變性、腫瘤的發(fā)病過程。因此，降低tau蛋白磷酸化從而阻止異常tau蛋白聚集也是這類疾病的重要策略和分子靶標(biāo)。
5.目前，基于tau蛋白的策略主要基于對(duì)tau蛋白的降解。這一策略的優(yōu)點(diǎn)是：(1)大量證據(jù)顯示，在正常動(dòng)物中降低細(xì)胞內(nèi)tau蛋白的含量不引起顯著副作用。(2)降低tau蛋白的含量可抑制tau蛋白的聚集，而tau蛋白聚集則是引起神經(jīng)元退行性變的重要原因。(3)降低tau蛋白的含量可降低多種因素(比如aβ)引起的神經(jīng)元興奮性神經(jīng)毒性作用。因此，降低tau蛋白也被認(rèn)為是一種新的潛在的癲癇及腦卒中的方案。
6.常用降低細(xì)胞內(nèi)靶蛋白的技術(shù)有兩種：(1)降低靶蛋白的表達(dá)：常用的分子有sirna、mirna或反義寡核苷酸。由于這些寡核苷酸在組織中的分別不好、藥物代謝動(dòng)力學(xué)效果差、還存在脫靶可能性，嚴(yán)重限制了核苷酸類藥物向臨床應(yīng)用的推進(jìn)。(2)增強(qiáng)靶蛋白的
降解：常見的方法是增強(qiáng)蛋白降解系統(tǒng)，包括蛋白水解酶系統(tǒng)和自噬系統(tǒng)的活性。然而，由于非特異性地增強(qiáng)蛋白降解系統(tǒng)的活性可引起其它非靶蛋白的降解，可引起嚴(yán)重副作用，故目前尚未見激活蛋白降解系統(tǒng)的藥物獲批在臨床應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
7.鑒于上述針對(duì)tau蛋白技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是構(gòu)建一種小分子tau蛋白靶向去磷酸化的嵌合體(small-molecule dephosorylation-targeting chimaeras，簡(jiǎn)稱為sdeptac)，用以特異性促進(jìn)過度磷酸化tau蛋白的去磷酸化，從而改善tau蛋白的促微管組裝和穩(wěn)定微管功能。為了實(shí)現(xiàn)此目的，本發(fā)明的發(fā)明人通過深入研究發(fā)現(xiàn)，基于蛋白降解靶向嵌合體(proteolysis targeting chimeras,protac)相似的原理，可以構(gòu)建一種雙功能小分子嵌合體，小分子的一端能特異結(jié)合靶蛋白(即tau蛋白)，另一端特異結(jié)合特定的磷酸酯酶，兩者之間經(jīng)由連接體(linker)連接。所構(gòu)建的小分子嵌合體可同時(shí)結(jié)合靶蛋白(tau)和磷酸酯酶，達(dá)到選擇性促進(jìn)tau蛋白去磷酸化，改善神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。并且，所述sdeptac技術(shù)還具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)可選擇性結(jié)合并促進(jìn)靶蛋白ptau去磷酸化。(2)可作用于許多傳統(tǒng)難以成藥的靶點(diǎn)。許多傳統(tǒng)小分子藥物必須作用于靶蛋白的特定結(jié)合口袋(bindingpockets)才能發(fā)揮作用，sdeptac技術(shù)則沒有這種限制，它只要能與靶蛋白的任何區(qū)段相互作用，無需很高的親和力便可導(dǎo)致靶蛋白的快速去磷酸化，從而改善靶蛋白的功能。(3)sdeptac技術(shù)在細(xì)胞內(nèi)能被重復(fù)使用，其作用類似催化效應(yīng)，故無需很高濃度即可達(dá)到效果。
8.為此，第一方面，本發(fā)明提供了靶向促進(jìn)tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合體、或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其前藥、或其溶劑合物、或其同位素化合物，所述小分子嵌合體包括tau蛋白配體、連接體和磷酸酯酶募集體，所述tau蛋白配體與所述磷酸酯酶募集體通過所述連接體連接。
9.優(yōu)選地，所述磷酸酯酶為abαc型磷酸酯酶2a。
10.優(yōu)選地，所述tau蛋白配體選自如下結(jié)構(gòu)中的任意一種：
[0011][0012]
其中，
[0013]
a選自nh2、cooh、cho或oh；
[0014]
b選自c、n或o；
[0015]
c選自c、n或o；
[0016]
d選自h、d、鹵素、硝基、氨基、氰基、羥基、c1-c4烷基、鹵代c1-c4烷基和氘代c1-c4烷基中的一種；
[0017]
e選自ch2、nh、o或s；
[0018]
f選自c或n；
[0019]
g選自其中m選自0-10整數(shù)；h選自nh2、cooh、cho、oh、炔基、疊氮基或鹵素；n選自0-10整數(shù)；i選自nh2、cooh、cho、oh、炔基、疊氮基或鹵素；
[0020]
優(yōu)選地，所述tau蛋白配體的結(jié)構(gòu)式如式(i)所示：
[0021][0022]
優(yōu)選地，所述磷酸酯酶募集體為：
[0023][0024]
其中，
[0025]
j選自c或n；
[0026]
k選自nh、o或s；
[0027]
l選自h、d、鹵素、硝基、氨基、氰基、羥基、c1-c4烷基、鹵代c1-c4烷基和氘代c1-c4烷基中的一種；
[0028]
m選自ch、ch2或羰基；
[0029]
n選自其中m為0-10之間整數(shù)；
[0030]
o選自h、鹵素、nh2、cooh、cho、oh、炔基、疊氮基或以下任一結(jié)構(gòu)：
[0031][0032]
其中n為0-10之間整數(shù)，p選自鹵素、nh2、cooh、cho、oh、炔基、疊氮基；
[0033]
優(yōu)選地，所述磷酸酯酶募集體的結(jié)構(gòu)如式(ii)所示：
[0034][0035]
優(yōu)選地，所述連接體選自如下結(jié)構(gòu)中的任意一種：
[0036][0037][0038]
其中，m和n為0-10之間整數(shù)；
[0039]
優(yōu)選地，所述連接體的結(jié)構(gòu)如式(iii)或式(iv)所示：
[0040][0041]
優(yōu)選地，所述小分子嵌合體的結(jié)構(gòu)如式(v)或式(vi)所示：
[0042][0043][0044]
優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的鹽為無機(jī)酸鹽或有機(jī)酸鹽；
[0045]
優(yōu)選地，所述無機(jī)酸選自鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸中的至少一種；
[0046]
優(yōu)選地，所述有機(jī)酸選自甲磺酸、乙磺酸、對(duì)甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、馬來酸、檸檬酸、富馬酸、草酸、酒石酸、苯甲酸等。鹽酸、氫溴酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、馬來酸、苯磺酸和琥珀酸中的至少一種。
[0047]
第二方面，本發(fā)明提供了上述靶向促進(jìn)tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合體、或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其前藥、或其溶劑合物、或其同位素化合物在制備用于和/或預(yù)防與tau蛋白有關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用；
[0048]
優(yōu)選地，所述與tau蛋白有關(guān)的疾病為阿爾茨海默病、連鎖于17號(hào)染體伴帕金森病的額顳葉癡呆、皮克病、進(jìn)行性核上麻痹、皮質(zhì)基底節(jié)變性、原發(fā)性年齡相關(guān)性tau病、嗜銀顆粒病、老化相關(guān)tau星形膠質(zhì)細(xì)胞病、慢性創(chuàng)傷性腦病、球形膠質(zhì)細(xì)胞tau病變、帕金森病、亨廷頓病、腦卒中、癲癇、嗅覺障礙、視網(wǎng)膜變性和腫瘤中的至少一種。
[0049]
第三方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，包含有效量的上述靶向促進(jìn)tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合體、或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其前藥、或其溶劑合物、或其同位素化合物，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
[0050]
第四方面，本發(fā)明提供了促進(jìn)有需要的患者體內(nèi)的tau蛋白去磷酸化的方法，該方法包括向患者給藥有效量的上述靶向促進(jìn)tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合體、或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其前藥、或其溶劑合物、或其同位素化合物；
[0051]
優(yōu)選地，所述給藥方式選自口服、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻服、吸入、局部、皮下、經(jīng)皮、腹腔、硬膜外、鞘內(nèi)途徑中的至少一種。
[0052]
本發(fā)明提供通過化學(xué)合成靶向促進(jìn)tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合體。使用本發(fā)明的小分子嵌合體處理穩(wěn)定或瞬時(shí)過表達(dá)人類tau蛋白的hek293細(xì)胞，可有效降低tau蛋白在pt205、ps262、ps396、ps404表位的磷酸化水平，從而降低細(xì)胞內(nèi)的tau蛋白病理性聚集。由此表明，本發(fā)明所述的靶向促進(jìn)tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合體可在預(yù)防和包括阿爾茨海默病在內(nèi)的一系列tau疾病中發(fā)揮作用。與已經(jīng)報(bào)道的全肽段或部分肽段形式的
去磷酸化嵌合體分子相比，本發(fā)明為完全的小分子去磷酸化嵌合體，具有小分子屬性，可以解決多肽類嵌合體血腦屏障透過性差的問題，具有更強(qiáng)的成藥性優(yōu)勢(shì)。
[0053]
圖1顯示了小分子嵌合體sdeptac對(duì)hek293細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的人類磷酸化tau蛋白的去磷酸化作用。
[0054]
圖2顯示小分子嵌合體sdeptac對(duì)大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞中對(duì)tau蛋白的去磷酸化作用。
[0055]
圖3顯示了小分子嵌合體sdeptac對(duì)p301l小鼠海馬組織中tau蛋白的去磷酸化情況。
[0056]
其中，“sdeptac”為本發(fā)明提供的小分子嵌合體，“pt205、ps262、ps396、ps404”分別為位點(diǎn)特異性磷酸化tau蛋白的抗體，可分別檢測(cè)thr205、ser262、ser396和ser404位點(diǎn)發(fā)生磷酸化的人源性或小鼠源性tau蛋白，去磷酸化后的tau蛋白在pt205、ps262、ps396、ps404位點(diǎn)的磷酸化水平降低；“tau5”為一種總tau蛋白抗體，可檢測(cè)人源性tau蛋白和小鼠源性tau蛋白的總體水平。
具體實(shí)施方式
[0057]
以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0058]
在本文中所披露的范圍的端點(diǎn)和任何值都不限于該精確的范圍或值，這些范圍或值應(yīng)當(dāng)理解為包含接近這些范圍或值的值。對(duì)于數(shù)值范圍來說，各個(gè)范圍的端點(diǎn)值之間、各個(gè)范圍的端點(diǎn)值和單獨(dú)的點(diǎn)值之間，以及單獨(dú)的點(diǎn)值之間可以彼此組合而得到一個(gè)或多個(gè)新的數(shù)值范圍，這些數(shù)值范圍應(yīng)被視為在本文中具體公開。
[0059]
第一方面，本發(fā)明提供了靶向促進(jìn)tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合體、或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其前藥、或其溶劑合物、或其同位素化合物，所述小分子嵌合體包括tau蛋白配體、連接體和磷酸酯酶募集體，所述tau蛋白配體與所述磷酸酯酶募集體通過所述連接體連接。
[0060]
優(yōu)選地，所述磷酸酯酶為abαc型磷酸酯酶2a。
[0061]
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述tau蛋白配體選自如下結(jié)構(gòu)中的任意一種：
[0062][0063]
其中，
[0064]
a選自nh2、cooh、cho或oh；
[0065]
b選自c、n或o；
[0066]
c選自c、n或o；
[0067]
d選自h、d、鹵素、硝基、氨基、氰基、羥基、c1-c4烷基、鹵代c1-c4烷基和氘代c1-c4烷基中的一種；
[0068]
e選自ch2、nh、o或s；
[0069]
f選自c或n；
[0070]
g選自其中m選自0-10整數(shù)；h選自nh2、cooh、cho、oh、炔基、疊氮基或鹵素；n選自0-10整數(shù)；i選自nh2、cooh、cho、oh、炔基、疊氮基或鹵素；
[0071]
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述tau蛋白配體的結(jié)構(gòu)式選自如下結(jié)構(gòu)中的任意一種：
[0072][0073]
更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述tau蛋白配體的結(jié)構(gòu)式如式(i)所示：
[0074][0075]
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述磷酸酯酶募集體為：
[0076][0077]
其中，
[0078]
j選自c或n；
[0079]
k選自nh、o或s；
[0080]
l選自h、d、鹵素、硝基、氨基、氰基、羥基、c1-c4烷基、鹵代c1-c4烷基和氘代c1-c4烷基中的一種；
[0081]
m選自ch、ch2或羰基；
[0082]
n選自其中m為0-10之間整數(shù)；
[0083]
o選自h、鹵素、nh2、cooh、cho、oh、炔基、疊氮基或以下任一結(jié)構(gòu)：
[0084][0085]
其中n為0-10之間整數(shù)，p選自鹵素、nh2、cooh、cho、oh、炔基、疊氮基；
[0086]
優(yōu)選地，所述磷酸酯酶募集體的結(jié)構(gòu)式選自如下結(jié)構(gòu)中的任意一種：
[0087][0088]
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述磷酸酯酶募集體的結(jié)構(gòu)如式(ii)所示：
[0089][0090]
優(yōu)選地，所述連接體選自如下結(jié)構(gòu)中的任意一種：
[0091][0092]
其中，m和n為0-10之間整數(shù)；
[0093]
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述連接體的結(jié)構(gòu)如式(iii)和式(iv)所示：
[0094][0095][0096]
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述小分子嵌合體具有如下結(jié)構(gòu)中的的任意一種：
[0097][0098]
其中，linker為連接體，a-l的定義如前文所述。
[0099]
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述小分子嵌合體的結(jié)構(gòu)式選自如下結(jié)構(gòu)中的任意一種：
[0100][0101]
更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述小分子嵌合體的結(jié)構(gòu)如式(v)和式(vi)所示，其包括tau蛋白配體(如式i所示)、磷酸酯酶募集體(如式ii所示)和連接體(如式iii或式iv所示)，能夠募集abαc型磷酸酯酶2a，以對(duì)特異性結(jié)合的tau蛋白進(jìn)行去磷酸化；
[0102][0103]
根據(jù)本發(fā)明，所述小分子嵌合體還可以連接有本領(lǐng)域常規(guī)的其他結(jié)構(gòu)，這些均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，本發(fā)明在此不再贅述。
[0104]
優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的鹽為無機(jī)酸鹽或有機(jī)酸鹽；
[0105]
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述無機(jī)酸選自鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸中的至少一種；
[0106]
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述有機(jī)酸選自甲磺酸、乙磺酸、對(duì)甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、馬來酸、檸檬酸、富馬酸、草酸、酒石酸、苯甲酸等。鹽酸、氫溴酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、馬來酸、苯磺酸和琥珀酸中的至少一種。
[0107]
第二方面，本發(fā)明提供了上述靶向促進(jìn)tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合體、或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其前藥、或其溶劑合物、或其同位素化合物在制備用于和/或預(yù)防與tau蛋白有關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用；
[0108]
優(yōu)選地，所述與tau蛋白有關(guān)的疾病為阿爾茨海默病、連鎖于17號(hào)染體伴帕金森病的額顳葉癡呆、皮克病、進(jìn)行性核上麻痹、皮質(zhì)基底節(jié)變性、原發(fā)性年齡相關(guān)性tau病、嗜銀顆粒病、老化相關(guān)tau星形膠質(zhì)細(xì)胞病、慢性創(chuàng)傷性腦病、球形膠質(zhì)細(xì)胞tau病變、帕金森病、亨廷頓病、腦卒中、癲癇、嗅覺障礙、視網(wǎng)膜變性和腫瘤中的至少一種。
[0109]
第三方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，包含有效量的上述靶向促進(jìn)tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合體、或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其前藥、或其溶劑合物、或其同位素化合物，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
[0110]
第四方面，本發(fā)明提供了促進(jìn)有需要的患者體內(nèi)的tau蛋白去磷酸化的方法，該方法包括向患者給藥有效量的上述靶向促進(jìn)tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合體、或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其前藥、或其溶劑合物、或其同位素化合物；
[0111]
優(yōu)選地，所述給藥方式選自口服、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、鼻服、吸入、局部、皮下、經(jīng)皮、腹腔、硬膜外、鞘內(nèi)途徑中的至少一種。
[0112]
本發(fā)明提供通過化學(xué)合成靶向促進(jìn)tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合體。使用本發(fā)明的小分子嵌合體處理穩(wěn)定或瞬時(shí)過表達(dá)人類tau蛋白的hek293細(xì)胞，可有效降低tau蛋白在pt205、ps262、ps396、ps404等表位的磷酸化水平，從而降低細(xì)胞內(nèi)的tau蛋白病理性聚
集。由此表明，本發(fā)明所述的靶向促進(jìn)tau蛋白去磷酸化的小分子嵌合體可在預(yù)防和包括阿爾茨海默病在內(nèi)的一系列tau疾病中發(fā)揮作用。
[0113]
以下將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。
[0114]
實(shí)施例1
[0115]
該實(shí)施例用于說明式(v)所述小分子嵌合體的制備過程。
[0116]
(一)磷酸酯酶募集體的合成
[0117]
1、中間體2的合成：
[0118][0119]
向茄形瓶中加入2-氯吩噻嗪(233.7mg，1mmol)，隨后加入5ml四氫呋喃將其溶解，冰浴條件下加入200mg nah(5mmol)，繼續(xù)攪拌30分鐘，緩慢滴加1-溴-3-氯丙烷(787.2mg，5mmol)，升溫至65℃反應(yīng)5小時(shí)。除去四氫呋喃，加入20ml乙酸乙酯溶解，用飽和食鹽水洗滌有機(jī)層3次，收集有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，經(jīng)硅膠柱譜層析純化獲得無油狀物，產(chǎn)率80％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.15(ddd,j＝14.6,7.5,1.5hz,2h),7.02(d,j＝8.1hz,1h),6.94(td,j＝7.5,1.1hz,1h),6.91
–
6.83(m,3h),4.02(t,j＝6.5hz,2h),3.64(t,j＝6.1hz,2h),2.20(p,j＝6.3hz,2h)。
[0120]
2、中間體3的合成：
[0121][0122]
將中間體2(70mg，0.226mmol)用2ml乙腈溶解，依次加入n-boc-哌嗪(63.2mg，0.339mmol)和三乙胺(100μl，0.678mmol)，置于80℃反應(yīng)4小時(shí)。除去乙腈，加入10ml乙酸乙酯溶解，用飽和食鹽水洗滌有機(jī)層3次，收集有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，經(jīng)硅膠柱譜層析純化獲得無油狀物，產(chǎn)率86％。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ7.08
–
7.00(m,2h),6.90(d,j＝8.0hz,1h),6.83(td,j＝7.5,1.1hz,1h),6.78(td,j＝8.2,1.5hz,2h),6.75(d,j＝2.1hz,1h),3.81(t,j＝6.7hz,2h),3.29(t,j＝5.0hz,4h),2.36(t,j＝6.9hz,2h),2.25(t,j＝5.1hz,4h),1.82(p,j＝6.9hz,2h),1.37(s,9h)。
[0123]
3、中間體4(磷酸酯酶募集體)的合成：
[0124][0125]
取適量中間體3，冰浴條件下加入過量的氯化氫乙酸乙酯溶液，攪拌30分鐘，除去過量氯化氫乙酸乙酯即得中間體4，為粉至紫固體。
[0126]
(二)連接體的合成
[0127]
4、中間體6(連接體)的合成：
[0128][0129]
取中間體5(癸二酸，100mg，0.49mmol)，用3ml二氯甲烷溶解，冰浴條件下，依次加入edci(103.3mg，0.54mmol)、dmap(0.6mg，0.005mmol)和19.8μl甲醇，反應(yīng)2小時(shí)。加入10ml二氯甲烷，用水洗滌3次，經(jīng)硅膠柱譜層析純化獲得無油狀物，產(chǎn)率30％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ11.96(s,1h),3.57(s,3h),2.27(t,j＝7.4hz,2h),2.17(t,j＝7.4hz,2h),1.56
–
1.43(m,4h),1.24(s,8h)。
[0130]
(三)tau蛋白配體和連接體偶聯(lián)產(chǎn)物的合成
[0131]
5、中間體8的合成：
[0132][0133]
將100mg 3-溴異喹啉(0.48mmol)用2ml濃硫酸溶解，冰浴條件下，緩慢加入58mg硝酸鉀(0.58mmol)，反應(yīng)30分鐘后轉(zhuǎn)移至室溫繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)。向反應(yīng)體系中，緩慢加入冰水，有淡黃固體產(chǎn)物析出，抽濾，水系濾餅3次，收集濾餅置于烘箱干燥，產(chǎn)率90％。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.47(s,1h),8.75(dd,j＝7.7,1.2hz,1h),8.66(dd,j＝8.2,1.3hz,1h),8.46(s,1h),7.93(t,j＝8.0hz,1h)。
[0134]
6、中間體9的合成：
[0135][0136]
100mg中間體8(0.4mmol)用10ml冰醋酸溶解，劇烈攪拌下，加入還原鐵粉119mg(2mmol)，反應(yīng)完畢，抽濾除去還原鐵粉，濾液加水稀釋，用乙酸乙酯萃取3次，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌3次，經(jīng)硅膠柱譜層析純化獲得土黃固體，產(chǎn)率76％。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.00(s,1h),8.15(s,1h),7.39(t,j＝7.8hz,1h),7.28(d,j＝8.1hz,1h),6.90(dd,j＝7.6,1.1hz,1h),6.09(s,2h)。
[0137]
7、中間體10-a的合成：
[0138][0139]
取中間體6(80.5mg，0.37mmol)于3ml dmf中溶解，冰浴下依次加入hatu(176.7mg，0.47mmol)、dipea(81μl，0.47mmol)和中間體9(70mg，0.31mmol)，轉(zhuǎn)為室溫繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)。向反應(yīng)體系中加入10ml水，用乙酸乙酯萃取3次，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌3次，收集有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，經(jīng)硅膠柱譜層析純化獲得白固體，產(chǎn)率63％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.03(s,1h),8.10(d,j＝7.5hz,1h),7.78(d,j＝8.3hz,1h),7.68(s,2h),7.57(t,j＝7.9hz,1h),3.66(s,3h),2.52(t,j＝7.6hz,2h),2.31(t,j＝7.5hz,2h),1.79(q,j＝7.6hz,2h),1.67
–
1.61(m,2h),1.45
–
1.29(m,8h)。
[0140]
8、中間體11-a的合成：
[0141][0142]
向茄形瓶中依次加入中間體10-a(36mg，0.086mmol)、6-氮雜吲哚(12mg，0.103mmol)、cu2o(0.24mg，0.002mmol)、bfmo(0.42mg，0.002mmol)和k3po4(36mg，0.172mmol)，氮?dú)庵脫Q后，向體系中加入2ml無水dmso，置于120℃反應(yīng)過夜。降溫，向反應(yīng)體系中加入乙酸乙酯，飽和食鹽水洗滌3次，收集有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，經(jīng)硅膠柱譜層析純化得到土黃固體，產(chǎn)率20％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ10.03(s,1h),9.44(s,1h),8.36(d,j＝3.3hz,1h),8.22(s,1h),8.09(d,j＝7.5hz,1h),8.03(d,j＝8.2hz,1h),7.80(s,1h),7.67(t,j＝7.8hz,1h),6.91(d,j＝3.3hz,1h),3.56(s,3h),2.54(t,j＝7.4hz,2h),2.25(t,j＝7.4hz,2h),1.69(p,j＝7.4hz,2h),1.47(p,j＝6.8,6.4hz,2h),1.37(p,j＝7.2hz,2h),1.33
–
1.27(m,2h),1.25
–
1.20(m,4h)。
[0143]
9、中間體12-a的合成：
[0144][0145]
取適量中間體11-a，用甲醇溶解，配置2m氫氧化鈉的水溶液，向反應(yīng)體系中加入2當(dāng)量的氫氧化鈉水溶液，室溫反應(yīng)3小時(shí)，除去甲醇，加水?dāng)U大體積，用2m hcl水溶液調(diào)節(jié)ph為2-3，用乙酸乙酯萃取3次，無水硫酸鈉干燥即得白固體產(chǎn)品。產(chǎn)率95％。
[0146]
10、終產(chǎn)品tp1(式v化合物)的合成：
[0147][0148]
將5mg中間體12-a(0.0112mmol)用2ml二氯甲烷溶解，冰浴條件下，依次加入edci(4.3mg，0.022mmol)、hobt(3.0mg，0.022mmol)、dipea(78μl，0.045mmol)和中間體4(5.3mg，0.013mmol)，攪拌30分鐘，轉(zhuǎn)室溫繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)。向反應(yīng)體系中加入10ml二氯甲烷，用水洗滌3次，收集有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，經(jīng)硅膠柱譜層析純化得到土黃固體，產(chǎn)率67％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ10.04(s,1h),9.68(s,1h),9.43(s,1h),8.34
–
8.27(m,2h),8.23(s,1h),8.09(d,j＝7.5hz,1h),8.02(d,j＝8.2hz,1h),7.70(d,j＝5.3hz,1h),7.66(t,j＝7.8hz,1h),7.21(ddd,j＝8.5,7.4,1.6hz,1h),7.17
–
7.11(m,2h),7.06(dd,j＝8.6,1.5hz,2h),7.00
–
6.93(m,2h),6.91(d,j＝3.3hz,1h),3.93(t,j＝6.7hz,2h),3.36(s,2h),2.54(t,j＝7.4hz,2h),2.43
–
2.37(m,2h),2.28(d,j＝22.5hz,4h),2.20(t,j＝7.5hz,2h),1.78(p,j＝6.9hz,2h),1.69(p,j＝7.4hz,2h),1.45
–
1.34(m,4h),1.30(h,j＝6.6hz,2h),1.22(d,j＝6.0hz,6h).
13
c nmr(151mhz,dmso-d6)δ172.60,170.94,153.15,146.92,146.69,144.40,140.21,136.41,135.08,133.58,132.90,132.10,130.88,128.51,128.26,127.65,127.61,127.20,125.81,124.92,123.67,123.44,122.96,122.52,116.76,116.20,105.27,104.74,54.88,53.51,53.02,45.21,44.90,41.25,40.53,36.55,32.61,29.22,29.20,29.17,29.15,25.69,25.22,23.83,21.53.hrms(esi
+
):m/z calculated for c
45h48
cln7o2s[m+h]
+
,786.3371；found,786.3351。
[0149]
實(shí)施例2
[0150]
該實(shí)施例用于說明式(vi)所述小分子嵌合體的制備過程。
[0151]
(一)磷酸酯酶募集體的合成
[0152]
參見實(shí)施例1，中間體2的合成、中間體3的合成、中間體4(磷酸酯酶募集體)的合成。
[0153]
(二)tau蛋白配體和連接體偶聯(lián)產(chǎn)物的合成
[0154]
1、中間體10-b的合成：
[0155][0156]
合成過程參見實(shí)施例1中間體10-a的合成，10-b為土黃固體，產(chǎn)率90％。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ9.87(s,1h),9.13(d,j＝0.8hz,1h),8.07(d,j＝0.9hz,1h),7.95(ddd,j＝7.7,3.7,1.1hz,2h),7.66(t,j＝7.9hz,1h),4.20(s,2h),3.83(s,2h),3.71
–
3.67(m,2h),3.62
–
3.58(m,2h),3.56
–
3.48(m,4h),1.32(s,9h)。
[0157]
2、中間體11-b的合成：
[0158][0159]
合成過程參見實(shí)施例1中間體11-a的合成，11-b為土黃固體，產(chǎn)率22％。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ9.65(s,1h),9.47(s,1h),9.27(d,j＝0.9hz,1h),8.36(d,j＝5.3hz,1h),8.13(dd,j＝7.6,1.0hz,1h),8.11(d,j＝3.4hz,1h),7.99(d,j＝1.0hz,1h),7.91(dt,j＝8.2,1.0hz,1h),7.65
–
7.59(m,2h),6.77(d,j＝3.3hz,1h),4.31(s,2h),3.95
–
3.90(m,2h),3.84
–
3.80(m,2h),3.60
–
3.55(m,2h),3.53(s,2h),3.42
–
3.37(m,2h),1.34(s,9h)。
[0160]
3、中間體12-b的合成：
[0161][0162]
取一定量中間體11-b，用二氯甲烷溶解，冰浴條件下，加入10當(dāng)量的三氟乙酸，室溫繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)完畢，減壓蒸餾除去溶劑，產(chǎn)率96％。
[0163]
4、終產(chǎn)品tp2(式vi化合物)的合成：
[0164][0165]
合成過程參見實(shí)施例1終產(chǎn)品tp1(式v化合物)的合成，tp2為土黃固體，產(chǎn)率52％。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ9.76(s,1h),9.58(s,1h),9.26(s,1h),8.35(s,1h),8.23(d,j＝3.3hz,1h),8.13(d,j＝7.4hz,1h),8.03(s,1h),7.91(d,j＝8.2hz,1h),7.68(d,j＝5.4hz,1h),7.63(t,j＝7.8hz,1h),7.18
–
7.10(m,2h),7.02(d,j＝8.2hz,1h),6.94(td,j＝7.5,1.1hz,1h),6.88(td,j＝8.5,1.6hz,2h),6.83(dd,j＝4.1,2.6hz,2h),4.33(s,2h),3.96
–
3.92(m,2h),3.89(t,j＝6.6hz,2h),3.85
–
3.80(m,2h),3.64(s,2h),3.62
–
3.57(m,2h),3.43
–
3.38(m,2h),3.32(d,j＝6.0hz,2h),3.06(t,j＝5.1hz,2h),2.40(t,j＝6.8hz,2h),2.21(p,j＝5.2hz,4h),1.87(p,j＝6.7hz,2h).
13
c nmr(151mhz,cdcl3)δ169.88,169.43,150.14,149.16,146.22,143.71,140.75,136.17,135.55,134.05,132.62,132.22,129.35,128.27,127.78,127.70,127.62,127.47,126.15,123.96,123.32,123.30,123.13,123.11,119.37,117.00,116.51,116.42,108.36,108.26,70.35,70.30,70.06,69.59,69.58,69.38,53.66,52.86,49.51,45.69,24.70.hrms(esi
+
):m/z calculated for c
43h44
cln7o5s[m+h]
+
,806.2886；found,806.2872。
[0166]
實(shí)施例3
[0167]
該實(shí)施例用于說明式(iv)所示的小分子嵌合體(sdeptac)的去磷酸化作用。
[0168]
試劑來源：人類tau-gfp質(zhì)粒(htau-gfp)委托和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司構(gòu)建，可轉(zhuǎn)染不表達(dá)人源性tau蛋白的細(xì)胞以使其表達(dá)人源性tau蛋白，該質(zhì)粒可以在細(xì)胞
內(nèi)表達(dá)人源性tau蛋白，人源性tau蛋白在表達(dá)后磷酸化水平高，能用pt205、ps262、ps396、ps404抗體檢測(cè)到；
[0169]
hek293細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫(武漢大學(xué))，貨號(hào)gdc0187；
[0170]
大鼠原代神經(jīng)元來源于原代培養(yǎng)的胚胎期約15天sd胎鼠海馬和皮層神經(jīng)元，本身有內(nèi)源性鼠tau的表達(dá)，可用pt205、ps262、ps396、ps404等抗體檢測(cè)其基礎(chǔ)磷酸化水平；
[0171]
其他生化試劑均可從普通生化試劑公司購買。
[0172]
一、
[0173][0174]
高壓滅菌200μl、1ml tip頭各一盒。在hek293細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入1mltrypsin液，消化1分鐘(37℃，5％co2)。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁可觀察到細(xì)胞完全從壁上脫落下來時(shí)，加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。加入培養(yǎng)液吹打細(xì)胞，并轉(zhuǎn)至培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁，細(xì)胞密度約為60％-80％時(shí)轉(zhuǎn)染htau-gfp質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24h后，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)超過60％以上的細(xì)胞表達(dá)gfp時(shí)，在培養(yǎng)基中加入小分子嵌合體sdeptac(0,0.01μm、0.1μm,1μm、10μm、20μm)，并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞6h。用ripa液裂解細(xì)胞并收集細(xì)胞提取液，用tau5(一種tau蛋白抗體，可檢測(cè)人源性tau蛋白和小鼠源性tau蛋白的總體水平)、pt205、ps262、ps396、ps404等抗體(位點(diǎn)特異性磷酸化tau蛋白抗體，可檢測(cè)thr205、ser262、ser396、ser404位點(diǎn)發(fā)生磷酸化的人源性或小鼠源性tau蛋白，去磷酸化后檢測(cè)到的tau磷酸化水平降低)進(jìn)行免疫印跡，定量分析tau磷酸化以及tau總蛋白含量。
[0175]
結(jié)果如圖1所示，在轉(zhuǎn)染有htau-gfp的hek293細(xì)胞中，小分子嵌合體可有效降低tau蛋白在pt205、ps262、ps396、ps404表位的磷酸化水平，且具有劑量依賴性。
[0176]
二、
[0177]
胚胎期12-15天的sd胎鼠，于無菌條件下取腦并于預(yù)冷解剖液(100％dme-f12)中分離去除軟膜、血管等組織，取皮層和海馬組織，漂洗后用眼科剪將皮質(zhì)反復(fù)剪切成碎塊，移入培養(yǎng)皿中，吸除解剖液后加入0.25％胰蛋白酶2ml，37℃培養(yǎng)箱中消化20min，棄去剩余消化液，用接種液(90％dme/f12、10％胎牛血清、105u/l青霉素、0.1g/l鏈霉素溶液)洗3次，每次洗滌后使組織塊充分沉降到試管底，棄去上清液，最后再用接種液(90％dme/f12、10％胎牛血清、105u/l青霉素、0.1g/l鏈霉素溶液)1ml混懸，反復(fù)吹打混懸液中的組織塊至渾濁后，將上清液移入培養(yǎng)瓶待用。加入1ml接種液后再次吹打，如此反復(fù)3-4次，組織塊逐漸消化后，棄去最終殘塊。收集含單細(xì)胞懸液的上清液約4-5ml于培養(yǎng)瓶中，以接種液(90％dme/f12、10％胎牛血清、105u/l青霉素、0.1g/l鏈霉素溶液)重新懸浮細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)。按約1x107個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)4h至細(xì)胞貼壁后，更換全培養(yǎng)液(97％neurobasal、2％b27、1％谷氨酰胺、105u/l青霉素、0.1g/l鏈霉素溶液)培養(yǎng)3天后，之后換用阿糖胞苷培養(yǎng)液(97％neurobasal、2％b27、1％谷氨酰胺、105u/l青霉素、0.1g/l鏈霉素溶液、阿糖胞苷2.5ug/ml)培養(yǎng)3天，以抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及雜細(xì)胞生長(zhǎng)，獲得單純培養(yǎng)的原代神經(jīng)細(xì)胞。最后每隔3天用全培養(yǎng)液1次，每次半換液。
[0178]
在原代神經(jīng)元培養(yǎng)第10天(10div)時(shí)，用完全培養(yǎng)基將小分子嵌合體稀釋為目標(biāo)濃度(0,0.01μm、0.1μm,1μm、10μm、20μm)后繼續(xù)培養(yǎng)原代神經(jīng)元24h。再用ripa液裂解細(xì)胞并收集細(xì)胞提取液，再用tau5(一種tau蛋白抗體，可檢測(cè)人源性tau蛋白和小鼠源性tau蛋白的總體水平)、pt205、ps262、ps396、ps404等抗體(位點(diǎn)特異性磷酸化tau蛋白抗體，可檢
測(cè)thr205、ser262、ser396、ser404位點(diǎn)發(fā)生磷酸化的人源性或小鼠源性tau蛋白，去磷酸化后檢測(cè)到的tau磷酸化水平降低)進(jìn)行western blot，定量分析tau磷酸化以及tau總蛋白含量的變化。
[0179]
結(jié)果如圖2所示，在大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞中，小分子嵌合體可有效降低tau蛋白在pt205、ps262、ps396、ps404表位的磷酸化水平。
[0180]
其中，細(xì)胞提取液的制備方法如下：
[0181]
(1)在顯微鏡下觀察細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和密度；
[0182]
(2)將1
×
pbs和細(xì)胞培養(yǎng)板放在冰上預(yù)冷，按照6孔板每孔加入80μl/6cm培養(yǎng)皿加入150μl配制1
×
緩沖液+pmsf(1:100)+蛋白水解酶混合抑制劑(1:1000)混合液；
[0183]
(3)用1ml加樣貼著細(xì)胞培養(yǎng)板底壁吸出培養(yǎng)基，貼壁加入1ml 1
×
pbs，根據(jù)細(xì)胞密度輕柔沖洗1-3遍，用1ml和200μl加樣貼著細(xì)胞培養(yǎng)板底壁吸出pbs，加入混合液后用超純水清洗細(xì)胞刮子，用細(xì)胞刮子稍用力刮孔板底部，吸出細(xì)胞懸液至1.5ml ep管中，不同樣品間需清洗細(xì)胞刮子；
[0184]
(4)煮沸10min(先以最高溫度煮沸再以150℃維持沸騰，打開抗氧表位)；
[0185]
(5)離心后20khz超聲20次(為了打開dna鏈，超聲機(jī)按i打開o關(guān)閉，每超完一個(gè)樣品后先在雙蒸水中超三次再用衛(wèi)生紙擦干，超聲頭不能接觸氣泡和ep管底部)；
[0186]
(6)振蕩混勻置于-20℃冰箱。
[0187]
免疫印跡法定量分析tau蛋白含量的過程：
[0188]
1、搭架子(兩種玻璃板，三個(gè)瓶子，五個(gè)試劑，濾紙，衛(wèi)生紙，垃圾桶，，頭，梳齒)
[0189]
(1)擦凈桌面和底架，洗凈梳齒、玻璃板、蒸餾水瓶和上、下部膠瓶，并烘干上、下部膠瓶，拿出配制電泳膠的試劑恢復(fù)至室溫；
[0190]
(2)將較高的玻璃板朝內(nèi)疊在一起，按住上部使下部緊貼桌面使其平齊，將夾子向外翻夾緊，放在底架上用夾子扣住。
[0191]
(3)注入雙蒸水檢驗(yàn)是否漏液，若漏液則重裝后再檢漏。
[0192]
2、制備電泳膠(見表1，天冷時(shí)ap和temed可加1.5倍)
[0193]
表1
[0194][0195]
(1)依次加入20％arc/bis，tris緩沖液，temed和10％ap，用移液器吹打混勻，整個(gè)過程防止混合液中混有氣泡；
[0196]
(2)沿兩個(gè)角分別將分離膠緩緩注入到膠膜內(nèi)(吸取時(shí)深入液面下輕柔吹打混勻，每次頭留少量液體以防產(chǎn)生氣泡)，每塊膠用量為3
×
900μl，觀察膠不漏后沿兩個(gè)角分別
用雙蒸水將膠膜的空隙處填滿(防止氧氣抑制聚合并保持下部膠水平，可多放一段時(shí)間)；
[0197]
(3)等待凝膠30min左右待分離膠凝固后傾去雙蒸水，并用濾紙將剩余水吸盡，并用記號(hào)筆標(biāo)出下部膠的上沿；
[0198]
(4)沿兩個(gè)角分別將濃縮膠緩緩注入到膠膜內(nèi)，斜著從左往右插入所需規(guī)格梳齒(上樣量＜20μl用小梳齒，上樣量＞20μl用大梳齒)，在泳道間補(bǔ)膠避免縮膠，等待凝膠50min。
[0199]
3、樣品的處理
[0200]
在細(xì)胞提取液中加入現(xiàn)配的溴酚藍(lán)和β-巰基乙醇(還原劑)，溴酚藍(lán)：β-巰基乙醇＝1:3，混合液：樣品＝1：10，100℃沸水浴10min，在振蕩器上振蕩20秒鐘后分裝，若結(jié)果不佳每次上樣前將樣品100℃沸水浴10min。
[0201]
4、上樣和蛋白的電泳分離(上樣針，樣品，排插，marker，電泳液，電泳槽，蒸餾水瓶)
[0202]
清洗電泳架下面的導(dǎo)電絲，將轉(zhuǎn)移到電泳架上，用記號(hào)筆標(biāo)出泳道及編號(hào)，緩慢垂直拔出梳齒，用電泳液加滿凝膠槽，用微量加樣器取樣品加入各個(gè)泳道(marker加1μl于第1和8泳道，加入溴酚藍(lán)和1
×
buffer混合液加于第15泳道平衡)。上完樣后將電泳架轉(zhuǎn)移至電泳槽，加電泳液后蓋上蓋子使紅對(duì)紅，黑對(duì)黑，加樣后先用恒流10ma/塊膠電泳約30min(按兩次啟動(dòng))，待溴酚藍(lán)指示劑電泳至濃縮膠與分離膠交界處成以線狀時(shí)，改為恒壓100v(若無法恒壓可調(diào)高電流)電泳約60min至溴酚藍(lán)到凝膠底部且marker完全跑開。
[0203]
5、轉(zhuǎn)膜(標(biāo)記nc膜，轉(zhuǎn)膜液，濾紙，冰盒，盆子，盤子，轉(zhuǎn)膜槽，塑料板，清洗鑷子)
[0204]
(1)將nc膜用記號(hào)筆標(biāo)記后浸于回收的轉(zhuǎn)膜液10min-20min(有利于蛋白質(zhì)的固定，能平衡凝膠且去除sds)，按住兩旁的卡口取下凝膠槽，用小板撬起玻璃板和白瓷板右側(cè)中間部分，期間保持剩余膠的電泳。
[0205]
(2)依欲顯分子量范圍用玻璃板垂直略傾斜并輕微地左右來回一次切膠，用鑷子將浸過轉(zhuǎn)膜液的三層濾紙貼在膠上，用小板小心地將膠撬起放在的海綿上(濾紙朝下)，另一面貼上倒置的nc膜，將膠和nc膜浸沒至轉(zhuǎn)膜液中(膠在上)用玻璃棒趕氣泡，用鑷子夾起小心放在手上(膠在上)，用鑷子將浸過轉(zhuǎn)膜液的三層濾紙貼在膠上，倒置放在海綿上，再貼上三層濾紙。由下至上放置黑塑料板
→
一層海綿
→
三層濾紙
→
膠
→
nc膜
→
三層濾紙
→
一層海綿
→
透明塑料板，若不緊可用橡皮筋固定。
[0206]
(3)紅對(duì)紅，白對(duì)黑，將轉(zhuǎn)膜槽放入冰浴中(通電前不要將膠長(zhǎng)時(shí)間泡在轉(zhuǎn)膜液中，以免蛋白質(zhì)擴(kuò)散分解)，轉(zhuǎn)移電流為恒流276ma，電壓一般在140v(可以適當(dāng)補(bǔ)充甲醇提高電壓)，具體轉(zhuǎn)移時(shí)間根據(jù)所需要轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)的分子量的大小決定，轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)的分子量＜100kda時(shí)時(shí)間為1h，＞100kda時(shí)時(shí)間為1.5h。
[0207]
6、免疫印跡顯(清洗鑷子，裝有雙蒸水的盒子，牛奶，保鮮袋，衛(wèi)生紙，一抗，冰盒，平板，透明膠，tbst，黑塑料袋，二抗)
[0208]
(1)封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后小心地將nc膜用含5％脫脂奶粉的tbs封閉液于室溫振蕩封閉1h或4℃過夜，回收未與膠接觸的濾紙。
[0209]
(2)一抗孵育：取出nc膜，用1
×
tbs漂去膜表面殘留的奶漬，用鑷子夾著nc膜豎在衛(wèi)生紙上除去多余的水，將nc膜marker一側(cè)朝外置于保鮮袋中用衛(wèi)生紙排水排氣。加入一抗(可加入0.1％的吐溫20降低背景)封口貼在平板上(有marker和蛋白的一面朝上)，透明
膠帶不要壓在目標(biāo)條帶上，于4℃孵育過夜。
[0210]
(3)二抗孵育：次日從孵育袋中取出nc膜并回收一抗，用tbst緩沖液漂洗3
×
5min，用1
×
tbs漂去膜表面殘留的鹽離子，用鑷子夾著nc膜豎在衛(wèi)生紙上除去多余的水，將nc膜置于保鮮袋中用衛(wèi)生紙排水排氣。避光加入熒光素標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠的odyssey二抗(可加入0.1％的吐溫20降低背景)，封口貼在平板上(有marker和蛋白的一面朝上)，透明膠帶不要壓在目標(biāo)條帶上，于室溫慢搖孵育1h(超過1h可能會(huì)增加背景，天冷可延長(zhǎng)至2h)后，從孵育袋中取出nc膜并回收二抗，用tbst緩沖液漂洗3
×
5min。漂洗完畢后，用1
×
tbs漂洗去掉膜表面殘留的鹽離子。
[0211]
(4)顯：先用蘸有無水乙醇的擦鏡紙將玻璃板擦干凈。將marker側(cè)朝下，按分子量從小到大在掃描儀由上至下方向放置，覆蓋塑料薄膜并排氣。打開odyssey軟件，點(diǎn)擊file
→
new
→
browse
→
輸入日期，點(diǎn)擊obtain image選擇掃膜長(zhǎng)、寬，掃描成像并保存原圖，點(diǎn)擊alter image調(diào)整圖像，用文本框標(biāo)記樣品和抗體類型，點(diǎn)擊export image file
→
save，收好膜后再用衛(wèi)生紙將玻璃板擦干凈。
[0212]
三、
[0213]
采用4月齡雄性p301l小鼠(平均體重約30mg)，用立體定位注射法向側(cè)腦室一次性注射sdeptac(濃度400μm，注射體積2.5μl)，對(duì)照組注射等體積溶媒(pbs)。分別在注射后24h和48h處死小鼠，分離小鼠的海馬組織。
[0214]
將海馬組織置于勻漿液中(50mm tris
·
hcl ph 7.4-7.5,100mm nacl,1％(vol/vol)triton x-100,5mm edta,1:100pmsf,1:1,000protease inhibitor cocktail containing 4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluride hydrochloride,aprotinin,bestatin,leupeptin,e-64,and pepstatin a stored at 4℃)進(jìn)行勻漿，接著在冰上繼續(xù)裂解30min，隨后以12000g轉(zhuǎn)速4℃離心15min，收集上清。然后根據(jù)上清的體積加入終體積1/4的4xbuffer(tris-hcl 200mm ph 6.8,sds 8％,glycerol 40％)，隨后沸水浴10min，冷卻后稍離心，然后在冰上進(jìn)行超聲。超聲后繼續(xù)在12000g轉(zhuǎn)速下4℃離心15min，收集上清，使用bca試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，然后將蛋白濃度調(diào)至5μg/μl進(jìn)行后續(xù)的western blot分析。
[0215]
western blot步驟如下：
[0216]
1.將以上獲得的樣品加入1/10體積的一溴三巰(1體積溴酚藍(lán)：3體積250mmβ-巰基乙醇)，沸水浴10min，冷熱后振蕩混勻，然后稍離心，用于后續(xù)上樣；
[0217]
2.上樣后在10％的聚丙烯酰胺梯度凝膠中電泳；
[0218]
3.電泳完畢后將蛋白轉(zhuǎn)膜電泳至0.45um的硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間視蛋白分子量而定，時(shí)間為60-90min；
[0219]
4.轉(zhuǎn)膜完畢后，使用5％脫脂奶粉(pbs配置)室溫封閉60min；
[0220]
5.tbst洗去殘余脫脂牛奶，使用3％bsa配置一抗，4℃孵育過夜；
[0221]
6.tbst洗滌3次，8min/次；
[0222]
7.使用一抗對(duì)應(yīng)的二抗進(jìn)行孵育，室溫孵育60min；
[0223]
8.tbst洗滌3次，8min/次；
[0224]
9.odyssey顯；
[0225]
10.用image j對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。
[0226]
制備sdeptac可以有效降低4月齡p301l小鼠海馬組織中tau的磷酸化水平
[0227]
結(jié)果如圖3所示，在4月齡p301l側(cè)腦室一次性注射400μm/2.5μl小分子嵌合體后，24h時(shí)可見tau蛋白在pt205、ps262、ps396表位的磷酸化水平有下降趨勢(shì)；48h時(shí)可見tau蛋白在pt205、ps262、ps396、ps404表位的磷酸化水平顯著降低，同時(shí)伴有總tau蛋白(tau5表位)和人類特異性tau蛋白(ht7表位)水平的顯著降低(圖3)。
[0228]
采用相同的方法進(jìn)行檢測(cè)分析，式(vi)所示的小分子嵌合體(sdeptac)也具有去磷酸化作用，因此不再贅述。
[0229]
以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于此。在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，包括各個(gè)技術(shù)特征以任何其它的合適方式進(jìn)行組合，這些簡(jiǎn)單變型和組合同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
