一種菌酶酸復合制劑及其應用的制作方法
1.本發明屬于飼料添加劑技術領域，具體涉及一種菌酶酸復合制劑及其應用。
背景技術：
2.飼料原料常見的霉菌毒素來源有：曲霉菌屬(aspergillus，主要分泌黃曲霉毒素等)、青霉菌屬(penicillium，主要分泌赭曲霉毒素、桔霉素等)、鐮刀菌屬(fusarium，主要分泌嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、t-2毒素等)和鐮刀菌、赭曲霉、桔青霉屬(主要分泌麥角毒素)等。霉菌的大量繁殖會引起飼料發生霉變，這不僅會使飼料的適口性降低，而且還會影響畜禽的采食量，同時由于霉菌的生長和繁殖是通過飼料中的營養成分來供給，因此霉變還會降低飼料的營養價值。另外，霉菌在代謝過程中產生霉菌毒素，而霉菌毒素在畜禽采食后不僅會影響畜禽的免疫機能，高劑量的霉菌毒素還會導致畜禽發生中毒現象。據統計，有66％以上的飼料原料至少存在1種霉菌毒素污染，35％的飼料原料存在2種以上霉菌毒素污染，而玉米粕、豆粕及麩皮等霉菌毒素的含量是整粒谷物含量的30～500倍，幾乎所有的花生粕都存在霉菌毒素污染，飼料霉變嚴重危害飼料業及畜牧業。
3.為此，急需開發能夠抑制飼料原料中有害霉菌的綠產品，以提高飼料產品的安全性，減少公共危害。
技術實現要素：
4.本發明的目的是提供一種能夠抑制多種霉菌生長繁殖的飼料添加劑。
5.為此，本發明提供了一種菌酶酸復合制劑，包括：3-4份葡萄糖氧化酶、3-4份凝結芽孢桿菌、1-2份乳酸制劑和0-2份載體。
6.具體的，上述葡萄糖氧化酶的酶活為8000u/g。
7.具體的，上述凝結芽孢桿菌的菌活為1.0
×
10
10
cfu/ml。
8.具體的，上述乳酸制劑中乳酸質量濃度為25％。
9.本發明還提供了一種抑制飼料中鐮刀菌、赭曲霉、桔青霉生長繁殖的方法，包括以下步驟：將上述菌酶酸復合制劑加入到生理鹽水中，搖床提取后離心取上清液，得到菌酶酸復合制劑溶液，將所述菌酶酸復合制劑溶液加入到飼料中混勻。
10.具體的，以飼料質量計，所述菌酶酸復合劑溶液的添加量為0.48％-1.6％。
11.與現有技術相比，本發明具有以下優點和有益效果：
12.本發明提供的這種菌酶酸復合制劑可顯著抑制鐮刀菌、赭曲霉、桔青霉的生長繁殖，將其作為添加劑加入飼料中，能夠從源頭抑制鐮刀菌、赭曲霉、桔青霉，有效去除飼料中相應酶菌毒素的累積，可提高飼料產品的安全性，減少公共危害。
13.以下將結合附圖對本發明做進一步詳細說明。
附圖說明
14.圖1是本發明實施例3中不同試驗組桔青霉生長情況；a、試驗組1；b、試驗組2、c、試
驗組3；d、試驗組4；e、試驗組5；f、試驗組6；g、陽性對照；h、陰性對照。
15.圖2是本發明實施例3中不同對照組桔青霉生長情況；a、對照組1；b、對照組2、c、對照組3。
16.圖3是本發明實施例3中不同試驗組赭曲霉生長情況；a、試驗組1；b、試驗組2、c、試驗組3；d、試驗組4；e、試驗組5；f、試驗組6；g、陽性對照；h、陰性對照。
17.圖4是本發明實施例3中不同對照組赭曲霉生長情況；a、對照組1；b、對照組2、c、對照組3。
18.圖5是本發明實施例3中不同試驗組鐮刀菌生長情況；a、試驗組1；b、試驗組2、c、試驗組3；d、試驗組4；e、試驗組5；f、試驗組6；g、陽性對照；h、陰性對照。
19.圖6是本發明實施例中3不同對照組鐮刀菌生長情況；a、對照組1；b、對照組2、c、對照組3。
具體實施方式
20.下面將結合實施例對本發明中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。盡管已經詳細描述了本發明的代表性實施例，但是本發明所屬技術領域的普通技術人員將理解，在不脫離本發明范圍的情況下可以對本發明進行各種修改和改變。因此，本發明的范圍不應局限于實施方案，而應由所附權利要求及其等同物來限定。
21.下面通過具體實施例對本發明的菌酶酸復合制劑的效果進行研究，本發明實施例中使用的乳酸制劑中乳酸質量濃度為25％。
22.實施例1：
23.本實施例提供了一種菌酶酸復合制劑，包括：3份葡萄糖氧化酶、4份凝結芽孢桿菌、2份乳酸制劑和2份淀粉。
24.其中葡萄糖氧化酶的酶活為8000u/g，凝結芽孢桿菌的菌活為1.0
×
1010cfu/ml。
25.實施例2：
26.本實施例提供了一種菌酶酸復合制劑，包括：4份葡萄糖氧化酶、3份凝結芽孢桿菌、1份乳酸和1份淀粉。
27.其中葡萄糖氧化酶的酶活為8000u/g，凝結芽孢桿菌的菌活為1.0
×
1010cfu/ml。
28.實施例3：
29.本實施例研究了酶酸復合制劑對鐮刀菌、赭曲霉、桔青霉的抑制作用，具體步驟如下。
30.1、配制培養基
31.pda培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水補足至1000ml。液體培養基不添加瓊脂。
32.察氏培養基：：硝酸鈉3g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂(mgso4·
7h2o)0.5g，氯化鉀0.5g，硫酸亞鐵0.01g，蔗糖30g，瓊脂15～20g，蒸餾水補足至1000ml。液體培養基不添加瓊脂。
33.ypd培養基：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％瓊脂粉。液體培養基不添加瓊脂。
34.2、實驗試劑配制
35.制備菌酶酸復合制劑溶液：稱取1g實施例1提供的酶酸復合制劑，加入99ml滅菌的生理鹽水，于搖床提取30min，離心取上清，再用滅菌生理鹽水稀釋至不同濃度，備用。
36.制備鐮刀菌懸液：將鐮刀菌接種于50ml pda液體培養基中，置于28℃培養72h左右，觀察菌懸液渾濁度，選擇對數期菌液作為試驗菌懸液備用。
37.制備赭曲霉菌懸液：將赭曲霉接種于50ml察氏液體培養基中，置于28℃培養72h左右，觀察菌懸液渾濁度，選擇對數期菌液作為試驗菌懸液備用。
38.制備桔青霉菌懸液：將桔青霉接種到ypd斜面，置于28℃培養72h左右，用無菌生理鹽水從斜面洗脫菌液，作為備用菌懸液。
39.制備葡萄糖氧化酶溶液：稱取1g酶活為8000u/g的葡萄糖氧化酶，加入99ml滅菌的生理鹽水，于搖床提取30min，離心取上清，再用滅菌生理鹽水稀釋至不同濃度，備用。
40.制備凝結芽孢桿菌溶液：稱取1g菌活為1.0
×
1010cfu/ml的凝結芽孢桿菌，加入99ml滅菌的生理鹽水，于搖床提取30min，離心取上清，再用滅菌生理鹽水稀釋至不同濃度，備用。
41.制備乳酸溶液：稱取1g乳酸，加入99ml滅菌的生理鹽水，于搖床提取30min，離心取上清，再用滅菌生理鹽水稀釋至不同濃度，備用。
42.3、平板混菌實驗
43.(1)桔青霉組
44.取11個pda平板培養基，分別作為陰性對照組、陽性對照組、試驗組1-6和對照組1-3，每個平板中菌酶酸復合制劑溶液和桔青霉菌懸液的添加量如下，其中菌酶酸復合制劑的濃度為相對于平板中培養基的體積濃度。
45.陽性對照：加入1ml的桔青霉菌懸液；
46.陰性對照：加入1ml經煮沸5分鐘滅活的桔青霉菌懸液；
47.試驗組1：加入1ml的桔青霉菌懸液和0.08％的菌酶酸復合制劑溶液；
48.試驗組2：加入1ml的桔青霉菌懸液和0.16％的菌酶酸復合制劑溶液；
49.試驗組3：加入1ml的桔青霉菌懸液和0.32％的菌酶酸復合制劑溶液；
50.試驗組4：加入1ml的桔青霉菌懸液和0.48％的菌酶酸復合制劑溶液；
51.試驗組5：加入1ml的桔青霉菌懸液和0.64％的菌酶酸復合制劑溶液；
52.試驗組6：加入1ml的桔青霉菌懸液和1.6％的菌酶酸復合制劑溶液；
53.對照組1：加入1ml的桔青霉菌懸液和1.6％的葡萄糖氧化酶溶液；
54.對照組2：加入1ml的桔青霉菌懸液和1.6％的凝結芽孢桿菌溶液；
55.對照組3：加入1ml的桔青霉菌懸液和1.6％的乳酸溶液。
56.將各組均置于28℃搖床培養72h，觀察桔青霉的生長情況，結果如圖1-2所示。6個試驗組桔青霉平板上均未正常生長，但加入到平板中的菌絲周邊有氣泡，可能菌體未被殺死或完全抑制，仍有活力，但生長十分緩慢，已無法繁殖。陽性對照組和對照組1-4中桔青霉生長旺盛。
57.檢測各試驗組和對照組對桔青霉cgmcc 3.10140抑菌率，結果如表1所示。
58.表1桔青霉抑菌率檢測結果
[0059] 抑菌率試驗組190％
試驗組292％試驗組397％試驗組499％試驗組5100％試驗組6100％對照組130％對照組215％對照組310％
[0060]
(2)赭曲霉組
[0061]
取11個察氏平板培養基，分別作為陰性對照組、陽性對照組、試驗組1-6和對照組1-3，每個平板中菌酶酸復合制劑溶液和赭曲霉菌懸液的添加量如下，其中菌酶酸復合制劑的濃度為相對于平板中培養基的體積濃度。
[0062]
陽性對照：加入1ml的赭曲霉菌懸液；
[0063]
陰性對照：加入1ml經煮沸5分鐘滅活的赭曲霉菌懸液；
[0064]
試驗組1：加入1ml的赭曲霉菌懸液和0.08％的菌酶酸復合制劑溶液；
[0065]
試驗組2：加入1ml的赭曲霉菌懸液和0.16％的菌酶酸復合制劑溶液；
[0066]
試驗組3：加入1ml的赭曲霉菌懸液和0.32％的菌酶酸復合制劑溶液；
[0067]
試驗組4：加入1ml的赭曲霉菌懸液和0.48％的菌酶酸復合制劑溶液；
[0068]
試驗組5：加入1ml的赭曲霉菌懸液和0.64％的菌酶酸復合制劑溶液；
[0069]
試驗組6：加入1ml的赭曲霉菌懸液和1.6％的菌酶酸復合制劑溶液；
[0070]
對照組1：加入1ml的赭曲霉菌懸液和1.6％的葡萄糖氧化酶溶液；
[0071]
對照組2：加入1ml的赭曲霉菌懸液和1.6％的凝結芽孢桿菌溶液；
[0072]
對照組3：加入1ml的赭曲霉菌懸液和1.6％的乳酸溶液。
[0073]
將各組均置于28℃搖床培養72h，觀察赭曲霉的生長情況，結果如圖3-4所示。6個試驗組平板上均未見赭曲霉生長，跟陰性對照一致，說明菌酶酸產品對赭曲霉抑制效果明顯。陽性對照組和對照組1-4中赭曲霉生長旺盛。
[0074]
檢測各試驗組和對照組對赭曲霉cgmcc 3.6255抑菌率，結果如表2所示。
[0075]
表2赭曲霉抑菌率檢測結果
[0076]
[0077][0078]
(3)鐮刀菌組
[0079]
取11個ypd平板培養基，分別作為陰性對照組、陽性對照組、試驗組1-6和對照組1-3，每個平板中菌酶酸復合制劑溶液和鐮刀菌菌懸液的添加量如下，其中菌酶酸復合制劑的濃度為相對于平板中培養基的體積濃度。
[0080]
陽性對照：加入1ml的鐮刀菌菌懸液；
[0081]
陰性對照：加入1ml經煮沸5分鐘滅活的鐮刀菌菌懸液；
[0082]
試驗組1：加入1ml的鐮刀菌菌懸液和0.08％的菌酶酸復合制劑溶液；
[0083]
試驗組2：加入1ml的鐮刀菌菌懸液和0.16％的菌酶酸復合制劑溶液；
[0084]
試驗組3：加入1ml的鐮刀菌菌懸液和0.32％的菌酶酸復合制劑溶液；
[0085]
試驗組4：加入1ml的鐮刀菌菌懸液和0.48％的菌酶酸復合制劑溶液；
[0086]
試驗組5：加入1ml的鐮刀菌菌懸液和0.64％的菌酶酸復合制劑溶液；
[0087]
試驗組6：加入1ml的鐮刀菌菌懸液和1.6％的菌酶酸復合制劑溶液；
[0088]
對照組1：加入1ml的鐮刀菌菌懸液和1.6％的葡萄糖氧化酶溶液；
[0089]
對照組2：加入1ml的鐮刀菌菌懸液和1.6％的凝結芽孢桿菌溶液；
[0090]
對照組3：加入1ml的鐮刀菌菌懸液和1.6％的乳酸溶液。
[0091]
將各組均置于28℃搖床培養72h，觀察鐮刀菌的生長情況，結果如圖5-6所示。添加量在0.08％-0.32％的試驗組1-3鐮刀菌抑制率在50％以上，添加量0.48％-1.6％的試驗組4-6能完全抑制鐮刀菌。陽性對照組和對照組1-4中桔青霉生長旺盛。檢測各試驗組和對照組對鐮刀菌cgmcc 3.4610抑菌率，結果如表3所示。
[0092]
表3鐮刀菌抑菌率檢測結果
[0093]
[0094][0095]
綜上所述，添加量不低于0.48％時，菌酶酸復合制劑對鐮刀菌、赭曲霉、桔青霉的生長抑制效果顯著。
[0096]
以上例舉僅僅是對本發明的舉例說明，并不構成對本發明的保護范圍的限制，凡是與本發明相同或相似的設計均屬于本發明的保護范圍之內。
