用于橡膠草種子真實性檢測的毛細管電泳和SSR熒光標記引物組及檢測方法

用于橡膠草種子真實性檢測的毛細管電泳和SSR熒光標記引物組及檢測方法

用于橡膠草種子真實性檢測的毛細管電泳和ssr熒光標記引物組及檢測方法
技術領域
1.本發明屬于植物分子標記檢測技術領域，具體涉及一種用于橡膠草種子真實性檢測的毛細管電泳和ssr熒光標記引物組及檢測方法。


背景技術：

2.橡膠草(taraxacumkok-saghyz rodin)，是菊科(asteraceae)蒲公英屬(taraxacum)多年生草本植物。作為一種天然橡膠植物，橡膠草根部橡膠含量高、品質優良成為巴西橡膠樹橡膠替代作物之一。橡膠草是一種具有龐大基因組的同源或異源多倍體植物，遺傳背景十分復雜，相互間存在明顯的遺傳多態性。橡膠草種質資源的遺傳多樣性和親緣關系對于橡膠草種質資源收集，育種工作尤為重用，那么橡膠草種子真實性的鑒定就更顯重要。目前橡膠草種子真實性鑒定主要經歷了生物學的形態鑒定、染體鑒定、同工酶鑒定、分子鑒定等幾個階段。其中種子形態學鑒定簡單直觀但準確性較差；由于橡膠草具有龐大的基因組，遺傳背景非常復雜，常規的染體方法鑒定橡膠草種子非常困難；同工酶鑒定是目前橡膠草種子鑒定應用較多的方法，但由于同工酶是基因表達的產物，產生的多態性較少，對某些親本關系較近的品種難以鑒定。
3.隨著分子生物技術的發展，分子標記技術已廣泛應用于橡膠草品種與雜交后代真實性鑒定。在這些分子標記技術中，ssr(simple sequence repeat)標記由于具有多態性高、數量豐富、遺傳上呈共顯性、結果穩定可靠、實驗操作簡單、引物序列易交流等優點，是目前作物種子鑒定中使用最多的分子標記技術。
4.目前常用的ssr分子標記檢測方法有瓊脂糖凝膠電泳、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細管電泳熒光檢測方法，所揭示的多態性因采用的方法不同而有所差別。ssr主要表現為2-5個核苷酸重復次數的變化，多態性片段長度的差異可以小到2-4bp，這就需要更靈敏有效的檢測方法。page理論上是分離可以達到1bp，實際在應用中難以實現；定性也不準確，不能準確給出片段的大小，只能粗略的估計。毛細管電泳(capillay electrophoresis，ce)是20世紀80年代后期在全球范圍內迅速崛起的一種分離分析技術，具有快速、高效、高靈敏度、易定量、重現性好及易于自動化等優點。毛細管電泳結合熒光檢測比變性page銀染檢測法的結果更精確，在微量pcr產物中更為靈敏，表現出強大的分析能力，大大地提高工作效率。將毛細管電泳應用于基于pcr技術的分子標記，不僅使分子標記的重復驗證工作不再繁重，且在一定程度上避免了硝酸銀染料或同位素標記過程中出現的假帶現象。


技術實現要素：

5.本發明的目的是解決橡膠草種子純度和真偽的鑒定難題，提供一種用于橡膠草種子真實性檢測的毛細管電泳和ssr熒光標記引物組，能夠在短時間內對待測種子進行快速真偽測定。
6.本發明所采用的技術如下：一種基于毛細管電泳和ssr標記的橡膠草種子真實性引物組，選擇如下全部的23對引物組：
7.引物名稱：tks 01，
8.正向：5'-ctgactttgactggggcact-3'
9.反向：5'-cctcggtttctggggtatct-3'；
10.引物名稱：tks 02，
11.正向：5'-aaagccaaacctatacttctccg-3'
12.反向：5'-ctaacatacgctgattggctacc-3'；
13.引物名稱：tks 03，
14.正向：5'-gatgggctccttcaactaac-3'
15.反向：5'-tccacgctgatgtatgctac-3'；
16.引物名稱：tks 04，
17.正向：5'-gcatccagaggaggagcagt-3'
18.反向：5'-gccgtcaaaggaaccaacat-3'；
19.引物名稱：tks 05，
20.正向：5'-tctgtctctcacactctatttctttca-3'
21.反向：5'-aatgcgatcttcaaagtcttcaa-3'；
22.引物名稱：tks 06，
23.正向：5'-ttgagtgatatggataaggggtg-3'
24.反向：5'-tttcatcttgactcaaaccgtct-3'；
25.引物名稱：tks 07，
26.正向：5'-agaagaaggaaactttgctcgat-3'
27.反向：5'-tgtttcgtgatcttctccttgat-3'；
28.引物名稱：tks 08，
29.正向：5'-gatgctgaagaagatgatgatga-3'
30.反向：5'-aagtaacacacagccaaaagagc-3'；
31.引物名稱：tks 09，
32.正向：5'-ctcaaacccgtcacccaaac-3'
33.反向：5'-gcgtcatcatcgtctccacc-3'；
34.引物名稱：tks 10，
35.正向：5'-cgcctcagatctctgaacttatc-3'
36.反向：5'-aacatattgtgttgcagcgattt-3'；
37.引物名稱：tks 11，
38.正向：5'-aaccaccacctccttcttct-3'
39.反向：5'-tccgtacatcctcactttcc-3'；
40.引物名稱：tks 12，
41.正向：5'-tttcccttttcatcttctcg-3'
42.反向：5'-gtaaacctgaccttccttgc-3'；
43.引物名稱：tks 13，
master mix 10μl，濃度為10μmol/l的正、反向引物各0.2μl，20-50ng/μl的dna模板1μl，ddh2o 8.6μl，在正向引物5’端以cy5磷熒光染料標記。
78.進一步的，所述pcr擴增的程序為：首先95℃預變性5min；94℃變性45sec，退火40sec，72℃延伸1min；30個循環，最后72℃下延伸10min。
79.進一步的，所述的毛細管電泳方法為，將pcr產物稀釋100倍后，在遺傳分析系統儀上利用毛細管電泳法檢測，每個ce樣品中含有μl pcr產物、0.2μl genescan-400分子量標準品和20μl sls溶液；在毛細管凝膠電泳過程中，pcr產物與genescan-400分子量標準品的熒光信號均由基因分析儀自動保存。
80.進一步的，用genemapper-v軟件對遺傳分析系統儀收集到的數據進行分析，通過人工分析與軟件統計得出不同參試材料的ssr標記的擴增片段，利用軟件將擴增片段與genescan-400分子量標準品比較，得到片段長度大小。
81.進一步的，橡膠草基因組總dna的提取方法采用ctab提取方法，方法如下：稱取橡膠草葉片0.5g，放入預冷的滅菌研缽中，加入液氮充分研磨，將粉末轉移到15ml離心管，加入5ml 2
×
ctab提取buffer，所述的ctab配方組成為：2％w/v ctab，1％v/vβ-巰基乙醇，1.4m nacl，20mm edta-na2，質量分數2％pvp-40，100mm tris-cl，調至ph 8.0；快速顛倒混勻，于65℃水浴30-60min，期間顛倒離心管2-3次；取出離心管，冷至室溫，加入1體積氯仿，輕緩顛倒充分混勻；室溫，10000r/min離心15min，取上清；加入1體積氯仿再抽提1-2次，取上清，加入1/10體積的3m naac調至ph 5.2和1體積預冷異丙醇，混勻后-20℃靜置30min以上；4℃，11000r/min離心15min，沉淀用質量分數75％的乙醇4℃，10000r/min離心5min，洗2次，倒去乙醇，超凈臺中晾干dna；加入100μl te，te配方組成為：10mmol/l tris-hcl，1mmol/l edta，6mol/l，調至ph 8.0，溶解后加入1μl的10μg/μl rnase，在37℃溫育60min；加入te至1000μl，分別用等體積的tris-苯酚、氯仿、異戊醇的混合液、氯仿和異戊醇的混合液各抽提1次，其中，tris-苯酚：氯仿：異戊醇的體積比＝25:24:1，氯仿：異戊醇的體積比＝24:1，每次10000r/min離心10min，吸取上清液，加入1/10體積的3m naac調至ph 5.2和1體積預冷異丙醇，-20℃靜置1h；4℃、11000r/min離心15min，質量分數70％乙醇洗滌2次；倒去乙醇，超凈臺中晾干dna，加入100μl ddh2o溶解沉淀，dna完全溶解后-20℃保存備用。
82.本發明的優點及有益效果：本實驗采用ssr分子標記技術，該標記具有多態性高，穩定性好，有高度變異、微衛星在染體上分布均勻等優點，使得其更適用于種子的鑒定。靈敏度較高，在pcr產物稀釋200倍后仍能正常檢測出結果，在微量的pcr產物分析中表現出來強大的分析能力。能準確讀出條帶大小，區分度在1bp之內，提高了種子鑒定的準確性。各泳道的dna片段直接與其泳道中的分子量內標相比就可精確獲得其大小數值，一次檢測只需一塊96孔板同時檢測96個樣品，不僅使分子標記的重復驗證工作不再繁重，且在一定程度上避免了硝酸銀染料或同位素標記過程中出現的假帶現象。不僅省去了人力，提高了工作效率，也避免了這些操作中的人為誤差，從而增強了試驗結果的穩定性和可重復性。
附圖說明
83.圖1為標準種子k-445的電泳圖譜，
84.圖2為待測樣品中的真實種子的電泳圖譜，
85.圖3為待測樣品中的混子的電泳圖譜，擴增引物為sks 07。
86.圖4為標準種子ke-19的電泳圖譜，
87.圖5為檢測的與標準種子條帶相同的電泳圖譜，
88.圖6為檢測的與標準種子條帶不同的電泳圖譜，擴增引物為sks 07。
具體實施方式
89.下面根據說明書附圖舉例對本發明做進一步的說明：
90.實施例1
91.以橡膠草品種k-445種子為標準種子鑒定橡膠草種子真實性。
92.1、種子樣品的選取
93.從橡膠草品種k-445中隨機數取45粒種子，為檢驗鑒定效果，再摻入3粒k-448和2粒k-450品種的種子，共50粒種子作為檢驗樣品。
94.2、種子樣品基因組dna提取
95.(1)將橡膠草種子放于30℃恒溫下發芽出苗，待長出2-3片真葉時，取橡膠草嫩葉于研缽中，加入液氮研磨成粉末狀，裝入15ml離心管中；
96.(2)向離心管中加入5ml 2
×
ctab提取buffer，ctab配方組成為：2％w/v ctab，1％v/vβ-巰基乙醇，1.4m nacl，20mm edta-na2，質量分數2％pvp-40，100mm tris-cl，調至ph 8.0，快速顛倒混勻，于65℃水浴30-60min，期間顛倒離心管2-3次；取出離心管，冷至室溫，加入1體積氯仿，輕緩顛倒充分混勻；
97.(3)室溫，10000r/min離心15min，取上清；加入1體積氯仿再抽提1-2次，取上清，加入1/10體積的3m naac(調至ph 5.2)和1體積預冷異丙醇，混勻后-20℃靜置30min以上；
98.(4)4℃，11000r/min離心15min，沉淀用75％乙醇洗2次，4℃，10000r/min離心5min，倒去乙醇，超凈臺中晾干dna；
99.(5)加入100μl te(10mmol/l tris-hcl，1mmol/l edta，調至ph 8.0)溶解后加入1μl的10μg/μlrnase，在37℃溫育60min；；
100.(6)加入te至1000μl，分別加等體積tris-苯酚：氯仿：異戊醇(體積比25:24:1)和等體積氯仿：異戊醇(體積比24:1)各抽提1次，每次10000r/min離心10min，吸取上清液，加入1/10體積的3m naac(調至ph 5.2)和1體積預冷異丙醇，-20℃靜置1h；
101.(7)4℃，11000r/min離心15min，70％乙醇洗滌2次；倒去乙醇，超凈臺中晾干dna，加入100μl ddh2o溶解沉淀，dna完全溶解后-20℃保存備用；3、pcr擴增
102.從http://www.plantgdb.org，下載橡膠草轉錄組數據，對鑒定出的各est-ssr進行引物設計，篩選出的23對ssr引物，引物序列由英濰捷基(上海)貿易有限公司提供，23對引物組如下：
103.引物名稱：tks 01，條帶大小：165-233bp，引物退火溫度：62℃，引物序列：
104.正向：5'-ctgactttgactggggcact-3'
105.反向：5'-cctcggtttctggggtatct-3'；
106.引物名稱：tks 02，條帶大小：158-171bp，引物退火溫度：60℃，引物序列：
107.正向：5'-aaagccaaacctatacttctccg-3'
108.反向：5'-ctaacatacgctgattggctacc-3'；
109.引物名稱：tks 03，條帶大小：203-229bp，引物退火溫度：62℃，引物序列：
110.正向：5'-gatgggctccttcaactaac-3'
111.反向：5'-tccacgctgatgtatgctac-3'；
112.引物名稱：tks 04，條帶大小：127-152bp，引物退火溫度：58℃，引物序列：
113.正向：5'-gcatccagaggaggagcagt-3'
114.反向：5'-gccgtcaaaggaaccaacat-3'；
115.引物名稱：tks 05，條帶大小：92-127bp，引物退火溫度：58℃，引物序列：
116.正向：5'-tctgtctctcacactctatttctttca-3'
117.反向：5'-aatgcgatcttcaaagtcttcaa-3'；
118.引物名稱：tks 06，條帶大小：134-154bp，引物退火溫度：60℃，引物序列：
119.正向：5'-ttgagtgatatggataaggggtg-3'
120.反向：5'-tttcatcttgactcaaaccgtct-3'；
121.引物名稱：tks 07，條帶大小：138-185bp，引物退火溫度：62℃，引物序列：
122.正向：5'-agaagaaggaaactttgctcgat-3'
123.反向：5'-tgtttcgtgatcttctccttgat-3'；
124.引物名稱：tks 08，條帶大小：160-190bp，引物退火溫度：60℃，引物序列：
125.正向：5'-gatgctgaagaagatgatgatga-3'
126.反向：5'-aagtaacacacagccaaaagagc-3'；
127.引物名稱：tks 09，條帶大小：168-252bp，引物退火溫度：52℃，引物序列：
128.正向：5'-ctcaaacccgtcacccaaac-3'
129.反向：5'-gcgtcatcatcgtctccacc-3'；
130.引物名稱：tks 10，條帶大小：122-146bp，引物退火溫度：48℃，引物序列：
131.正向：5'-cgcctcagatctctgaacttatc-3'
132.反向：5'-aacatattgtgttgcagcgattt-3'；
133.引物名稱：tks 11，條帶大小：214-229bp，引物退火溫度：54℃，引物序列：
134.正向：5'-aaccaccacctccttcttct-3'
135.反向：5'-tccgtacatcctcactttcc-3'；
136.引物名稱：tks 12，條帶大小：205-220bp，引物退火溫度：58℃，引物序列：正向：5'-tttcccttttcatcttctcg-3'
137.反向：5'-gtaaacctgaccttccttgc-3'；
138.引物名稱：tks 13，條帶大小：146-186bp，引物退火溫度：60℃，引物序列：正向：5'-caaattgacattgctgctcaac-3'
139.反向：5'-caaaaatccacaacacaaaacct-3'；
140.引物名稱：tks 14，條帶大小：122-157bp，引物退火溫度：52℃，引物序列：正向：5'-cttacatcaaatcccctgtccta-3'
141.反向：5'-cacagaattggtcccaagaatag-3'；
142.引物名稱：tks 15，條帶大小：126-158bp，引物退火溫度：62℃，引物序列：正向：5'-agcttgatcttcaatcgagttct-3'
143.反向：5'-agttttgagctccccatattgac-3'；
144.引物名稱：tks 16，條帶大小：136-175bp，引物退火溫度：60℃，引物序列：正向：
5'-tatcacccattcagaacctc-3'
145.反向：5'-atcctcctctaaatcatactcg-3'；
146.引物名稱：tks 17，條帶大小：112-134bp，引物退火溫度：54℃，引物序列：正向：5'-tatcactgggcttagaaatggtg-3'
147.反向：5'-tgcatcatcactcacttcacttc-3'；
148.引物名稱：tks 18，條帶大小：156-184bp，引物退火溫度：58℃，引物序列：正向：5'-ttccggtaaacaaaattgatacg-3'
149.反向：5'-tgattttacaagacaacagagcg-3'；
150.引物名稱：tks 19，條帶大小：118-148bp，引物退火溫度：60℃，引物序列：正向：5'-aacattctaaaaactggcacgaa-3'
151.反向：5'-gtcttcaaacagaaagccaaaaa-3'；
152.引物名稱：tks 20，條帶大小：132-175bp，引物退火溫度：60℃，引物序列：正向：5'-tcgaatcgctggttaatttattg-3'
153.反向：5'-gtttggaagagttttcttggaga-3'；
154.引物名稱：tks 21，條帶大小：221-268bp，引物退火溫度：62℃，引物序列：正向：5'-tttgatgcggaggagtaaga-3'
155.反向：5'-cgagcgaagaaaacagaaga-3'；
156.引物名稱：tks 22，條帶大小：150-175bp，引物退火溫度：54℃，引物序列：正向：5'-tgtactcctgtactcccaccaat-3'
157.反向：5'-catatacactcgaaggcggatac-3'；
158.引物名稱：tks 23，條帶大小：208-228bp，引物退火溫度：62℃，引物序列：正向：5'-tggaggtagggagtattgcg-3'
159.反向：5'-tgggctcttctgatggttga-3'；
160.正向引物5'端以cy5磷熒光染料標記，反應體系為：20μl，各組分包括：2
×
taq master mix(mg
2+
)10μl，濃度為10μmol/l的正反向引物各0.2μl，20-50ng/μl的dna模板1μl，ddh2o8.6μl。
161.pcr擴增程序：95℃預變性5min；94℃變性45sec，退火40sec，72℃延伸1min；30個循環，最后72℃下延伸10min。
162.4、毛細管凝膠電泳檢測
163.上樣板：將所得到的pcr產物稀釋100倍，在96孔板的各孔中分別加入20μl甲酰胺，0.3μl0.3μlrox-500分子量標準品和1μl稀釋后的pcr產物。
164.緩沖板：在96孔板的各孔中加入分離液，大約為每孔的2/3。
165.將上樣板和緩沖板放入beckman coulter ceq 8800遺傳分析系統儀(美國，beckman公司生產)中，90℃變性2min；進樣電壓2kv，時間30sec；分離電壓7.5kv，時間40min。在毛細管凝膠電泳過程中，pcr產物與0.3μlrox-500分子量標準品的熒光信號均由基因分析儀自動保存。
166.5、數據分析
167.用genemapper-v4.0軟件對beckman coulter ceq 8800遺傳分析系統儀收集到的數據進行分析，通過人工分析與軟件統計得出各供試材料的ssr標記的擴增片段，軟件系統
將根據擴增片段目標峰的位置與同一泳道中的rox-500分子量標準品進行比較，得到片段長度大小。
168.6、鑒定結果分析
169.將待測樣品每粒種子dna的23對引物擴增的電泳圖譜分別與按照上述步驟1-5的方法獲得的標準種子k-445的23對引物的電泳圖譜相比較，結果表明，50粒待測種子中有45粒種子的20對引物擴增條帶結果與均與k-445品種的種子相同，5粒種子帶型有差異，與預選摻雜的情況相符，說明前者為k-445的種子，后者為混。其中，部分檢測結果如圖1-3所示。
170.實施例2
171.鑒定某單位正在使用的親本材料a是否為品種ke-19，鑒定操作流程如下：隨機挑取待測品種a種子10粒，進行dna制備，pcr擴增，毛細管凝膠電泳檢測，數據分析，具體實施步驟如實施例1。
172.鑒定結果分析
173.將待測品種a的10粒種子的23對引物擴增結果分別與標準品ke-19擴增結果相對比，結果表明，其中三粒種子的擴增結果中含有與標準種子相差異的條帶，說明該單位使用的親本材料a不是橡膠草品種ke-19。其中部分檢測結果如圖4-6所示。