UPLC-MS/MS法同時測定人血漿中纈沙坦、沙庫巴曲及其代謝物濃度的方法
uplc-ms/ms法同時測定人血漿中纈沙坦、沙庫巴曲及其代謝物濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域
1.本發(fā)明涉及一種檢測人血漿中藥物濃度的方法，具體涉及一種 uplc-ms/ms法同時測定人血漿生物樣品中纈沙坦、沙庫巴曲及其代謝物 lbq657濃度的方法。
背景技術(shù)：
2.沙庫巴曲/纈沙坦(lcz696，商品名諾欣妥)是一種雙重的血管緊張素受體拮抗劑(arb)和腦啡肽酶抑制劑(nepi)，通過降低射血分?jǐn)?shù)不僅有利于心力衰竭，而且可能對高血壓也有效。lcz696由沙庫巴曲(nepi 的一種非活性前藥)和纈沙坦(一種arb)組成，摩爾比為1:1。經(jīng)口服后，沙庫巴曲和纈沙坦迅速被吸收并分解為沙庫巴曲和纈沙坦，沙庫巴曲迅速轉(zhuǎn)化為lbq657(nepi的活性代謝物)。沙庫巴曲和纈沙坦主要通過腎臟途徑排泄。沙庫巴曲和纈沙坦在射血分?jǐn)?shù)減少的心力衰竭、高血壓伴腎功能不全、腎功能損害、血液透析伴心衰的患者中的藥代動力學(xué)已有報道。然而，沙庫巴曲和纈沙坦在經(jīng)腹膜透析的終末期腎病患者中的藥代動力學(xué)尚不清楚。
3.為了調(diào)查經(jīng)腹膜透析的終末期腎病患者中纈沙坦、沙庫巴曲的藥物動力學(xué)，需要建立一種快速、敏感、準(zhǔn)確uplc-ms/ms方法來檢測口服lcz696 后血漿中纈沙坦、沙庫巴曲和lbq657的濃度。
4.uplc-ms/ms提高了分析通量，節(jié)省了樣品和溶劑分析時間。例如文獻 1(cn110031568a)提供了一種uplc-ms/ms測定了人血漿生物樣品中的纈沙坦、沙庫巴曲、lbq657的方法，使用的內(nèi)標(biāo)纈沙坦-d3，內(nèi)標(biāo)與待測物只相差3個質(zhì)量數(shù)，但彼此之間的干擾大；流動相的洗脫方法為等度洗脫。但等度洗脫對于譜柱來說極容易殘留生物樣品中的物質(zhì)，極容易造成譜柱的損壞；此外等度洗脫的峰寬較梯度洗脫寬，靈敏度不如梯度洗脫的高，需要加大進樣量，對于質(zhì)譜的污染大大增加。uplc-ms/ms檢測方法若采用梯度洗脫的方法，為了實現(xiàn)良好的重現(xiàn)性，對于流動相的選擇要求更高；另外，uplc-ms/ms應(yīng)用梯度洗脫時極容易殘留，并且主要是殘留在進樣閥，要解決殘留問題，就要對流動相性質(zhì)及其起始比例、洗針液及其洗針程序、進樣閥的轉(zhuǎn)動等有更高要求。文獻2(raja harandha等發(fā)表的文章 development and validation of a reliable and rapid lc-ms/ms method forsimultaneous quantification of sacubitril and valsartan in rat plasma and itsapplication to a pharmacokinetic study.[j]biomedical chromatography,2016) 采用甲酸-乙腈蛋白沉淀法，并采用uplc-ms/ms檢測大鼠血漿樣品中的沙庫巴曲和纈沙坦。該方法雖然采用蛋白沉淀法，但是并未對處理后的樣品進行稀釋，后續(xù)一方面會對譜柱造成較大破壞，另一方面也會因為樣品中的雜質(zhì)較多對液相系統(tǒng)和質(zhì)譜造成堵塞。文獻3(cn112415114a)雖然給出同時定量檢測健康人血漿中纈沙坦、沙庫巴曲和lbq657濃度的方法，但其中纈沙坦的定量上限(uloq)為16000ng/ml、沙庫巴曲的定量上限(uloq) 為4000ng/ml和lbq657的定量上限(uloq)為8000ng/ml。文獻4 (cn112415114a)采用hplc-ms/ms法測定心衰患者中經(jīng)血液透析后血漿和超濾液中纈沙坦和lbq657的濃度，兩個分析物的
血漿uloq均為7500 ng/ml；文獻5([j].中國臨床藥理學(xué)與學(xué),2010,15(07):809-813)快速靈敏的lc-ms/ms法測定人血漿中纈沙坦?jié)舛龋m然采用的進樣量有所減少，但線性范圍大大減小，纈沙坦的定量上限僅為3100ng/ml。
[0005]
慢性腎衰終末期病人的三個化合物的線性范圍難以預(yù)測，且三個化合物的線性范圍差異大，這對于同時測定三個化合物的難度進一步加大。
[0006]
文獻6([j].華西藥學(xué)雜志,2014,29(03):295-297.doi:10.13375/j.cnki. wcjps.2014.03.021)lc-ms/ms法測定人血漿中的纈沙坦及其人體生物等效性，采取的血漿樣品量為0.5ml，但還會造成儀器中較多樣品殘留，減少儀器使用壽命；以及文獻7([j].中國藥房,2016,27(05):619-621)lc-ms/ms法測定人血漿及尿液中纈沙坦的濃度及其藥動學(xué)研究，采用的處理方式過于復(fù)雜，步驟過多容易出錯。
[0007]
因此，目前已有的檢測人血漿中纈沙坦、沙庫巴曲及l(fā)bq657濃度的方法并不適用于慢性腎衰患者臨床藥代動力學(xué)研究的樣本檢測。本領(lǐng)域急需能夠用于檢測慢性腎病終末期患者血漿中纈沙坦、沙庫巴曲和lbq657的濃度的快速靈敏的方法，同時還需解決殘留問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
[0008]
本發(fā)明的目的是提供一種uplc-ms/ms法同時測定人血漿生物樣品中纈沙坦、沙庫巴曲及其代謝物lbq657濃度的方法，解決了不能快速靈敏地同時檢測慢性腎病終末期患者血漿中纈沙坦、沙庫巴曲和lbq657濃度的問題。本發(fā)明應(yīng)用了梯度洗脫的方式，并解決了化合物的殘留，而且進樣量比較少大大降低對儀器的污染。
[0009]
為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種uplc-ms/ms法同時測定人血漿生物樣品中纈沙坦、沙庫巴曲及其代謝物lbq657濃度的方法，該方法針對的是慢性腎病終末期患者血漿樣品；該方法包含：采用乙腈蛋白沉淀法對樣品進行前處理，樣品前處理后采用等體積的稀釋劑進行稀釋，其中所述稀釋劑為50％乙腈-0.1％甲酸水(體積百分?jǐn)?shù))；采用超高效液相譜串聯(lián)質(zhì)譜對稀釋后的樣品進行檢測：溫度：40℃，流動相：a相0.1％甲酸水溶液，b 相是體積比為50:50:0.2的甲醇-乙腈-甲酸，洗脫方式：梯度洗脫。
[0010]
其中洗脫梯度洗脫條件：
[0011]
0min時，流動相流速為0.3ml/min，流動相中的b相含量65％；
[0012]
1.50min時，流動相流速為0.3ml/min，流動相中的b相含量80％；
[0013]
2.00min時，流動相流速為0.3ml/min，流動相中的b相含量98％；
[0014]
2.60min時，流動相流速為0.3ml/min，沖洗自動進樣器高壓閥；
[0015]
2.61～3.00min時，流動相流速為0.6ml/min，流動相中的b相含量98％；
[0016]
3.01min時，流動相流速為0.6ml/min，流動相中的b相含量65％；
[0017]
3.51min時，流動相流速為0.3ml/min，流動相中的b相含量65％；
[0018]
4.00min時，流動相流速為0.3ml/min，停止進樣。
[0019]
所述的流動相b相的含量是體積百分?jǐn)?shù)；a相的含量為1-b相含量。在反相譜柱起始梯度設(shè)置成65％的b相，是讓目標(biāo)化合物有保留；0-1.5min 流動相b相梯度的上升是將目標(biāo)化合物纈沙坦、沙庫巴曲和lbq657洗脫出來；1.50-3min 98％的b相是將譜柱脂溶性的雜質(zhì)洗脫出來，3.01-4min的 b相恢復(fù)成起始梯度65％，是為了平衡譜柱。
[0020]
所述的超高效液相譜串聯(lián)質(zhì)譜中，高效液相譜儀是島津lc-30ad 超高效液相譜，串聯(lián)質(zhì)譜儀是日本島津公司8060型串聯(lián)質(zhì)譜儀。
[0021]
優(yōu)選地，所述的高效液相譜儀，譜柱：acquityuplc beh c
18
，規(guī)格為2.1mm
×
50mm，1.7μm。
[0022]
優(yōu)選地，所述的高效液相譜儀，配有自動進樣器，該自動進樣器為 sil-30ac ht自動進樣器。
[0023]
優(yōu)選地，所述的所述串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有turbo ionspray離子源以及 labsolutions 6.70數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。
[0024]
優(yōu)選地，所述的所述串聯(lián)質(zhì)譜儀，輔助數(shù)據(jù)處理軟件為microsoft office。
[0025]
優(yōu)選地，所述的自動進樣器溫度設(shè)為15℃。
[0026]
優(yōu)選地，所述的超高效液相譜串聯(lián)質(zhì)譜的進樣溶劑含有機相比例超過了75％。該進樣溶劑中含有的機相比例指的是樣品沉淀離心后取上清與稀釋劑等比例混勻之后的有機相體積百分含量，樣品沉淀離心后上清液的有機相含量幾乎是100％。在反相高效液相譜的使用過程中，如果采用梯度洗脫，則進樣溶劑有機相的比例要求高于流動相有機相的初始比例，不然會有嚴(yán)重的溶劑效應(yīng)，導(dǎo)致譜峰變形。
[0027]
所述的超高效液相譜串聯(lián)質(zhì)譜，在洗針時，洗針程序為：洗針液r0及外置泵r3連通的溶液均為甲醇-乙腈-異丙醇-水-甲酸(25:25:25:25:1,v/v)，洗針程序為洗針液r0清洗進樣針的外壁，進樣前后各潤洗3s，洗針?biāo)俣?5 μl/s，洗針體積500μl，外置泵r3的程序為清洗泵-》清洗進樣口，用于進一步在進樣前后清洗進樣針的外壁。所述的清洗泵-》清洗進樣口的具體操作就是在液相采集方法中自動進樣器洗針程序中增設(shè)外置泵r3用來在進樣前后清洗進樣針的外壁。
[0028]
所述的超高效液相譜串聯(lián)質(zhì)譜的分析中所用內(nèi)標(biāo)為待分析物的氘代衍生物，選用纈沙坦-d9、沙庫巴曲-d4和lbq657-d4。
[0029]
所述的超高效液相譜串聯(lián)質(zhì)譜的進樣量為0.5μl。所述的進樣量是血漿樣本已經(jīng)經(jīng)過蛋白沉淀并進行稀釋處理后進樣到液質(zhì)聯(lián)用儀器分析所用的量。
[0030]
本發(fā)明提供了一種所述的uplc-ms/ms法同時測定人血漿生物樣品中纈沙坦、沙庫巴曲及其代謝物lbq657濃度的方法在纈沙坦、沙庫巴曲及其代謝物lbq657臨床藥代動力學(xué)研究中的用途。
[0031]
本發(fā)明的一種uplc-ms/ms法同時測定人血漿生物樣品中纈沙坦、沙庫巴曲及其代謝物lbq657濃度的方法，解決了不能快速靈敏地同時檢測慢性腎病終末期患者血漿中纈沙坦、沙庫巴曲和lbq657濃度的問題。具有以下優(yōu)點：
[0032]
1、本發(fā)明前處理采用乙腈作為沉淀劑，并進一步稀釋進樣，采用1：1 稀釋比例，進樣量僅為0.5μl，大大降低了對儀器的污染。
[0033]
2、本發(fā)明與現(xiàn)有文獻相比，血漿樣本量(前處理過程中每一個樣本的血漿用量)為0.05ml，從源頭上減少了儀器中樣品殘留，延長了儀器使用壽命。
[0034]
3、本發(fā)明使用內(nèi)標(biāo)纈沙坦-d9，可以大大減少纈沙坦與內(nèi)標(biāo)之間的干擾。
[0035]
4、傳統(tǒng)的血漿檢測方法存在明顯的纈沙坦殘留，本發(fā)明采用外置泵洗滌進樣針、增加自動進樣器高壓閥的沖洗與梯度洗脫結(jié)合的辦法，初始有機相得比例由40％提高到65％。
[0036]
5、本發(fā)明所測量的為腹膜透析患者血漿中纈沙坦、沙庫巴曲和lbq657 濃度，由于患者具有慢性腎病，導(dǎo)致三個化合物的代謝周期延長，藥物的峰值濃度更大，因而具有更大的線性范圍。
[0037]
6、本發(fā)明應(yīng)用于終末期腎病患者的血樣分析，分析腹膜透析對藥物的代謝的影響以及腹膜透析患者腎功能對藥物清除的影響，定量上限進一步提高。
附圖說明
[0038]
圖1為本發(fā)明纈沙坦、沙庫巴曲和lbq657和內(nèi)標(biāo)纈沙坦-d9、沙庫巴曲
??
d4和lbq-d4的二級全掃描質(zhì)譜圖一。圖中(a)纈沙坦、(b)沙庫巴曲、 (c)lbq657。橫坐標(biāo)：質(zhì)荷比；縱坐標(biāo)：強度。
[0039]
圖2為本發(fā)明纈沙坦、沙庫巴曲和lbq657和內(nèi)標(biāo)纈沙坦-d9、沙庫巴曲
??
d4和lbq-d4的二級全掃描質(zhì)譜圖二。圖中(d)纈沙坦-d9、(e)沙庫巴曲-d4、 (f)lbq657-d4。橫坐標(biāo)：質(zhì)荷比；縱坐標(biāo)：強度。
[0040]
圖3為本發(fā)明uplc-ms/ms測定人血漿中纈沙坦、沙庫巴曲及l(fā)bq657 譜圖一。圖中，a：空白血漿；字母后的數(shù)字表示：1：纈沙坦；2：纈沙坦-d9；3：沙庫巴曲；4：沙庫巴曲-d4；5：lbq657；6：lbq657-d4。橫坐標(biāo)：時間；縱坐標(biāo)：強度。
[0041]
圖4為本發(fā)明uplc-ms/ms測定人血漿中纈沙坦、沙庫巴曲及l(fā)bq657 譜圖二。圖中，b：加標(biāo)空白血漿；字母后的數(shù)字表示：1：纈沙坦；2：纈沙坦-d9；3：沙庫巴曲；4：沙庫巴曲-d4；5：lbq657；6：lbq657-d4。橫坐標(biāo)：時間；縱坐標(biāo)：強度。
[0042]
圖5為本發(fā)明uplc-ms/ms測定人血漿中纈沙坦、沙庫巴曲及l(fā)bq657 譜圖三。圖中，c：給藥血漿樣品；字母后的數(shù)字表示：1：纈沙坦；2：纈沙坦-d9；3：沙庫巴曲；4：沙庫巴曲-d4；5：lbq657；6：lbq657-d4。橫坐標(biāo)：時間；縱坐標(biāo)：強度。
[0043]
圖6為本發(fā)明方法驗證階段代表性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖中，a：纈沙坦；b：沙庫巴曲；c：lbq657。橫坐標(biāo)：待測物的濃度；縱坐標(biāo)：待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比。
[0044]
圖7為本發(fā)明腹膜透析患者服用諾欣妥后的血藥濃度圖(均值
±
標(biāo)準(zhǔn)差)。圖中：a：纈沙坦；b：沙庫巴曲；c：lbq657。bid：每天給藥兩次；qd：每天給藥一次。
具體實施方式
[0045]
下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0046]
本發(fā)明以下實驗例中使用的實驗藥品、材料、試劑以及分子結(jié)構(gòu)式：
[0047]
1、藥品及試劑名稱
[0048][0049][0050]
2、結(jié)構(gòu)式
[0051]
lcz696由沙庫巴曲和纈沙坦組成，纈沙坦、沙庫巴曲和lbq657以及本發(fā)明中使用的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)纈沙坦-d9、沙庫巴曲-d4和lbq-d4的化學(xué)結(jié)構(gòu)式分別為以下式a、式b、式c、式d、式e和式f。
[0052]
[0053][0054]
實驗例1工作液的制備
[0055]
1、工作液稀釋劑，其制備方法包括：
[0056]
在200ml溶劑瓶中加入50ml甲醇、50ml水，超聲混勻后于室溫下儲存，標(biāo)記為溶劑d。
[0057]
2、纈沙坦、沙庫巴曲和lbq657混合標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液，其制備方法包括：
[0058]
(1)取纈沙坦(xst)、沙庫巴曲(skb)和lbq657(lbq)分別用甲醇、dmso、dmso配制成1.00mg/ml纈沙坦、沙庫巴曲和lbq657的儲備液，轉(zhuǎn)移至透明聚丙烯管中-40℃冰箱冷凍保存。
[0059]
(2)將步驟(1)中配成的纈沙坦、沙庫巴曲和lbq657儲備液用50％甲醇(溶劑d)按表1所示稀釋成下列濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，并在-40℃條件下儲存?zhèn)溆谩?br>[0060][0061]
[0062]
3、纈沙坦、沙庫巴曲和lbq657質(zhì)控工作液，其制備方法與標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的過程基本相同，區(qū)別在于：
[0063]
在步驟(2)中，將步驟(1)中配成的纈沙坦、沙庫巴曲和lbq657儲備液用50％甲醇(溶劑d)按表2所示稀釋成下列濃度的質(zhì)控樣品工作液，并在
??
40℃條件下儲存?zhèn)溆谩?br>[0064][0065]
4、內(nèi)標(biāo)工作液，其制備方法包括：
[0066]
(1)精密稱取纈沙坦-d9、沙庫巴曲-d4和lbq-d4(內(nèi)標(biāo))分別用甲醇、 dmso、dmso溶解配成濃度為1.00mg/ml纈沙坦-d9、沙庫巴曲-d4和lbq-d4的儲備液。
[0067]
(2)將步驟(1)中配成的纈沙坦-d9、沙庫巴曲-d4和lbq657-d4儲備液用乙腈按表3所示稀釋成下列濃度的內(nèi)標(biāo)工作溶液，-40℃冰箱冷凍保存。
[0068][0069]
實驗例2血漿樣品前處理
[0070]
1、空白血漿樣品，其制備方法包括：
[0071]
(1)取空白人血漿(健康人的血漿)50μl，置于1.5ml聚丙烯管中，加入乙腈150μl，室溫渦旋2min制得樣品。
[0072]
(2)將步驟(1)中制得的樣品于室溫下在轉(zhuǎn)速為14000rpm下離心5 min，轉(zhuǎn)移50μl上清液至另一干凈的聚丙烯管中，用50μl 50％乙腈含0.1％甲酸將上清液稀釋，再渦旋1min混勻，得到用于進行uplc-ms/ms分析測定的溶液。
[0073]
2、零點血漿樣品，其制備方法與空白血漿樣品的過程基本相同，區(qū)別在于：
[0074]
在步驟(1)中，取空白人血漿50μl，置于1.5ml離心管中，加入實驗例1制備的150μl內(nèi)標(biāo)工作液，渦流混合2min制得樣品。
[0075]
3、標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，其制備方法與空白血漿樣品的過程基本相同，區(qū)別在于：
[0076]
在步驟(1)中，取實驗例1制備的10μl標(biāo)準(zhǔn)系列工作液加至190μl 空白人血漿中，分別配制成纈沙坦/沙庫巴曲/lbq657濃度為8.00/2.00/30.0、 16.0/4.00/60.0、40.0/10.0/150、100/25.0/375、400/100/1500、1000/250/3750、 4000/1000/15000、8000/2000/30000ng/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品；混勻后，再分別取該標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品50μl，加入150μl內(nèi)標(biāo)工作液，渦流混合2min制得樣品。
[0077]
4、質(zhì)控血漿樣品，其制備方法與空白血漿樣品的過程基本相同，區(qū)別在于：
[0078]
在步驟(1)中，取實驗例1制備的10μl質(zhì)控工作液加至190μl空白人血漿中，分別配制成纈沙坦/沙庫巴曲/lbq657濃度為8.00/2.00/30.0、24.0/6.00/90.0、200/50.0/750、6000/1500/22500ng/ml的混合質(zhì)控血漿樣品，混勻后，再分別取該混合質(zhì)控血漿樣品50μl，加入150μl內(nèi)標(biāo)工作液，渦流混合2min制得樣品。
[0079]
5、未知血漿樣品，其制備方法與空白血漿樣品的過程基本相同，區(qū)別在于：
[0080]
在步驟(1)中，取慢性腎病終末期患者服用諾欣妥后血漿樣品50μl，置于1.5ml離心管中，加入實驗例1制備的150μl內(nèi)標(biāo)工作液，渦流混合 2min制得樣品。
[0081]
實驗例3測試血漿樣品的穩(wěn)定性
[0082]
質(zhì)控血漿樣品的穩(wěn)定性，其方法包括：
[0083]
(1)取實驗例1制備質(zhì)控樣品工作溶液hqc\mqc\lqc三個水平的工作液20μl，置于1.5ml離心管中，加入380μl空白人血漿，渦旋2min制備成纈沙坦、沙庫巴曲、lbq657的高、中、低三個濃度的血漿樣品，分裝成6份，每份50μl。
[0084]
(2)將步驟(1)制備的血漿樣品在室溫下放置14小時后，加入實驗例 1制備的150μl內(nèi)標(biāo)工作液，渦流混合2min，按實驗例2制備空白血漿樣品的步驟(2)制得樣品，考察制備的樣品室溫放置14小時的穩(wěn)定性。
[0085]
(3)將步驟(1)制備的血漿樣品加入實驗例1制備的150μl內(nèi)標(biāo)工作液，渦流混合2min，按實驗例2制備空白血漿樣品的步驟(2)制得樣品，考察制備的樣品室溫放置23小時的穩(wěn)定性。
[0086]
(4)將步驟(1)制備的血漿樣品加入實驗例1制備的150μl內(nèi)標(biāo)工作液，渦流混合2min，按實驗例2制備空白血漿樣品的步驟(2)制得樣品，考察制得的樣品在自動進樣器中放置37小時的穩(wěn)定性。
[0087]
(5)將步驟(1)制備的血漿樣品加入實驗例1制備的150μl內(nèi)標(biāo)工作液，渦流混合2min，按實驗例2制備空白血漿樣品的步驟(2)制得樣品，考察制得的1個樣品重復(fù)進樣6次的穩(wěn)定性。
[0088]
(6)將步驟(1)制備的血漿樣品先凍存在-80℃冰箱12小時后，取出在室溫下融化，再儲存在-80℃冰箱，如此重復(fù)5次后，取出，加入實驗例1 制備的150μl內(nèi)標(biāo)工作液，渦流混合2min，按實驗例2制備空白血漿樣品的步驟(2)制得樣品，考察制得的樣品循環(huán)凍融5次后的穩(wěn)定性。
[0089]
(7)將步驟(1)制備的血漿樣品分別在-40℃和-80℃冰箱儲存86天后，取出在室溫下融化，加入實驗例1制備的150μl內(nèi)標(biāo)工作液，渦流混合2min，按實驗例2制備空白血漿樣品的步驟(2)制得樣品，分別考察制得的樣品在
??
40℃和-80℃儲存86天的穩(wěn)定性。
[0090]
上述穩(wěn)定性實驗的結(jié)果見表4。
[0091][0092]
實驗例4uplc-ms/ms分析測定
[0093]
1、主要儀器
[0094]
超高效液相譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(uplc-ms/ms)是島津lc-30ad超高效液相譜，配有電噴霧離子源以及l(fā)absolutions 6.70數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，液相譜系統(tǒng)包括sil-30ac ht自動進樣器。xpe26電子分析天平(mettler公司)；vx
?ⅱ
多管渦旋振蕩器(天根生化科技(北京)有限公司)；5810r 離心機(德國eppendorf公司)。
[0095]
2、試驗條件與結(jié)果
[0096]
(1)譜
[0097]
譜條件：所用的分析柱為美國waters公司的譜柱，其規(guī)格為1.7μm， 2.1
×
50mmacquityuplc beh c
18
，流動相a為0.1％甲酸水溶液。流動相 b為甲醇-乙腈-甲酸(50:50:0.2，v/v)的混合溶液，柱溫40℃，洗脫梯度為 0min(65％b)
→
1.50min(80％b)
→
2.0min(98％b)
→
2.60min(autosamplerinse)
→
3.00min(98％b)
→
3.01min(65％b)
→
3.51min(65％b)
→
4.0min (stop)，流動相流速0.30ml/min～0.6ml/min。
[0098]
如圖3所示，uplc-ms/ms測定人血漿中纈沙坦、沙庫巴曲及l(fā)bq657 譜圖一。圖中，a：空白血漿；字母后的數(shù)字表示：1：纈沙坦；2：纈沙坦-d9；3：沙庫巴曲；4：沙庫巴曲-d4；5：lbq657；6：lbq657-d4。
[0099]
如圖4所示，uplc-ms/ms測定人血漿中纈沙坦、沙庫巴曲及l(fā)bq657 譜圖二。圖中，b：加標(biāo)空白血漿；字母后的數(shù)字表示：1：纈沙坦；2：纈沙坦-d9；3：沙庫巴曲；4：沙庫巴曲-d4；5：lbq657；6：lbq657-d4。
[0100]
如圖5所示，uplc-ms/ms測定人血漿中纈沙坦、沙庫巴曲及l(fā)bq657 譜圖三。圖中，c：給藥血漿樣品；字母后的數(shù)字表示：1：纈沙坦；2：纈沙坦-d9；3：沙庫巴曲；4：沙庫巴曲-d4；5：lbq657；6：lbq657-d4。
[0101]
(2)質(zhì)譜
[0102]
質(zhì)譜條件：電噴霧離子化源，正離子方式檢測；檢測器電壓為2.22kv；接口溫度為300℃，加熱塊溫度為400℃；碰撞誘導(dǎo)解離cid gas為270kpa；霧化氣流：3l/min；加熱氣流：15l/min；干燥氣流：15l/min；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式即mrm模式，用于定量分析的離子對分別為：
[0103]
纈沙坦：m/z 436.00
→
m/z 291.10，其ce為-20v；
[0104]
纈沙坦-d9：m/z 445.00
→
m/z 300.20，其ce為-20v；
[0105]
沙庫巴曲：m/z 412.25
→
m/z266.15，其ce為-20v；
[0106]
沙庫巴曲-d4：m/z 416.25
→
m/z 266.15，其ce為-20v；
[0107]
lbq657：m/z 384.20
→
m/z 266.15，其ce為-30v；
[0108]
lbq-d4：m/z 388.20
→
m/z 266.15，其ce為-30v；每一個通道的掃描時間為30msec。
[0109]
采用超高效液相譜串聯(lián)質(zhì)譜對稀釋后的樣品進行檢測，解決其殘留的洗針程序為：洗針液r0及外置泵r3均為甲醇-乙腈-異丙醇-水-甲酸，所述的甲醇-乙腈-異丙醇-水-甲酸的體積比為25:25:25:25:1；洗針程序為r0清洗進樣針的外壁，進樣前后各潤洗3s，洗針?biāo)俣?5μl/s，洗針體積500μl，外置泵r3的程序為清洗泵-》清洗進樣口(rinse pump-》rinse port)，用于進一步清洗進樣針的外壁。解決其殘留的方法一是在化合物出峰之后，增加自動進樣閥的高壓閥的沖洗，在2.60min在autosample模塊增加沖洗(rinse) 命令，用流動相沖洗高壓閥；解決其殘留的方法二是在所有化合物出峰后提高譜柱的流速，流速在2.61～3.01min為0.6ml/min，此時有機相比例為 98％，增加對系統(tǒng)及譜柱脂溶性物質(zhì)的洗脫。
[0110]
如圖1所示，纈沙坦、沙庫巴曲和lbq657和內(nèi)標(biāo)纈沙坦-d9、沙庫巴曲
??
d4和lbq-d4的二級全掃描質(zhì)譜圖一。圖中(a)纈沙坦、(b)沙庫巴曲、 (c)lbq657。橫坐標(biāo)：質(zhì)荷比；縱坐標(biāo)：強度。
[0111]
如圖2所示，纈沙坦、沙庫巴曲和lbq657和內(nèi)標(biāo)纈沙坦-d9、沙庫巴曲
??
d4和lbq-d4的二級全掃描質(zhì)譜圖二。圖中(d)纈沙坦-d9、(e)沙庫巴曲-d4、 (f)lbq657-d4。橫坐標(biāo)：質(zhì)荷
比；縱坐標(biāo)：強度。
[0112]
3、數(shù)據(jù)處理與分析
[0113]
應(yīng)用labsolutions 6.70藥代動力學(xué)軟件對所測數(shù)據(jù)進行分析，并采用輔助數(shù)據(jù)處理軟件microsoft office 2010，獲得藥物的藥代動力學(xué)參數(shù)見表5。
[0114][0115][0116]
注：濃度以均值
±
標(biāo)準(zhǔn)差表示，n代表計算的樣本量。bid：每天給藥兩次；qd：每天給藥一次。
[0117]
4、uplc-ms/ms定量方法學(xué)驗證
[0118]
(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0119]
標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品為實驗例2中的制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，以待測物的濃度(即標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品)為橫坐標(biāo)(x)，待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，用加權(quán) (w＝1/x2)最小二乘法進行回歸運算，求得纈沙坦、沙庫巴曲、lbq657的直線回歸方程，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0120]
如圖6所示，方法驗證階段代表性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖中，a：纈沙坦；b：沙庫巴曲；c：lbq657。橫坐標(biāo)：待測物的濃度；縱坐標(biāo)：待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比。結(jié)果表明纈沙坦(a)在血漿8～8000ng/ml范圍內(nèi)，沙庫巴曲 (b)在血漿2～2000ng/ml，lbq657(c)在血漿30～30000ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
[0121]
(2)未知血漿樣品測定與質(zhì)量控制
[0122]
對實驗例2中制備的未知血漿樣品分析，并以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各時間點樣品中纈沙坦、沙庫巴曲、lbq657的濃度，由質(zhì)控血漿樣品決定當(dāng)日數(shù)據(jù)的取舍。要求每個分析批的質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度(re)在理論值的
±
15％范圍內(nèi)，可以有1/3的濃度點超限，但同一濃度至少有50％符合標(biāo)準(zhǔn)。
[0123]
5、實際應(yīng)用
[0124]
40名腹膜透析患者口服諾欣妥后，于不同時間點取血樣，采用實驗例4 中的方法測定血漿中纈沙坦、沙庫巴曲、lbq657濃度，并繪制平均血藥濃度-時間曲線，結(jié)果顯示，同一劑量時藥物濃度-時間曲線吻合，不同劑量時藥物濃度-時間曲線變化趨勢相同，參見圖7。
[0125]
本發(fā)明采用uplc-ms/ms法同時測定人血漿樣品中纈沙坦、沙庫巴曲、 lbq657的濃度。血漿樣品經(jīng)處理后，采用esi源，以mrm掃描方式進行定量分析，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾纈沙坦、沙庫巴曲、lbq657的測定。本發(fā)明方法準(zhǔn)確、選擇性強，并且符合nmpa頒布的“化學(xué)藥物臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則”([h]gcl1-2)有關(guān)要求，適合纈沙坦、沙庫巴曲、 lbq657在人血漿中藥物動力學(xué)研究。
[0126]
盡管本發(fā)明的內(nèi)容已經(jīng)通過上述優(yōu)選實施例作了詳細(xì)介紹，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到上述的描述不應(yīng)被認(rèn)為是對本發(fā)明的限制。在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀了上述內(nèi)容后，對于本發(fā)明的多種修改和替代都將是顯而易見的。因此，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)由所附的權(quán)利要求來限定。
