一種預測房顫發生風險的檢測試劑盒及其應用
1.本發明涉及生物檢測技術領域，具體涉及一種預測房顫發生風險的檢測試劑盒及其應用。
背景技術：
2.心房顫動（atrial fibrillation，af），簡稱房顫，是臨床上最常見的心律失常，發病率正隨著人口老齡化的發展而顯著上升，流行病學資料顯示，目前全球房顫患者已高達4000萬人，且正以每年200萬人的速度逐年遞增。
3.房顫與諸多心血管不良事件緊密相關，可導致患者的心室率（律）紊亂，嚴重時甚至出現室顫或者心臟驟停；促使血栓形成，并發腦卒中；長期房顫可引發和加重心力衰竭等，嚴重危害患者健康，加重醫療費用負擔。而目前國內外有關房顫預測的研究成果，預測效能較低，并且很少應用于臨床實踐，使得房顫難以被早期預警、早期干預，因此本領域迫切需要開發能夠有效預測房顫發病風險的生物標志物。
技術實現要素：
4.因此，本發明的目的在于提供用于預測房顫風險的生物標志物，具體提供了一種預測房顫發生風險的檢測試劑盒及其應用。
5.本發明提供了一種生物標志物在制備預測心房顫動發生風險的產品中的用途，所述生物標志物選自鳥氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、異胞嘧啶、n-乙酰-l-酪氨酸、2'-o-甲基胞苷、肌醇、精氨酸或者甲硫氨酸。
6.本發明還提供了一種用于預測心房顫動發生風險的生物標志物組合物，所述生物標志物組合物包括精氨酸、鳥氨酸、乙酰谷氨酸和甲硫氨酸。
7.進一步地，所述生物標志物組合物包含鳥氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、異胞嘧啶、n-乙酰-l-酪氨酸、2'-o-甲基胞苷、肌醇、尿刊酸、l-亮氨酸、1,5-酐-d-山梨糖醇和精氨酸。
8.進一步地，所述生物標志物組合物還包含甲硫氨酸。
9.本發明還提供了任一所述的生物標志物組合物在制備用于預測心房顫動風險的產品中的用途。
10.進一步地，所述產品為試劑盒。
11.進一步地，所述試劑盒包括生物標志物的標準品；優選的，優選的，所述試劑盒還包括溶劑1、溶劑2和溶劑3，其中溶劑1為體積百分數15-25%乙腈和75-85%甲醇的混合液，溶劑2為含8-12mm乙酸銨和體積百分數為0.2-0.4%氨水的水溶液，溶劑3為體積百分比為85-95%乙腈和5-15%水的混合液。氨水為濃氨水，例如每100ml含10mm乙酸銨的水溶液中加入0.3ml的濃氨水。
12.進一步地，所述預測是檢測待測受試者血清或血漿中的生物標志物或者生物標志物組合物的水平值，若當受試者血清或血漿中上述任一種生物標準物的水平值或者上述任
一所述的生物標志物組合物中的每一種生物標志物的水平值低于參考值下限或高于參考值上限時，則所述受試者具有發生心房顫動的風險。
13.其中，本發明中的參考值下限和參考值上限分別為對照人水平的第5百分位數和第95百分位數。
14.具體地，對于鳥氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、n-乙酰-l-酪氨酸、肌醇、尿刊酸、l-亮氨酸、1,5-酐-d-山梨糖醇、精氨酸或者甲硫氨酸來說，低于參考值下限時，則所述受試者具有發生心房顫動的風險，對于異胞嘧啶、2'-o-甲基胞苷來說，高于參考值上限時，則所述受試者具有發生心房顫動的風險。
15.進一步地，通過質譜聯用液相譜法測定生物標志物的水平。
16.進一步地，所述心房顫動發生風險是指心臟外科手術術后發生心房顫動的風險。
17.本發明中，心臟外科手術是指主要通過開胸或者胸腔鏡完成的手術，包括冠狀動脈旁路移植手術、瓣膜修復手術或者瓣膜置換手術，還包括先天性心臟病開胸修補手術等。
18.本發明還提供了一種預測心房顫動發生風險的試劑盒，包括任一所述的生物標志物組合物。
19.本發明還提供了所述的生物標志物或者所述的生物標志物組合物在制備用于篩選預防或心房顫動的藥物中的用途。
20.本發明技術方案，具有如下優點：1. 本發明研究發現，鳥氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、異胞嘧啶、n-乙酰-l-酪氨酸、2'-o-甲基胞苷、肌醇、精氨酸或者甲硫氨酸可作為生物標志物，這些生物標志物預測房顫發生風險有良好的敏感性和特異性，具備臨床應用前景。
21.2. 本發明所述生物標志物，可以包含精氨酸、鳥氨酸、乙酰谷氨酸和甲硫氨酸的組合物。尤其是包含鳥氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、異胞嘧啶、n-乙酰-l-酪氨酸、2'-o-甲基胞苷、肌醇、尿刊酸、l-亮氨酸、1,5-酐-d-山梨糖醇和精氨酸的組合物，具有較高的敏感性和特異性。
22.更加突出的是，上述組合物中還包含甲硫氨酸時，具有更高的敏感性和特異性。
附圖說明
23.為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
24.圖1是對同一質控樣本質譜檢測分析的總離子流圖（tic）重疊圖；圖2是qc樣本相關性分析；圖3是各組樣本中cv分布圖；圖4是鳥氨酸和乙酰谷酰胺用于預測心房顫動的 roc 曲線；圖5是尿嘧啶和2-甲氧基苯甲酸用于預測心房顫動的 roc 曲線；圖6是異胞嘧啶和n-乙酰-l-酪氨酸用于預測心房顫動的 roc 曲線；圖7是2'-o-甲基胞苷和肌醇用于預測心房顫動的 roc 曲線；圖8是精氨酸和甲硫氨酸用于預測心房顫動的 roc 曲線；
圖9是組合1（即精氨酸、鳥氨酸、乙酰谷氨酸和甲硫氨酸的組合）的水平用于預測心房顫動的 roc 曲線；圖10是組合2（即鳥氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、異胞嘧啶、n-乙酰-l-酪氨酸、2'-o-甲基胞苷、肌醇、尿刊酸、l-亮氨酸、1,5-酐-d-山梨糖醇和精氨酸的組合）的水平用于預測心房顫動的 roc 曲線；圖11是組合3（即鳥氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、異胞嘧啶、n-乙酰-l-酪氨酸、2'-o-甲基胞苷、肌醇、尿刊酸、l-亮氨酸、1,5-酐-d-山梨糖醇、精氨酸和甲硫氨酸的組合）的水平用于預測心房顫動的 roc 曲線。
具體實施方式
25.提供下述實施例是為了更好地進一步理解本發明，并不局限于所述最佳實施方式，不對本發明的內容和保護范圍構成限制，任何人在本發明的啟示下或是將本發明與其他現有技術的特征進行組合而得出的任何與本發明相同或相近似的產品，均落在本發明的保護范圍之內。
26.實施例中未注明具體實驗步驟或條件者，按照本領域內的文獻所描述的常規實驗步驟的操作或條件即可進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規試劑產品。
27.實施例11、臨床樣品在首都醫科大學附屬北京安貞醫院符合心臟外科手術適應癥并進行手術的患者納入本研究，所有研究對象術前沒有心房顫動，實驗組人是心臟外科術后（冠狀動脈旁路移植手術）經心電圖確診的房顫患者，共101例。參加本研究的所有對照人在心臟外科術后（冠狀動脈旁路移植手術）同一時期中的醫學檢查中沒有出現心電圖確診的房顫，共101例。
28.房顫診斷標準：完整的12導聯心電圖記錄到房顫特征性心電圖表現，或者單導聯記錄超過30秒，特征心電圖表現為：（1）“絕對”不規則r-r間期（無完全房室傳導阻滯的基礎上）；（2）體表心電圖上無明顯p波；（3）心房周期長度（可見時）常小于200毫秒。
29.參考文獻：《心房顫動外科中國專家共識2020版》注意事項：排除標準是既往房顫史，合并瓣膜病、腫瘤或者甲狀腺疾病，二次或急診手術，服用過或正在服用抗心律失常藥物，拒絕參與實驗的患者。
30.2、質譜聯用液相譜技術檢測化合物水平主要儀器：lc-ms/ms，型號qtrap 6500+，品牌sciex。
31.血漿樣本采集：采集房顫患者和健康對照人空腹狀態下靜脈血1ml，3000 rpm
×
10min 離心后留取上清于-80℃凍存。
32.血漿樣本的前處理：（1）樣本解凍后，渦旋10 s混勻；（2）取樣本50 μl（取完樣的樣本盡快放回-80 ℃冰箱保存）加入到對應的已編號的1.5 ml離心管中，加入250 μl溶劑1（體積百分數20 %乙腈和80%甲醇的混合液）；（3）渦旋3 min后離心，12000 r/min，4 ℃條件下離心10 min；（4）離心完后吸取上清液250 μl到另一個編好號的1.5 ml離心管中，-20℃冰箱中靜置30 min；（5）12000 r/min，4 ℃條件下再離心10 min；（6）取180 μl上清液過蛋
白沉淀板后用于上機通過hplc-ms進行代謝譜分析，上機液置于-20℃保存。從每個血漿樣本中取出等體積(10μl)樣品并混合均勻，將其作為“質量控制”(qc)樣本，該樣本用于估計一個能夠代表在分析過程中所遇到的所有分析物的“平均”譜(profile)。每隔10個檢測分析樣本插入一個質控樣本，以進一步監測系統穩定性。
33.（1）檢測方法：液相譜采用的是梯度洗脫的方法，譜柱選擇 acquity uplc beh amide 柱（1.7
?μ
m， 100 mm
×
2.1 mm i.d.），流動相：a相，溶劑2：超純水（10mm乙酸銨，體積百分數為0.3%氨水）；b相，溶劑3：90%乙腈/10%水（v/v），流速0.40 ml/min；柱溫40
°
c；進樣量2 μl ；流動相梯度：0-1.2 min a/b為5:95（v/v），8 min a/b為30:70（v/v），9.0-11 min a/b為50:50（v/v），11.1-15 min a/b為5:95（v/v）。質譜條件：電噴霧離子源（electrospray ionization，esi）溫度550℃，正離子模式下質譜電壓 5500 v，負離子模式下質譜電壓-4500 v，氣簾氣（curtain gas，cur）35 psi。在q-trap 6500+ 中，每個離子對是根據優化的去簇電壓（declustering potential，dp）和碰撞能（collision energy，ce）進行掃描檢測。
34.標準品溶液的制備：配制0.01 ng/ml、0.02 ng/ml、0.05 ng/ml、0.1 ng/ml、0.2 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、500 ng/ml、1000 ng/ml、2000 ng/ml、5000 ng/ml、10000 ng/ml、20000 ng/ml不同濃度的標準品溶液。標準品分別是2-羥基十六烷酸、十八烷二酸、沒食子酸、十六烷-1,16-二酸、吲哚-3-乙酸甲酯、水楊酸、高香草酸、3-羥基異戊酸、苯丙酮酸、2-糠酸、2,5-二羥基苯甲酸、原兒茶酸、苯甲酸、尿囊素、辛二酸、黃尿酸/黃嘌呤酸、肌苷、dl-3-苯乳酸、喹啉酸、對羥基苯甲酸、馬尿酸、羥基異己酸、alpha-亞麻酸、延胡索酸/富馬酸、羥基癸酸、石膽酸、5-甲基尿苷、肌醇、甲基丙二酸/異琥珀酸、豬脫氧膽酸、苯乙醛酸、4-羥苯基丙酮酸、alpha-酮戊二酸、乙酰丙酸、alpha-羥基異丁酸、二羥基苯基乙酸、3-羥基、腸二醇、3,4-二甲氧基、1,3-二甲基尿酸、dl-泛醇、4-羥基苯甲醛、苯丙氨酰苯丙氨酸、2-羥基-2-甲基丁酸、尿黑酸、甘氨膽酸、1,7-二甲基尿酸、5,6-二羥基吲哚-2-羧酸、6-羥基褪黑素、甘氨石膽酸、3-羥基-5-膽甾烯酸酯、生物蝶呤、己酰甘氨酸、苯乙酰谷氨酰胺、3-羥基-3-甲基谷氨酸、反式-烏頭酸、乙基丙二酸、2-(甲酰氨基)苯甲酸、環腺苷酸、2,4-二羥基苯甲酸、3-甲基-2-氧代戊酸、咖啡酸、三碘甲狀腺原氨酸、3,4,5-三甲氧基苯甲酸、6-磷酸葡萄糖酸、泛酸、苯氧乙酸、蓖麻油酸、甘氨酰-l-纈氨酸、n-l-gamma-谷氨酰-l-亮氨酸、對甲酚硫酸鹽銨鹽、2,6
??
二異丙基β
??d??
吡喃葡萄糖酸、3-甲基水楊酸、硫酸脫氫表雄酮、衣康酸、異亮氨酰-異亮氨酸、隱綠原酸、3-(3-羥基苯基)-3-羥基丙酸、omega-鼠膽酸、甘氨石膽酸-3-硫酸鹽、甘氨豬去氧膽酸、3-氧代膽酸、鵝去氧膽酸24-酰基-beta-d-葡糖苷酸、7-酮基脫氧膽酸、去甲膽酸、熊膽酸、5-羥甲基-2-呋喃甲酸、吲哚丙酮酸、12,13-dihome、尿嘧啶-5-羧酸、3-甲氧基苯甲酸、3-、朱砂精酸、鼠尾草酸、吲哚-3-乙酰胺、牛磺豬膽酸、牛磺-beta－鼠膽酸、牛磺熊去氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸、牛磺膽酸、甘氨豬膽酸、牛磺石膽酸、3beta-膽酸、脫氧胸苷酸、3-羥基-2-吡啶甲酸、2-羥基-3-甲基丁酸、n-肉桂基甘氨酸、3,4-二羥基苯丙酸、戊烯二酸、12-羥基十二酸、beta-鼠膽酸、豬膽酸、7-酮基石膽酸、12-酮基石膽酸、7,12-二酮石膽酸、甘氨脫氫膽酸、牛磺脫氫膽酸、23-脫甲脫氧膽酸、別脫氧膽酸、異石膽酸、別異石膽酸、牛磺鵝脫氧膽酸、膽酸、牛磺脫氧膽酸、脫氫石膽酸、3-氧代-12alpha羥基-24膽酸、3beta-脫氧膽酸、3,5-二碘-l-甲狀
腺原氨酸、鄰羥基、4-甲氧基、4-羥基-3-甲基苯甲酸、(e)-3-吲哚丙烯酸、3-(4-羥基苯基)乳酸、2-氨基-3-甲氧基苯甲酸、苯丁酸、甜蜜素、2-氨基-5-羥基苯甲酸、戊二酸、2-甲基丁酰肉堿、2-甲氧基苯甲酸、酪胺、胺、3-甲氧酪胺、亞精胺、腺苷、2-氮己環酮、吲哚-2-羧酸、dl-3-甲氧基腎上腺素鹽酸鹽、1-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿、嘌呤、1,5-戊二胺、亮氨酸、苯丙氨酸、犬尿氨酸、酪氨酸、次黃嘌呤、組氨酸、異亮氨酸、鳥嘌呤、氨酸、1-十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、5-甲氧基胺、尿刊酸、順式-10-十七碳烯酸、n6,n6,2
’?
o-三甲基腺苷、5-十二碳烯酸、吲哚-3-乙醛酸、維生素b9/葉酸、二氫睪酮、雄酮、5beta-雄甾酮、脫氫表雄酮、對乙酰氨基酚、3-氨基水楊酸、胸苷、腐胺、5,2
’?
o-甲基胞苷、n4-乙酰基-2
’?
o-甲基胞苷、5-甲酰基-2'-o-甲基胞苷、1-甲基偽尿苷、n4,2'-o-甲基胞苷、腎上腺素、6-甲基尿苷、2-硫-2'-o-甲基尿苷、雌酮、n-甲基煙酰胺、苯乙胺、蛋氨酸(甲硫氨酸)、多巴(左旋多巴)、甲狀腺素、吡啶甲酸、鄰苯二甲酸、n-乙酰-l-酪氨酸、氫化可的松、17alpha-炔雌醇、去氧皮質酮、17a-羥孕酮、、原兒茶醛、棕櫚酰乙醇酰胺(pea)、3-碘化酪氨酸、左旋肌肽、多巴胺、l-o-磷酸絲氨酸、5-羥基吲哚-3-乙酸、p-氨基馬尿酸、吡咯-2-羧酸、dl-2-氨基辛酸、環磷酸鳥苷、5-甲氧基吲哚-3-乙酸、n-甲基胺、皮質酮、3-吲哚乳酸、乙酰谷酰胺、4-乙酰氨基丁酸、吲哚-3-甲醛、吲哚-3-丁酸、s-(5-腺苷)-l-高半胱氨酸、二氫尿嘧啶、二氫胸腺嘧啶、苯乙酰甘氨酸、副黃嘌呤、黃嘌呤核苷、n-乙酰-5-羥胺、1-甲基黃嘌呤、7-甲基黃嘌呤、n-甲酰基犬尿氨酸、脫氧可的松、骨化二醇、7-羥基-4-膽甾烯-3-酮、20alpha-羥基膽固醇、醛固酮、7-酮膽固醇、煙酰甘氨酸、11-酮本膽烷醇酮、n-甘氨酰-l-亮氨酸、孕烯醇酮、睪酮、17alpha-雌二醇、17beta-雌二醇、雄烯二酮、可的松、黃體酮na孕酮、二氫黃體酮、5beta-孕烷-3alpha,20alpha-二醇、l-棕櫚酰肉堿、3-甲氧基腎上腺素、7alpha,25-二羥基膽固醇、1,3,7-三甲基尿酸、(3beta,24s)-膽甾-5-烯-3,24-二醇、11-去氫皮質甾酮、3-羥基馬尿酸、17alpha-羥基妊娠烯醇酮、7a,27-dihydroxycholesterol、二甲基鳥苷、7-甲基鳥嘌呤、n8-乙酰基亞精胺、5
’?
脫氧-5
’?
甲基硫代腺苷、異戊酰肉堿、異丁酰-l-肉堿、月桂酰肉堿/十二烷酰基左旋肉堿、硬脂酰肉毒堿、癸酰氯化肉堿、辛酰氯化肉堿、褪黑素、吲哚-3-羧酸、熊果酸、對-氨基苯甲酸、光素、1,25-二羥基維生素d2、l-正亮氨酸、山楂酸、蛻皮激素、胡椒堿、對甲氧基苯甲酸、alpha-己基肉桂醛、2-苯基乙酰胺、丙二酸二乙酯、異戊胺、酪氨酸甲酯、環己胺、正丁胺、己胺、二苯胺、對甲氧基苯甲醛、二氫茉莉酮酸甲酯、n-苯甲酰-l-酪氨酸乙酯、1-單棕櫚酸、4-戊烯酸、3-硝基酪氨酸、gamma-谷氨酰苯丙氨酸、1-十四酰-2-羥基卵磷脂、緩激肽、5-碘吡啶胞苷、5'-脫氧腺苷、十六碳酰胺、油酸酰胺、7-甲基鳥苷、4-硫尿苷、3-甲基尿苷、5,2'-o-甲基尿苷、n6,n6-二甲基腺苷、o6-甲基鳥苷、5-甲氧羰基甲基尿苷、2-硫胞苷、n6-蘇氨甲酰氨基腺苷、n2,n2,7-三甲基鳥苷、5-甲氧羰基甲基-2-硫尿苷、5-甲氧基尿苷、8-羥基腺苷、n6,2
’?
o-二甲基腺苷、5-甲酰基胞苷、亞油酰胺、組氨酸-氨酸、n-環己基甲酰胺、對甲基苯甲酸、苯丙氨酰氨酸、16alpha羥基雌酮、2-甲氧基雌酮、4-甲氧基雌酮、2-羥基雌酮、beta-吲哚-3-乙酸、l-焦谷氨酸、肉桂酸、4-羥基馬尿酸、5-甲基-2'-脫氧胞苷、n6-甲基-2'-脫氧腺苷、甲瓦龍酸內酯、別孕烯醇酮、奧昔嘌醇、利他寧酸、苯胺、3-(2-羥苯基)丙酸、2-喹啉羧酸、8-氨基辛酸、l-亮氨酸-l-丙氨酸、、5-羥基胺/血清素、l-丙氨酰-l-苯丙氨酸、甘氨酰苯基丙氨酸、甘氨酰-氨酸、吡咯、5alpha-雄甾烷二酮、11-beta-羥基雄酮、2
’?
o-甲基尿苷、鳥苷、3-吲哚乙醇、醋酸甲羥孕酮、脫硫生物素、l-亮氨酸酰基-l-纈氨酸、谷氨酰
基-蛋氨酸、苯丙氨酰蛋氨酸、l-苯丙氨酰-l-亮氨酸、煙酰胺、l-苯丙氨酰基-l-天冬酰胺、冬胺基乙酸-基乙酸、苯丙氨酰纈氨酸、章魚胺、3-甲基羥基吲哚、5-羥基賴氨酸、左甲狀腺素、犬尿喹啉酸/犬尿酸、戊酸、l-甘氨酸-l-異亮氨酸、2
’?
o-甲基鳥苷、3-氯-l-酪氨酸、2-(3,4-二甲氧基苯基)乙胺、6-二甲基氨基嘌呤、2-苯甘氨酸、苯甲酰胺、5-羥基氨酸、維a酸、硫胺素焦磷酸、環二腺苷酸、維生素b6(吡哆醛)、腺嘌呤、胞嘧啶、金雞納酸、d-木糖醛酸、莽草酸、2-氨基乙烷磺酸/牛磺酸、谷氨酸鹽(谷氨酸)、蘇氨酸、絲氨酸、l-天冬酰胺、d-木酮糖5-磷酸、腺苷酸、磷酸二羥丙酮、尿苷5-單磷酸、l-瓜氨酸、脫氧胞苷酸、海藻糖、4-磷酸赤蘚糖、鳥苷酸、nadp、葡萄糖-6-磷酸、磷酸乙醇胺、三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、n-異戊酰氨基乙酸、gama-谷氨酰-丙氨酸、n-乙酰-l-谷氨酸、尿嘧啶、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、肌苷-1-磷酸、3-磷酸甘油、核黃素磷酸鈉、生物素、癸二酸、檸檬酸、5-羥甲基尿嘧啶、山梨酸、古洛糖酸內酯、(3r,4r)-d-赤酮酸內酯、d-葡醛內酯、2-羥基-6-氨基嘌呤、1,5-酐-d-山梨糖醇、dl-水蘇堿、膽堿、甜菜堿醛氯化物、甜菜堿、d-甘露糖、胸腺嘧啶、5-羧基胞苷、尿素、肌酸酐、2'-脫氧胞苷、胞嘧啶核苷、5-羥甲基-2'-脫氧胞苷、5-羥甲基胞苷、n,n-二甲基甘氨酸、亞牛磺酸、肌氨酸、丙氨酸、維生素b6(鹽酸吡哆胺)、氨基甲酰天冬氨酸、乙酰膽堿、甘氨酸、乙酸胍、肉毒堿、4-氨基丁酸/gamma-氨基丁酸、谷氨酰胺、4-羥基-1-l-脯氨酰-l-脯氨酸、l-天冬氨酸、乙醇胺、磷酸膽堿、胞苷一磷酸(cmp)、胱氨酸、精氨基琥珀酸、組胺、itp、s-腺苷甲硫氨酸、鳥氨酸、精氨酸、賴氨酸、高精氨酸、丙氨酰-丙氨酸、瞇基牛磺酸、纈氨酸、脯氨酸、酸、n-乙酰神經氨酸、2-氨基異丁酸、氨基異丁酸、氧化三甲胺、4-羥基-l-脯氨酸、n6-乙酰-l-賴氨酸、肌酸、甘氨酰-l-脯氨酸、同型絲氨酸、蛋氨酸亞砜、β-氨基丙酸、a-氨基已二酸、3-n-甲基-l-組氨酸、高瓜氨酸、5-氨基戊酸、鵝肌肽、高胱氨酸、氧化型谷胱甘肽、胱硫醚、三甲胺、尿苷、n1-甲基肌苷、2
’?
o-甲基肌苷、乙酰肉堿、假尿苷、2-脫氧尿苷、1-甲基腺苷、核黃素-5-磷酸、n-α-乙酰-l-精氨酸、2
’?
o-甲基腺苷、n6-甲基腺苷、1-甲基鳥苷、n2-甲基鳥苷、2'-脫氧鳥苷、5-甲基胞苷、2
’?
o-甲基胞苷、硫胺素單磷酸鹽、硫鳥嘌呤、3-甲基腺嘌呤、四氫吡咯、1-甲基組胺、葫蘆巴堿、n-乙酰基-d-半乳糖胺、三乙胺、5-甲基胞嘧啶、1-甲基腺嘌呤、l-去氧腎上腺素、異胞嘧啶、l-正纈氨酸、d-甘露糖胺、gama-o-十八烷基-l-alpha-溶血卵磷脂、n-乙酰丁二胺。
35.測試：取標準品溶液、處理后的待測血樣本各2微升上機檢測。獲取254個代謝物的各個濃度標準品的對應定量信號的質譜峰強度數據；以外標與內標濃度比或外標濃度（concentration ratio or concentration）為橫坐標，外標與內標峰面積比或外標峰面積（area ratio or area）為縱坐標，繪制如下共254種代謝物的標準曲線，代謝物包括：氨基異丁酸、1,3,7-三甲基尿酸、1,3-二甲基尿酸、1,5-酐-d-山梨糖醇、1,7-二甲基尿酸、順式-10-十七碳烯酸、12,13-dihome、蓖麻油酸、17alpha-雌二醇、17a-羥孕酮、溶血磷脂酰乙醇胺、1-甲基腺苷、1-甲基鳥苷、1-甲基偽尿苷、1-甲基黃嘌呤、1-十四酰-2-羥基卵磷脂、gama-o-十八烷基-l-alpha-溶血卵磷脂、1-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸膽堿、2,5-二羥基苯甲酸、、2-氨基異丁酸、dl-2-氨基辛酸、羥基癸酸、2-羥基十六烷酸、2-羥基-3-甲基丁酸、吲哚-2-羧酸、2-甲氧基苯甲酸、2-甲基丁酰肉堿、alpha-羥基異丁酸、2
’?
o-甲基胞苷、2
’?
o-甲基鳥苷、吡啶甲酸、2-氮己環酮、3-(3-羥基苯基)-3-羥基丙酸、三碘甲狀腺原氨酸、3beta-膽酸、3beta-脫氧膽酸、3-羥基-5-膽甾烯酸酯、3-、3-羥基馬尿酸、3-羥基異戊酸、3-羥基-3-甲基谷氨酸、多巴胺、吲哚-3-丁酸、3-甲氧酪胺、3-甲基羥
基吲哚、3-甲基水楊酸、3-n-甲基-l-組氨酸、3-氧代膽酸、3-氧代-12alpha羥基-24膽酸、dl-3-苯乳酸、4-乙酰氨基丁酸、4-羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸、5
’?
脫氧-5
’?
甲基硫代腺苷、5-甲酰基胞苷、5-羥基賴氨酸、5-甲氧羰基甲基-2-硫尿苷、5-甲基尿苷、7,12-二酮石膽酸、7-羥基-4-膽甾烯-3-酮、7-酮基脫氧膽酸、7-甲基黃嘌呤、8-氨基辛酸、乙酰谷酰胺、對乙酰氨基酚、乙酰肉堿、l-丙氨酰-l-苯丙氨酸、尿囊素、a-氨基已二酸、alpha-己基肉桂醛、alpha-亞麻酸、5alpha-雄甾烷二酮、精氨酸、精氨基琥珀酸、苯甲酸、β-氨基丙酸、beta-吲哚-3-乙酸、甜菜堿、生物素、緩激肽、正丁胺、咖啡酸、、環磷酸鳥苷、鵝脫氧膽酸、鵝去氧膽酸24-酰基-beta-d-葡糖苷酸、膽酸、磷酸膽堿、朱砂精酸、脫氧可的松、皮質酮、氫化可的松、可的松、肌酸、肌酸酐、甜蜜素、環己胺、胞嘧啶核苷、丙氨酰-丙氨酸、癸酰氯化肉堿、脫氫表雄酮、硫酸脫氫表雄酮、去氧皮質酮、(3r,4r)-d-赤酮酸內酯、丙二酸二乙酯、二氫胸腺嘧啶、n,n-二甲基甘氨酸、肉毒堿、月桂酰肉堿/十二烷酰基左旋肉堿、雌酮、乙基丙二酸、3,4,5-三甲氧基苯甲酸、延胡索酸/富馬酸、gama-谷氨酰-丙氨酸、谷氨酰基-蛋氨酸、gamma-谷氨酰苯丙氨酸、谷氨酰胺、戊二酸、3-磷酸甘油、甘氨酸、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨膽酸、甘氨脫氫膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨豬去氧膽酸、甘氨石膽酸、甘氨酰苯基丙氨酸、甘氨酰-氨酸、甘氨酰-l-纈氨酸、鳥苷酸、乙酸胍、鳥嘌呤、鳥苷、十六碳酰胺、十六烷-1,16-二酸、己酰甘氨酸、n-l-gamma-谷氨酰-l-亮氨酸、組氨酸-氨酸、馬尿酸、組氨酸、尿黑酸、高香草酸、苯丙氨酰氨酸、豬脫氧膽酸、亞牛磺酸、次黃嘌呤、吲哚丙酮酸、(e)-3-吲哚丙烯酸、3-吲哚乳酸、肌苷、別異石膽酸、異丁酰-l-肉堿、異胞嘧啶、異石膽酸、異戊酰肉堿、犬尿氨酸、丙氨酸、冬胺基乙酸-基乙酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-瓜氨酸、胱氨酸、l-亮氨酸酰基-l-纈氨酸、l-亮氨酸-l-丙氨酸、乙酰丙酸、谷氨酸鹽(谷氨酸)、高瓜氨酸、高胱氨酸、亞油酰胺、異亮氨酸、羥基異己酸、亮氨酸、蛋氨酸(甲硫氨酸)、l-正亮氨酸、l-棕櫚酰肉堿、脯氨酸、l-焦谷氨酸、光素、纈氨酸、賴氨酸、蛋氨酸亞砜、肌醇、二甲基鳥苷、n2,n2,7-三甲基鳥苷、n2-甲基鳥苷、n6,2
’?
o-二甲基腺苷、n6-乙酰-l-賴氨酸、n6-蘇氨甲酰氨基腺苷、n-α-乙酰-l-精氨酸、n-乙酰-l-谷氨酸、n-乙酰-l-酪氨酸、n-甲酰基犬尿氨酸、煙酰胺、煙酰甘氨酸、23-脫甲脫氧膽酸、十八烷二酸、辛酰氯化肉堿、油酸酰胺、鳥氨酸、棕櫚酰乙醇酰胺(pea)、泛酸、副黃嘌呤、l-苯丙氨酰-l-亮氨酸、苯丙氨酰蛋氨酸、苯丙氨酰苯丙氨酸、苯丙氨酰纈氨酸、苯乙酰甘氨酸、苯氧乙酸、苯乙酰谷氨酰胺、苯丙氨酸、鄰苯二甲酸、胡椒堿、4-羥基-1-l-脯氨酰-l-脯氨酸、2,6
??
二異丙基β
??d??
吡喃葡萄糖酸、原兒茶酸、假尿苷、吡咯-2-羧酸、金雞納酸、2-喹啉羧酸、維a酸、s-(5-腺苷)-l-高半胱氨酸、水楊酸、絲氨酸、5-羥基胺/血清素、莽草酸、亞精胺、dl-水蘇堿、硬脂酰肉毒堿、辛二酸、2-氨基乙烷磺酸/牛磺酸、牛磺-beta－鼠膽酸、牛磺鵝脫氧膽酸、牛磺膽酸、牛磺脫氫膽酸、牛磺脫氧膽酸、睪酮、蘇氨酸、甲狀腺素、4-羥基-l-脯氨酸、反式-烏頭酸、海藻糖、葫蘆巴堿、氧化三甲胺、氨酸、酪氨酸、尿苷5-單磷酸、尿嘧啶、尿素、尿苷、尿刊酸、熊膽酸、黃尿酸/黃嘌呤酸、d-木糖醛酸。
36.本項目所檢測的部分代謝物的標準曲線現行方程及相關系數見下表。
37.注：index：物質簡稱；equation為線性方程；r為相關系數（coefficient of correlation）；weighting為權重；lloq(ng/ml)和uloq(ng/ml)分別是定量下限和定量上限，兩者范圍內可準確定量。
38.將檢測到的所有樣本的積分峰面積代入標準曲線線性方程進行計算，進一步代入計算公式計算后，最終得到實際樣本中該物質的含量數據。注意：計算公式已進行單位換算，直接將對應數值代入即可得到樣本含量。
39.樣本中各物質的含量（ng/ml）= c
×
v1/1000/v2公式中各字母含義：c：樣本中積分峰面積代入標準曲線得到的濃度值（ng/ml）；v1：提取液總體積（μl）；v2：移取的樣本量（ml）。
40.3、篩選可用于預測房顫風險的標志物（1）樣本質控分析
以混合溶液作為qc樣本，在儀器分析過程中，每隔10個檢測分析樣本插入一個質控樣本，通過對同一質控樣本質譜檢測分析的總離子流圖（tic）進行重疊展示分析，如圖1所示，代謝物檢測總離子流的曲線重疊性高，即保留時間和峰強度均一致，表明質譜對同一樣品不同時間檢測時，信號穩定性較好。
41.對qc樣本進行皮爾遜（pearson）相關性分析，如圖2所示，對角線方格代表qc樣本名稱；對角線左下角方格為對應qc樣本相關性散點圖，橫縱坐標分別為代謝物含量，圖中每個點代表一個代謝物；對角線右上角方格為對應qc樣本相關性系數。qc樣本相關性高（ | r | 接近于 1 ），說明整個檢測過程穩定性好，數據質量高。
42.cv值即變異系數（coefficient of variation），是原始數據標準差與原始數據平均數的比，可反映數據離散程度。使用經驗累積分布函數（empirical cumulative distribution function, ecdf）分析對照組（sn）、實驗組（saf）和qc樣本（qc）小于參考值的物質cv出現的頻率，qc樣本的cv值較低的物質占比越高，代表實驗數據越穩定：qc樣本cv值小于0.3的物質占比高于80%，表明實驗數據穩定；qc樣本cv值小于0.2的物質占比高于80%，表明實驗數據非常穩定。結果見圖3所示，橫坐標代表cv值，縱坐標表示小于對應cv值的物質數目占總物質數的比例，不同顏代表不同的分組樣本，qc為質控樣本，其中與x軸垂直的兩條參考線對應的cv值為0.2和0.3，與x軸平行的參考線對應物質數目占總物質數的80%。結果顯示，qc樣本cv值小于0.2的物質占比高于80%，表明實驗數據非常穩定。
43.（2）數據統計分析對實驗組數據、對照組數據和qc樣本數據進行主成分分析（principal component analysis，pca）以便初步了解各組樣本之間的總體代謝差異和組內樣本之間的變異度大小，進行正交偏最小二乘判別分析（opls-da）以便尋差異代謝物，opls-da在原始數據進行log2轉換后，再進行中心化處理（mean centering），然后利用r軟件中的 metaboanalystr 包 oplsr.anal 函數進行分析，根據opls-da模型分析代謝組數據，繪制各分組的得分圖，進一步展示各個分組之間的差異(th
é
venot et al., 2015)。基于opls-da模型的變量投影重要性(vip)可以初步篩選出不同品種或組織間差異的代謝物。vip值表示對應代謝物的組間差異在模型中各組樣本分類判別中的影響強度，一般認為vip ≥ 1的代謝物則為差異顯著。同時結合單變量分析的p-value來進一步篩選出差異代謝物，獲得造成患者和對照受試者的代謝譜掃描差異的代謝物。
44.結果顯示，肌醇、油酸酰胺、1,3-二甲基尿酸、賴氨酸、4-羥基苯甲醛、3-羥基-5-膽甾烯酸酯、尿嘧啶、尿刊酸、鄰苯二甲酸、原兒茶酸、鳥氨酸、乙酰谷酰胺、2-甲氧基苯甲酸、異胞嘧啶、n-乙酰-l-酪氨酸、2'-o-甲基胞苷、肌醇、l-亮氨酸、1,5-酐-d-山梨糖醇、精氨酸、甲硫氨酸的vip ≥1，為差異代謝產物。
45.3、為了評估上述差異代謝物作為生物標志物的潛能，將獲取的101例實驗組人數據及101例對照人數據通過軟件進行編輯，獲得roc(receiver operator characteristic curve)曲線。
46.roc曲線的繪制可以使用現有技術領域的軟件或系統，比如spss 9.0、r0cp0wer.sas、designr0c.for、r
??
studio等等。本實施例中繪制roc曲線使用的軟件r
??
studio。
47.roc 曲線是反映真陽性率(靈敏度，又稱敏感性，sensitivity)和假陽性率(特異
性，specificity)連續變量的綜合指標，是用構圖法揭示靈敏度和特異性的相互關系。是以靈敏度為縱坐標、特異性為橫坐標繪制的曲線，曲線下面積(auc)越大，診斷準確性越高。
48.其中，對照人和房顫人的水平值均取中位數（第25百分位數，第75百分位數），以及單變量分析的p值，見下表所示。
49.參考值范圍是對照人通過大量人實驗檢測后所得水平值取5-95%區間，見下表所示。
50.其中，表格顯示參考值范圍是第5百分位數（參考值下限）-第95百分位數（參考值上限）。
51.結果顯示，10種代謝物均顯示大于0.80的auc，如圖4-8所示，鳥氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、n-乙酰-l-酪氨酸、肌醇、精氨酸、甲硫氨酸的水平在房顫患者中顯著下降，auc分別是0.951、0.913、0.953、0.899、0.822、0.8、0.896、0.815。異胞嘧啶和2'-o-甲基胞苷在房顫患者中顯著上升，auc分別是0.813和0.832。
52.組合1（即精氨酸、鳥氨酸、乙酰谷氨酸和甲硫氨酸的組合）的水平用于診斷心房顫動的準確性明顯提高，auc高達至0.96；組合2（即鳥氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、異胞嘧啶、n-乙酰-l-酪氨酸、2'-o-甲基胞苷、肌醇、尿刊酸、l-亮氨酸、1,5-酐-d-山梨糖醇和精氨酸的組合）以及組合3（即鳥氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、異胞嘧啶、n-乙酰-l-酪氨酸、2'-o-甲基胞苷、肌醇、尿刊酸、l-亮氨酸、1,5-酐-d-山梨糖醇、精氨酸和甲硫氨酸的組合）的水平用于診斷心房顫動的準確性明顯提高，auc高達0.996和0.994（cl0.986-1.000）。
53.而其余代謝物單獨預測的auc均小于0.8，均未顯示良好的預測能力。
54.實施例2 采用生物標志物預測心房顫動心臟外科術后（冠狀動脈旁路移植手術）病人3例，在術前按照實施例1的方法分別采集患者空腹狀態下靜脈血1ml，3000 rpm
×
10min 離心后留取上清于-80℃凍存，然后測試血清中精氨酸、鳥氨酸、乙酰谷氨酸、甲硫氨酸、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、異胞嘧啶、n-乙酰-l-酪氨酸、2'-o-甲基胞苷、肌醇、尿刊酸、l-亮氨酸和1,5-酐-d-山梨糖醇的水平。術前病例1提前進行藥物干預，干預方法為：口服200mg制劑的胺碘酮(可達龍)一天兩次，一次一片。病例2和3未進行藥物干預。
55.其中，對于病例2來說，血清中鳥氨酸、乙酰谷酰胺、尿嘧啶、2-甲氧基苯甲酸、n-乙酰-l-酪氨酸、肌醇、異胞嘧啶、2'-o-甲基胞苷、精氨酸和甲硫氨酸等的水平均在對照人的參考值范圍內，預測不具有發生心房顫動的風險。經證實該病例心臟術后未發生房顫，預測結果與實際結果相一致。
56.病例3經檢測鳥氨酸的水平低于參考值下限，預測具有發生心房顫動的風險，術前未進行藥物干預，術后房顫持續時間較長，為36小時。
57.病例1經檢測血清中精氨酸、鳥氨酸、乙酰谷氨酸、甲硫氨酸和肌醇的水平均低于參考值下限，預測具有發生心房顫動的風險，術前進行藥物干預，術后房顫持續時間較短，為6小時。
58.由此說明，通過檢測本發明所限定的生物標志物為心房顫動發生風險和預防提供有效信息，有利于實現對心臟外科術后心房顫動患者的預防性，從而改善患者生存質量。
59.顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明創造的保護范圍之中。
