一種采用電刺激對華南虎的采精方法
1.本發明涉及華南虎人工采精領域，具體為一種采用電刺激對華南虎的采精方法。
背景技術：
2.華南虎是我國特有的虎種，過去主要生活在華南、華東、華中三個地區，屬我國一級保護動物，被國際自然保護組織列為世界十大瀕危物種之一。
3.華南虎無固定的繁殖季節，孕期在103天，幼虎會跟隨母虎2年左右，此時母虎一般不會發情，2-3年后幼虎開始獨立生活，3-5年后性成熟，華南虎的壽命在自然環境中可達10-20年。
4.60多年前，中國還存在超過4000只華南虎。但是由于上世紀五十年代虎患嚴重，危害人和動物的生命，政府頒布了懸賞令，重金懸賞打虎，還成立了剿虎聯合指揮部，全國各地掀起了一股打虎的熱潮。1994年最后一只野生華南虎被射殺，之后再沒有確鑿證據證明華南虎野生種的存在。因此很多專家都認為，華南虎的自然種已經滅絕。現有的189頭華南虎都是動物園圈養的，分布于杭州野生動物世界，上海動物園，洛陽王城動物園等國內幾個有限的動物園內。其中洛陽王城動物園飼養量最多，達到30多頭。現今華南虎飼養種的來源是40多年前的6只野生華南虎(4只雌體和2只雄體)，近親繁殖嚴重。
5.物種的繁衍需要自然種的存在，自然種還必須維持一定的個體數目、保持基因達到足夠的雜合水平，種才不會因為近親繁殖而發生近交衰退。華南虎屬于珍稀保護動物，種擴繁是保護該物種的關鍵。但是近親繁殖導致華南虎后代基因雜合水平低下，雌虎發情不明顯或雌、雄虎發情不同步，交配不能有效發生；即使雌虎僥幸懷孕，也經常出現早期流產，或產下死胎、弱胎等現象，導致雄虎精子嚴重浪費。因此，加強華南虎繁育，增加華南虎產子量和成活率，對于保護華南虎種的延續，顯得十分迫切。為了促進華南虎的繁殖工作，我們擬開展華南虎的人工繁育，但要進行人工繁育，首先必須獲得華南虎精液。要獲得精液，對華南虎不能使用針對家畜的經陰道常規采精方法，必須首先對華南虎施行麻醉，再采用電刺激法采精。
技術實現要素：
6.本發明的目的在于提供一種采用電刺激對華南虎的采精方法，以解決上述背景技術中提出的問題。
7.為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種采用電刺激對華南虎的采精方法，包括以下步驟：
8.打開電刺激采精儀開關，調節其輸出電壓，從3v開始，通電5s，再間隔5s依次提升電壓；
9.控制電壓達到4-8v，直至虎射精。
10.優選的，在采精之前，還包括如下步驟：s1.將華南虎禁食一天，并對其進行麻醉；
11.s2.在7-8l溫水中加入半瓶(250ml)輕質液體石蠟后，對虎進行灌腸，使糞便排出，
再用生理鹽水清洗肛門四周；
12.s3.對華南虎進行尾靜脈采血，再剪去陰莖包皮周圍的被毛，再用生理鹽水進行清洗，準備采精；
13.s4.將涂抹了石蠟油的電刺激棒從肛門緩慢插入直腸，電極棒的金屬部位要貼緊直腸壁。
14.優選的，所述電刺激儀輸出電壓優選為4-6v。
15.優選的，所述電極棒的電極朝向虎的背側，電極棒深度為30cm。
16.優選的，所述電極棒直徑為5cm。
17.麻醉包括如下步驟：
18.s1.將作為實驗對象的虎事先禁食一天；
19.s2.先使用遠距離注射器對華南虎遠距離肌肉注射阿托品1-2ml；
20.s3.間隔10-25min后，用同樣的方法對其肌肉注射來誘導麻醉；
21.s4.直到其自行臥倒，無掙扎現象后，將華南虎抬上采精臺，將其側臥保定；
22.s5.打開呼吸麻醉機，將吸入麻醉濃度調節至4％-5％，通過異氟烷對其進行維持麻醉，用毛巾遮住虎的眼睛，同時包裹住虎的上下頜，再為虎套上麻醉面罩。
23.優選的，在注射15-20min前注射阿托品。
24.優選的，所述注射劑量為10mg/kg，可根據動物麻醉后的反應情況適當追加藥物。
25.與現有技術相比，本發明的有益效果是：
26.在電壓為4-6v時，更容易使虎射精，當電極棒的電極朝向虎的背側，電極棒深度在大約30cm時，虎對電刺激更加敏感，更容易射精。
27.使用的電極棒加粗至直徑5cm后，很容易就能采出精液。年輕的虎比年長的虎對電刺激反應更敏感，能更容易采到精液。
具體實施方式
28.下面將結合本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
29.實施對象：圈養于杭州野生動物世界的三只雄性華南虎。將其分別編號為一號、二號和三號。
30.表1華南虎信息
[0031][0032][0033]
實驗藥品：硫酸阿托品注射液，由三明三藥獸藥有限公司生產，規格：0.5mg/ml，2ml/支。鹽酸注射液，由沈陽市獸藥廠生產，規格：0.15g/ml，2ml/支。異氟烷，由河北
一品制藥有限公司生產，規格：100ml/瓶，和呼吸麻醉機配合使用。輕質液體石蠟，由衡水武羅藥業有限公司生產，規格：500ml
±
10％/瓶。
[0034]
實驗器材：美國matrx動物麻醉呼吸機，麻醉機型號：vme2，呼吸機型號：model3000。動物電刺激采精儀，由成都華智開物科技有限公司生產，型號：mdw1型。希森美康sysmex poch-100iv diff全自動動物血液分析儀。idexx catalyst one全自動生化分析儀。
[0035]
將作為實驗對象的虎事先禁食一天。先使用遠距離注射器對華南虎遠距離肌肉注射阿托品1-2ml，阿托品屬于抗膽堿藥，可用于麻醉前給藥，阿托品能減少因麻醉藥引起的支氣管分泌增加，減少迷走神經對心臟的影響，減輕胃腸蠕動與分泌，松弛平滑肌，改善呼吸功能。間隔10-25min后，用同樣的方法對其肌肉注射來誘導麻醉，一般注射劑量為10mg/kg，可根據動物麻醉后的反應情況適當追加藥物。直到其自行臥倒，無掙扎現象后，將華南虎抬上采精臺，將其側臥保定。打開呼吸麻醉機，將吸入麻醉濃度調節至4％-5％，通過異氟烷對其進行維持麻醉，用毛巾遮住虎的眼睛，同時包裹住虎的上下頜，再為虎套上麻醉面罩，這樣通過毛巾也可以增強面罩的密閉性。
[0036]
在7-8l溫水中加入約半瓶(250ml)輕質液體石蠟后，對虎進行灌腸，使糞便排出，以免糞便影響電刺激效果，再用生理鹽水清洗肛門四周。之后進行尾靜脈采血，再剪去陰莖包皮周圍的被毛，再用生理鹽水進行清洗，準備采精。
[0037]
將涂抹了石蠟油的電刺激棒從肛門緩慢插入直腸，電極棒的金屬部位要貼緊直腸壁。打開電刺激采精儀開關，調節其輸出電壓，先從3v開始，通電5s，間隔5s，根據虎的反應調節增減輸出電壓，精液收集人員手持離心管，管口向上略傾斜包住虎生殖器前端，時刻注意虎的生殖器反應。當電壓達到4-5v，通電5s，間隔5s時，虎便有射精反應，此時用離心管收集精液。采精結束后，摘除麻醉面罩，關閉呼吸麻醉機，解除保定，將虎重新小心放回飼養籠里，并將收集到的精液迅速放入35℃恒溫水浴鍋中保存，以便之后進行精液品質檢測。
[0038]
通過對三只華南虎進行麻醉后采精得到了以下結果(其中一號華南虎一共采精三次，每次間隔2天，二號和三號華南虎各采精一次)：
[0039]
華南虎血常規及血液生化檢測結果與分析：
[0040]
表2華南虎血常規檢測結果
[0041][0042][0043]
血常規檢測結果(見表2)顯示：二號和三號華南虎的plt值(血小板總數)稍微低于參考范圍，一號華南虎的plt值也接近參考范圍下限，plt值降低提示可能存在感染、出血、脾臟腫大、骨髓發育不良等疾病，根據韓志強等對圈養東北虎的血液生理參數檢測結果顯示，雄性虎plt值的范圍為163-420，平均值
±
標準差為227.77
±
79.62。由于華南虎的plt值要略低于東北虎，因此，上表中所檢測的三只華南虎的plt值基本處于正常范圍。同時上表中顯示，三只虎的lym值及lym％低于參考范圍，lym值偏低提示可能存在炎癥、淋巴組織受到破壞、類固醇性原因等疾病。由于，雄性華南虎lym％范圍為6-40，平均值
±
標準差為15.33
±
8.73，因此上表中所檢測的三只虎基本處于正常范圍。同時上表中還顯示三只虎eo值高于參考范圍，eo值偏高提示可能存在過敏、寄生蟲、肉芽腫性炎癥、腫瘤等疾病，根據現有資料測定結果顯示，所測東北虎eo值范圍為0.192-0.408，平均值為0.296，有研究表明華南虎的eo值略高于東北虎，因此上表中所檢測的三只華南虎eo值基本處于正常范圍。上表中有幾個數值輕微超出參考范圍，可能是因為虎受到驚嚇或者刺激出現的輕微波動。
[0044]
表3華南虎血液生化檢測結果
[0045][0046][0047]
血液生化檢測結果(見表3)顯示：
[0048]
一號華南虎在三次血液生化檢測中alkp值略微低于參考值，二號和三號也處于參考值下限，由于alkp值在升高時才提示可能存在疾病，故該指標偏低無意義。三只虎的amyl值顯著高于參考范圍，amyl值的升高指示可能存在胰腺疾病，根據對東北虎和孟加拉白虎的血液生化指標的研究顯示雄性東北虎的amyl值的平均值
±
標準差為619.4
±
42.78，雄性孟加拉白虎的amyl值的平均值
±
標準差為675.0
±
43.84，與上表中的結果仍有較大差異，由于三只虎的精神狀況、食欲、糞便等均正常，所以是否是由于麻醉的影響或者是儀器，血液保存，虎受到驚嚇等原因導致的還需要進一步研究。三只虎的crea值也高于參考范圍，crea值升高可能指示存在腎病或尿道阻塞，根據凌銘德等對華南虎的血液及生化某些指標的測定結果顯示，所測的雄性華南虎crea范圍為125.53-271.25，平均值
±
標準差為194.05
±
40.27，仍略低于上表中的所測結果，可能是由于麻醉的影響或者虎受到驚嚇或血液的保存等原因引起的。
[0049]
異氟烷配合對華南虎的麻醉情況及結果分析：
[0050]
表4華南虎麻醉情況
[0051][0052]
從上表中數據可以得知，一般使用10ml左右就可對虎進行誘導麻醉，年輕虎可能對該麻醉藥物敏感性較差，所以在過程中追加了一些劑量。一號虎在第二次麻醉時，肌肉注射初始劑量8ml后，又在28min后再次追加2ml，因此一號虎第二次的誘導麻醉時間要長于另外兩次。二號虎在肌肉注射初始劑量10ml后，又分別在初次注射30min后追加一次，初次注射52min后再次追加，共追加兩次，每次使用劑量2ml，因此二號虎的誘導麻醉時間較長。從表中也可看出使用配合異氟烷麻醉不僅可以減少用量，還能延長麻醉時間，配合呼吸麻醉機可以使麻醉時間安全可控。
[0053]
整個麻醉過程中，在肌肉注射麻醉藥物后，虎能自行臥倒，無抽搐及嘔吐，無明顯掙扎現象，對其進行搬運及保定時沒有反應，接上呼吸麻醉機后，眼瞼反射消失，肌肉松弛，刺激耳鼻無反應，對灌腸及血液采集也均無反應，舌拉出不能回縮，呼吸平穩通暢，心率在每分鐘125-149之間，達到外科麻醉水平。檢測虎的血常規和生化指標后，也發現無較大異常，并且在進行電刺激采精時，虎對電刺激反應較為敏感，能感受到不同強度和頻率的電刺激，并能在電刺激時出現肌肉收縮，發生射精反應。上午麻醉結束后，三只虎在下午均蘇醒，能抬頭，晚上已經能站立，第二天能正常行走，蘇醒過程均平穩順利，且之后無其他并發癥及不良反應出現，故該麻醉方法有良好的麻醉效果。
[0054]
華南虎電刺激采精方法及結果：
[0055]
表5一號華南虎采精情況
[0056][0057]
一號華南虎第一次采精情況見上表所示，第一次共采出約0.5ml精液，但均未發現精子。間隔2天后對其進行第二次采精，采了5管精液，總共約有3ml精液，只有第2管有精子，
且存在少量活的精子，其余4管均無精子。第二次采精后間隔2天進行第三次采精，共采出約4ml精液，存在精子，經過計數后發現精子密度為17.0
×
106個/ml。
[0058]
表6二號華南虎采精情況
[0059][0060]
二號華南虎采精情況見上表所示，一共采出約1.5ml精液，發現少量精子但均死亡。
[0061]
表7三號華南虎采精情況
[0062][0063]
三號華南虎采精情況見上表所示，一共采出約0.5ml精液，未發現精子。
[0064]
華南虎電刺激采精結果分析：
[0065]
觀察表5、表6、表7數據可發現，一般華南虎在電刺激采精儀輸出電壓為4-6v時就會射精。根據虎之間的個體差異，數據會略有不同。同時在本試驗中出現了好幾次精液中無精子的現象。10月和11月是對虎采精效果最差的時候，無精率占到了全年的44.4％。而本次實驗正值11月份，因此可能是季節原因影響了精液品質。
[0066]
在本次試驗中，的使用量在10ml左右，的使用劑量一般為10mg/kg。由于華南虎之間存在個體差異，故使用量可根據具體情況酌情追加。同時要注意會增加唾液與氣管支氣管分泌，所以在注射15-20min前必須按所需劑量注射阿托品。使用異氟烷進行吸入麻醉時需要配合呼吸麻醉機使用，在本次試驗中，麻醉機的異氟烷濃度調節至4％-5％，麻醉效果良好，且能通過電刺激使虎射精，采到的精液中也發現了活的精子，且精子密度尚可。檢測虎的血液生理生化指標后，發現無較大異常，麻醉過程平穩無不良反應出現，蘇醒時間能提前，且蘇醒后無并發癥，表明該麻醉方法有良好的安全性。并且在麻醉采精過程中，動物沒有出現排尿現象，有相關研究顯示一些動物在麻醉采精的過程中，由于麻醉的影響會引起尿道肌肉的放松，發生排尿現象，易污染精液。進一步說明了此麻醉方法對華南虎采精有較好的適用性。
[0067]
通過使用異氟烷配合的麻醉方法，不僅能減少的使用量，而且還能延長麻醉時間，使麻醉時間變得安全可控，同時減少了虎的應激，對虎造成的傷害較小。杭州野生動物世界過去使用的法國進口的速眠新價格為6、700元一支，每次用量在10ml左右，而本次試驗中使用的異氟烷價格為600元一瓶，共有100ml，并且每次使用量很少，能使用較
長時間。因此，該麻醉方法不僅麻醉效果好，而且更加經濟。值得一提的是，使用異氟烷進行麻醉時需要配合適合的呼吸麻醉機使用。
[0068]
電刺激儀輸出電壓最高不超過8v。本次試驗發現，在電壓為4-6v時，更容易使虎射精，當電極棒的電極朝向虎的背側，電極棒深度在大約30cm時，虎對電刺激更加敏感，更容易射精。電極棒不能太細，采用細的電極棒，沒有采出精液，將使用的電極棒加粗至直徑5cm后，很容易就能采出精液。年輕的虎比年長的虎對電刺激反應更敏感，能更容易采到精液。對同一只虎多次采集精液，因為長時間沒有進行射精精子可能會死亡，反復采集更易采出有活力的精子。
[0069]
盡管已經示出和描述了本發明的實施例，對于本領域的普通技術人員而言，可以理解在不脫離本發明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的范圍由所附權利要求及其等同物限定。
