一種高效的棉花轉(zhuǎn)基因植株嫁接技術(shù)
1.本發(fā)明涉及棉花栽培相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種高效的棉花轉(zhuǎn)基因植株嫁接技術(shù)。
背景技術(shù)：
2.將轉(zhuǎn)基因植物從溫室進(jìn)行組織培養(yǎng)到再移栽到田間是利用基因工程技術(shù)改良作物的關(guān)鍵一步，組織培養(yǎng)出來(lái)的苗一般被稱為試管苗或組培苗，試管苗長(zhǎng)期生長(zhǎng)在恒溫、高濕、弱光、無(wú)菌的密閉環(huán)境中，與外界環(huán)境差異較大，在這樣的環(huán)境下，棉花試管苗莖葉細(xì)弱，葉片的葉綠體光合作用較差，氣孔數(shù)目不足，根系不發(fā)達(dá)，吸收能力較差，導(dǎo)致整體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和抵抗能力較差。
3.傳統(tǒng)方法將再生植株移栽到溫室條件下，往往涉及到生根、硬化、殺菌、移栽等多個(gè)復(fù)雜步驟，而由于培養(yǎng)環(huán)境和移栽環(huán)境差別大、試管苗適應(yīng)外界環(huán)境的能力差，直接移栽棉花試管苗成活率很低，棉花再生植株的生根和移栽都是難點(diǎn)，棉花再生植株移栽成活率較低，約50％以上植株在移栽過(guò)程中死亡，因此，轉(zhuǎn)基因棉花植株的回收率低是轉(zhuǎn)基因棉花應(yīng)用的一個(gè)重要瓶頸，而通過(guò)健壯植株嫁接移栽可有助于提高成活率，鑒于此，針對(duì)上述問(wèn)題，深入研究，遂有本案產(chǎn)生。
4.針對(duì)上述問(wèn)題，在原有棉花轉(zhuǎn)基因植株栽植技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行創(chuàng)新設(shè)計(jì)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
5.本發(fā)明的目的在于提供一種高效的棉花轉(zhuǎn)基因植株嫁接技術(shù)，以解決上述背景技術(shù)中提出棉花轉(zhuǎn)基因植株栽植成活率低，不利于轉(zhuǎn)基因植株試驗(yàn)推廣的問(wèn)題。
6.為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種高效的棉花轉(zhuǎn)基因植株嫁接技術(shù)，具體包括如下步驟：
7.s1.材料準(zhǔn)備；
8.準(zhǔn)備材料包括：轉(zhuǎn)基因棉花植物、健壯棉花根莖、大小種植盆、土壤混合物、ms培養(yǎng)基、保鮮膜、手術(shù)刀和塑料袋；
9.s2.準(zhǔn)備根莖；
10.a.土壤混合物在120-130℃下消毒30分鐘；
11.b在小種植盆里裝滿消毒過(guò)的土壤；
12.c.健壯棉花根莖植株是在溫室里的小種植盆里培養(yǎng)的；
13.d.1.5-2周后，將健壯棉花根莖植株移入植物組培室；
14.e.去掉子葉上面的部分；
15.f.將莖垂直切開(kāi)2-3cm深；
16.s3.準(zhǔn)備接穗；
17.a.選擇準(zhǔn)備移植的轉(zhuǎn)基因棉花植物；
18.b.將轉(zhuǎn)基因棉花植物從試管中取出；
19.c.只保留一片展開(kāi)的葉子，去掉其余的葉子；
20.d.將轉(zhuǎn)基因棉花植物的植株底部切成深的“v”形；
21.s4.嫁接；
22.a.把接穗垂直插入到“v”形砧木的基部，直到它穩(wěn)定；
23.b.移植物部分用保鮮膜纏繞固定；
24.c.接枝植物須用塑料袋蓋??；
25.d.接枝植物生長(zhǎng)在16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗周期，1500勒克斯光照下，溫度設(shè)置為28
±
2℃；
26.e.除去砧木節(jié)上長(zhǎng)出的嫩枝；
27.f.每天監(jiān)測(cè)土壤，如有必要，添加水和1/2ms培養(yǎng)基；
28.g.1周后，從移植物上取下塑料袋或杯子；
29.h.大約2周后，接穗長(zhǎng)出大約兩片新葉，移植物被轉(zhuǎn)移到溫室；
30.i.再過(guò)3周，植物被轉(zhuǎn)移到一個(gè)大種植盆里。
31.優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)基因棉花植物是通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的體細(xì)胞胚胎獲得，且健壯棉花根莖植株為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的科學(xué)家培育的國(guó)審棉花品種 ez9。
32.優(yōu)選的，大小種植盆包括直徑15-20厘米的小種植盆和直徑約30-35厘米的大種植盆分別用于前后期不同大小植株的栽種移植。
33.優(yōu)選的，所述土壤混合物為預(yù)施有機(jī)肥的砂質(zhì)或黏質(zhì)土壤，所述培養(yǎng)基為murashige和skoog(ms)培養(yǎng)基。
34.優(yōu)選的，所述s2步驟中莖垂直切開(kāi)位置為莖稈中間位置，從中間劈開(kāi)莖稈是很重要的，這樣兩邊才能保持平衡，且切莖深度具體以直到莖維管組織滿足接穗固定為準(zhǔn)。
35.優(yōu)選的，所述s3步驟中需要通過(guò)手術(shù)刀切割植株底部切成深的“v”形結(jié)構(gòu)，且切口的v形底座切面保持光滑以便于接穗和砧木對(duì)接固定牢固。
36.優(yōu)選的，所述s3步驟中接穗的大小不得低于0.3cm，且接穗的大小優(yōu)選為0.8-1.0cm，0.1-0.2cm的小接穗成活率較低，0.8-1.0cm的大接穗成活率高達(dá)95％。
37.優(yōu)選的，所述s4步驟中在接穗長(zhǎng)出兩片新葉前，保持除去砧木節(jié)上長(zhǎng)出的嫩枝，避免多個(gè)葉片需要更多的水分和營(yíng)養(yǎng)導(dǎo)致接穗因缺水和營(yíng)養(yǎng)不足而死亡。
38.優(yōu)選的，所述s4步驟中蓋住嫁接植株的主要目的是保持濕度，在嫁接后的前一周監(jiān)測(cè)濕度保持濕度為70％-90％，避免接穗和砧木之間還沒(méi)有形成新的維管組織時(shí)水分過(guò)度流失導(dǎo)致接穗死亡，嫁接后的前一周是非常關(guān)鍵的，應(yīng)仔細(xì)監(jiān)測(cè)濕度，低濕度常導(dǎo)致移植物成活率低。
39.與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：該高效的棉花轉(zhuǎn)基因植株嫁接技術(shù)，采用嫁接技術(shù)對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的轉(zhuǎn)基因棉花植株進(jìn)行再生，獲得了65-92％的轉(zhuǎn)基因棉花植株回收率，嫁接技術(shù)顯著提高了轉(zhuǎn)基因棉花移栽的成活率，操作簡(jiǎn)單，成活率高，適用于對(duì)轉(zhuǎn)基因棉苗的基礎(chǔ)研究，也適合大田種植推廣，適合實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，通過(guò)此移栽技術(shù)，在不同于試管苗培養(yǎng)環(huán)境的高溫、強(qiáng)光、空氣干燥的條件下仍然能夠進(jìn)行試管苗移栽，有效提高轉(zhuǎn)基因試管苗的移栽成活率，方便轉(zhuǎn)基因棉花植株的推廣試驗(yàn)和應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
40.下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
41.本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
42.實(shí)施例1
43.一種高效的棉花轉(zhuǎn)基因植株嫁接技術(shù)，具體包括如下步驟：
44.s1.材料準(zhǔn)備；
45.準(zhǔn)備材料包括：轉(zhuǎn)基因棉花植物、健壯棉花根莖、大小種植盆、土壤混合物、ms培養(yǎng)基、保鮮膜、手術(shù)刀和塑料袋；
46.s2.準(zhǔn)備根莖；
47.a.土壤混合物在120℃下消毒30分鐘；
48.b在小種植盆里裝滿消毒過(guò)的土壤；
49.c.ez9健壯棉花根莖植株是在溫室里的小種植盆里培養(yǎng)的；
50.d.1.5周后，將健壯棉花根莖植株移入植物組培室；
51.e.去掉子葉上面的部分；
52.f.將莖垂直切開(kāi)2cm深，莖垂直切開(kāi)位置為莖稈中間位置；
53.s3.準(zhǔn)備接穗；
54.a.選擇準(zhǔn)備移植的轉(zhuǎn)基因棉花植物；
55.b.將轉(zhuǎn)基因棉花植物從試管中取出；
56.c.只保留一片展開(kāi)的葉子，去掉其余的葉子；
57.d.將轉(zhuǎn)基因棉花植物的植株底部切成深的“v”形，接穗大小為0.9
±?
0.1cm；
58.s4.嫁接；
59.a.把接穗垂直插入到“v”形砧木的基部，直到它穩(wěn)定；
60.b.移植物部分用保鮮膜纏繞固定；
61.c.接枝植物須用塑料袋蓋?。?br>62.d.接枝植物生長(zhǎng)在16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗周期，1500勒克斯光照下，溫度設(shè)置為28
±
2℃；
63.e.除去砧木節(jié)上長(zhǎng)出的嫩枝；
64.f.每天監(jiān)測(cè)土壤，如有必要，添加水和1/2ms培養(yǎng)基；
65.g.1周后，從移植物上取下塑料袋或杯子；
66.h.2周后，接穗長(zhǎng)出大約兩片新葉，移植物被轉(zhuǎn)移到溫室；
67.i.再過(guò)3周，植物被轉(zhuǎn)移到一個(gè)大種植盆里。
68.轉(zhuǎn)基因棉花植物是通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的體細(xì)胞胚胎獲得，且健壯棉花根莖植株為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的科學(xué)家培育的國(guó)審棉花品種ez9。
69.大小種植盆包括直徑15厘米的小種植盆和直徑約30厘米的大種植盆分別用于前后期不同大小植株的栽種移植。
70.土壤混合物為預(yù)施有機(jī)肥的砂質(zhì)或黏質(zhì)土壤，培養(yǎng)基為murashige和 skoog(ms)
培養(yǎng)基。
71.s2步驟中從中間劈開(kāi)莖稈是很重要的，這樣兩邊才能保持平衡，且切莖深度具體以直到莖維管組織滿足接穗固定為準(zhǔn)。
72.s3步驟中需要通過(guò)手術(shù)刀切割植株底部切成深的“v”形結(jié)構(gòu)，且切口的 v形底座切面保持光滑以便于接穗和砧木對(duì)接固定牢固。
73.s3步驟中接穗的大小為0.8-1.0cm的大接穗成活率高達(dá)90％。
74.s4步驟中在接穗長(zhǎng)出兩片新葉前，保持除去砧木節(jié)上長(zhǎng)出的嫩枝，避免多個(gè)葉片需要更多的水分和營(yíng)養(yǎng)導(dǎo)致接穗因缺水和營(yíng)養(yǎng)不足而死亡。
75.s4步驟中蓋住嫁接植株的主要目的是保持濕度，在嫁接后的前一周監(jiān)測(cè)濕度保持濕度為75％，避免接穗和砧木之間還沒(méi)有形成新的維管組織時(shí)水分過(guò)度流失導(dǎo)致接穗死亡，嫁接后的前一周是非常關(guān)鍵的，應(yīng)仔細(xì)監(jiān)測(cè)濕度，低濕度常導(dǎo)致移植物成活率低。
76.實(shí)施例2
77.一種高效的棉花轉(zhuǎn)基因植株嫁接技術(shù)，具體包括如下步驟：
78.s1.材料準(zhǔn)備；
79.準(zhǔn)備材料包括：轉(zhuǎn)基因棉花植物、健壯棉花根莖、大小種植盆、土壤混合物、ms培養(yǎng)基、保鮮膜、手術(shù)刀和塑料袋；
80.s2.準(zhǔn)備根莖；
81.a.土壤混合物在130℃下消毒30分鐘；
82.b在小種植盆里裝滿消毒過(guò)的土壤；
83.c.ez9健壯棉花根莖植株是在溫室里的小種植盆里培養(yǎng)的；
84.d.2周后，將健壯棉花根莖植株移入植物組培室；
85.e.去掉子葉上面的部分；
86.f.將莖垂直切開(kāi)3cm深，莖垂直切開(kāi)位置為莖稈中間位置；
87.s3.準(zhǔn)備接穗；
88.a.選擇準(zhǔn)備移植的轉(zhuǎn)基因棉花植物；
89.b.將轉(zhuǎn)基因棉花植物從試管中取出；
90.c.只保留一片展開(kāi)的葉子，去掉其余的葉子；
91.d.將轉(zhuǎn)基因棉花植物的植株底部切成深的“v”形，接穗大小為0.9
±?
0.1cm；
92.s4.嫁接；
93.a.把接穗垂直插入到“v”形砧木的基部，直到它穩(wěn)定；
94.b.移植物部分用保鮮膜纏繞固定；
95.c.接枝植物須用塑料袋蓋住；
96.d.接枝植物生長(zhǎng)在16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗周期，1500勒克斯光照下，溫度設(shè)置為28
±
2℃；
97.e.除去砧木節(jié)上長(zhǎng)出的嫩枝；
98.f.每天監(jiān)測(cè)土壤，如有必要，添加水和1/2ms培養(yǎng)基；
99.g.1周后，從移植物上取下塑料袋或杯子；
100.h.2周后，接穗長(zhǎng)出大約兩片新葉，移植物被轉(zhuǎn)移到溫室；
101.i.再過(guò)3周，植物被轉(zhuǎn)移到一個(gè)大種植盆里。
102.轉(zhuǎn)基因棉花植物是通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的體細(xì)胞胚胎獲得，且健壯棉花根莖植株為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的科學(xué)家培育的國(guó)審棉花品種ez9。
103.大小種植盆包括直徑20厘米的小種植盆和直徑約35厘米的大種植盆分別用于前后期不同大小植株的栽種移植。
104.土壤混合物為預(yù)施有機(jī)肥的砂質(zhì)或黏質(zhì)土壤，培養(yǎng)基為murashige和 skoog(ms)培養(yǎng)基。
105.s2步驟中從中間劈開(kāi)莖稈是很重要的，這樣兩邊才能保持平衡，且切莖深度具體以直到莖維管組織滿足接穗固定為準(zhǔn)。
106.s3步驟中需要通過(guò)手術(shù)刀切割植株底部切成深的“v”形結(jié)構(gòu)，且切口的 v形底座切面保持光滑以便于接穗和砧木對(duì)接固定牢固。
107.s3步驟中接穗的大小0.8-1.0cm的大接穗成活率高達(dá)95％。
108.s4步驟中在接穗長(zhǎng)出兩片新葉前，保持除去砧木節(jié)上長(zhǎng)出的嫩枝，避免多個(gè)葉片需要更多的水分和營(yíng)養(yǎng)導(dǎo)致接穗因缺水和營(yíng)養(yǎng)不足而死亡。
109.s4步驟中蓋住嫁接植株的主要目的是保持濕度，在嫁接后的前一周監(jiān)測(cè)濕度保持濕度為85％，避免接穗和砧木之間還沒(méi)有形成新的維管組織時(shí)水分過(guò)度流失導(dǎo)致接穗死亡，嫁接后的前一周是非常關(guān)鍵的，應(yīng)仔細(xì)監(jiān)測(cè)濕度，低濕度常導(dǎo)致移植物成活率低。
110.實(shí)施例3
111.一種高效的棉花轉(zhuǎn)基因植株嫁接技術(shù)，具體包括如下步驟：
112.s1.材料準(zhǔn)備；
113.準(zhǔn)備材料包括：轉(zhuǎn)基因棉花植物、健壯棉花根莖、大小種植盆、土壤混合物、ms培養(yǎng)基、保鮮膜、手術(shù)刀和塑料袋；
114.s2.準(zhǔn)備根莖；
115.a.土壤混合物在121℃下消毒30分鐘；
116.b在小種植盆里裝滿消毒過(guò)的土壤；
117.c.ez9健壯棉花根莖植株是在溫室里的小種植盆里培養(yǎng)的；
118.d.2周后，將健壯棉花根莖植株移入植物組培室；
119.e.去掉子葉上面的部分；
120.f.將莖垂直切開(kāi)2.5cm深，莖垂直切開(kāi)位置為莖稈中間位置；
121.s3.準(zhǔn)備接穗；
122.a.選擇準(zhǔn)備移植的轉(zhuǎn)基因棉花植物；
123.b.將轉(zhuǎn)基因棉花植物從試管中取出；
124.c.只保留一片展開(kāi)的葉子，去掉其余的葉子；
125.d.將轉(zhuǎn)基因棉花植物的植株底部切成深的“v”形，接穗大小為0.9
±?
0.1cm；
126.s4.嫁接；
127.a.把接穗垂直插入到“v”形砧木的基部，直到它穩(wěn)定；
128.b.移植物部分用保鮮膜纏繞固定；
129.c.接枝植物須用塑料袋蓋?。?br>130.d.接枝植物生長(zhǎng)在16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗周期，1500勒克斯光照下，溫度設(shè)置為28
±
2℃；
131.e.除去砧木節(jié)上長(zhǎng)出的嫩枝；
132.f.每天監(jiān)測(cè)土壤，如有必要，添加水和1/2ms培養(yǎng)基；
133.g.1周后，從移植物上取下塑料袋或杯子；
134.h.2周后，接穗長(zhǎng)出大約兩片新葉，移植物被轉(zhuǎn)移到溫室；
135.i.再過(guò)3周，植物被轉(zhuǎn)移到一個(gè)大種植盆里。
136.轉(zhuǎn)基因棉花植物是通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的體細(xì)胞胚胎獲得，且健壯棉花根莖植株為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的科學(xué)家培育的國(guó)審棉花品種ez9。
137.大小種植盆包括直徑15厘米的小種植盆和直徑約35厘米的大種植盆分別用于前后期不同大小植株的栽種移植。
138.土壤混合物為預(yù)施有機(jī)肥的砂質(zhì)或黏質(zhì)土壤，培養(yǎng)基為murashige和 skoog(ms)培養(yǎng)基。
139.s2步驟中，從中間劈開(kāi)莖稈是很重要的，這樣兩邊才能保持平衡，且切莖深度具體以直到莖維管組織滿足接穗固定為準(zhǔn)。
140.s3步驟中需要通過(guò)手術(shù)刀切割植株底部切成深的“v”形結(jié)構(gòu)，且切口的 v形底座切面保持光滑以便于接穗和砧木對(duì)接固定牢固。
141.s3步驟中接穗的大小為0.8-1.0cm的大接穗成活率高達(dá)94％。
142.s4步驟中在接穗長(zhǎng)出兩片新葉前，保持除去砧木節(jié)上長(zhǎng)出的嫩枝，避免多個(gè)葉片需要更多的水分和營(yíng)養(yǎng)導(dǎo)致接穗因缺水和營(yíng)養(yǎng)不足而死亡。
143.s4步驟中蓋住嫁接植株的主要目的是保持濕度，在嫁接后的前一周監(jiān)測(cè)濕度保持濕度為80％
±
5％，避免接穗和砧木之間還沒(méi)有形成新的維管組織時(shí)水分過(guò)度流失導(dǎo)致接穗死亡，嫁接后的前一周是非常關(guān)鍵的，應(yīng)仔細(xì)監(jiān)測(cè)濕度，低濕度常導(dǎo)致移植物成活率低。
144.通過(guò)上述實(shí)施例采用嫁接技術(shù)對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的轉(zhuǎn)基因棉花植株進(jìn)行再生，獲得了65-92％的轉(zhuǎn)基因棉花植株回收率，嫁接技術(shù)顯著提高了轉(zhuǎn)基因棉花移栽的成活率如下表，對(duì)于健康的再生植株，成活率可高達(dá)94％。
[0145][0146]
盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。
