殺傷或抑制癌細(xì)胞生長的方法與流程

殺傷或抑制癌細(xì)胞生長的方法與流程

殺傷或抑制癌細(xì)胞生長的方法
交叉引用
1.本技術(shù)要求于2020年2月12日提交的美國臨時申請?zhí)?2/975,599的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。


技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

2.本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請均以引用的方式并入本文，其程度與每個單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾埍痪唧w地和單獨(dú)地表明通過引用并入的程度相同。
3.本文公開了在有需要的對象中直接殺傷癌細(xì)胞的方法，所述方法包括使癌細(xì)胞與分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞來自實(shí)體瘤或在實(shí)體瘤內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞來自選自以下的癌癥：肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、胃癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)癌、骨癌、淋巴癌、皮膚癌、頭頸癌、腎癌、睪丸癌、子宮癌、宮頸癌、食管癌、甲狀腺癌、唾液腺癌、腎上腺癌和胃腸癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是不可手術(shù)的。在一些實(shí)施方案中，cns癌癥是神經(jīng)膠質(zhì)瘤或轉(zhuǎn)移癌。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)膠質(zhì)瘤是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或間變性星形細(xì)胞瘤。在一些實(shí)施方案中，癌癥是肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌或皮膚癌。在一些實(shí)施方案中，結(jié)腸癌是腺癌。在一些實(shí)施方案中，皮膚癌是黑素瘤。在一些實(shí)施方案中，癌癥是前列腺癌。在一些實(shí)施方案中，接觸包括將hc-ha/ptx3復(fù)合物注射到腫瘤、周圍組織或其組合中。在一些實(shí)施方案中，接觸是在癌細(xì)胞的手術(shù)切除、冷凍消融或射頻消融之前、期間或之后進(jìn)行的。在一些實(shí)施方案中，接觸包括將hc-ha/ptx3應(yīng)用到手術(shù)切除癌細(xì)胞的手術(shù)切緣，或應(yīng)用到腫瘤的任何剩余部分。在一些實(shí)施方案中，分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物是天然hc-ha/ptx3復(fù)合物、重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物或其組合。在一些實(shí)施方案中，天然hc-ha/ptx3復(fù)合物分離自胎兒支持組織。在一些實(shí)施方案中，重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物包含間-α-抑制劑(iαi)的重鏈1(hc1)和重鏈2(hc2)、透明質(zhì)酸(ha)和ptx3。在一些實(shí)施方案中，重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物包含hc1、hc2、ha、ptx3和tsg-6。在一些實(shí)施方案中，hc-ha/ptx3包含在包含藥學(xué)上可接受的藥學(xué)上可接受的稀釋劑、賦形劑、媒介物或載劑的組合物中。在一些實(shí)施方案中，方法進(jìn)一步包括施用另外的劑。在一些實(shí)施方案中，劑選自化療劑、鎮(zhèn)痛劑、抗炎劑、類固醇、免疫療法、細(xì)胞療法、放射療法、靶向藥物劑和抗生素。在一些實(shí)施方案中，施用劑發(fā)生在使癌細(xì)胞與hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸之前。在一些實(shí)施方案中，施用劑發(fā)生在使癌細(xì)胞與hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸之后。在一些實(shí)施方案中，施用劑與使癌細(xì)胞與hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸同時發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，血管生成被減少或抑制。在一些實(shí)施方案中，殺傷癌細(xì)胞是通過細(xì)胞凋亡或壞死進(jìn)行的。
4.本文公開了在有需要的對象中直接抑制癌細(xì)胞增殖的方法，所述方法包括使癌細(xì)胞與分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞來自實(shí)體瘤或在實(shí)體瘤內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞來自選自以下的癌癥：肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、胃癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)癌、骨
癌、淋巴癌、皮膚癌、頭頸癌、腎癌、睪丸癌、子宮癌、宮頸癌、食管癌、甲狀腺癌、唾液腺癌、腎上腺癌和胃腸癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是不可手術(shù)的。在一些實(shí)施方案中，cns癌癥是神經(jīng)膠質(zhì)瘤或轉(zhuǎn)移癌。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)膠質(zhì)瘤是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或間變性星形細(xì)胞瘤。在一些實(shí)施方案中，癌癥是肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌或皮膚癌。在一些實(shí)施方案中，結(jié)腸癌是腺癌。在一些實(shí)施方案中，皮膚癌是黑素瘤。在一些實(shí)施方案中，癌癥是前列腺癌。在一些實(shí)施方案中，接觸包括將hc-ha/ptx3復(fù)合物注射到腫瘤、周圍組織或其組合中。在一些實(shí)施方案中，接觸是在癌細(xì)胞的手術(shù)切除、冷凍消融或射頻消融之前、期間或之后進(jìn)行的。在一些實(shí)施方案中，接觸包括將hc-ha/ptx3應(yīng)用到手術(shù)切除癌細(xì)胞的手術(shù)切緣。在一些實(shí)施方案中，分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物是天然hc-ha/ptx3復(fù)合物、重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物或其組合。在一些實(shí)施方案中，天然hc-ha/ptx3復(fù)合物分離自胎兒支持組織。在一些實(shí)施方案中，重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物包含間-α-抑制劑(iαi)的重鏈1(hc1)和重鏈2(hc2)、透明質(zhì)酸(ha)和ptx3。在一些實(shí)施方案中，重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物包含hc1、hc2、ha、ptx3和tsg-6。在一些實(shí)施方案中，包含藥學(xué)上可接受的稀釋劑、賦形劑、媒介物或載劑。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，hc-ha/ptx3包含在包含施用劑的組合物中。在一些實(shí)施方案中，劑選自化療劑、鎮(zhèn)痛劑、抗炎劑、類固醇、免疫療法、細(xì)胞療法、放射療法、靶向藥物劑和抗生素。在一些實(shí)施方案中，施用劑發(fā)生在使癌細(xì)胞與hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸之前。在一些實(shí)施方案中，施用劑發(fā)生在使癌細(xì)胞與hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸之后。在一些實(shí)施方案中，施用劑與使癌細(xì)胞與hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸同時發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，血管生成被減少或抑制。在一些實(shí)施方案中，在表達(dá)cd44或rhamm的細(xì)胞中增殖受到抑制。
5.本文描述了在有需要的對象中直接降低癌細(xì)胞代謝活性的方法，所述方法包括使癌細(xì)胞與分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞來自實(shí)體瘤或在實(shí)體瘤內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞來自選自以下的癌癥：肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、胃癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)癌、骨癌、淋巴癌、皮膚癌、頭頸癌、腎癌、睪丸癌、子宮癌、宮頸癌、食管癌、甲狀腺癌、唾液腺癌、腎上腺癌和胃腸癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是不可手術(shù)的。在一些實(shí)施方案中，cns癌癥是神經(jīng)膠質(zhì)瘤或轉(zhuǎn)移癌。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)膠質(zhì)瘤是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或間變性星形細(xì)胞瘤。在一些實(shí)施方案中，癌癥是肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌或皮膚癌。在一些實(shí)施方案中，結(jié)腸癌是腺癌。在一些實(shí)施方案中，皮膚癌是黑素瘤。在一些實(shí)施方案中，癌癥是前列腺癌。在一些實(shí)施方案中，接觸包括將hc-ha/ptx3復(fù)合物注射到腫瘤、周圍組織或其組合中。在一些實(shí)施方案中，接觸是在癌細(xì)胞的手術(shù)切除、冷凍消融或射頻消融之前、期間或之后，或進(jìn)入腫瘤的任何剩余部分。在一些實(shí)施方案中，接觸包括將hc-ha/ptx3應(yīng)用到手術(shù)切除癌細(xì)胞的手術(shù)切緣。在一些實(shí)施方案中，分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物是天然hc-ha/ptx3復(fù)合物、重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物或其組合。在一些實(shí)施方案中，天然hc-ha/ptx3復(fù)合物分離自胎兒支持組織。在一些實(shí)施方案中，重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物包含間-α-抑制劑(iαi)的重鏈1(hc1)和重鏈2(hc2)、透明質(zhì)酸(ha)和ptx3。在一些實(shí)施方案中，重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物包含hc1、hc2、ha、ptx3和tsg-6。在一些實(shí)施方案中，hc-ha/ptx3包含在包含藥學(xué)上可接受的藥學(xué)上可接受的稀釋劑、賦形劑、媒介物或載劑的組合物中。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，hc-ha/ptx3包含在包含施用劑的組合物中。在一些實(shí)施方案中，劑選自化療劑、鎮(zhèn)痛劑、抗炎劑、類固醇、免疫療法、細(xì)胞療法、放射療法、靶向藥物劑和抗生素。在
一些實(shí)施方案中，施用劑發(fā)生在使癌細(xì)胞與hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸之前。在一些實(shí)施方案中，施用劑發(fā)生在使癌細(xì)胞與hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸之后。在一些實(shí)施方案中，施用劑與使癌細(xì)胞與hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸同時發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，血管生成被減少或抑制。在一些實(shí)施方案中，在表達(dá)cd44或rhamm的細(xì)胞中代謝活性降低。
6.本文描述了殺傷癌細(xì)胞的方法，所述方法包括在手術(shù)切除、冷凍消融或射頻消融腫瘤之前、期間或之后用分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸手術(shù)切緣或腫瘤的任何部分，從而殺傷手術(shù)切緣的癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，腫瘤是選自以下的癌癥：肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、胃癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)癌、骨癌、淋巴癌、皮膚癌、頭頸癌、腎癌、睪丸癌、子宮癌、宮頸癌、食管癌、甲狀腺癌、唾液腺癌、腎上腺癌和胃腸癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是不可手術(shù)的。在一些實(shí)施方案中，cns癌癥是神經(jīng)膠質(zhì)瘤或轉(zhuǎn)移癌。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)膠質(zhì)瘤是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。在一些實(shí)施方案中，癌癥是肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌或皮膚癌。在一些實(shí)施方案中，結(jié)腸癌是腺癌。在一些實(shí)施方案中，皮膚癌是黑素瘤。在一些實(shí)施方案中，腫瘤是前列腺癌。在一些實(shí)施方案中，hc-ha/ptx3復(fù)合物是天然hc-ha/ptx3復(fù)合物、重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物或其組合。在一些實(shí)施方案中，天然hc-ha/ptx3復(fù)合物分離自胎兒支持組織。在一些實(shí)施方案中，重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物包含間-α-抑制劑(iαi)的重鏈1(hc1)和重鏈2(hc2)、透明質(zhì)酸(ha)和ptx3。在一些實(shí)施方案中，重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物包含hc1、hc2、ha、ptx3和tsg-6。在一些實(shí)施方案中，hc-ha/ptx3包含在包含藥學(xué)上可接受的藥學(xué)上可接受的稀釋劑、賦形劑、媒介物或載劑的組合物中。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物包括施用劑。在一些實(shí)施方案中，劑選自化療劑、鎮(zhèn)痛劑、抗炎劑、類固醇、免疫療法、細(xì)胞療法、放射療法、靶向藥物劑和抗生素。在一些實(shí)施方案中，施用劑發(fā)生在使癌細(xì)胞與hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸之前。在一些實(shí)施方案中，施用劑發(fā)生在使癌細(xì)胞與hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸之后。在一些實(shí)施方案中，施用劑與使癌細(xì)胞與hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸同時發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，殺傷癌細(xì)胞是通過細(xì)胞凋亡或壞死進(jìn)行的。
7.在一些實(shí)施方案中，本文公開了在有需要的個體中抑制腫瘤的癌細(xì)胞再生長的方法，所述方法包括在手術(shù)程序后使腫瘤周圍的區(qū)域與分離的重鏈-透明質(zhì)酸/正五聚蛋白3(hc-ha/ptx3)復(fù)合物接觸，從而抑制腫瘤周圍的區(qū)域的癌細(xì)胞再生長。在一些實(shí)施方案中，手術(shù)程序包括腫瘤的手術(shù)切除、冷凍消融或射頻消融。在一些實(shí)施方案中，手術(shù)程序包括化學(xué)療法、免疫療法或靶向療法。在一些實(shí)施方案中，腫瘤周圍的區(qū)域包括手術(shù)切緣。在一些實(shí)施方案中，腫瘤周圍的區(qū)域是瘤周區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，腫瘤是實(shí)體瘤。在一些實(shí)施方案中，腫瘤是選自以下的癌癥：肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、胃癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)癌、骨癌、淋巴癌、皮膚癌、頭頸癌、腎癌、睪丸癌、子宮癌、宮頸癌、食管癌、甲狀腺癌、唾液腺癌、腎上腺癌和胃腸癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是不可手術(shù)的癌癥。在一些實(shí)施方案中，癌癥是胰腺癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是前列腺癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。在一些實(shí)施方案中，癌癥是皮膚癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是結(jié)腸癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是肺癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，腫瘤周圍的區(qū)域與約10微克至100毫克接觸。在一些實(shí)施方案中，hc-ha/ptx3復(fù)合物是天然hc-ha/ptx3復(fù)合物、重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物或其組合。在一些實(shí)施方案中，天然hc-ha/ptx3復(fù)合物分離自胎兒支持組
織。在一些實(shí)施方案中，重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物包含間-α-抑制劑(iαi)的重鏈1(hc1)和重鏈2(hc2)、透明質(zhì)酸(ha)和ptx3。在一些實(shí)施方案中，重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物包含hc1、hc2、ha、ptx3和腫瘤壞死因子α-刺激的基因6(tsg-6)。在一些實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸(ha)是高分子量透明質(zhì)酸(hmw ha)。在一些實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸(ha)是低分子量透明質(zhì)酸(lmw ha)。在一些實(shí)施方案中，hc-ha/ptx3復(fù)合物是冷凍保存的。在一些實(shí)施方案中，hc-ha/ptx3復(fù)合物包含活細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括施用劑。在一些實(shí)施方案中，劑選自化療劑、鎮(zhèn)痛劑、抗炎劑、類固醇、免疫療法、細(xì)胞療法、放射療法、靶向藥物劑和抗生素。在一些實(shí)施方案中，施用劑發(fā)生在使腫瘤周圍的區(qū)域與hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸之前。在一些實(shí)施方案中，施用劑發(fā)生在使腫瘤周圍的區(qū)域與hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸之后。在一些實(shí)施方案中，施用劑與使腫瘤周圍的區(qū)域與hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸同時發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，所述方法通過殺傷癌細(xì)胞來抑制腫瘤細(xì)胞再生長。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞的殺傷是通過細(xì)胞凋亡或壞死來實(shí)現(xiàn)的。在一些實(shí)施方案中，所述方法通過抑制癌細(xì)胞增殖來抑制腫瘤細(xì)胞再生長。在一些實(shí)施方案中，所述方法通過抑制癌細(xì)胞的代謝活性來抑制腫瘤細(xì)胞再生長。
8.在一些實(shí)施方案中，本文公開了在有需要的個體中殺傷腫瘤癌細(xì)胞的方法，所述方法包括在手術(shù)程序之前、期間或之后用分離的重鏈透明質(zhì)酸/正五聚蛋白3(hc-ha/ptx3)復(fù)合物接觸腫瘤或腫瘤周圍的區(qū)域，從而殺傷癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，手術(shù)程序包括腫瘤的手術(shù)切除、冷凍消融或射頻消融。在一些實(shí)施方案中，手術(shù)程序包括化學(xué)療法、免疫療法或靶向療法。在一些實(shí)施方案中，腫瘤周圍的區(qū)域包括手術(shù)切緣。在一些實(shí)施方案中，腫瘤周圍的區(qū)域是瘤周區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，腫瘤是實(shí)體瘤。在一些實(shí)施方案中，腫瘤是選自以下的癌癥：肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、胃癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)癌、骨癌、淋巴癌、皮膚癌、頭頸癌、腎癌、睪丸癌、子宮癌、宮頸癌、食管癌、甲狀腺癌、唾液腺癌、腎上腺癌和胃腸癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是不能手術(shù)的癌癥。在一些實(shí)施方案中，癌癥是胰腺癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是前列腺癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。在一些實(shí)施方案中，癌癥是皮膚癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是結(jié)腸癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是肺癌。在一些實(shí)施方案中，癌癥是乳腺癌。在一些實(shí)施方案中，腫瘤周圍的區(qū)域與約10微克至100毫克接觸。在一些實(shí)施方案中，hc-ha/ptx3復(fù)合物是天然hc-ha/ptx3復(fù)合物、重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物或其組合。在一些實(shí)施方案中，天然hc-ha/ptx3復(fù)合物分離自胎兒支持組織。在一些實(shí)施方案中，重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物包含間-α-抑制劑(iαi)的重鏈1(hc1)和重鏈2(hc2)、透明質(zhì)酸(ha)和ptx3。在一些實(shí)施方案中，重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物包含hc1、hc2、ha、ptx3和腫瘤壞死因子α-刺激的基因6(tsg-6)。在一些實(shí)施方案中，hc-ha/ptx3復(fù)合物是冷凍保存的。在一些實(shí)施方案中，hc-ha/ptx3復(fù)合物包含活細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸(ha)是高分子量透明質(zhì)酸(hmw ha)。在一些實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸(ha)是低分子量透明質(zhì)酸(lmw ha)。在一些實(shí)施方案中，接觸包括將hc-ha/ptx3直接注射到腫瘤中。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括施用劑。在一些實(shí)施方案中，劑選自化療劑、鎮(zhèn)痛劑、抗炎劑、類固醇、免疫療法、細(xì)胞療法、放射療法、靶向藥物劑和抗生素。在一些實(shí)施方案中，施用劑發(fā)生在使癌細(xì)胞與hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸之前。在一些實(shí)施方案中，施用劑發(fā)生在使癌細(xì)胞與hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸之后。在一些實(shí)施方案中，施用劑與使癌細(xì)胞
與hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸同時發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞的殺傷是通過細(xì)胞凋亡或壞死進(jìn)行的。
附圖說明
9.圖1a顯示在rpmi培養(yǎng)基中培養(yǎng)后lncap細(xì)胞的聚集。
10.圖1b顯示在rpmi培養(yǎng)基中培養(yǎng)后pc-3細(xì)胞分布均勻。
11.圖2a-圖2d顯示lncap在一系列劑量的精制的btgel或hc-ha/ptx3處理下的形態(tài)和細(xì)胞代謝活性。
12.圖3a
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圖3d顯示pc-3在一系列劑量的精制的btgel或hc-ha/ptx3處理下的形態(tài)和代謝活性。
13.圖4a顯示在用uc提取物(使用在水中的uc提取物)、hc-ha/ptx3和ha處理后lncap細(xì)胞中的wst-1測定數(shù)據(jù)。
14.圖4b顯示在用uc提取物(使用在水中的uc提取物)、hc-ha/ptx3和ha處理后pc-3細(xì)胞中的wst-1測定數(shù)據(jù)。
15.圖5a
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圖5c顯示用ha(圖5a)、hc-ha/ptx3(圖5b)和臍帶提取物(uce)(圖5c)處理后lncap細(xì)胞的形態(tài)。
16.圖6a
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圖6c顯示用ha(圖6a)、hc-ha/ptx3(圖6b)和臍帶提取物(uce)(圖6c)處理后pc-3細(xì)胞的形態(tài)。
17.圖7顯示在層粘連蛋白和iv型膠原蛋白上生長的lncap細(xì)胞比在其他表面上生長的細(xì)胞表現(xiàn)出更多細(xì)胞聚集。
18.圖8a顯示10x和20x放大倍率下拍攝的prec前列腺細(xì)胞系形態(tài)的明場圖像。
19.圖8b顯示10x和20x放大倍率下拍攝的pnt2前列腺細(xì)胞系形態(tài)的明場圖像。
20.圖9顯示人原代正常前列腺細(xì)胞與不同濃度的hc-ha/ptx3和hmw-ha孵育48小時后的代表性明場顯微圖像(比例尺50μm)。
21.圖10a和圖10b顯示通過wst-1測定在與不同濃度(0.78、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)的hc-ha/ptx3和ha孵育48小時后在正常人原代前列腺上皮細(xì)胞prec(圖10a)和正常人前列腺細(xì)胞系pnt2(圖10b)中評估的代謝活性(％)。通過相對于未處理樣品的雙尾t檢驗(yàn)計(jì)算p值。
22.圖11a和圖11b顯示與不同濃度(0.78、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)的hc-ha/ptx3孵育48小時后在正常原代前列腺上皮細(xì)胞(prec) amp;細(xì)胞系(pnt2)以及前列腺癌細(xì)胞系：pc3 amp;lncap中評估的代謝活性(％)(圖11a)和對數(shù)標(biāo)度代謝活性(圖11b)的比較分析。
23.圖12a和圖12b顯示與不同濃度的ha孵育48小時后在正常原代前列腺上皮細(xì)胞(prec) amp;細(xì)胞系(pnt2)以及前列腺癌細(xì)胞系：pc3 amp;lncap中評估的代謝活性(％)(圖12a)和對數(shù)標(biāo)度代謝活性(圖12b)的比較分析。
24.圖13顯示與不同濃度的hc-ha/ptx3和hmw-ha孵育48小時后a375(黑素瘤)細(xì)胞的代表性明場顯微圖像(比例尺50μm)。
25.圖14顯示與不同濃度的hc-ha/ptx3和hmw-ha孵育48小時后ht-29(結(jié)腸癌)細(xì)胞的代表性明場顯微圖像(比例尺50μm)。
26.圖15顯示與不同濃度的hc-ha/ptx3和hmw-ha孵育48小時后a549(肺癌)細(xì)胞的代
表性明場顯微圖像(比例尺50μm)。
27.圖16顯示與不同濃度的hc-ha/ptx3和hmw-ha孵育48小時后mcf-7(乳腺癌)細(xì)胞的代表性明場顯微圖像(比例尺50μm)。
28.圖17a
–
圖17d顯示通過wst-1測定在與不同濃度的hc-ha/ptx3和ha孵育48小時后在4種人癌細(xì)胞系：a375(圖17a)、ht-29(圖17b)、mcf-7(圖17c)和a-549(圖17d)中評估的代謝活性(％)。
29.圖18a顯示用不同濃度的hc-ha/ptx3處理后針對不同時間點(diǎn)(分別是15-30分鐘、1小時、5小時、24小時和48小時)的lnc(limbal niche cell，角膜緣微環(huán)境細(xì)胞)的代表性明場顯微圖像(比例尺50μm)。
30.圖18b顯示用不同濃度的hmw-ha處理后針對不同時間點(diǎn)(分別是15-30分鐘、1小時、5小時、24小時和48小時)的lnc(角膜緣微環(huán)境細(xì)胞)的代表性明場顯微圖像(比例尺50μm)。
31.圖18c顯示與100μg/ml hc-ha/ptx3和hmw-ha孵育48小時后lnc(角膜緣微環(huán)境細(xì)胞)的代表性明場顯微圖像(比例尺50μm)。
32.圖19顯示與不同濃度的hc-ha/ptx3和ha孵育48小時后，通過wst-1測定評估的角膜緣微環(huán)境細(xì)胞中的代謝活性(％)。
33.圖20a和圖20b顯示在用不同濃度的hc-ha/ptx3(圖20a)和hmw-ha(圖20b)處理后針對不同的時間點(diǎn)的htm(人小梁網(wǎng))細(xì)胞的代表性明場顯微圖像(比例尺50μm)。
34.圖21顯示在與不同濃度的hc-ha/ptx3和ha孵育48小時后，通過wst-1測定評估的人小梁網(wǎng)細(xì)胞中的代謝活性(％)。
35.圖22a和圖22b顯示用不同濃度的hc-ha/ptx3(圖22a)和hmw-ha(圖22b)處理后針對不同的時間點(diǎn)的人角膜成纖維細(xì)胞(hcf)細(xì)胞的代表性明場顯微圖像(比例尺50μm)。
36.圖23顯示與不同濃度的hc-ha/ptx3和ha孵育48小時后，通過wst-1測定評估的人角膜成纖維細(xì)胞中的代謝活性(％)。
37.圖24a和圖24b顯示與不同濃度的hc-ha/ptx3(圖24a)和ha(圖24b)孵育48小時后通過wst-1測定評估的三種類型的人正常原代間充質(zhì)細(xì)胞：hcf、htm amp;lnc中的代謝活性(％)的比較分析。
38.圖25提供了具有代表性的明場顯微圖像(比例尺50μm)，顯示hc-ha/ptx3(100μg/ml)對lnc和hcf細(xì)胞形態(tài)的瞬時影響，而在htm細(xì)胞中沒有相應(yīng)的影響。
39.圖26a顯示與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，用hc-ha/ptx3和ha處理后a375細(xì)胞形態(tài)的明場圖像。
40.圖26b顯示使用a375細(xì)胞的brdu細(xì)胞增殖測定曲線。
41.圖26c顯示使用a375細(xì)胞的半對數(shù)尺度brdu細(xì)胞增殖測定曲線。
42.圖27a顯示用ha或hc-ha/ptx3處理后的prec細(xì)胞形態(tài)在兩個放大倍率(10x amp;20x)下的明場圖像。
43.圖27b顯示hc-ha/ptx3處理后的brdu細(xì)胞增殖測定曲線。
44.圖27c顯示ha處理后的brdu細(xì)胞增殖測定曲線。
45.圖28a顯示用hc-ha/ptx3、hmw-ha處理或未處理后的pnt2細(xì)胞形態(tài)的明場圖像。
46.圖28b顯示用hc-ha/ptx3或ha處理后pnt2細(xì)胞中的brdu細(xì)胞增殖測定曲線。
ha具有3000kda的重均分子量。在一些實(shí)施方案中，hmw ha是具有約3000kda的重均分子量。在一些實(shí)施方案中，hmw ha具有約500kda至約10,000kda的分子量。在一些實(shí)施方案中，hmw ha具有約800kda至約8,500kda的分子量。在一些實(shí)施方案中，hmw ha具有約3,000kda的分子量。
57.如本文所用，如在低分子量透明質(zhì)酸(lmwha)中的術(shù)語“低分子量”或“l(fā)mw”意指重均分子量為小于500kda，例如小于約400kda、小于約300kda、小于約200kda、約200-300kda或約1-300kda的ha。
58.如本文所用，正五聚蛋白3或ptx3蛋白質(zhì)或多肽是指任何ptx3蛋白質(zhì)，包括但不限于重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、合成產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、天然ptx3蛋白質(zhì)和從細(xì)胞或組織中提取的ptx3蛋白質(zhì)。ptx3包括ptx3的多聚體形式(例如同源多聚體)，包括但不限于二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體、八聚體和其他天然或人工產(chǎn)生的多聚體形式。
59.如本文所用，“透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白”、“ha結(jié)合蛋白”或“habp”是指特異性結(jié)合ha的任何蛋白質(zhì)。
60.如本文所用，“連接模塊”是指透明質(zhì)酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
61.如本文所用，“生物活性”是指nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的體內(nèi)活性或在體內(nèi)施用nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物或含有nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的組合物或混合物后產(chǎn)生的生理應(yīng)答。因此，生物活性包括nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物及其組合物和混合物的效果和藥物活性。
62.如本文所用，術(shù)語“對象”、“個體”和“患者”可互換使用。任何這些術(shù)語均不得解釋為需要醫(yī)療專業(yè)人員(例如，醫(yī)生、護(hù)士、醫(yī)師助理、護(hù)理員、臨終關(guān)懷工作者)的監(jiān)督。如本文所用，對象是任何動物，包括哺乳動物(例如，人或非人動物)和非哺乳動物。在本文提供的方法和組合物的一個實(shí)施方案中，哺乳動物是人。
63.如本文所用，術(shù)語“(treat)”、“(treating)”或“(treatment)”以及其他語法等同物包括緩解、消除或改善疾病或病況的一種或多種癥狀，改善、預(yù)防或減少疾病或病況的一種或多種其他癥狀的出現(xiàn)、嚴(yán)重性或頻率，改善或預(yù)防疾病或病況的一種或多種癥狀的潛在代謝原因，抑制疾病或病況，例如，阻止疾病或病況的發(fā)展，減輕疾病或病況，引起疾病或病況的消退，減輕由疾病或病況引起的病況，或預(yù)防性和/或性地抑制疾病或病況的癥狀。在一個非限制性示例中，為了預(yù)防性益處，將本文公開的rchc-ha/ptx3復(fù)合物、天然hc-ha/ptx3復(fù)合物或組合物施用于有發(fā)展特定障礙風(fēng)險(xiǎn)、傾向于發(fā)展特定障礙的個體，或施用于被告知有障礙的一種或多種生理癥狀的個體。
64.如本文所用，“胎盤”是指將發(fā)育中的胎兒連接到母體子宮壁以允許通過母體血液供應(yīng)吸收營養(yǎng)、排除廢物和氣體交換的器官。胎盤由三層組成。圍繞胎兒的最內(nèi)胎盤層稱為羊膜。尿囊是胎盤的中間層(來源于胚胎后腸)；源自臍部的血管穿過該膜。胎盤的最外層，絨毛膜，與子宮內(nèi)膜接觸。絨毛膜和尿囊融合形成絨毛尿囊膜。
65.如本文所用，“絨毛膜”是指由胚外中胚層和兩層滋養(yǎng)層形成的膜。絨毛膜由兩層組成：由滋養(yǎng)層形成的外層和由體細(xì)胞中胚層形成的內(nèi)層；羊膜與后者接觸。滋養(yǎng)層由立方體或棱柱狀細(xì)胞的內(nèi)層、細(xì)胞滋養(yǎng)層或朗漢斯層和沒有細(xì)胞邊界的富核原生質(zhì)的外層、合胞體滋養(yǎng)層組成。無血管羊膜粘附在絨毛膜的內(nèi)層。
66.如本文所用，“羊膜-絨毛膜”是指包含羊膜和絨毛膜的產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，
羊膜和絨毛膜不分離(即，羊膜自然粘附到絨毛膜的內(nèi)層)。在一些實(shí)施方案中，羊膜最初與絨毛膜分離，隨后在加工過程中與絨毛膜結(jié)合。
67.如本文所用，“臍帶”是指將發(fā)育中的胎兒連接到胎盤的器官。臍帶由華頓氏膠(wharton's jelly)組成，這是一種主要由粘多糖制成的凝膠狀物質(zhì)。它包含一條靜脈(其將含氧、營養(yǎng)豐富的血液輸送給胎兒)以及兩條動脈(其將脫氧、營養(yǎng)耗盡的血液帶走)。
68.如本文所用，“胎盤羊膜”(pam)是指源自胎盤的羊膜。在一些實(shí)施方案中，pam基本上是隔離的。
69.如本文所用，“臍帶羊膜”(ucam)是指源自臍帶的羊膜。ucam是半透明膜。ucam有多個層：上皮層；基底膜；致密層；成纖維細(xì)胞層；和海綿層。它缺乏血管或直接的血液供應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，ucam包括華頓氏膠。在一些實(shí)施方案中，ucam包括血管和/或動脈。在一些實(shí)施方案中，ucam包括華頓氏膠和血管和/或動脈。
70.如本文所用，術(shù)語“純化的”、“分離的”是指材料(例如，nhc-ha/ptx3復(fù)合物)基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含通常在它天然狀態(tài)下伴隨它的組分。在一些實(shí)施方案中，“純化的”或“分離的”是指如下材料(例如，nhc-ha/ptx3復(fù)合物)，所述材料約50％或更多地不含通常在它天然狀態(tài)下伴隨它的組分，例如約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、或約99％不含通常在它天然狀態(tài)下伴隨它的組分。方法
71.在某些實(shí)施方案中，本文公開了有需要的個體的方法，所述方法包括向個體施用本文所述的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物，包括直接殺傷癌細(xì)胞、直接抑制癌細(xì)胞增殖、降低癌細(xì)胞代謝活性或其組合的方法。在一些實(shí)施方案中，nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物用于直接殺傷癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物用于直接抑制癌細(xì)胞的增殖。在一些實(shí)施方案中，nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物用于降低癌細(xì)胞的代謝活性。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞來自實(shí)體瘤或在實(shí)體瘤內(nèi)。
72.在一些實(shí)施方案中，有需要的個體的方法包括通過任何合適的方法向個體施用本文所述的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，有需要的個體患有癌癥。在一些實(shí)施方案中，有需要的個體患有不可手術(shù)的癌癥。在一些實(shí)施方案中，有需要的個體患有選自胰腺癌、前列腺癌和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的不可手術(shù)的癌癥。在一些實(shí)施方案中，個體患有實(shí)體瘤。在一些實(shí)施方案中，個體患有選自以下的癌癥：肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、胃癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)癌、骨癌、淋巴癌、皮膚癌、頭頸癌、腎癌、睪丸癌、子宮癌、宮頸癌、食管癌、甲狀腺癌、唾液腺癌、腎上腺癌和胃腸癌。
73.在一些實(shí)施方案中，在手術(shù)程序之前、期間或手術(shù)程序之后將nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物施用于個體。在一些實(shí)施方案中，手術(shù)程序包括腫瘤的切除。在一些實(shí)施方案中，手術(shù)程序包括腫瘤的手術(shù)切除、冷凍消融或射頻消融。在一些實(shí)施方案中，手術(shù)程序包括化學(xué)療法、免疫療法或靶向療法。
74.在一些實(shí)施方案中，在腫瘤切除后施用nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物多達(dá)1天、多達(dá)2天、多達(dá)3天、多達(dá)5天或超過5天。在一些實(shí)施方案中，在腫瘤切除后施用nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物一周、兩周、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、一年、兩
年、三年、四年、五年或超過五年。在一些實(shí)施方案中，在腫瘤切除后單次施用，或在一段時間內(nèi)(例如每天、每周多次、每周、每兩周、每月或更不頻繁地)施用nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，在腫瘤切除后單次施用，或在一段時間內(nèi)(例如每天、每周多次、每周、每兩周、每月或更頻繁地)施用nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物。
75.在一些實(shí)施方案中，在腫瘤切除之前施用nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，在切除腫瘤前施用nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物多達(dá)1天、多達(dá)2天、多達(dá)3天、多達(dá)5天或超過5天。在一些實(shí)施方案中，在腫瘤切除之前單次施用，或在一段時間內(nèi)(例如每天、每周多次、每周、每兩周、每月或更不頻繁地)施用nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，在腫瘤切除之前單次施用，或在一段時間內(nèi)(例如每天、每周多次、每周、每兩周、每月或更頻繁地)施用nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物。
76.在一些實(shí)施方案中，在腫瘤的手術(shù)切除、冷凍消融或射頻消融期間或之后向個體施用nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，在腫瘤的手術(shù)切除(例如，全部或部分)、冷凍消融或射頻消融之后，將nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物施用于手術(shù)切緣(例如，已經(jīng)手術(shù)切除的腫瘤周圍的明顯組織區(qū)域)。
77.在一些實(shí)施方案中，有需要的個體的方法包括通過任何合適的施用途徑向個體施用nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物。合適的施用方法將取決于待的疾病或病況。在一些實(shí)施方案中，將nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物局部施用至部位。在一些實(shí)施方案中，將nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物注射到腫瘤、腫瘤周圍的組織或兩者中。在一些實(shí)施方案中，將nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物注射到腫瘤中。在一些實(shí)施方案中，在腫瘤已被手術(shù)去除或用冷凍消融或射頻消融后，將nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物應(yīng)用于腫瘤周圍的區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，全身施用nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物。用于施用本文提供的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的示例性方法包括但不限于腸胃外、腸內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、透皮、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、局部、吸入或植入。
78.本文證明分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物直接殺傷癌細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，本文提供了分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物(包括包含hc-ha/ptx3的制劑或組合物)殺傷癌細(xì)胞的用途。在一些實(shí)施方案中，本文提供了分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物殺傷實(shí)體瘤中的癌細(xì)胞的用途。在一些實(shí)施方案中，本文提供了在手術(shù)去除或用冷凍消融或射頻消融腫瘤后，分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物殺傷腫瘤周圍的區(qū)域中的癌細(xì)胞的用途。在一些實(shí)施方案中，本文提供了分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物在有需要的對象中局部殺傷癌細(xì)胞的用途。在一些實(shí)施方案中，本文提供了分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物在有需要的對象中全身殺傷癌細(xì)胞的用途。
79.本文證明分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物抑制癌細(xì)胞的增殖。在某些實(shí)施方案中，本文提供了分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物(包括包含hc-ha/ptx3的制劑或組合物)抑制癌細(xì)胞增殖的用途。在一些實(shí)施方案中，本文提供了分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物抑制實(shí)體瘤中的癌細(xì)胞增殖的用途。在一些實(shí)施方案中，本文提供了在手術(shù)去除或用冷凍消融或射頻消融腫瘤后，分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物抑制腫瘤周圍的區(qū)域中的癌細(xì)胞增殖的用途。在一些實(shí)施方案中，本文提供了分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物在有需要的對象中局部抑制癌細(xì)胞增殖的用途。在一些實(shí)施方案中，本文提供了分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物在有需要的對象中全身抑制癌細(xì)胞增殖的用途。在一些實(shí)施方案中，增殖被抑制或減少5-95％、10-90％、20-80％、30-70％、40-60％、50-95％、65-85％或75-95％。在一些實(shí)施方案中，增殖被抑制或減少至少
5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大于95％。在一些實(shí)施方案中，增殖被抑制或減少至少5％。在一些實(shí)施方案中，增殖被抑制或減少至少10％。在一些實(shí)施方案中，增殖被抑制或減少至少50％。
80.本文證明分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物降低癌細(xì)胞的代謝活性。在某些實(shí)施方案中，本文提供了分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物(包括包含hc-ha/ptx3的制劑或組合物)降低癌細(xì)胞中的代謝活性的用途。在一些實(shí)施方案中，本文提供了分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物降低實(shí)體瘤中的癌細(xì)胞的代謝活性的用途。在一些實(shí)施方案中，本文提供了在手術(shù)去除或用冷凍消融或射頻消融腫瘤后，分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物降低腫瘤周圍的區(qū)域中的癌細(xì)胞的代謝活性的用途。在一些實(shí)施方案中，本文提供了分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物在有需要的對象中局部降低癌細(xì)胞的代謝活性的用途。在一些實(shí)施方案中，本文提供了分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物在有需要的對象中全身降低癌細(xì)胞的代謝活性的用途。在一些實(shí)施方案中，代謝活性降低5-95％、10-90％、20-80％、30-70％、40-60％、50-95％、65-85％或75-95％。在一些實(shí)施方案中，代謝活性降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大于95％。在一些實(shí)施方案中，代謝活性降低至少5％。在一些實(shí)施方案中，代謝活性降低至少10％。在一些實(shí)施方案中，代謝活性降低至少50％。
81.在某些實(shí)施方案中，本文提供了分離的hc-ha/ptx3復(fù)合物(包括包含hc-ha/ptx3的制劑或組合物)增加癌細(xì)胞死亡的用途。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞死亡增加約10％至約25％、約10％至約50％、約20％至約90％。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞死亡增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或大于95％。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞死亡是由細(xì)胞凋亡引起的。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞死亡是由壞死引起的。
82.在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞來自實(shí)體瘤或在實(shí)體瘤內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，實(shí)體瘤是肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、胃癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)癌、骨癌、淋巴癌、皮膚癌、頭頸癌、腎癌、睪丸癌、子宮癌、宮頸癌、食管癌、甲狀腺癌、唾液腺癌、腎上腺癌或胃腸癌。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞來自液體腫瘤。在一些實(shí)施方案中，液體癌是淋巴癌或白血病。在一些實(shí)施方案中，cns癌癥是神經(jīng)膠質(zhì)瘤或轉(zhuǎn)移癌。在一些實(shí)施方案中，神經(jīng)膠質(zhì)瘤是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤或間變性星形細(xì)胞瘤。在一些實(shí)施方案中，結(jié)腸癌是腺癌、類癌瘤、原發(fā)性結(jié)腸直腸淋巴癌、間質(zhì)瘤或平滑肌肉瘤。在一些實(shí)施方案中，皮膚癌是黑素瘤、基底細(xì)胞癌或鱗狀細(xì)胞癌。產(chǎn)生分離的nhc-ha/ptx3復(fù)合物的方法
83.在一些實(shí)施方案中，在本文提供的方法中使用分離的天然hc-ha/ptx3(nhc-ha/ptx3)復(fù)合物。
84.在一些實(shí)施方案中，分離的nhc-ha/ptx3復(fù)合物分離自羊膜組織。在一些實(shí)施方案中，分離的nhc-ha/ptx3復(fù)合物分離自羊膜或臍帶。在一些實(shí)施方案中，分離的nhc-ha/ptx3復(fù)合物分離自新鮮、冷凍或先前冷凍的胎盤羊膜(pam)，新鮮、冷凍或先前冷凍的臍帶羊膜(ucam)，新鮮、冷凍或先前冷凍的胎盤，新鮮、冷凍或先前冷凍的臍帶，新鮮、冷凍或先前冷凍的絨毛膜，新鮮、冷凍或先前冷凍的羊膜-絨毛膜或其任何組合。此類組織可獲自任何哺
乳動物，例如但不限于人、非人靈長類動物、牛或豬。
85.在一些實(shí)施方案中，通過任何合適的方法純化nhc-ha/ptx3。在一些實(shí)施方案中，通過離心(例如，超速離心、梯度離心)、譜(例如，離子交換、親和、尺寸排阻和羥磷灰石譜)、切向流過濾(tff)、凝膠過濾或差異溶解度、乙醇沉淀或任何其他可用的蛋白質(zhì)純化技術(shù)來純化nhc-ha/ptx3復(fù)合物(參見，例如，scopes,protein purification principles and practice第2版,springer-verlag,new york,1987；higgins,s.j.和hames,b.d.(編輯),protein expression:a practical approach,oxford univ press,1999；和deutscher,m.p.,simon,m.i.,abelson,j.n.(編輯),guide to protein purification:methods in enzymology(methods in enzymology series,第182卷),academic press,1997，均通過引用并入本文)。
86.在一些實(shí)施方案中，nhc-ha/ptx3從提取物分離。在一些實(shí)施方案中，提取物從羊膜提取物制備。在一些實(shí)施方案中，提取物從臍帶提取物制備。在一些實(shí)施方案中，臍帶提取物包含臍帶基質(zhì)和/或華頓氏膠。在一些實(shí)施方案中，nhc-ha/ptx3復(fù)合物包含在通過超速離心制備的提取物中。在一些實(shí)施方案中，nhc-ha/ptx3復(fù)合物包含在通過使用cscl/4-6m鹽酸胍梯度超速離心制備的提取物中。在一些實(shí)施方案中，提取物通過至少2輪的超速離心制備。在一些實(shí)施方案中，提取物通過多于2輪的超速離心制備(即nhc-ha/ptx3第2)。在一些實(shí)施方案中，提取物通過至少4輪的超速離心制備(即nhc-ha/ptx3第4)。在一些實(shí)施方案中，nhc-ha/ptx3復(fù)合物包含小的富含亮氨酸的蛋白聚糖。在一些實(shí)施方案中，nhc-ha/ptx3復(fù)合物包含hc1、ha、ptx3和/或小的富含亮氨酸的蛋白聚糖。
87.在一些實(shí)施方案中，對通過在等滲溶液中提取制備的提取物進(jìn)行超速離心。在一些實(shí)施方案中，等滲溶液是pbs。例如，在一些實(shí)施方案中，組織在pbs中均質(zhì)化以產(chǎn)生均質(zhì)化樣品。然后通過離心將勻質(zhì)化的樣品分離成可溶部分和不溶部分。在一些實(shí)施方案中，對pbs提取組織的可溶部分進(jìn)行超速離心。在這樣的實(shí)施方案中，通過對pbs提取的組織進(jìn)行超速離心而純化的nhc-ha/ptx3稱為nhc-ha/ptx3可溶性復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，nhc-ha可溶性復(fù)合物包含小的富含亮氨酸的蛋白聚糖。在一些實(shí)施方案中，nhc-ha/ptx3可溶性復(fù)合物包含hc1、ha、ptx3和/或小的富含亮氨酸的蛋白聚糖。
88.在一些實(shí)施方案中，對通過羊膜和/或臍帶組織的直接鹽酸胍提取(例如4-6m gnhcl)制備的提取物進(jìn)行超速離心。在一些實(shí)施方案中，然后將gnhcl提取物組織離心以產(chǎn)生gnhcl可溶部分和gnhcl不溶部分。在一些實(shí)施方案中，對gnhcl可溶部分進(jìn)行超速離心。在這樣的實(shí)施方案中，通過對鹽酸胍提取的組織進(jìn)行超速離心而純化的nhc-ha/ptx3被稱為nhc-ha/ptx3不溶性復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，nhc-ha不溶性復(fù)合物包含小的富含亮氨酸的蛋白聚糖。在一些實(shí)施方案中，nhc-ha/ptx3不溶性復(fù)合物包含hc1、ha、ptx3和/或小的富含亮氨酸的蛋白聚糖。
89.在一些實(shí)施方案中，對通過pbs提取組織的不溶部分的進(jìn)一步鹽酸胍提取而制備的提取物進(jìn)行超速離心。例如，在一些實(shí)施方案中，組織在pbs中均質(zhì)化以產(chǎn)生均質(zhì)化樣品。然后通過離心將勻質(zhì)化的樣品分離成可溶部分和不溶部分。然后在鹽酸胍(例如4-6m gnhcl)中進(jìn)一步提取不溶部分并離心以產(chǎn)生鹽酸胍可溶部分和不溶部分。在一些實(shí)施方案中，對鹽酸胍可溶部分進(jìn)行超速離心。在這樣的實(shí)施方案中，通過對鹽酸胍提取的組織進(jìn)行超速離心而純化的nhc-ha/ptx3被稱為nhc-ha/ptx3不溶性復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，
nhc-ha不溶性復(fù)合物包含小的富含亮氨酸的蛋白聚糖。在一些實(shí)施方案中，nhc-ha/ptx3不溶性復(fù)合物包含hc1、ha、ptx3和/或小的富含亮氨酸的蛋白聚糖。
90.在一些實(shí)施方案中，純化分離的nhc-ha/ptx3提取物的方法包括：(a)將分離的提取物(例如通過本文所述的可溶性或不溶性方法制備的)以1.35g/ml的初始密度溶解在cscl/4-6m鹽酸胍中以生成cscl混合物，(b)在15℃下以125,000x g離心cscl混合物48小時以生成第一純化提取物，并將含有ha的級分匯集/調(diào)整至初始密度為1.40g/ml，在15℃下以125,000x g進(jìn)行48小時的第二超速離心，(c)匯集純化的級分并用蒸餾水透析以去除cscl和鹽酸胍，產(chǎn)生透析液。在一些實(shí)施方案中，純化分離的提取物的方法進(jìn)一步包括(d)將透析液與3體積的含有1.3％(w/v)乙酸鉀的95％(v/v)乙醇在0℃混合1小時，以產(chǎn)生第一透析液/乙醇混合物，(e)以15,000x g離心第一透析液/乙醇混合物，以產(chǎn)生第二純化提取物，和(f)提取第二純化提取物。在一些實(shí)施方案中，純化分離的提取物的方法進(jìn)一步包括：(g)用乙醇(例如，70％乙醇)洗滌第二純化提取物，以產(chǎn)生第二純化提取物/乙醇混合物；(h)離心第二純化提取物/乙醇混合物，以產(chǎn)生第三純化提取物；(i)提取第三純化提取物。在一些實(shí)施方案中，純化分離的提取物的方法進(jìn)一步包括：(j)用乙醇(例如，70％乙醇)洗滌第三純化提取物，以產(chǎn)生第三純化提取物/乙醇混合物；(k)離心第三純化提取物/乙醇混合物，以產(chǎn)生第四純化提取物；(l)提取第四純化提取物。在一些實(shí)施方案中，純化提取物包含nhc-ha/ptx3復(fù)合物。
91.在一些實(shí)施方案中，nhc-ha/ptx3復(fù)合物通過免疫親和譜純化。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生抗hc1抗體、抗hc2抗體或兩者并固定到固定支持物上。在一些實(shí)施方案中，未純化的hc-ha復(fù)合物(即流動相)通過支持物。在某些情況下，hc-ha復(fù)合物與抗體結(jié)合(例如，通過(a)抗hc1抗體和hc1，(b)抗hc2抗體和hc2，(c)抗ptx抗體和ptx3，(d)抗slrp抗體和slrp，或(e)其任何組合的相互作用)。在一些實(shí)施方案中，洗滌支持物(例如，用pbs)以去除任何未結(jié)合或松散結(jié)合的分子。在一些實(shí)施方案中，然后用能夠從支持物洗脫nhc-ha/ptx3復(fù)合物的溶液(例如，1％ sds、6m鹽酸胍或8m脲)洗滌支持物。
92.在一些實(shí)施方案中，通過親和譜純化nhc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生habp并將其固定到固定支持物上。在一些實(shí)施方案中，未純化的nhc-ha/ptx3復(fù)合物(即流動相)通過支持物。在某些情況下，nhc-ha/ptx3復(fù)合物與habp結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，洗滌支持物(例如，用pbs)以去除任何未結(jié)合或松散結(jié)合的分子。在一些實(shí)施方案中，然后用能夠從支持物洗脫hc-ha復(fù)合物的溶液洗滌支持物。
93.在一些實(shí)施方案中，通過habp親和譜，和使用抗hc1抗體、抗hc2抗體、抗ptx3抗體、抗slrp或slrp的組合的抗體或其任何抗體組合的免疫親和譜純化nhc-ha/ptx3復(fù)合物。
94.在一些實(shí)施方案中，使用一種或多種抗體從如本文所述的不溶性級分中純化nhc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，使用抗slrp抗體從如本文所述的不溶性級分中純化nhc-ha/ptx3復(fù)合物。
95.在一些實(shí)施方案中，從如本文所述的可溶性級分中純化nhc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，使用抗ptx3抗體從如本文所述的可溶性級分中純化nhc-ha/ptx3復(fù)合物。
96.在一些實(shí)施方案中，nhc-ha/ptx3復(fù)合物包含小的富含亮氨酸的蛋白聚糖(slrp)。在一些實(shí)施方案中，nhc-ha/ptx3復(fù)合物包含i類、ii類或iii類slrp。在一些實(shí)施方案中，小
的富含亮氨酸的蛋白聚糖選自i類slrp，例如核心蛋白聚糖和雙糖鏈蛋白聚糖。在一些實(shí)施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白聚糖選自ii類slrp，例如纖調(diào)蛋白聚糖、基膜聚糖、prelp(末端富含脯氨酸精氨酸的富亮氨酸蛋白質(zhì))、角蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些實(shí)施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白聚糖選自iii類slrp，例如表聚糖(epipycan)和骨甘蛋白聚糖。在一些實(shí)施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白聚糖選自bikunin、核心蛋白聚糖、雙糖鏈蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些實(shí)施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白質(zhì)包含糖胺聚糖。在一些實(shí)施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白聚糖包含硫酸角質(zhì)素。產(chǎn)生rchc-ha/ptx3復(fù)合物的方法
97.在一些實(shí)施方案中，rchc-ha/ptx3復(fù)合物用于本文提供的方法中。這種重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物可以含有或不含slrp。
98.在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物的方法包括(a)使透明質(zhì)酸(ha)與iαi和tsg-6接觸以形成預(yù)結(jié)合tsg-6的hc-ha復(fù)合物和(b)在合適的條件下使hc-ha復(fù)合物與正五聚蛋白3(ptx3)接觸以形成rchc-ha/ptx3復(fù)合物。本文提供了通過這種方法產(chǎn)生的rchc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，iαi的hc1與ha形成共價(jià)鍵。在一些實(shí)施方案中，所述方法的步驟(a)和(b)按順序依次進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使與tsg-6預(yù)結(jié)合的hc-ha復(fù)合物與ptx3接觸。在一些實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸(ha)是高分子量透明質(zhì)酸(hmw hw)。在一些實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸(ha)是低分子量透明質(zhì)酸(lmw hw)。
99.在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物的方法包括(a)使高分子量透明質(zhì)酸(hmw ha)與iαi和tsg-6接觸以形成預(yù)結(jié)合tsg-6的hc-ha復(fù)合物和(b)在合適的條件下使hc-ha復(fù)合物與正五聚蛋白3(ptx3)接觸以形成rchc-ha/ptx3復(fù)合物。本文提供了通過這種方法產(chǎn)生的rchc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，iαi的hc1與ha形成共價(jià)鍵。在一些實(shí)施方案中，所述方法的步驟(a)和(b)按順序依次進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使與tsg-6預(yù)結(jié)合的hc-ha復(fù)合物與ptx3接觸。
100.在一些實(shí)施方案中，iαi蛋白和tsg-6蛋白以約1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1或20:1(iαi:tsg-6)的摩爾比與hmw ha接觸。在一些實(shí)施方案中，iαi:tsg-6的比率范圍是約1:1至約20:1，例如約1:1至約10:1，例如約1:1至5約:1，例如約1:1至約3:1。在一些實(shí)施方案中，iαi:tsg-6的比率是3:1或更高。在一些實(shí)施方案中，iαi:tsg-6的比率是3:1。
101.在某些情況下，tsg-6與iαi相互作用并與iαi的hc1和hc2形成共價(jià)復(fù)合物(例如，hc1
·
tsg-6和hc2
·
tsg-6)。在某些情況下，在ha存在的情況下，hc轉(zhuǎn)移至ha以形成rchc-ha。
102.在一些實(shí)施方案中，使透明質(zhì)酸(ha)與iαi和tsg-6接觸的步驟進(jìn)行至少10分鐘、至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少3小時、至少4小時、至少5小時、至少6小時、至少12小時或至少24小時或更長時間。在一些實(shí)施方案中，使ha與iαi和tsg-6接觸的步驟進(jìn)行至少2小時或更長時間。在一些實(shí)施方案中，使ha與iαi和tsg-6接觸的步驟進(jìn)行至少2小時。在一些實(shí)施方案中，使ha與iαi和tsg-6接觸的步驟發(fā)生在37℃。在一些實(shí)施方案中，使固定化的ha與iαi和tsg-6接觸的步驟發(fā)生在pbs中的5mm mgcl2中。在一些實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸(ha)是高分子量透明質(zhì)酸(hmw hw)。在一些實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸(ha)是低分子量透明質(zhì)酸(lmw hw)。
103.在一些實(shí)施方案中，使高分子量透明質(zhì)酸(hmw ha)與iαi和tsg-6接觸的步驟進(jìn)行至少10分鐘、至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少3小時、至少4小時、至少5小時、至少6小時、至少12小時或至少24小時或更長時間。在一些實(shí)施方案中，使hmw ha與iαi和tsg-6接觸的步驟進(jìn)行至少2小時或更長時間。在一些實(shí)施方案中，使hmw ha與iαi和tsg-6接觸的步驟進(jìn)行至少2小時。在一些實(shí)施方案中，使hmw ha與iαi和tsg-6接觸的步驟發(fā)生在37℃。在一些實(shí)施方案中，使固定化的hmw ha與iαi和tsg-6接觸的步驟發(fā)生在pbs中的5mm mgcl2中。
104.在一些實(shí)施方案中，使ptx3與hc-ha復(fù)合物接觸的步驟進(jìn)行至少10分鐘、至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少3小時、至少4小時、至少5小時、至少6小時、至少12小時或至少24小時或更長時間。在一些實(shí)施方案中，使ptx3與hc-ha復(fù)合物接觸的步驟進(jìn)行至少2小時或更長時間。在一些實(shí)施方案中，使ptx3與hc-ha復(fù)合物接觸的步驟進(jìn)行至少2小時。在一些實(shí)施方案中，使ptx3與hc-ha復(fù)合物接觸的步驟發(fā)生在37℃。在一些實(shí)施方案中，使ptx3與hc-ha復(fù)合物接觸的步驟發(fā)生在pbs中的5mm mgcl2中。
105.在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使透明質(zhì)酸(ha)與正五聚蛋白3(ptx3)蛋白、包含重鏈1(hc1)和重鏈2(hc2)的間-α-抑制劑(iαi)蛋白和腫瘤壞死因子α刺激基因6(tsg-6)在合適的條件下同時接觸形成hc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，ha與ptx3、iαi和tsg-6接觸進(jìn)行至少10分鐘、至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少3小時、至少4小時、至少5小時、至少6小時、至少12小時或至少24小時或更長時間。在一些實(shí)施方案中，使ha、ptx3、iαi和tsg-6接觸的步驟發(fā)生在37℃。在一些實(shí)施方案中，使ha、ptx3、iαi和tsg-6接觸的步驟發(fā)生在pbs中的5mm mgcl2中。在一些實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸(ha)是高分子量透明質(zhì)酸(hmw hw)。在一些實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸(ha)是低分子量透明質(zhì)酸(lmw hw)。
106.在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使高分子量透明質(zhì)酸(hmw ha)與正五聚蛋白3(ptx3)蛋白、包含重鏈1(hc1)和重鏈2(hc2)的間-α-抑制劑(iαi)蛋白和腫瘤壞死因子α刺激基因6(tsg-6)在合適的條件下同時接觸形成hc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，hmw ha與ptx3、iαi和tsg-6的接觸進(jìn)行至少10分鐘、至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少3小時、至少4小時、至少5小時、至少6小時、至少12小時或至少24小時或更長時間。在一些實(shí)施方案中，使hmw ha、ptx3、iαi和tsg-6接觸的步驟發(fā)生在37℃。在一些實(shí)施方案中，使hmw ha、ptx3、iαi和tsg-6接觸的步驟發(fā)生在pbs中的5mm mgcl2中。
107.在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使透明質(zhì)酸(ha)與正五聚蛋白3(ptx3)蛋白、包含重鏈1(hc1)和重鏈2(hc2)的間-α-抑制劑(iαi)蛋白和腫瘤壞死因子α刺激基因6(tsg-6)在合適的條件下以任何順序依次接觸形成hc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，hmw ha與ptx3、iαi和tsg-6的接觸進(jìn)行至少10分鐘、至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少3小時、至少4小時、至少5小時、至少6小時、至少12小時或至少24小時或更長時間。在一些實(shí)施方案中，使ha、ptx3、iαi和tsg-6接觸的步驟發(fā)生在37℃。在一些實(shí)施方案中，使ha、ptx3、iαi和tsg-6接觸的步驟發(fā)生在pbs中的5mm mgcl2中。在一些實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸(ha)是高分子量透明質(zhì)酸(hmw hw)。在一些實(shí)施方案中，透明質(zhì)酸(ha)是低分子量透明質(zhì)酸(lmw hw)。
108.在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使高分子量透明質(zhì)酸(hmw ha)與正五聚蛋白3(ptx3)蛋白、包含重鏈1(hc1)和重鏈2(hc2)的間-α-抑制劑(iαi)蛋白和腫瘤壞死因子α刺
激基因6(tsg-6)在合適的條件下以任何順序依次接觸形成hc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，hmw ha與ptx3、iαi和tsg-6的接觸進(jìn)行至少10分鐘、至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少3小時、至少4小時、至少5小時、至少6小時、至少12小時或至少24小時或更長時間。在一些實(shí)施方案中，使hmw ha、ptx3、iαi和tsg-6接觸的步驟發(fā)生在37℃。在一些實(shí)施方案中，使hmw ha、ptx3、iαi和tsg-6接觸的步驟發(fā)生在pbs中的5mm mgcl2中。
109.在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生rchc-ha/ptx3復(fù)合物的方法進(jìn)一步包括添加一種或多種小的富含亮氨酸的蛋白聚糖(slrp)。在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物的方法包括(a)使透明質(zhì)酸(ha)與iαi和tsg-6接觸以形成預(yù)結(jié)合tsg-6的hc-ha復(fù)合物，(b)使hc-ha復(fù)合物與正五聚蛋白3(ptx3)接觸和(c)在合適的條件下使hc-ha復(fù)合物與一種或多種slrps接觸以形成rchc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物的方法包括(a)使高分子量透明質(zhì)酸(hmw ha)與iαi和tsg-6接觸以形成預(yù)結(jié)合tsg-6的hc-ha復(fù)合物，(b)使hc-ha復(fù)合物與正五聚蛋白3(ptx3)接觸和(c)在合適的條件下使hc-ha復(fù)合物與一種或多種slrps接觸以形成rchc-ha/ptx3復(fù)合物。本文提供了通過這種方法產(chǎn)生的rchc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，iαi的hc1與ha形成共價(jià)鍵。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使預(yù)結(jié)合tsg-6的hc-ha復(fù)合物與ptx3接觸。在一些實(shí)施方案中，所述方法的步驟(a)、(b)和(c)按順序依次進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，所述方法的步驟(a)、(b)和(c)同時進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行所述方法的步驟(a)，然后依次進(jìn)行所述方法的步驟(b)和(c)。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行所述方法的步驟(a)，然后同時進(jìn)行所述方法的步驟(b)和(c)。
110.在一些實(shí)施方案中，slrp選自i類、ii類或iii類slrp。在一些實(shí)施方案中，slrp選自i類slrp，例如核心蛋白聚糖和雙糖鏈蛋白聚糖。在一些實(shí)施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白聚糖選自ii類slrp，例如纖調(diào)蛋白聚糖、基膜聚糖、prelp(末端富含脯氨酸精氨酸的富亮氨酸蛋白質(zhì))、角蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些實(shí)施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白聚糖選自iii類slrp，例如表聚糖和骨甘蛋白聚糖。在一些實(shí)施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白聚糖選自bikunin、核心蛋白聚糖、雙糖鏈蛋白聚糖和骨黏附蛋白聚糖。在一些實(shí)施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白質(zhì)包含糖胺聚糖。在一些實(shí)施方案中，小的富含亮氨酸的蛋白聚糖包含硫酸角質(zhì)素。
111.ptx3
112.在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的ptx3分離自一個細(xì)胞或多個細(xì)胞(例如，組織提取物)。適合于表達(dá)ptx3的示例性細(xì)胞包括但不限于動物細(xì)胞和植物細(xì)胞，其中動物細(xì)胞包括但不限于哺乳動物細(xì)胞、靈長類動物細(xì)胞、人細(xì)胞、嚙齒動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、細(xì)菌和酵母，其中植物細(xì)胞包括但不限于藻類、被子植物、裸子植物、蕨類植物和苔蘚植物。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的ptx3分離自人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的ptx3分離自用一種或多種促炎細(xì)胞因子刺激以上調(diào)ptx3表達(dá)的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，促炎細(xì)胞因子是il-1或tnf-α。
113.在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的ptx3分離自羊膜細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的ptx3分離自來自臍帶的羊膜細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用一種或多種促炎細(xì)胞因子刺激羊膜細(xì)胞以上調(diào)ptx3表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，促炎細(xì)胞因子是il-1或tnf-α。
114.在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的ptx3分離自臍帶細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用一種或多種促炎細(xì)胞因子刺激臍帶細(xì)胞以上調(diào)ptx3表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，促炎細(xì)胞因子是il-1或tnf-α。
115.在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的ptx3分離自羊膜上皮細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的ptx3分離自臍帶上皮細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用一種或多種促炎細(xì)胞因子刺激羊膜上皮細(xì)胞或臍帶上皮細(xì)胞以上調(diào)ptx3表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，促炎細(xì)胞因子是il-1或tnf-α。
116.在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的ptx3分離自羊膜基質(zhì)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的ptx3分離自臍帶基質(zhì)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用一種或多種促炎細(xì)胞因子刺激羊膜基質(zhì)細(xì)胞或臍帶基質(zhì)細(xì)胞以上調(diào)ptx3表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，促炎細(xì)胞因子是il-1或tnf-α。
117.在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的ptx3是從細(xì)胞中分離的天然ptx3蛋白。在一些實(shí)施方案中，用一種或多種促炎細(xì)胞因子刺激細(xì)胞以上調(diào)ptx3表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，促炎細(xì)胞因子是il-1或tnf-α。
118.在一些實(shí)施方案中，通過重組技術(shù)制備ptx3。在一些實(shí)施方案中，由重組表達(dá)載體表達(dá)ptx3。在一些實(shí)施方案中，編碼ptx3的核酸可操作地連接至組成型啟動子。在一些實(shí)施方案中，編碼ptx3的核酸可操作地連接至誘導(dǎo)型啟動子。在一些實(shí)施方案中，ptx3在轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，ptx3是重組蛋白。在一些實(shí)施方案中，ptx3是從細(xì)胞分離的重組蛋白。在一些實(shí)施方案中，ptx3是在無細(xì)胞提取物中產(chǎn)生的重組蛋白。
119.在一些實(shí)施方案中，從羊膜、臍帶、臍帶羊膜、絨毛膜、羊水或其組合中純化ptx3。在一些實(shí)施方案中，從羊膜細(xì)胞中純化ptx3。在一些實(shí)施方案中，羊膜細(xì)胞是羊膜上皮細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，羊膜細(xì)胞是臍帶上皮細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，羊膜細(xì)胞是羊膜基質(zhì)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，羊膜細(xì)胞是臍帶基質(zhì)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用一種或多種促炎細(xì)胞因子刺激羊膜細(xì)胞以上調(diào)ptx3表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，促炎細(xì)胞因子是il-1或tnf-α。
120.在一些實(shí)施方案中，ptx3并非分離自一個細(xì)胞或多個細(xì)胞(例如，組織提取物)。
121.在一些實(shí)施方案中，ptx3包含足以促進(jìn)形成rchc-ha/ptx3復(fù)合物的ptx3片段。用于所提供方法中的ptx3變體包括具有氨基酸修飾的變體，所述氨基酸修飾是氨基酸置換(取代)、缺失或插入。在一些實(shí)施方案中，此類修飾改善了ptx3多肽的一種或多種特性，例如改善rchc-ha/ptx3復(fù)合物的一個或多個特性(例如，抗炎、抗免疫、抗血管生成、抗瘢痕形成、抗粘連、再生或本文所述的其他活性)。
122.在一些實(shí)施方案中，ptx3蛋白獲自商業(yè)來源。ptx3的示例性商業(yè)來源是但不限于ptx3(目錄號1826-ts；r amp;d systems，minneapolis，mn)。
123.在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的ptx3蛋白是多聚體蛋白。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的ptx3蛋白是同多聚體。在一些實(shí)施方案中，同多聚體是二聚體、三聚體、四聚體、六聚體、五聚體或八聚體。在一些實(shí)施方案中，ptx3同多聚體是三聚體、四聚體或八聚體。在特定實(shí)施方案中，ptx3同多聚體是八聚體。在一些實(shí)施方案中，修飾多聚化結(jié)構(gòu)域以改善ptx3蛋白的多聚化。在一些實(shí)施方案中，多聚化結(jié)構(gòu)域被異質(zhì)多聚化結(jié)構(gòu)域(例如，fc多聚化結(jié)構(gòu)域或亮氨酸拉鏈)替換，其當(dāng)與ptx3融合時改善ptx3的多聚化。
124.tsg-6
125.在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的tsg-6分離自一個細(xì)胞或多個細(xì)胞(例如，組織提取物)。適合于表達(dá)tsg-6的示例性細(xì)胞包括但不限于動物細(xì)胞和植物細(xì)胞，其中動物細(xì)胞包括但不限于哺乳動物細(xì)胞、靈長類動物細(xì)胞、人細(xì)胞、嚙齒動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、細(xì)菌和酵母，其中植物細(xì)胞包括但不限于藻類、被子植物、裸子植物、蕨類植物和苔蘚植物。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的tsg-6分離自人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的tsg-6分離自用一種或多種促炎細(xì)胞因子刺激以上調(diào)tsg-6表達(dá)的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，促炎細(xì)胞因子是il-1或tnf-α。
126.在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的tsg-6分離自羊膜細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的tsg-6分離自來自臍帶的羊膜細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的tsg-6分離自用一種或多種促炎細(xì)胞因子刺激以上調(diào)tsg-6表達(dá)的羊膜細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，促炎細(xì)胞因子是il-1或tnf-α。
127.在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的tsg-6分離自臍帶細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的tsg-6分離自用一種或多種促炎細(xì)胞因子刺激以上調(diào)tsg-6表達(dá)的臍帶細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，促炎細(xì)胞因子是il-1或tnf-α。
128.在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的tsg-6分離自羊膜上皮細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的tsg-6分離自臍帶上皮細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的tsg-6分離自用一種或多種促炎細(xì)胞因子刺激以上調(diào)tsg-6表達(dá)的羊膜上皮細(xì)胞或臍帶上皮細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，促炎細(xì)胞因子是il-1或tnf-α。
129.在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的tsg-6分離自羊膜基質(zhì)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的tsg-6分離自臍帶基質(zhì)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的tsg-6分離自用一種或多種促炎細(xì)胞因子刺激以上調(diào)tsg-6表達(dá)的羊膜基質(zhì)細(xì)胞或臍帶基質(zhì)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，促炎細(xì)胞因子是il-1或tnf-α。
130.在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的tsg-6是從細(xì)胞中分離的天然tsg-6蛋白。在一些實(shí)施方案中，用一種或多種促炎細(xì)胞因子刺激細(xì)胞以上調(diào)tsg-6表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，促炎細(xì)胞因子是il-1或tnf-α。
131.在一些實(shí)施方案中，通過重組技術(shù)制備tsg-6。在一些實(shí)施方案中，由重組表達(dá)載體表達(dá)tsg-6。在一些實(shí)施方案中，編碼tsg-6的核酸可操作地連接至組成型啟動子。在一些實(shí)施方案中，編碼tsg-6的核酸可操作地連接至誘導(dǎo)型啟動子。在一些實(shí)施方案中，tsg-6在轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，tsg-6是重組蛋白。在一些實(shí)施方案中，tsg-6是從細(xì)胞分離的重組蛋白。在一些實(shí)施方案中，tsg-6是在無細(xì)胞提取物中產(chǎn)生的重組蛋白。
132.在一些實(shí)施方案中，從羊膜、羊膜、絨毛膜、羊水或其組合中純化tsg-6。在一些實(shí)施方案中，從羊膜細(xì)胞中純化tsg-6。在一些實(shí)施方案中，羊膜細(xì)胞是羊膜上皮細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，羊膜上皮細(xì)胞是臍帶上皮細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，羊膜細(xì)胞是羊膜基質(zhì)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，羊膜細(xì)胞是臍帶基質(zhì)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用一種或多種促炎細(xì)胞因子刺激羊膜細(xì)胞以上調(diào)tsg-6表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，促炎細(xì)胞因子是il-1或tnf-α。
133.在一些實(shí)施方案中，tsg-6并非分離自一個細(xì)胞或多個細(xì)胞(例如，組織提取物)。
134.在一些實(shí)施方案中，tsg-6包含足以促進(jìn)或催化iαi的hc1向ha轉(zhuǎn)移的tsg-6片段。
在一些實(shí)施方案中，tsg-6包括tsg-6的連接模塊。
135.在一些實(shí)施方案中，tsg-6包含親和標(biāo)簽。示例性親和標(biāo)簽包括但不限于血凝素標(biāo)簽、聚組氨酸標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、flag標(biāo)簽、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(gst)標(biāo)簽。此類親和標(biāo)簽在本領(lǐng)域中用于純化是眾所周知的。在一些實(shí)施方案中，此類親和標(biāo)簽作為融合蛋白或通過化學(xué)接頭摻入tsg-6多肽中。在一些實(shí)施方案中，tsg-6包含親和標(biāo)簽，以及通過親和純化從rchc-ha/ptx3復(fù)合物中去除未結(jié)合的tsg-6。
136.在一些實(shí)施方案中，tsg-6蛋白獲自商業(yè)來源。tsg-6的示例性商業(yè)來源是但不限于tsg-6(目錄號2104-ts r amp;d systems，minneapolis，mn)。
137.iαi
138.在一些實(shí)施方案中，iαi包含hc1鏈。在一些實(shí)施方案中，iαi包含hc1和hc2鏈。在一些實(shí)施方案中，iαi包含hc1、hc2鏈和bikunin。在一些實(shí)施方案中，iαi包含通過硫酸軟骨素鏈連接的hc1和hc2鏈和bikunin。
139.在一些實(shí)施方案中，從生物樣品中分離iαi。在一些實(shí)施方案中，生物樣品是來自哺乳動物的生物樣品。在一些實(shí)施方案中，哺乳動物是人。在一些實(shí)施方案中，生物樣品是血液、血清、血漿、肝臟、羊膜、絨毛膜或羊水樣品。在一些實(shí)施方案中，生物樣品是血液、血清或血漿樣品。在一些實(shí)施方案中，生物樣品是血液樣品。在一些實(shí)施方案中，生物樣品是血清樣品。在一些實(shí)施方案中，生物樣品是血漿樣品。在一些實(shí)施方案中，從人血液、血漿或血清純化iαi。在一些實(shí)施方案中，iαi分離自人血清。在一些實(shí)施方案中，iαi并非分離自血清。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的iαi在羊膜細(xì)胞中產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的iαi在臍帶細(xì)胞中產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的iαi在來自臍帶的羊膜細(xì)胞中產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的iαi在羊膜上皮細(xì)胞中產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的iαi在臍帶上皮細(xì)胞中產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的iαi在羊膜基質(zhì)細(xì)胞中產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的iαi在臍帶基質(zhì)細(xì)胞中產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，用于所述方法中的iαi在肝細(xì)胞中產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，通過重組技術(shù)制備iαi。
140.在一些實(shí)施方案中，iαi的hc1分離自生物樣品。在一些實(shí)施方案中，生物樣品是來自哺乳動物的生物樣品。在一些實(shí)施方案中，哺乳動物是人。在一些實(shí)施方案中，生物樣品是血液、血清、血漿、肝臟、羊膜、絨毛膜或羊水樣品。在一些實(shí)施方案中，生物樣品是血液、血清或血漿樣品。在一些實(shí)施方案中，生物樣品是血液樣品。在一些實(shí)施方案中，生物樣品是血清樣品。在一些實(shí)施方案中，生物樣品是血漿樣品。在一些實(shí)施方案中，從人血液、血漿或血清純化iαi的hc1。在一些實(shí)施方案中，iαi分離自人血清。在一些實(shí)施方案中，iαi的hc1并非從血清純化。在一些實(shí)施方案中，通過重組技術(shù)制備iαi的hc1。在一些實(shí)施方案中，從肝細(xì)胞純化iαi的hc1。在一些實(shí)施方案中，從羊膜細(xì)胞純化iαi的hc1。在一些實(shí)施方案中，從羊膜上皮細(xì)胞或臍帶上皮細(xì)胞純化iαi的hc1。在一些實(shí)施方案中，從羊膜基質(zhì)細(xì)胞或臍帶基質(zhì)細(xì)胞純化iαi的hc1。
141.在一些實(shí)施方案中，從生物樣品分離iαi的hc2。在一些實(shí)施方案中，生物樣品是來自哺乳動物的生物樣品。在一些實(shí)施方案中，哺乳動物是人。在一些實(shí)施方案中，生物樣品是血液、血清、血漿、肝臟、羊膜、絨毛膜或羊水樣品。在一些實(shí)施方案中，生物樣品是血液、血清或血漿樣品。在一些實(shí)施方案中，生物樣品是血液樣品。在一些實(shí)施方案中，生物樣品
ha固定在covalink
tm-nh表面上。在一些實(shí)施方案中，hmw ha作為涂層直接固定在固體支持物上。在一些實(shí)施方案中，hmw ha在4℃固定在covalink
tm-nh表面上約16小時。
148.在一些實(shí)施方案中，所述方法包括通過直接連接至固體支持物(即沒有中間蛋白)將hmw ha固定至固體表面。在一些實(shí)施方案中，在使固定化的ha與iαi、tsg-6和ptx3接觸之前，洗滌固體支持物以去除未結(jié)合的hmw ha。在一些實(shí)施方案中，在使固定化的ha與iαi、tsg-6和ptx3接觸之前，用8m gnhcl和pbs的清洗液洗滌固體支持物以去除未結(jié)合的hmw ha。
149.在一些實(shí)施方案中，所述方法包括通過中間蛋白或接頭將ha固定到固體表面。在一些實(shí)施方案中，接頭是肽接頭。在一些實(shí)施方案中，中間蛋白是ha結(jié)合蛋白(habp)。在一些實(shí)施方案中，habp首先連接至固體支持物(例如，通過交聯(lián)、化學(xué)鍵或通過化學(xué)接頭)。在一些實(shí)施方案中，然后使包含habp的固體支持物與ha(例如，hmw ha)接觸以通過habp與ha的結(jié)合將ha固定到固體支持物上。在一些實(shí)施方案中，在使固定化的hmw ha與iαi、tsg-6和ptx3接觸之前，洗滌固體支持物以去除未結(jié)合的hmw ha。在一些實(shí)施方案中，在使固定化的ha與iαi、tsg-6和ptx3接觸之前，用8m gnhcl和pbs的清洗液洗滌固體支持物以去除未結(jié)合的hmw ha。
150.在一些實(shí)施方案中，所述方法包括通過肽接頭與固體支持物的連接和ha與肽接頭的連接將ha固定到固體表面。在一些實(shí)施方案中，肽接頭包含蛋白酶切割位點(diǎn)。
151.在一些實(shí)施方案中，所述方法包括通過連接可切割的化學(xué)接頭，例如但不限于二硫化物化學(xué)接頭，將ha固定到固體表面。
152.在一些實(shí)施方案中，選擇用于所述方法中的habp是在形成rchc-ha/ptx3復(fù)合物后從ha解離的habp。在一些實(shí)施方案中，habp與ha非共價(jià)結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括使用一種或多種解離劑將rchc-ha/ptx3復(fù)合物與habp解離。用于破壞非共價(jià)相互作用的解離劑(例如，鹽酸胍、脲和各種去污劑，例如，sds)是本領(lǐng)域已知的。在一些實(shí)施方案中，解離劑是脲。在一些實(shí)施方案中，解離劑是鹽酸胍。在一些實(shí)施方案中，解離劑是約4m至約8m鹽酸胍。在一些實(shí)施方案中，解離劑是約4m、約5m、約6m、約7m、約8m鹽酸胍。在一些實(shí)施方案中，解離劑是在ph 7.5的pbs中的約4m至約8m鹽酸胍。
153.在一些實(shí)施方案中，此類解離劑用于將rchc-ha/ptx3復(fù)合物與中間habp解離。通常選擇用于所述方法中的habp，使得對ha的結(jié)合親和力足夠強(qiáng)以允許rchc-ha/ptx3復(fù)合物的組裝，但用合適的解離劑與rchc-ha/ptx3復(fù)合物解離。在一些實(shí)施方案中，解離劑是鹽酸胍。
154.與本文提供的方法一起使用的示例性habp包括但不限于hapln1、hapln2、hapln3、hapln4、聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、神經(jīng)蛋白聚糖、短蛋白聚糖、磷酸酶蛋白聚糖、tsg-6、cd44、stabilin-1、stabilin-2或其足以結(jié)合ha的部分(例如，其連接模塊)。在一些實(shí)施方案中，habp是多功能蛋白聚糖。在一些實(shí)施方案中，habp是重組蛋白。在一些實(shí)施方案中，habp是重組哺乳動物蛋白。在一些實(shí)施方案中，habp是重組人蛋白。在一些實(shí)施方案中，habp是重組多功能蛋白聚糖蛋白或其足以結(jié)合ha的部分。在一些實(shí)施方案中，habp是重組聚集蛋白聚糖蛋白或其足以結(jié)合ha的部分。在一些實(shí)施方案中，habp是天然habp或其足以結(jié)合ha的部分。在一些實(shí)施方案中，天然habp分離自哺乳動物組織或細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，habp分離自牛鼻軟骨(例如來自seikagaku的habp，其含有聚集蛋白聚糖的ha結(jié)合結(jié)
構(gòu)域和連接蛋白)。
155.在一些實(shí)施方案中，habp包含hapln1、hapln2、hapln3、hapln4、聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、神經(jīng)蛋白聚糖、短蛋白聚糖、磷酸酶蛋白聚糖、tsg-6、cd44、stabilin-1或stabilin-2的連接模塊。在一些實(shí)施方案中，habp包含多功能蛋白聚糖的連接模塊。在一些實(shí)施方案中，包含連接模塊的habp是重組蛋白。在一些實(shí)施方案中，包含多功能蛋白聚糖的連接模塊的habp是重組蛋白。
156.在一些實(shí)施方案中，中間蛋白(例如habp)含有被位點(diǎn)特異性蛋白酶(例如弗林蛋白酶、3c蛋白酶、半胱天冬酶、基質(zhì)金屬蛋白酶或tev蛋白酶)識別并水解的蛋白水解切割序列。在此類實(shí)施方案中，通過使固定化的復(fù)合物與切割特定切割序列的蛋白酶接觸而從固體支持物釋放組裝的rchc-ha/ptx3復(fù)合物。
157.在一些實(shí)施方案中，純化rchc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，通過任何合適的方法或方法組合來純化rchc-ha/ptx3復(fù)合物。下面描述的實(shí)施方案不是排他性的，僅是示例性的。
158.在一些實(shí)施方案中，通過譜法(例如，離子交換、親和、尺寸排阻和羥磷灰石譜)、切向流過濾(tff)、凝膠過濾、離心(例如梯度離心)或差異溶解度、乙醇沉淀或任何其他可用的蛋白質(zhì)純化技術(shù)來純化rchc-ha/ptx3復(fù)合物。
159.在一些實(shí)施方案中，通過免疫親和譜法純化rchc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生針對rchc-ha/ptx3復(fù)合物的組分的抗體(例如，抗hc1、抗ptx3、針對rchc-ha/ptx3復(fù)合物的一個或多個slrp的抗體(例如抗bikunin、抗核心蛋白聚糖、抗雙糖鏈蛋白聚糖或抗骨黏附蛋白聚糖))并固定在固體支持物上。在一些實(shí)施方案中，未純化的rchc-ha/ptx3復(fù)合物(即流動相)通過支持物。在某些情況下，rchc-ha/ptx3復(fù)合物與抗體結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，洗滌支持物(例如，用pbs)以去除任何未結(jié)合或松散結(jié)合的分子。在一些實(shí)施方案中，然后用能夠從支持物洗脫rchc-ha/ptx3復(fù)合物的溶液(例如，1％sds、6m鹽酸胍或8m脲)洗滌支持物。在一些實(shí)施方案中，從解離的rchc-ha/ptx3復(fù)合物中去除解離劑。在一些實(shí)施方案中，通過包括但不限于離子交換譜法、透析、切向流過濾(tff)、凝膠過濾譜法、超濾或滲濾的方法從解離的rchc-ha/ptx3復(fù)合物中去除解離劑。
160.在一些實(shí)施方案中，通過親和譜法純化rchc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，habp用于結(jié)合rchc-ha/ptx3復(fù)合物以純化復(fù)合物并固定至固定支持物。在一些實(shí)施方案中，未純化的rchc-ha/ptx3復(fù)合物(即流動相)通過支持物。在某些情況下，rchc-ha/ptx3復(fù)合物與habp結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，洗滌支持物(例如，用pbs)以去除任何未結(jié)合或松散結(jié)合的分子。在一些實(shí)施方案中，然后用能夠從支持物洗脫rchc-ha/ptx3復(fù)合物的溶液(例如解離劑)洗滌支持物。在一些實(shí)施方案中，通過包括但不限于離子交換譜法、透析、切向流過濾(tff)、凝膠過濾譜法、超濾或滲濾的方法從解離的rchc-ha/ptx3復(fù)合物中去除解離劑。
161.在一些實(shí)施方案中，rchc-ha/ptx3復(fù)合物通過habp親和譜法和免疫親和譜法的組合來純化，其中免疫親和譜法使用針對rchc-ha/ptx3復(fù)合物的一種或多種組分的抗體。
162.在一些實(shí)施方案中，本文公開的rchc-ha/ptx3復(fù)合物的一種或多種組分包含親和標(biāo)簽(例如，具有親和標(biāo)簽的ptx3或hc1的融合蛋白)。在一些實(shí)施方案中，摻入rchc-ha/
ptx3復(fù)合物的一種或多種組分中的示例性親和標(biāo)簽包括但不限于血凝素標(biāo)簽、聚組氨酸、myc標(biāo)簽、flag標(biāo)簽或谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶序列。在一些實(shí)施方案中，親和標(biāo)簽的配體被固定到固體支持物上。在一些實(shí)施方案中，未純化的rchc-ha/ptx3復(fù)合物通過支持物。在某些情況下，rchc-ha/ptx3復(fù)合物與配體結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，洗滌支持物(例如，用pbs)以去除任何未結(jié)合或松散結(jié)合的分子。在一些實(shí)施方案中，然后用能夠從支持物洗脫本文公開的rchc-ha/ptx3復(fù)合物的溶液洗滌支持物。在一些實(shí)施方案中，通過包括但不限于離子交換譜法、透析、切向流過濾(tff)、凝膠過濾譜法、超濾或滲濾的方法從解離的rchc-ha/ptx3復(fù)合物中去除洗脫劑。
163.在一些實(shí)施方案中，ptx3、tsg-6和/或hc1與標(biāo)記綴合。“標(biāo)記”是指直接或間接與多肽綴合以產(chǎn)生經(jīng)標(biāo)記的多肽的可檢測化合物或組合物。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記本身(例如，放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)是可檢測的，或者在酶標(biāo)記的情況下，催化可檢測的底物化合物組合物的化學(xué)改變。標(biāo)記的非限制性示例包括熒光部分、染料、熒光標(biāo)簽、綠熒光蛋白或熒光素酶。
164.評估nhc-ha/ptx3和rchc-ha/ptx3復(fù)合物活性的方法
165.本文提供的nhc-ha/ptx3和rchc-ha/ptx3復(fù)合物的特性通過任何合適的方法評估，包括體外和體內(nèi)方法。本文提供了示例性體外方法，包括但不限于細(xì)胞培養(yǎng)方法，所述方法評估nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物促進(jìn)巨噬細(xì)胞附著于固定化的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的能力、抑制或減少巨噬細(xì)胞聚集的能力、促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡、巨噬細(xì)胞吞噬凋亡的中性粒細(xì)胞和經(jīng)刺激的巨噬細(xì)胞的m2極化的能力。在一些實(shí)施方案中，用于測定中的巨噬細(xì)胞受到刺激，例如通過暴露于lps或ifn-γ。在一些實(shí)施方案中，在與nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物接觸后評估受刺激的巨噬細(xì)胞中的基因或蛋白質(zhì)表達(dá)。在此類評估nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的活性的方法中，使用合適的對照進(jìn)行比較。在一些實(shí)施方案中，對照是不使用nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物處理(即陰性對照)。
166.在一些實(shí)施方案中，將rchc-ha/ptx3復(fù)合物的活性與天然hc-ha/ptx3復(fù)合物的活性進(jìn)行比較。在一些實(shí)施方案中，天然hc-ha/ptx3分離自羊膜。
167.在一些實(shí)施方案中，通過pcr、rt-pcr、rna印跡、蛋白質(zhì)印跡、斑點(diǎn)印跡、免疫組織化學(xué)、譜法或其他合適的檢測蛋白質(zhì)或核酸的方法評估經(jīng)處理的巨噬細(xì)胞中的基因表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，評估il-10、il-12、il23、light和sphk1的表達(dá)水平。藥物組合物
168.在某些實(shí)施方案中，本文公開了包含本文所述的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的藥物組合物。在某些實(shí)施方案中，本文公開了包含通過本文提供的方法產(chǎn)生的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，使用一種或多種生理學(xué)上可接受的載劑以常規(guī)方式配制藥物組合物，所述載劑包括促進(jìn)將nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物加工成適用于藥物用途的制劑的賦形劑和助劑。適當(dāng)?shù)闹苿┤Q于所選的施用途徑。任何眾所周知的技術(shù)、載劑和賦形劑都可以適當(dāng)?shù)夭⑶胰绫绢I(lǐng)域所理解的那樣使用。
169.在某些實(shí)施方案中，本文公開了一種藥物組合物，其包含本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物還包含至少一種藥學(xué)上可接受的
載劑。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物還包含佐劑、賦形劑、防腐劑、延遲吸收劑、填充劑、粘合劑、吸附劑、緩沖劑和/或增溶劑。配制為含有本文提供的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的示例物組合物包括但不限于溶液、懸浮液、乳劑、糖漿、顆粒、粉劑、藥膏、片劑、膠囊、丸劑、酊劑、透皮貼、油膏、洗劑、乳膏、糊劑、泡沫、凝膠或氣霧劑。
170.劑型
171.在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物作為水性懸浮液施用。在一些實(shí)施方案中，水性懸浮液包含水、林格氏溶液和/或等滲氯化鈉溶液。在一些實(shí)施方案中，水性懸浮液包含甜味劑或調(diào)味劑、著物質(zhì)或染料，以及，如果需要的話，還包括乳化劑或懸浮劑，連同稀釋劑水、乙醇、丙二醇、甘油或其組合。在一些實(shí)施方案中，水性懸浮液包含懸浮劑。在一些實(shí)施方案中，水性懸浮液包含羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍樹膠和/或阿拉伯樹膠。在一些實(shí)施方案中，水性懸浮液包含分散劑或潤濕劑。在一些實(shí)施方案中，水性懸浮液包含天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)，或烯烴氧化物與脂肪酸的縮合產(chǎn)物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)，或環(huán)氧乙烷與長鏈脂族醇的縮合產(chǎn)物(例如，十七烷基乙烯氧基鯨蠟醇(heptadecaethylene-oxycetanol))，或環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn)物(如，聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯)，或環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物(例如，聚乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)。在一些實(shí)施方案中，水性懸浮液包含防腐劑。在一些實(shí)施方案中，水性懸浮液包含對羥基苯甲酸乙酯或正丙酯。在一些實(shí)施方案中，水性懸浮液包含甜味劑。在一些實(shí)施方案中，水性懸浮液包含蔗糖、糖精或阿斯巴甜。
172.在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物作為油性懸浮液施用。在一些實(shí)施方案中，通過將活性成分懸浮在植物油(例如，花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)或礦物油(例如，液體石蠟)中來配制油性懸浮液。在一些實(shí)施方案中，油性懸浮液包含增稠劑(例如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇)。在一些實(shí)施方案中，油性懸浮液包含甜味劑(例如，上述那些)。在一些實(shí)施方案中，油性懸浮液包含抗氧化劑(例如，丁基化羥基茴香醚或α-生育酚)。
173.在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物被配制用于腸胃外注射(例如，通過包括以下途徑的注射或輸注：動脈內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、十二指腸內(nèi)、髓內(nèi)、肌內(nèi)、骨內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、血管內(nèi)、靜脈內(nèi)、玻璃體內(nèi)、硬膜外和/或皮下)。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物作為無菌溶液、懸浮液或乳液施用。
174.在一些實(shí)施方案中，用于腸胃外施用的制劑包括本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的水性和/或非水性(油性)無菌注射溶液，在一些實(shí)施方案中，該溶液含有抗氧化劑、緩沖液、抑細(xì)菌劑和/或使該制劑與預(yù)期接受者的血液等滲的溶質(zhì)；和/或水性和/或非水性無菌懸浮液，在一些實(shí)施方案中，該懸浮液包括懸浮劑和/或增稠劑。在一些實(shí)施方案中，用于腸胃外施用的制劑包括合適的穩(wěn)定劑或增加本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的溶解度以允許制備高濃度溶液的試劑。
175.在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物作為水包油微乳劑施用，其中活性成分溶解在油相中。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物溶解在脂肪油(例如，芝麻油，或合成脂肪酸酯，(例如，油酸乙酯或甘油三酯，或脂質(zhì)體)中。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物
溶解在大豆油和/或卵磷脂的混合物中。在一些實(shí)施方案中，將油溶液引入水和甘油混合物中并加工以形成微乳液。
176.在一些實(shí)施方案中，配制用于腸胃外施用的組合物作為單次推注施用。在一些實(shí)施方案中，配制用于腸胃外施用的組合物通過連續(xù)靜脈內(nèi)遞送裝置(例如，deltec cadd-plus
tm
5400型靜脈泵)施用。
177.在一些實(shí)施方案中，注射用制劑以單位劑型存在，例如，在安瓿或多劑量容器中，并添加了防腐劑。在一些實(shí)施方案中，注射用制劑以粉末形式或在冷凍干燥(凍干)條件下儲存，僅需要在使用前立即添加無菌液體載劑，例如鹽水或無菌無熱原水。
178.在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物被配制用于局部施用。局部制劑包括但不限于軟膏、乳膏、洗劑、溶液、糊劑、凝膠、薄膜、棒狀物、脂質(zhì)體、納米顆粒。在一些實(shí)施方案中，通過使用貼劑、繃帶或傷口敷料來施用局部制劑。
179.在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物被配制成固體、交聯(lián)凝膠或脂質(zhì)體形式的組合物。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物被配制成不溶性交聯(lián)水凝膠。
180.在一些實(shí)施方案中，局部制劑包含膠凝劑(或增稠劑)。合適的膠凝劑包括但不限于纖維素、纖維素衍生物、纖維素醚(例如，羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素)、瓜爾膠、黃原膠、刺槐豆膠、藻酸鹽(例如，海藻酸)、硅酸鹽、淀粉、黃蓍膠、羧基乙烯基聚合物、角叉菜膠、石蠟、凡士林、阿拉伯膠(阿拉伯樹膠)、瓊脂、硅酸鎂鋁、海藻酸鈉、硬脂酸鈉、墨角藻、膨潤土、卡波姆、角叉菜膠、卡波普、黃原膠、纖維素、微晶纖維素(mcc)、角豆膠、角叉菜、右旋糖、紅藻膠、明膠、印度樹膠、瓜爾膠、硅酸鎂鋰、乳糖、蔗糖、麥芽糊精、甘露醇、山梨糖醇、蜂蜜、玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、梧桐膠、聚乙二醇(例如peg 200-4500)、黃蓍樹膠、乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、乙基甲基纖維素、甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥乙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、聚(甲基丙烯酸羥乙酯)、氧聚明膠、果膠、聚明膠、聚維酮、碳酸丙烯酯、甲基乙烯基醚/馬來酸酐共聚物(pvm/ma)、聚(甲基丙烯酸甲氧基乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲氧基乙氧基乙酯)、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素(hpmc)、羧甲基纖維素鈉(cmc)、二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮(pvp：聚維酮)或其組合。
181.在一些實(shí)施方案中，本文公開的局部制劑包含潤膚劑。潤膚劑包括但不限于蓖麻油酯、可可油酯、紅花油酯、棉籽油酯、玉米油酯、橄欖油酯、魚肝油酯、杏仁油酯、鱷梨油酯、棕櫚油酯、芝麻油酯、角鯊烯酯、石栗子油酯(kukui oil ester)、大豆油酯、乙酰化甘油單酯、乙氧基化甘油單硬脂酸酯、月桂酸己酯、月桂酸異己酯、棕櫚酸異己酯、棕櫚酸異丙酯、棕櫚酸甲酯、油酸癸酯、油酸異癸酯、硬脂酸十六烷酯、硬脂酸癸酯、異硬脂酸異丙酯、異硬脂酸甲酯、己二酸二異丙酯、己二酸二異己酯、己二酸二己基癸酯、癸二酸二異丙酯、乳酸月桂基酯、乳酸肉豆蔻基酯和乳酸鯨蠟基酯、豆蔻酸油烯基酯、硬脂酸油烯基酯和油酸油烯基酯、壬酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、異硬脂酸、羥基硬脂酸、油酸、亞油酸、蓖麻油酸、花生酸、山萮酸、芥酸、月桂醇、肉豆蔻醇、鯨蠟醇、十六烷基醇、硬脂醇、異硬脂醇、羥基硬脂醇、油醇、蓖麻油醇、山崳醇、瓢兒菜醇、2-辛基十二烷醇、羊毛脂和羊毛脂衍生物、蜂蠟、鯨蠟、肉豆蔻酸肉豆蔻基酯、硬脂酸硬脂基酯、巴西棕櫚蠟、小燭樹蠟、卵磷脂和膽固醇。
182.在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與一種或多
種天然聚合物一起配制。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與天然聚合物一起配制，所述天然聚合物是纖連蛋白、膠原蛋白、層粘連蛋白、角蛋白、纖維蛋白、纖維蛋白原、透明質(zhì)酸、硫酸類肝素、硫酸軟骨素。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與由天然聚合物配制的聚合物凝膠一起配制。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與由天然聚合物配制的聚合物凝膠一起配制，所述天然聚合物例如但不限于纖連蛋白、膠原蛋白、層粘連蛋白、角蛋白、纖維蛋白、纖維蛋白原、透明質(zhì)酸、硫酸類肝素、硫酸軟骨素及其組合。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與交聯(lián)聚合物一起配制。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與非交聯(lián)聚合物一起配制。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與非交聯(lián)聚合物和交聯(lián)聚合物一起配制。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠一起配制。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與不溶性交聯(lián)ha水凝膠一起配制。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與非交聯(lián)透明質(zhì)酸凝膠一起配制。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與膠原基質(zhì)一起配制。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與纖維蛋白基質(zhì)一起配制。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與纖維蛋白/膠原基質(zhì)一起配制。
183.在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物被配制用于施用至腫瘤或與其相關(guān)的組織。適合施用于腫瘤的制劑包括但不限于溶液、懸浮液(例如水性懸浮液)、軟膏、凝膠、乳膏、脂質(zhì)體、泡囊、藥質(zhì)體、納米顆粒或其組合。在一些實(shí)施方案中，本文公開的用于注射到實(shí)體瘤中的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物通過注射到腫瘤、周圍組織或其組合中來施用。在一些實(shí)施方案中，在切除癌細(xì)胞或腫瘤的同時施用本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，將本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物施用于切除癌細(xì)胞或腫瘤的手術(shù)切緣。在一些實(shí)施方案中，施用本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物
184.如本文所用，“長效制劑”是(例如皮下、肌內(nèi)、玻璃體內(nèi)或結(jié)膜下)植入腫瘤或與其相關(guān)的組織(例如，手術(shù)切緣)的控釋制劑。在一些實(shí)施方案中，通過在可生物降解聚合物中形成本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的微膠囊化基質(zhì)(也稱為微膠囊化基質(zhì))來配制長效制劑。在一些實(shí)施方案中，通過將本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物包埋在脂質(zhì)體或微乳液中來配制長效制劑。
185.在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物被配制用于直腸或陰道施用。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物作為栓劑施用。在一些實(shí)施方案中，通過將本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與合適的無刺激性賦形劑混合來制備適合直腸施用的組合物，所述無刺激性賦形劑在常溫下為固體但在直腸溫度下為液體且將因此在直腸中融化以釋放藥物。在一些實(shí)施方案中，通過將本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與可可脂、甘油化明膠、氫化植物油、各種分子量的聚乙二醇或聚乙二醇的脂肪酸酯的混合物混合來制備適合于直腸施用的組合物。
186.在某些實(shí)施方案中，本文所述的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物任選地?fù)饺?br>控釋顆粒、脂質(zhì)復(fù)合物、脂質(zhì)體、納米顆粒、微球、微粒、納米膠囊或其他增強(qiáng)或促進(jìn)局部遞送至皮膚的藥劑。用于藥物制劑的常規(guī)微膠囊化方法的一個示例描述于美國專利號3,737,337，此類公開內(nèi)容通過引用并入本文。
187.劑量
188.施用的藥物組合物的量部分取決于被的個體。在將藥物組合物施用于人對象的情況下，每日劑量通常由處方醫(yī)師確定，劑量通常根據(jù)以下因素而變化：個體的年齡、性別、飲食、體重、一般健康和反應(yīng)、個體癥狀的嚴(yán)重程度、正在的確切疾病或病況、正在的疾病或病況的嚴(yán)重程度、施用時間、施用途徑、組合物的配置、排泄率、藥物組合以及處方醫(yī)師的判斷。
189.在一些情況下，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物通過局部注射直接施用到腫瘤和/或周圍組織中。在一些情況下，腫瘤不能通過手術(shù)切除，或者是“不可手術(shù)的”。在一些實(shí)施方案中，不可手術(shù)的腫瘤是不可接近的，或者患者具有限制承受手術(shù)能力的醫(yī)學(xué)狀況。在一些情況下，腫瘤位于敏感位置，例如脊髓、腦或其他組織，手術(shù)切除可能會嚴(yán)重?fù)p害周圍組織。在一些情況下，腫瘤會浸潤或侵入周圍組織，例如某些腦癌，并且不可能在不傷害周圍組織的情況下通過手術(shù)提取。不可手術(shù)的腫瘤可能來自但不限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)癌癥，例如多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、胰腺癌或膀胱癌。在一些情況下，癌癥在身體其他部位有多個繼發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移灶。繼發(fā)性腫瘤的數(shù)量可能太多而無法安全切除。轉(zhuǎn)移癌的類型包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直腸癌、胃癌、甲狀腺癌、肝癌或子宮癌。
190.在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的施用劑量在約0.001至約1000mg之間。在一些實(shí)施方案中，施用的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的量在約0.5至約50mg的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，施用的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的量為約0.001至約7g。在一些實(shí)施方案中，施用的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的量為約0.01至約7g。在一些實(shí)施方案中，施用的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的量為約0.02至約5g。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的量為約0.05至約2.5g。在一些實(shí)施方案中，施用的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3的量為約0.1至約1g。
191.在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物在疾病或病況發(fā)生之前、期間或之后施用。在一些實(shí)施方案中，在疾病或病況發(fā)生之前、期間或之后施用聯(lián)合療法。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物在疾病或病況發(fā)生之前、期間或之后與聯(lián)合療法一起施用。在一些實(shí)施方案中，施用包含本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3的組合物的時間是不同的。因此，在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物用作預(yù)防劑，并連續(xù)施用給有發(fā)展病況或疾病傾向的對象以預(yù)防疾病或病況的發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，在癥狀發(fā)作期間或之后盡快將本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物施用于對象。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的施用是在癥狀發(fā)作的前48小時內(nèi)開始的，優(yōu)選在癥狀發(fā)作的前48小時內(nèi)，更優(yōu)選在癥狀發(fā)作的前6小時內(nèi)，最優(yōu)選在癥狀發(fā)作的3小時內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，初始施用是通過任何可行的途徑，例如，靜脈內(nèi)注射、快速推注、5分鐘至約5小時輸注、丸劑、膠囊、透皮貼劑、口腔遞送或其組合。優(yōu)選地，在檢測到或懷疑疾病或病況
發(fā)作后可行時盡快施用本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物，并持續(xù)該疾病所需的時間長度，例如約1個月至約3個月。在一些實(shí)施方案中，每個對象的時間長短不同，并且該長度使用已知標(biāo)準(zhǔn)來確定。在一些實(shí)施方案中，施用本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物或含有復(fù)合物的制劑至少2周，優(yōu)選約1個月至約5年，更優(yōu)選約1個月至約3年。
192.在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物以單劑量施用，每日一次。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物以多劑量施用，每日超過一次。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物每天施用兩次。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物每天施用三次。在一些實(shí)施方案中，nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物每天施用四次。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物每天施用超過四次。
193.在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物以單劑量施用。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合腫瘤切除、冷凍消融或射頻消融以單劑量施用本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物。
194.在一些實(shí)施方案中，施用本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物用于預(yù)防性和/或性。在應(yīng)用中，在一些實(shí)施方案中，將本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物以足以治愈或至少部分地抑制疾病或病況的癥狀的量施用給已經(jīng)患有疾病或病況的個體。用于該用途的有效量將取決于疾病或病況的嚴(yán)重程度和病程、先前的療法、個體的健康狀況、體重和對藥物的反應(yīng)，以及醫(yī)師的判斷。
195.在預(yù)防性應(yīng)用中，在一些實(shí)施方案中，將本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物施用于處于特定障礙風(fēng)險(xiǎn)中的個體。這樣的量被定義為“預(yù)防有效量或劑量”。在這樣的用途中，精確的量還取決于個體的健康狀況、體重和個體的其他身體參數(shù)。
196.在個體的病況沒有改善的情況下，根據(jù)醫(yī)生的判斷，長期施用本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物，即施用延長的時間段，包括在個體的整個生命期間，以改善或以其他方式控制或限制個體疾病或病況的癥狀。
197.在一些實(shí)施方案中，在個體狀態(tài)確實(shí)改善的情況下，根據(jù)醫(yī)生的判斷，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物被連續(xù)施用或暫時減少正在被施用的藥物劑量或暫時中止一定時間段(即“藥物假期”)。在一些實(shí)施方案中，藥物假期的長度在2天和1年之間變化，僅作為示例，包括2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。在一些實(shí)施方案中，藥物假期期間的劑量減少為10％-100％，僅作為示例，包括10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
198.一旦個體病況出現(xiàn)改善，如有必要，將施用維持劑量。在一些實(shí)施方案中，隨后，根據(jù)癥狀將施用劑量或頻率或兩者降低至保持疾病、障礙或病況改善的水平。在一些實(shí)施方案中，個體在任何癥狀復(fù)發(fā)后需要長期的間歇性。
199.在一些實(shí)施方案中，本文所述的藥物組合物為單位劑型，適用于精確劑量的單次施用。在單位劑型中，制劑被分成含有適當(dāng)量的本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的單位劑量。在一些實(shí)施方案中，單位劑量是包含離散量的制劑的包裝形式。非限制性
實(shí)例是包裝的片劑或膠囊，以及小瓶或安瓿中的粉末。在一些實(shí)施方案中，水性懸浮液組合物包裝在單劑量不可重新封閉的容器中。在一些實(shí)施方案中，使用多劑量可再封閉容器，在這種情況下，通常在組合物中包含防腐劑。在一些實(shí)施方案中，用于腸胃外注射的制劑以單位劑型呈現(xiàn)，其包括但不限于安瓿，或以具有添加的防腐劑的多劑量容器呈現(xiàn)。
200.在一些實(shí)施方案中，腫瘤周圍的區(qū)域與至少或約1微克(ug)、10ug、20ug、30ug、40ug、50ug、60ug、70ug、80ug、90ug、100ug、200ug、300ug、400ug、500ug、600ug、700ug、800ug、900ug、1000ug或大于1000ug的hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸。在一些實(shí)施方案中，腫瘤周圍的區(qū)域與至少或約1毫克(mg)、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg或大于500mg的hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸。在一些實(shí)施方案中，腫瘤周圍的區(qū)域與約1至10、1至20、1至40、1至60、1至80、1至100、1至150、1至200、10至20、10至40、10至60、10至80、10至100、10至150、10至200、20至40、20至60、20至80、20至100、20至150、20至200、40至60、40至80、40至100、40至150、40至200、60至80、60至100、60至150、60至200、80至100、80至150、80至200、100至150、100至200或150至200微克(ug)范圍的hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸。在一些實(shí)施方案中，腫瘤周圍的區(qū)域與約1至10、1至20、1至40、1至60、1至80、1至100、1至150、1至200、10至20、10至40、10至60、10至80、10至100、10至150、10至200、20至40、20至60、20至80、20至100、20至150、20至200、40至60、40至80、40至100、40至150、40至200、60至80、60至100、60至150、60至200、80至100、80至150、80至200、100至150、100至200或150至200毫克(mg)范圍的hc-ha/ptx3復(fù)合物接觸。
201.適用于本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的日劑量為例如約0.01至100mg。大型哺乳動物(包括但不限于人)的指示日劑量范圍為約10ug至約100mg、約0.5mg至約100mg，方便地以分劑量施用，包括但不限于每天多達(dá)四次或以緩釋形式施用。適合口服施用的單位劑型包括約1至50mg活性成分。注射到腫瘤和/或周圍組織中的合適劑量在每次注射約0.1至約100mg的范圍內(nèi)。上述范圍僅是暗示性的，因?yàn)殛P(guān)于個體方案的變量數(shù)量很大，并且與這些推薦值有相當(dāng)大的偏差并不少見。在一些實(shí)施方案中，劑量根據(jù)許多變量而改變，不限于使用的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的活性、待的疾病或病況、施用方式、個體對象的要求、正在的疾病或病況的嚴(yán)重程度以及醫(yī)生的判斷。
202.在一些實(shí)施方案中，此類方案的毒性和功效通過細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動物中的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序確定，包括但不限于確定ld
50
(對50％體致死的劑量)和ed
50
(對50％體有效的劑量)。在一些實(shí)施方案中，毒性作用和作用之間的劑量比是指數(shù)，它表示為ld
50
和ed
50
之間的比值。優(yōu)選表現(xiàn)出高指數(shù)的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，從細(xì)胞培養(yǎng)測定和動物研究獲得的數(shù)據(jù)用于制定用于人的劑量范圍。本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的劑量優(yōu)選位于包括ed
50
(具有最小毒性)的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，劑量根據(jù)所使用的劑型和所使用的施用途徑而在該范圍內(nèi)變化。
203.在一些實(shí)施方案中，將nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的藥物組合物包裝為制品，所述制品含有包裝材料、有效預(yù)防和/或疾病或病況的藥物組合物以及指示藥物組合物將用于疾病或病況的標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物被包裝在單位劑型中，其含有一定量的單劑量或多劑量的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，包裝的組合物包含藥物組合物的凍干粉末，其在施用前被重構(gòu)(例如，用水或鹽水)。
204.醫(yī)療裝置
205.在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物直接組裝在可植入醫(yī)療裝置的表面上或配制為用于可植入醫(yī)療裝置的涂層。用于將透明質(zhì)酸共價(jià)連接至例如但不限于金屬、聚合物、陶瓷、二氧化硅和復(fù)合材料表面的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并且在一些實(shí)施方案中，與本文提供的用于在此類表面上組裝nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的方法結(jié)合使用(參見例如，美國專利號5,356,433；5,336,518、4,613,665、4,810,784、5,037,677、8,093,365)。在一些實(shí)施方案中，將nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物直接組裝在可植入醫(yī)療裝置或其一部分的表面上。在一些實(shí)施方案中，已根據(jù)本文提供的方法產(chǎn)生的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物被純化，然后直接附著在可植入醫(yī)療裝置或其一部分的表面上。在一些實(shí)施方案中，已根據(jù)本文提供的方法產(chǎn)生的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物被純化，然后配制成用于附著到醫(yī)療裝置或其一部分的涂層。在一些實(shí)施方案中，涂層直接施加到表面上或施加到經(jīng)預(yù)處理或經(jīng)涂覆的表面，其中所述預(yù)處理或涂覆被設(shè)計(jì)成有助于涂層粘附到基材上。在一些實(shí)施方案中，已根據(jù)本文提供的方法產(chǎn)生的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物被純化，然后附著到已經(jīng)涂有促進(jìn)nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物附著的物質(zhì)的醫(yī)療裝置或其一部分。例如，在一些實(shí)施方案中，醫(yī)療裝置或其一部分涂有粘性聚合物，該粘性聚合物在其表面上提供官能團(tuán)以用于nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的透明質(zhì)酸的共價(jià)連接。在一些實(shí)施方案中，使用偶聯(lián)劑，例如但不限于碳二亞胺，以將nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物連接至聚合物涂層。在一些實(shí)施方案中，采用光固定來將已經(jīng)根據(jù)本文提供的方法產(chǎn)生的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物共價(jià)連接至醫(yī)療裝置或其一部分。在一些實(shí)施方案中，使用包含光化學(xué)或熱化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)的間隔分子將已根據(jù)本文提供的方法產(chǎn)生的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物附著至醫(yī)療裝置或其一部分。
206.在一些實(shí)施方案中，通過例如浸涂將包含nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的涂層制劑施加到基材上。其他施加方法包括但不限于噴涂、洗滌、氣相沉積、刷涂、輥涂、簾式涂布、旋涂和本領(lǐng)域已知的其他方法。
207.示例性的可植入醫(yī)療裝置包括但不限于骨植入物、傷口引流管、分流器、尿道插入物、金屬或塑料植入物、支架、支架移植物、血管移植物、小球、晶片、可植入藥物泵、藥物遞送系統(tǒng)、微粒、納米粒子和微膠囊。
208.在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物連接至微膠囊或直接組裝在微膠囊上。在一些實(shí)施方案中，將nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與用于形成微膠囊的材料組合并且產(chǎn)生包含nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的微膠囊。在一些實(shí)施方案中，nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物用于包被微膠囊的內(nèi)表面。在一些實(shí)施方案中，nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物用于包被微膠囊的外表面。在一些實(shí)施方案中，nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物用于包被微膠囊的內(nèi)表面和外表面。組合
209.在一些實(shí)施方案中，本文所述的組合物和方法與除了天然或重構(gòu)的hc-ha/ptx3復(fù)合物之外的第二或另外的或額外的劑結(jié)合使用。在一些實(shí)施方案中，本文所述的組合物和方法與兩種或更多種劑結(jié)合使用。在一些實(shí)施方案中，本文所述的組合物和方法與一種或多種劑結(jié)合使用。在一些實(shí)施方案中，本文所述的組合物和方法與2、3、4、5、
6、7、8、9、10或更多種劑結(jié)合使用。
210.在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物和第二劑以相同劑型施用。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物和第二劑以單獨(dú)的劑型施用。
211.在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物和第二劑同時(例如，同時、基本上同時或在同一方案內(nèi))施用。
212.在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物和第二劑依次施用。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物在第二劑之前或之后施用。在一些實(shí)施方案中，施用本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物和第二活性劑之間的時間段范圍從幾分鐘到幾小時，這取決于每種藥劑的性質(zhì)，例如藥劑的效力、溶解度、生物利用度、血漿半衰期和動力學(xué)曲線。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)分子濃度的晝夜變化決定了最佳劑量間隔。在一些實(shí)施方案中，施用本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與第二活性劑之間的時間為約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約10小時、約11小時、約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約1周、約2周、約3周、約1個月或更長時間。
213.在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的共同施用導(dǎo)致nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物所需的劑量低于單獨(dú)施用nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物時所需的劑量。在一些實(shí)施方案中，第二劑的共同施用導(dǎo)致第二藥劑的所需劑量低于單獨(dú)施用第二藥劑時所需的劑量。用于通過實(shí)驗(yàn)確定用于聯(lián)合方案的藥物和其他藥劑的有效劑量的方法是本領(lǐng)域已知和記載的。例如，節(jié)拍式給藥的使用，即，提供更頻繁、更低的劑量以使毒副作用最小化，已在本領(lǐng)域中廣泛描述。聯(lián)合進(jìn)一步包括在不同時間開始和停止的周期性，以協(xié)助個體的臨床管理。
214.在一些實(shí)施方案中，對nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物和一種或多種另外劑的聯(lián)合進(jìn)行修改。在一些實(shí)施方案中，聯(lián)合被修改，由此nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的量相對于第二劑的量增加。在一些實(shí)施方案中，聯(lián)合被修改，由此nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的量相對于第二劑的量減少。在一些實(shí)施方案中，聯(lián)合被修改，由此第二劑的量相對于nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的量增加。在一些實(shí)施方案中，聯(lián)合被修改，由此第二劑的量相對于nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的量減少。
215.在一些實(shí)施方案中，第二劑選自細(xì)胞毒劑、鎮(zhèn)痛劑、抗炎劑、抗生素、抗微生物劑、抗血管生成劑、化療劑、抗腫瘤劑、免疫療法或放射療法。在一些實(shí)施方案中，第二劑是化療劑。在一些實(shí)施方案中，第二劑選自烷化劑、抗代謝物、表葉毒素(epidophyllotoxins)、抗腫瘤酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、丙卡巴肼、米托蒽醌、鈀配位絡(luò)合物、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑和生長抑制劑、激素/抗激素劑、造血生長因子、芳香酶抑制劑、抗雌激素、抗雄激素、皮質(zhì)類固醇、促性腺激素激動劑、微管活性劑、亞、脂質(zhì)或蛋白激酶靶向劑、免疫調(diào)節(jié)藥物(imid)、蛋白質(zhì)或脂質(zhì)磷酸酶靶向劑、抗血管生成劑、akt抑制劑、igf-i抑制劑、fgf3調(diào)節(jié)劑、mtor抑制劑、smac模擬物、hdac抑制劑、誘導(dǎo)細(xì)胞分化的藥劑、緩激肽1受體拮抗劑、血管緊張素ii拮抗劑、環(huán)氧合酶抑制劑、乙酰肝素酶抑制劑、淋巴因子抑制劑、細(xì)胞因子抑制劑、ikk抑制劑、p38mapk抑制劑、hsp90抑制劑、多激酶抑制劑、二膦酸鹽、雷帕
霉素衍生物、抗凋亡通路抑制劑、凋亡通路激動劑、ppar激動劑、rar激動劑、ras同種型抑制劑、端粒酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、氨肽酶抑制劑、ship激活劑-aqx-mn100、humax-cd20(奧法木單抗)、cd20拮抗劑、il2-白喉毒素融合物或其組合。在一些實(shí)施方案中，抗微生物劑是抗病毒劑、抗細(xì)菌劑或抗真菌劑。一種或多種非限制性示例性抗細(xì)菌劑包括如下分類：氨基糖苷、β內(nèi)酰胺、喹諾酮或氟喹諾酮、大環(huán)內(nèi)酯、磺胺、磺胺甲噁唑、四環(huán)素、鏈陽菌素、噁唑烷酮(如利奈唑胺)、克林霉素、林可霉素、利福霉素、糖肽、多粘菌素、脂肽類抗生素以及藥理學(xué)上可接受的鈉鹽、藥理學(xué)上可接受的鈣鹽、藥理學(xué)上可接受的鉀鹽、脂質(zhì)制劑、上述的衍生物和/或類似物。一些示例性類別的先天肽或蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白、防御素、磷脂酶、溶菌酶、抗菌肽、絲氨酸蛋白酶殺菌素、殺細(xì)菌透性增加蛋白、兩親性α螺旋肽和其他合成抗微生物蛋白。在一些實(shí)施方案中，抗微生物劑是防腐劑。
216.在一些實(shí)施方案中，第二劑選自arry-797、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)(dtic)、放線菌素(actinomycins)c2、c3、d、和f1、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、美法侖(melphalan)、雌莫司汀(estramustine)、美登醇(maytansinol)、利福霉素(rifamycin)、曲張鏈菌素(streptovaricin)、阿霉素(doxorubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊達(dá)比星(idarubicin)、地托比星(detorubicin)、洋紅霉素(carminomycin)、依索比星(esorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、博來霉素(bleomycins)a、a2和b、喜樹堿(camptothecin)、伊立替康(irinotecan)、拓泊替康(topotecan)、9-氨基喜樹堿、10,11-亞甲二氧基喜樹堿、9-硝基喜樹堿、硼替佐米(bortezomib)、替莫唑胺(temozolomide)、tas103、npi0052、康普瑞汀(combretastatin)、康普瑞汀a-2(combretastatin a-2)、康普瑞汀a-4(combretastatin a-4)、加利車霉素(calicheamicins)、新制癌菌素(neocarcinostatins)、埃博霉素(epothilones)a、b、c和半合成變體、赫賽汀(herceptin)、利妥昔單抗(rituxan)、cd40抗體、天冬酰胺酶(asparaginase)、白介素(interleukins)-2、干擾素(interferons)、亮丙瑞林(leuprolide)、和培門冬酶(pegaspargase)、5-氟尿嘧啶、氟脫氧尿苷(fluorodeoxyuridine)、托拉弗(ptorafur)、5'-脫氧氟尿苷、uft、mitc、s-1卡培他濱(s-1capecitabine)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、它莫西芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremefine)、tolmudex、諾拉屈西二氫氯組胺(thymitaq)、氟他胺(flutamide)、氟甲睪酮(fluoxymesterone)、比卡魯胺(bicalutamide)、非那雄胺(finasteride)、雌二醇(estradiol)、曲沃昔芬(trioxifene)、地塞米松(dexamethasone)、醋酸亮丙瑞林(leuproelin acetate)、雌莫司汀(estramustine)、屈洛昔芬(droloxifene)、甲羥孕酮(medroxyprogesterone)、醋酸甲地孕酮(megesterol acetate)、氨魯米特(aminoglutethimide)、睪內(nèi)酯(testolactone)、睪酮(testosterone)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、羥孕酮(hydroxyprogesterone)、絲裂霉素(mitomycins)a、b和c、泊非霉素(porfiromycin)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、四鉑(tetraplatin)、鉑-dach(platinum-dach)、奧瑪鉑(ormaplatin)、沙利度胺(thalidomide)、來那度胺(lenalidomide)、ci-973、端粒抑素(telomestatin)、chir258、rad 001、saha、煙草苷(tubacin)、17-aag、索拉非尼(sorafenib)、jm-216、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、特羅凱(tarceva)、易瑞沙(iressa)、伊馬替尼(imatinib)、米替福新
(miltefosine)、哌立福新(perifosine)、氨基蝶呤(aminopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲蝶呤(methopterin)、二氯甲氨蝶呤(dichloro-methotrexate)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、別嘌呤醇(allopurinol)、克拉屈濱(cladribine)、氟達(dá)拉濱(fludarabine)、噴司他丁(pentostatin)、2-氯腺苷(2-chloroadenosine)、脫氧胞苷(deoxycytidine)、胞嘧啶阿糖核苷(cytosine arabinoside)、阿糖胞苷(cytarabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、5-氮雜胞嘧啶(5-azacytosine)、吉西他濱(gencitabine)、5-氮雜胞嘧啶-阿拉伯糖苷(5-azacytosine-arabinoside)、長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)、環(huán)氧長春堿(leurosine)、異長春堿(leurosidine)和長春地辛(vindesine)、紫杉醇(paclitaxel)、泰索帝(taxotere)和/或多西他賽(docetaxel)。
217.在一些實(shí)施方案中，第二劑是煙酸、貝特類、他汀類、apo-a1模擬多肽(例如，df-4，novartis)、apoa-i轉(zhuǎn)錄上調(diào)劑、acat抑制劑、cetp調(diào)節(jié)劑、糖蛋白(gp)iib/iiia受體拮抗劑、p2y12受體拮抗劑、lp-pla2-抑制劑、抗腫瘤壞死因子(tnf)劑、白介素-1(il-1)受體拮抗劑、白介素-2(il-2)受體拮抗劑、白介素-6(il-6)受體拮抗劑、白介素-12(il-12)受體拮抗劑、白介素-17(il-17)受體拮抗劑、白介素-23(il-23)受體拮抗劑、細(xì)胞毒性劑、抗微生物劑、免疫調(diào)節(jié)劑、抗生素、t細(xì)胞共刺激阻滯劑、b細(xì)胞耗竭劑、免疫抑制劑、抗淋巴細(xì)胞抗體、烷化劑、抗代謝藥、植物生物堿、萜類化合物、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、抗腫瘤抗生素、單克隆抗體、激素療法(例如，芳香酶抑制劑)或其組合。
218.在一些實(shí)施方案中，第二活性劑是抗tgf-β抗體、抗tgf-β受體阻斷抗體、抗tnf抗體、抗tnf受體阻斷抗體、抗il1β抗體、抗il1β受體阻斷抗體、抗il-2抗體、抗il-2受體阻斷抗體、抗il-6抗體、抗il-6受體阻斷抗體、抗il-12抗體、抗il-12受體阻斷抗體、抗il-17抗體、抗il-17受體阻斷抗體、抗il-23抗體或抗il-23受體阻斷抗體。
219.在一些實(shí)施方案中，第二活性劑是阿來西普(alefacept)、依法利珠單抗(efalizumab)、甲氨蝶呤(methotrexate)、阿維a酸(acitretin)、異維a酸(isotretinoin)、羥基脲(hydroxyurea)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、達(dá)力士(dovonex)、泰克龍(taclonex)、倍他米松(betamethasone)、他扎羅汀(tazarotene)、羥氯喹(hydroxychloroquine)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、依那西普(etanercept)、阿達(dá)木單抗(adalimumab)、英利昔單抗(infliximab)、阿巴西普(abatacept)、利妥昔單抗(rituximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、抗cd45單克隆抗體ahn-12(nci)、碘-131抗-b1抗體(corixa corp.)、抗cd66單克隆抗體bw 250/183(nci，southampton general hospital)、抗cd45單克隆抗體(nci，baylor college of medicine)、抗體抗anb3整合素(nci)、biw-8962(biowa inc.)、抗體bc8(nci)、抗體muj591(nci)、銦in 111單克隆抗體mn-14(nci)、釔y 90單克隆抗體mn-14(nci)、f105單克隆抗體(niaid)、單克隆抗體rav12(raven biotechnologies)、cat-192(人抗tgf-β1單克隆抗體，genzyme)、抗體3f8(nci)、177lu-j591(weill medical college of cornell university)、tb-403(bioinvent international ab)、阿那白滯素(anakinra)、硫唑嘌呤(azathioprine)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、環(huán)孢菌素a(cyclosporine a)、來氟米特(leflunomide)、d-青霉胺(d-penicillamine)、阿米替林(amitriptyline)或去甲替林(nortriptyline)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氮芥
(nitrogen mustard)、普拉睪酮(prasterone)、ljp 394(阿貝莫司鈉(abetimus sodium))、ljp 1082(la jolla pharmaceutical)、依庫珠單抗(eculizumab)、貝利木單抗(belibumab)、rhucd40l(niaid)、依帕珠單抗(epratuzumab)、西羅莫司(sirolimus)、他克莫司(tacrolimus)、吡美莫司(pimecrolimus)、沙立度胺(thalidomide)、抗胸腺細(xì)胞球蛋白-馬(atgam，pharmacia upjohn)、抗胸腺細(xì)胞球蛋白-兔(胸腺球蛋白，genzyme)、莫羅單抗-cd3(muromonab-cd3，fda office of orphan products development)、巴利昔單抗(basiliximab)、達(dá)克珠單抗(daclizumab)、利魯唑(riluzole)、克拉屈濱(cladribine)、那他珠單抗(natalizumab)、干擾素β-1b(interferon beta-1b)、干擾素β-1a(interferon beta-1a)、替扎尼定(tizanidine)、巴氯芬(baclofen)、美沙拉嗪(mesalazine)、美沙拉嗪片(asacol)、頗得斯安(pentasa)、氨水楊酸(mesalamine)、巴柳氮(balsalazide)、奧沙拉秦(olsalazine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、ain457(抗il-17單克隆抗體，novartis)、茶堿(theophylline)、d2e7(來自knoll pharmaceuticals的人抗tnf mab)、美泊利單抗(mepolizumab)(抗il-5抗體，sb 240563)、卡那努單抗(canakinumab)(抗il-1β單克隆抗體，niams)、抗il-2受體抗體(達(dá)珠單抗(daclizumab)，nhlbi)、cnto 328(抗il-6單克隆抗體，centocor)、acz885(全人抗白介素-1β單克隆抗體，novartis)、cnto 1275(全人抗il-12單克隆抗體，centocor)、(3s)-n-羥基-4-({4-[(4-羥基-2-丁炔基)氧基]苯基}磺酰基)-2,2-二甲基-3-硫代嗎啉甲酰胺(阿雷司他(apratastat))、戈利木單抗(golimumab)(cnto 148)、奧那西普(onercept)、bg9924(biogen idec)、培塞利珠單抗(certolizumab pegol)(cdp870，ucb pharma)、azd9056(astrazeneca)、azd5069(astrazeneca)、azd9668(astrazeneca)、azd7928(astrazeneca)、azd2914(astrazeneca)、azd6067(astrazeneca)、azd3342(astrazeneca)、azd8309(astrazeneca)、)、[(1r)-3-甲基-1-({(2s)-3-苯基-2-[(吡嗪-2-基羰基)氨基]丙酰基}氨基)丁基]硼酸(硼替佐米(bortezomib))、amg-714、cnto 15(抗il-15單克隆抗體，amgen)、abt-874(抗il-12單克隆抗體，abbott labs)、mra(托珠單抗(tocilizumab)、抗il-6受體單克隆抗體，chugai pharmaceutical)、cat-354(人抗白介素-13單克隆抗體，cambridge antibody technology,medimmune)、阿司匹林(aspirin)、水楊酸、龍膽酸、膽堿水楊酸鎂、水楊酸膽堿、膽堿水楊酸鎂、水楊酸膽堿、水楊酸鎂、水楊酸鈉、二氟尼柳(diflunisal)、卡洛芬(carprofen)、非諾洛芬(fenoprofen)、非諾洛芬鈣(fenoprofen calcium)、氟比洛芬(flurobiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、萘丁美酮(nabutone)、酮咯酸(ketolorac)、酮咯酸氨丁三醇(ketorolac tromethamine)、萘普生(naproxen)、奧沙普秦(oxaprozin)、雙氯芬酸(diclofenac)、依托度酸(etodolac)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美汀(tolmetin)、甲氯芬酯(meclofenamate)、甲氯芬酸鈉(meclofenamate sodium)、甲芬那酸(mefenamic acid)、吡羅昔康(piroxicam)、美洛昔康(meloxicam)、塞來昔布(celecoxib)、羅非昔布(rofecoxib)、伐地昔布(valdecoxib)、帕瑞昔布(parecoxib)、依托昔布(etoricoxib)、盧美昔布(lumiracoxib)、cs-502(sankyo)、jte-522(japan tobacco inc.)、l-745,337(almirall)、ns398(sigma)、倍他米松(betamethasone，celestone)、潑尼松(prednisone，deltasone)、阿氯米松(alclometasone)、醛固酮(aldosterone)、安西奈德(amcinonide)、倍氯米松(beclometasone)、倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、環(huán)索奈德(ciclesonide)、氯倍他索(clobetasol)、氯倍他松(clobetasone)、氯可托龍
(clocortolone)、氯潑尼醇(cloprednol)、可的松(cortisone)、可的伐唑(cortivazol)、地夫可特(deflazacort)、脫氧皮質(zhì)酮(deoxycorticosterone)、地奈德(desonide)、去羥米松(desoximetasone)、去氧皮質(zhì)酮(desoxycortone)、地塞米松(dexamethasone)、二氟拉松(diflorasone)、二氟可龍(diflucortolone)、二氟潑尼酯(difluprednate)、氟氯奈德(fluclorolone)、氟氫可的松(fludrocortisone)、氟氫縮松(fludroxycortide)、氟米松(flumetasone)、氟尼縮松(flunisolide)、氟輕松(fluocinolone acetonide)、醋酸氟輕松(fluocinonide)、氟可丁(fluocortin)、氟可龍(fluocortolone)、氟米龍(fluorometholone)、氟培龍(fluperolone)、氟潑尼定(fluprednidene)、氟替卡松(fluticasone)、福莫可他(formocortal)、福莫特羅(formoterol)、氯氟舒松(halcinonide)、鹵米松(halometasone)、氫化可的松(hydrocortisone)、醋丙氫可的松(hydrocortisone aceponate)、丙丁氫化可的松(hydrocortisone buteprate)、丁酸氫化可的松(hydrocortisone butyrate)、氯替潑諾(loteprednol)、甲羥松(medrysone)、甲潑尼松(meprednisone)、甲潑尼龍(methylprednisolone)、醋丙甲潑尼龍(methylprednisolone aceponate)、糠酸莫米松(mometasone furoate)、帕拉米松(paramethasone)、潑尼卡酯(prednicarbate)、潑尼松(prednisone)、利美索龍(rimexolone)、替可的松(tixocortol)、曲安西龍(triamcinolone)、烏倍他索(ulobetasol)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)、長春地辛(vindesine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、氟達(dá)拉濱(fludarabine)、噴司他丁(pentostatin)、克拉屈濱(cladribine)、5-氟脲嘧啶(5fu)、氟尿苷(floxuridine，fudr)、胞嘧啶阿糖核苷(cytosine arabinoside)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲氧芐啶(trimethoprim)、乙胺嘧啶(pyrimethamine)、培美曲塞(pemetrexed)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、伊立替康(irinotecan)、拓?fù)涮婵?topotecan)、安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、替尼泊苷(teniposide)、更生霉素(dactinomycin)、阿霉素(doxorubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、戊柔比星(valrubicine)、伊達(dá)比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、博來霉素(bleomycin)、普利霉素(plicamycin)、絲裂霉素(mitomycin)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、利妥昔單抗(rituximab)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、非那雄胺(finasteride)、戈舍瑞林(goserelin)、氨魯米特(aminoglutethimide)、阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、伏氯唑(vorozole)、依西美坦(exemestane)、4-雄烯-3,6,17-三酮(“6-oxo”；1,4,6-雄甾三烯-3,17-二酮(atd)、福美坦(formestane)、睪內(nèi)酯(testolactone)、法倔唑(fadrozole)或其組合。
[0220]
在一些實(shí)施方案中，第二劑是抗生素。在一些實(shí)施方案中，第二劑是抗細(xì)菌劑。在一些實(shí)施方案中，第二劑是阿米卡星(amikacin)、慶大霉素(gentamicin)、卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)、奈替米星(netilmicin)、鏈霉素(streptomycin)、妥布霉素(tobramycin)、巴龍霉素(paromomycin)、格爾德霉素(geldanmycin)、除莠霉素(herbimycin)、氯碳頭孢(loracarbef)、厄他培南(ertapenem)、多利培南(doripenem)、亞
胺培南(imipenem)、西司他丁(cilastatin)、美洛培南(meropenem)、頭孢羥氨芐(cefadroxil)、頭孢唑啉(cefazolin)、頭孢噻吩(cefalotin)、頭孢氨芐(cefalexin)、頭孢克洛(cefaclor)、頭孢孟多(cefamandole)、頭孢西丁(cefoxitin)、地氟丙嗪(defprozil)、頭孢呋辛(cefuroxime)、頭孢克肟(cefixime)、頭孢地尼(cefdinir)、頭孢托侖(cefditoren)、頭孢哌酮(cefoperazone)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢泊肟(cefpodoxime)、頭孢他啶(ceftazidime)、頭孢布烯(ceftibuten)、頭孢唑肟(ceftizoxime)、頭孢曲松(ceftriaxone)、頭孢吡肟(cefepime)、頭孢比羅(ceftobiprole)、拉寧(teicoplanin)、萬古霉素(vancomycin)、阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、地紅霉素(dirithromycin)、紅霉素(erythromycin)、羅紅霉素(roxithromycin)、醋竹桃霉素(troleandomycin)、泰利霉素(telithromycin)、大觀霉素(spectinomycin)、氨曲南(aztreonam)、阿莫西林(amoxicillin)、氨芐西林(ampicillin)、阿洛西林(azlocillin)、羧芐西林(carbenicillin)、氯唑西林(cloxacillin)、雙氯西林(dicloxacillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、美洛西林(mezlocillin)、甲氧西林(meticillin)、萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、盤尼西林(penicillin)、哌拉西林(piperacillin)、替卡西林(ticarcillan)、桿菌肽(bacitracin)、粘菌素(colistin)、多粘菌素(polymyxin)b、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)、依諾沙星(enoxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、曲伐沙星(trovfloxacin)、磺胺米隆(mafenide)、百浪多息(prontosil)、磺胺醋酰(sulfacetamide)、磺胺甲二唑(sulfamethizole)、磺胺嘧啶(sulfanimilimde)、柳氮磺胺吡啶(sulfsalazine)、磺胺異噁唑(sulfsioxazole)、甲氧芐啶(trimethoprim)、地美環(huán)素(demeclocycline)、多西環(huán)素(doxycycline)、米諾環(huán)素(minocycline)、氧四環(huán)素(oxtetracycline)、四環(huán)素(tetracycline)、胂凡納明(arsphenamine)、氯霉素(chloramphenicol)、克林霉素(clindamycin)、林可霉素(lincomycin)、乙胺丁醇(ethambutol)、磷霉素(fosfomycin)、夫西地酸(fusidic acid)、呋喃唑酮(furazolidone)、(isoniazid)、利奈唑胺(linezolid)、甲硝唑(metronidazole)、莫匹羅星(mupirocin)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、平板霉素(platensimycin)、吡嗪酰胺(pyrazinamide)、奎奴普丁(quinuspristin)/達(dá)福普汀(dalfopristin)、利福平(rifampin)、替硝唑(tinidazole)及其組合。
[0221]
在一些實(shí)施方案中，第二劑是放射療法。在一些實(shí)施方案中，第二劑選自x射線療法或質(zhì)子束療法。在一些實(shí)施方案中，放射療法可以是外束放射或近距離放射療法。
[0222]
在一些實(shí)施方案中，第二劑是靶向療法。靶向療法靶向有助于癌癥生長和存活的特定基因、蛋白質(zhì)或組織環(huán)境。在一些實(shí)施方案中，靶向療法包括一種或多種單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，靶向療法包括小分子，例如但不限于血管生成抑制劑，如本文所述。在一些實(shí)施方案中，靶向療法包括一種或多種單克隆抗體和一種或多種小分子，如本文所述。
[0223]
與細(xì)胞的組合
[0224]
在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與一個細(xì)胞、
多個細(xì)胞或組織共同施用。
[0225]
在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與性細(xì)胞共同施用。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與組織移植物共同施用。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與干細(xì)胞移植物共同施用。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與器官移植物共同施用。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與免疫細(xì)胞共同施用。
[0226]
在一些實(shí)施方案中，在腫瘤切除、冷凍消融或射頻消融的同時(例如同時、基本上同時或在同一方案內(nèi))施用本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合。在一些實(shí)施方案中，在腫瘤切除、冷凍消融或射頻消融之前或之后施用本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，施用本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與腫瘤切除、冷凍消融或射頻消融之間的時間段范圍從幾分鐘到幾小時，這取決于每種藥劑的性質(zhì)，例如藥劑的效力、溶解度、生物利用度、血漿半衰期和動力學(xué)曲線。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)分子濃度的晝夜變化決定了最佳劑量間隔。在一些實(shí)施方案中，施用本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與第二活性劑之間的時間為約少于一小時、少于一天、少于一周或少于一個月。
[0227]
在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與腫瘤切除、冷凍消融或射頻消融和免疫抑制劑共同施用。在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與如下共同施用：腫瘤切除、冷凍消融、或射頻消融和神經(jīng)鈣蛋白抑制劑(例如，環(huán)孢菌素(cyclosporin)或他克莫司(tacrolimus))；mtor抑制劑(西羅莫司(sirolimus)；依維莫司(everolimus))；抗增殖劑(硫唑嘌呤(azathioprine)或霉酚酸(mycophenolic acid))；皮質(zhì)類固醇(例如，潑尼松龍(prednisolone)或氫化可的松(hydrocortisone))；單克隆抗il-2rα受體抗體(例如，巴利昔單抗(basiliximab)或達(dá)珠單抗(daclizumab))；多克隆抗t細(xì)胞抗體(例如，抗胸腺細(xì)胞球蛋白(atg)或抗淋巴細(xì)胞球蛋白(alg))；化療劑；鎮(zhèn)痛劑；抗炎劑；類固醇；和抗生素或其組合。
[0228]
在一些實(shí)施方案中，用本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物包被組織。在一些實(shí)施方案中，用本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物包被多個干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，用本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物包被器官。在一些實(shí)施方案中，用本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物包被組織防止組織受到宿主免疫系統(tǒng)的作用。
[0229]
在一些實(shí)施方案中，使器官、組織或多個干細(xì)胞與本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物接觸。在一些實(shí)施方案中，使器官、組織或多個干細(xì)胞與包含本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的組合物接觸。在一些實(shí)施方案中，組合物具有約7.0至約7.5的ph。在一些實(shí)施方案中，組合物具有7.4的ph。在一些實(shí)施方案中，組合物還包含鉀、鎂和棉子糖。在一些實(shí)施方案中，組合物還包含腺苷、谷胱甘肽、別嘌醇和羥乙基淀粉中的至少一種。在一些實(shí)施方案中，組合物是補(bǔ)充有本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物的uw溶液。
[0230]
在一些實(shí)施方案中，使器官、組織或多個干細(xì)胞與本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物接觸約30分鐘、約1小時，約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小
時、約12小時、約24小時、約36小時或約48小時。在一些實(shí)施方案中，接觸發(fā)生在保護(hù)組織和血管調(diào)節(jié)的溫度(例如，低于環(huán)境溫度)。在一些實(shí)施方案中，接觸發(fā)生在4℃。
[0231]
在一些實(shí)施方案中，本文公開的nhc-ha/ptx3或rchc-ha/ptx3復(fù)合物與免疫細(xì)胞共同施用于有需要的對象。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞對于有需要的對象是同種異體的。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞對于有需要的對象是自體的。在一些實(shí)施方案中，在施用于有需要的對象之前遺傳修飾免疫細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，修飾免疫細(xì)胞以包含嵌合抗原受體(car t細(xì)胞療法)。實(shí)施例
[0232]
以下實(shí)施例僅用于說明目的，并不旨在限制要求保護(hù)的主題的范圍。實(shí)施例1：確定前列腺癌細(xì)胞系在暴露于冷凍保存的am和uc提取物或純化的hc-ha/ptx3(am)后的活力和代謝活性
[0233]
已發(fā)表的數(shù)據(jù)(alvim等人，“the potential risk of tumor progression after use of dehydrated human amnion/chorion membrane allograft in a positive margin resection model”,ther adv uro 2019,第11卷:1-10)表明，與未的小鼠相比，用脫水的人羊膜和絨毛膜同種異體移植產(chǎn)品的小鼠在部分切除后腫瘤生長更快。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定前列腺癌細(xì)胞系在暴露于冷凍保存的am和uc提取物或純化的hc-ha/ptx3(am)后的活力和代謝活性。
[0234]
在兩次或更多次超速離心后，檢查冷凍保存的am和uc的提取物或純化的hc-ha/ptx3，以確定它們是否抑制增殖并降低人前列腺癌細(xì)胞系(即pc-3和lncap)的整體細(xì)胞代謝活性。
[0235]
對于初步可行性，使用wst-1測定測試了純化的hc-ha/ptx3和精制的btgel(即，顆粒化am和uc)的影響。wst-1測定用于量化總細(xì)胞代謝活性。lncap和pc-3的擴(kuò)增
[0236]
收到購買的冷凍pc-3(crl-1435
tm
，批號70004013)和lncap(lncap克隆fgccrl-1740，批號64207637)并儲存在液氮中。將lncap和pc-3的每個小瓶(1ml，未提供細(xì)胞的量)以200x g離心5分鐘。除去儲存培養(yǎng)基，將細(xì)胞重新懸浮于1ml rpmi 1640完全培養(yǎng)基中。將總共0.5ml轉(zhuǎn)移到100mm培養(yǎng)皿中(每個細(xì)胞系兩個培養(yǎng)皿)。細(xì)胞在37℃和5％co2孵育。三天后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育細(xì)胞四天，此時細(xì)胞達(dá)到70％匯合。注意到lncap傾向于形成聚集體(圖1a)而pc-3生長為均勻分布的單細(xì)胞層(圖1b)。通過0.25％胰蛋白酶-edta(貨號25200-056，fisher scientific)收獲細(xì)胞并通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。lncap和pc-3的總細(xì)胞數(shù)分別為5.92x106和2.88x106。
[0237]
將細(xì)胞重新懸浮于如下含有5％dmso的rpmi1640完全培養(yǎng)基中：lncap：10管，5.4x105/管，0.5ml/管(約1.08x106/ml)，液氮罐：s1r4b5，以及pc-3：10管，2.6x105/管，0.5ml/管(約5.2x105/ml)，液氮罐：s1r4b5。rbtgel和hc-ha/ptx3對lncap和pc-3的細(xì)胞代謝活性的影響
[0238]
將來自擴(kuò)增(上述)的2.9x105個lncap細(xì)胞或2.9x105個pc-3細(xì)胞在一個100mm培養(yǎng)皿中傳代并培養(yǎng)4天。收獲細(xì)胞(lncap：總細(xì)胞為1.24x106，活力為91％；pc-3：總細(xì)胞為4.08x106，活力為97％；所以pc-3細(xì)胞比lncap細(xì)胞生長得更快，這與報(bào)告一致，即lncap和pc-3的細(xì)胞倍增時間分別約為60小時和33小時)并以1x104/cm2或3.2x104/ml接種在96孔板
(lncap一個板，pc-3一個板)。孵育過夜后，用0、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50或100μg/ml的rbtgel(供體號btr161857；ha：175μg/ml；蛋白質(zhì)：165μg/ml)或hc-ha/ptx3(am/pbs的第2超速離心的匯集的級分3-9，供體2用于穩(wěn)定性驗(yàn)證，di：tglp17e002)(例如，添加11.1μl的10x劑量至100μl培養(yǎng)基以獲得準(zhǔn)確劑量)處理lncap和pc-3細(xì)胞(n＝3)。處理48小時后，通過顯微鏡圖像記錄細(xì)胞形態(tài)(圖2a和圖2b，以及和圖3a和圖3b)，然后用于根據(jù)制造商說明(od450或od450
–
od670)進(jìn)行細(xì)胞代謝活性的wst-1測定(貨號10008883，cayman chemical company，ann arbor，mi)(圖2c和圖2d以及圖3c和圖3d)。
[0239]
在形態(tài)學(xué)上，lncap生長為小細(xì)胞簇和大細(xì)胞簇。處理細(xì)胞48小時后，高劑量(50和100μg/ml)的精制的btgel導(dǎo)致大多數(shù)梭形細(xì)胞變成圓形細(xì)胞，但大多數(shù)細(xì)胞仍然附著并成簇。基于較低的細(xì)胞密度也可能發(fā)生細(xì)胞死亡。類似的形態(tài)變化在低得多的hc-ha/ptx3劑量(6.25μg/ml或更高)時發(fā)生。這些數(shù)據(jù)表明精制的btgel和hc-ha/ptx3均抑制lncap的細(xì)胞代謝活性。精制的btgel是在鹽水(約154mm nacl)中制備的，而hc-ha/ptx3已經(jīng)用蒸餾水進(jìn)行了廣泛透析，并且含有無法檢測到的鹽。因此，當(dāng)將凍干的btgel添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中時，它可能會增加培養(yǎng)基中的鹽濃度，如果將鹽濃度增加約30mm或更高，則可能會降低細(xì)胞增殖。當(dāng)精制的btgel以0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml添加時，使培養(yǎng)基中的鹽濃度分別增加了6.2、12.4、24.7、49.5、98.9、197.9、395.8、791.5mm(用公式劑量/175*154/0.111得到鹽濃度；btgel的ha濃度為175μg/ml，鹽水含154mm nacl，每孔中培養(yǎng)基總體積為0.111ml)。因此，精制的btgel在6.25μg/ml或更高時的抑制可能是由鹽引起的，而不必?fù)?dān)心hc-ha/ptx3的鹽效應(yīng)。wst-1測定數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)精制的btgel的劑量為25μg/ml或更高時，lncap的代謝活性受到抑制(p《0.05)(圖2c)。由于擔(dān)心鹽效應(yīng)，精制的btgel是否能在這些劑量下抑制lncap的細(xì)胞代謝活性尚無定論。相比之下，6.25μg/ml或更高濃度的hc-ha/ptx3抑制lncap的代謝活性(40％
–
85％)(圖2c和圖2d)。
[0240]
在形態(tài)學(xué)上，pc-3生長為比lncap分布更均勻的細(xì)胞。然而，在處理細(xì)胞48小時后，更高劑量(50和100μg/ml)的精制的btgel導(dǎo)致細(xì)胞更圓。基于較低的細(xì)胞密度也可能發(fā)生細(xì)胞死亡。類似的形態(tài)變化在低得多的hc-ha/ptx3劑量(12.5μg/ml或更高)時發(fā)生。這些數(shù)據(jù)暗示精制的btgel和hc-ha/ptx3均抑制pc-3的增殖(活力)。但是，如上所述，精制的btgel在6.25μg/ml或更高時的抑制可能是由鹽引起的，而不必?fù)?dān)心hc-ha/ptx3的鹽效應(yīng)。wst-1測定數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)精制的btgel的劑量為6.25μg/ml或更高時，pc-3的增殖受到抑制(p《0.05)(圖3c)。由于擔(dān)心鹽效應(yīng)，精制的btgel是否能在這些劑量下抑制pc-3的增殖尚無定論。相比之下，3.125μg/ml或更高濃度的hc-ha/ptx3抑制pc-3的增殖(8％
–
100％)(圖3c和圖3d)。
[0241]
兩個組均顯示具有劑量依賴性效應(yīng)，可顯著降低pc-3和lncap前列腺癌細(xì)胞的代謝效應(yīng)。根據(jù)形態(tài)，似乎存在與較高濃度的wst-1讀出相關(guān)的細(xì)胞死亡。
[0242]
這些數(shù)據(jù)顯示hc-ha/ptx3不促進(jìn)pc-3和lncap癌癥的形成，允許在前列腺切除術(shù)后使用。此外，rbtgel被證明具有抗癌作用。下面的實(shí)施例將表明uc提取物對前列腺癌細(xì)胞增殖的影響，而沒有潛在的鹽影響。
[0243]
結(jié)論
[0244]
6.25μg/ml或更高的精制的btgel和3.125μg/ml或更高的hc-ha/ptx3抑制pc-3的增殖。25μg/ml或更高的精制的btgel和6.25μg/ml或更高的hc-ha/ptx3抑制lncap的增殖。
由于擔(dān)心鹽效應(yīng)，羊膜和臍帶(amuc)或精制的btgel中的鹽是否能在這些劑量下抑制增殖尚無定論。
[0245]
與lncap相比，可能需要較低濃度的rbtgel和hc-ha/ptx3來抑制pc-3，因?yàn)橐阎猵c-3細(xì)胞具有更快的倍增時間。因此，陰性對照組和組之間的差異在pc-3中會更大。
[0246]
因此，盡管公布的數(shù)據(jù)表明某些胎兒支持產(chǎn)物與更快的腫瘤復(fù)發(fā)和生長有關(guān)，但這里證明am和uc產(chǎn)物不會促進(jìn)前列腺切除術(shù)后的癌癥復(fù)發(fā)。實(shí)施例2：確定前列腺癌細(xì)胞系在暴露于冷凍保存的uc提取物、ha和純化的hc-ha/ptx3(am)后的代謝活性。
[0247]
實(shí)施例1的結(jié)果顯示hc-ha/ptx3在兩種前列腺細(xì)胞系的濃度低至6.25μg/ml時降低這兩種細(xì)胞類型中的代謝活性。此外，顯示rbtgel在25μg/ml及以上時抑制活性。進(jìn)行以下研究以排除較高劑量rbtgel中的鹽濃度混淆數(shù)據(jù)解釋的可能性。
[0248]
使用相同的wst-1測定測試水中的uc提取物。此外，還測試了hc-ha/ptx3以與uc結(jié)果進(jìn)行比較。ha用作對照組。基于haμg/ml測試了一系列劑量。
[0249]
pc3和lncap細(xì)胞以1x104/cm2接種于96孔板(100ul/孔)(每個組n＝3)。孵育過夜后，將細(xì)胞用一系列劑量(由ha濃度定義，0、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200和400μg/ml，n＝3)的uc(用水提取)、純化的hc-ha/ptx3(am/pbs的第2超速離心的匯集的級分3-9，供體2用于穩(wěn)定性驗(yàn)證，di：tglp17e002，于2017年9月19日制備)和ha處理。處理48小時后，記錄細(xì)胞形態(tài)，然后根據(jù)制造商的說明(od450或od450
–
od670)用wst-1(貨號10008883,cayman chemical company,ann arbor,mi)測量細(xì)胞的細(xì)胞代謝活性。
[0250]
wst-1測定數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)用uc提取物(≥100μg/ml)和hc-ha/ptx3(≥6.25μg/ml)處理時，lncap細(xì)胞的代謝活性受到顯著抑制(p《0.05)，但ha處理時沒有(參見圖4a)。同樣，uc提取物(≥200μg/ml)和hc-ha/ptx3(≥1.56μg/ml)顯著抑制pc-3細(xì)胞中的代謝活性，但ha沒有(參見圖4b)。使用濃度≥25μg/ml的hc-ha/ptx3在lncap(圖5a
–
圖5c)和pc3(圖6a
–
圖6c)細(xì)胞兩者中在顯微鏡下明顯注意到細(xì)胞死亡。
[0251]
wst-1和形態(tài)學(xué)評估確定hc-ha/ptx3明顯抑制代謝活性。根據(jù)形態(tài)，pc3和lncap細(xì)胞都變圓，與基質(zhì)的粘附性降低，并且當(dāng)暴露于更高濃度的hc-ha/ptx3時，細(xì)胞數(shù)量較少。不同之處在于lncap細(xì)胞在較高的hc-ha/ptx3濃度下聚集為小直徑、圓形細(xì)胞的簇，但pc3細(xì)胞不聚集。
[0252]
wst-1測定數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)用uc提取物(≥100μg/ml)和hc-ha/ptx3(≥6.25μg/ml)處理時，lncap細(xì)胞的代謝活性受到顯著抑制(p《0.05)，但ha處理時沒有。同樣，uc提取物(≥200μg/ml)和hc-ha/ptx3(≥1.56μg/ml)顯著抑制pc-3細(xì)胞中的代謝活性，但ha沒有。使用濃度≥25μg/ml的hc-ha/ptx3在lncap和pc3細(xì)胞兩者中在顯微鏡下明顯注意到細(xì)胞死亡。
[0253]
討論
[0254]
wst-1和形態(tài)學(xué)評估確定hc-ha/ptx3明顯抑制代謝活性。根據(jù)形態(tài)，pc3和lncap細(xì)胞都變圓，與基質(zhì)的粘附性降低，并且當(dāng)暴露于更高濃度的hc-ha/ptx3時，細(xì)胞數(shù)量較少。不同之處在于lncap細(xì)胞在較高的hc-ha/ptx3濃度下聚集為小直徑、圓形細(xì)胞的簇，但pc3細(xì)胞不聚集。在暴露于hc-ha/ptx3后lncap聚集而pc3沒有聚集的原因仍然未知，但lncap細(xì)胞已被證明比pc3具有更快的聚集率。這可能是由于它們的附著依賴性，lncap和pc3分別是錨定依賴性和獨(dú)立的。對于lncap，活力和增殖需要附著在表面上，而脫離會通過失巢凋亡
過程誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。文獻(xiàn)比較了lncap在不同涂層試劑(聚-l-賴氨酸、聚-l-鳥氨酸、人胎盤iv型膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白)上生長的效果，并顯示層粘連蛋白和iv型膠原蛋白促進(jìn)細(xì)胞聚集(圖7，在24小時時采集)。這種聚集類似于本文提供的實(shí)驗(yàn)中看到的形態(tài)，并且可能表明hc-ha/ptx3減少了lncap細(xì)胞表面附著。眾所周知，不同的底物特性，包括表面電荷、形貌、疏水性/親水性、表面化學(xué)和表面能可能會影響細(xì)胞行為，而經(jīng)修飾的細(xì)胞-底物相互作用可能會影響細(xì)胞內(nèi)信號的產(chǎn)生。事實(shí)上，液體覆蓋技術(shù)通常用于該領(lǐng)域，通過在具有非粘附特性的表面上培養(yǎng)細(xì)胞來誘導(dǎo)聚集/球體，因此細(xì)胞間的相互作用比細(xì)胞和表面之間建立的相互作用更為突出。因此，對于細(xì)胞系中的大多數(shù)，細(xì)胞聚集導(dǎo)致在1-3天內(nèi)形成球體。
[0255]
結(jié)論
[0256]
wst-1測定數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)用uc提取物(≥100μg/ml)和hc-ha/ptx3(≥6.25μg/ml)處理時，lncap細(xì)胞的代謝活性受到顯著抑制(p《0.05)，但ha處理時沒有。同樣，uc提取物(≥200μg/ml)和hc-ha/ptx3(≥1.56μg/ml)顯著抑制pc-3細(xì)胞中的代謝活性，但ha沒有。使用濃度≥25μg/ml的hc-ha/ptx3在lncap和pc3細(xì)胞兩者中在顯微鏡下明顯注意到細(xì)胞死亡。
[0257]
這些數(shù)據(jù)表明uc提取物對前列腺細(xì)胞代謝活性的抑制與鹽作用無關(guān)。此外，這里證明am和uc產(chǎn)物不會促進(jìn)前列腺切除術(shù)后的癌癥復(fù)發(fā)。實(shí)施例3：確定hc-ha/ptx3和ha對正常前列腺細(xì)胞/細(xì)胞系的形態(tài)和代謝活性的影響，并與前列腺癌細(xì)胞系進(jìn)行比較。
[0258]
前列腺上皮由兩個組織學(xué)上不同的層構(gòu)成：分泌腔層和基底細(xì)胞層。使用人正常前列腺上皮基底細(xì)胞和腔細(xì)胞。人正常前列腺上皮基底細(xì)胞(prec)獲自clonetics-biowhittaker,inc.(walkersville,md,usa)，并使用pregm bulletkit在前列腺上皮基底細(xì)胞培養(yǎng)基(都來自clonetics)中培養(yǎng)，其含有補(bǔ)充劑和生長因子(bpe、氫化可的松、hegf、腎上腺素、胰島素、三碘甲狀腺原氨酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、慶大霉素/兩性霉素b和視黃酸)。
[0259]
人正常前列腺腔pnt2細(xì)胞系購自sigma(貨號95012613)。該細(xì)胞系是通過用含有具有缺陷復(fù)制起點(diǎn)的sv40基因組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，使正常成人前列腺上皮細(xì)胞永生化而建立的。在37℃、在加濕培養(yǎng)箱中、在空氣中5％ co2的氣氛中、在補(bǔ)充有10％胎牛血清(fbs)、l-谷氨酰胺(2mm)、青霉素(100u/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的rpmi 1640培養(yǎng)基(rpmi 1640完全培養(yǎng)基)中培養(yǎng)pnt2細(xì)胞。在70％-80％匯合時，通過0.25％(w/v)胰蛋白酶-0.53mm edta溶液收獲細(xì)胞，并在液氮?dú)庀嘀幸缘确衷嚇有问綄⑵鋬Υ嬖?5％完全培養(yǎng)基和5％ dmso中。表1：wst-1測定的細(xì)胞代謝分析：
[0260]
細(xì)胞在它們各自的生長培養(yǎng)基中復(fù)蘇。然后將細(xì)胞以3.2x104/ml在96孔板(即3200個細(xì)胞+100ul/孔)(每個測定n＝3)中接種過夜以進(jìn)行wst-1測定。純化的hc-ha/ptx3[am2p(f 3-9)[tgam17h008]；儲備量＝67μg]和hmw-ha(healon；貨號ce0344；批號up30583；儲備濃度＝10mg/ml)用相應(yīng)的培養(yǎng)基連續(xù)稀釋以獲得上述濃度。用連續(xù)劑量的純化hc-ha/ptx3或ha處理細(xì)胞，并在37℃保持48小時。在處理前和處理24小時和48小時后，在顯微鏡下(10x和20x放大倍率的明場)記錄細(xì)胞形態(tài)。按照制造商的說明(od450或od450 od670)在48小時時通過wst-1(貨號10008883，cayman chemical company，annarbor，mi)測量每個細(xì)胞系的代謝活性。a.正常人前列腺細(xì)胞/細(xì)胞系的擴(kuò)增
[0261]
人正常前列腺上皮基底細(xì)胞(prec)比人正常前列腺腔細(xì)胞(pnt2)生長得更快。prec的倍增時間為18-24小時，而pnt2的倍增時間更長，約為36-48小時。
[0262]
prec(圖8a)和pnt2(圖8b)前列腺細(xì)胞系的以10x和20x放大率拍攝的明場圖像顯示正常前列腺細(xì)胞的形態(tài)。b.hc-ha/ptx3和hmw-ha對人正常前列腺細(xì)胞形態(tài)的影響
[0263]
prec細(xì)胞通常快速增殖并且很好地附著在表面上。通常細(xì)胞很好地相互粘附。
[0264]
hc-ha/ptx3處理24小時后：在6.25μg/ml時，細(xì)胞失去細(xì)胞間粘附；在12.5μg/ml時，細(xì)胞間粘附的損失增加；在25μg/ml時，細(xì)胞逐漸開始改變其形態(tài)；在50μg/ml時，細(xì)胞逐漸變圓并失去細(xì)胞-細(xì)胞粘附；在100μg/ml時，細(xì)胞變圓并尺寸變小，但它們并未死亡。hc-ha/ptx3處理48小時后：在3.13μg/ml時，細(xì)胞開始解離；在25μg/ml時，細(xì)胞完全相互分離，并且沒有聚集生長；在50μg/ml時，細(xì)胞受到脅迫，尺寸變小，變得更小和更圓；在100μg/ml時，細(xì)胞死亡，細(xì)胞計(jì)數(shù)急劇下降(圖9)。
[0265]
沒有觀察到ha處理的顯著影響。
c.hc-ha/ptx3和ha對人正常前列腺細(xì)胞代謝的影響
[0266]
在用hc-ha/ptx3后，prec和pnt2的代謝活性以劑量依賴性方式顯著降低。相比之下，ha對細(xì)胞代謝沒有顯著影響(圖10a和10b)。在這兩種類型的正常前列腺細(xì)胞之間，prec(圖10a)對極低濃度的hc-ha/ptx3(1.56和3.125μg/ml)更敏感。相同低濃度的hc-ha/ptx3(1.56和3.13μg/ml)不影響pnt2(圖10b)細(xì)胞代謝活性。
[0267]
與不同濃度(0.78、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)的hc-ha/ptx3或ha孵育48小時后，通過wst-1測定在正常人原代前列腺上皮細(xì)胞prec和正常人前列腺細(xì)胞系pnt2中評估代謝活性(％)。通過相對于未處理樣品的雙尾t檢驗(yàn)計(jì)算p值。d.hc-ha/ptx3和ha的正常 amp;癌癥前列腺細(xì)胞/細(xì)胞系之間細(xì)胞代謝活性的比較分析
[0268]
比較不同濃度的hc-ha/ptx3(圖11a和11b)和ha(圖12a和圖12b)對正常前列腺細(xì)胞(prec amp;pnt2)和前列腺癌細(xì)胞系(lncap amp;pc3)的代謝活性的影響。正常和癌細(xì)胞類型都以類似的方式對hc-ha/ptx3和hmw-ha作出反應(yīng)。在25μg/ml hc-ha/ptx3時，與癌細(xì)胞系(lncap amp;pc3)相比，prec細(xì)胞和pnt2細(xì)胞系顯示更低敏感性。用hmw-ha處理后prec、pnt2、pc3和lncap細(xì)胞的代謝活性沒有顯著差異。
[0269]
圖11a-圖11b和圖12a-圖12b顯示了與不同濃度(0.78、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)的hc-ha/ptx3和ha孵育48小時后，通過wst-1測定在正常原代前列腺上皮細(xì)胞(prec)和細(xì)胞系(pnt2)和前列腺癌細(xì)胞系：pc3和lncap中評估的代謝活性(％)的比較分析。半對數(shù)回歸分析表明，hc-ha/ptx3以劑量依賴性方式線性抑制所有類型的前列腺細(xì)胞的代謝活性，而ha沒有任何顯著影響*(p《0.05)；**(p《0.01)；****(p《0.001)。
[0270]
總體而言，hc-ha/ptx3以劑量依賴性方式抑制所有類型的人前列腺細(xì)胞/細(xì)胞系(包括正常和癌癥)的細(xì)胞代謝活性，而hmw-ha沒有顯著影響。在濃度高達(dá)25μg/ml時，pnt2細(xì)胞系對hc-ha/ptx3的敏感性較低(細(xì)胞代謝活性：60％；p《0.001)，而癌細(xì)胞系(pc3和lncap)的代謝活性降低至低于25％(p《0.001)。實(shí)施例4：確定hc-ha/ptx3和ha對所選癌癥上皮細(xì)胞系的形態(tài)和代謝活性的影響。
[0271]
上述實(shí)施例表明hc-ha/ptx3調(diào)節(jié)兩種前列腺癌細(xì)胞系(pc-3和lncap)的代謝活性。在這項(xiàng)研究中，通過wst-1測定檢測了hc-ha/ptx3和hmw-ha(作為對照)對4種不同人癌細(xì)胞系：a-375(黑素瘤)、a549(肺癌)、mcf-7(乳腺癌)和ht-29(結(jié)腸腺癌)的形態(tài)和代謝活性的影響。基于實(shí)施例1中所示的結(jié)果選擇hc-ha/ptx3和ha的濃度。
[0272]
在實(shí)施例1中注意到，hc-ha/ptx3-反應(yīng)曲線在50μg/ml及以上的濃度下趨于平穩(wěn)。hc-ha/ptx3濃度在50μg/ml和100μg/ml之間的代謝活性沒有顯著變化。因此，hc-ha/ptx3的最大濃度保持在100μg/ml。
[0273]
將細(xì)胞解凍并重新懸浮于5ml預(yù)熱的新鮮完全培養(yǎng)基中，然后以250g離心5分鐘。小心去除上清液，將細(xì)胞沉淀物重新懸浮在10ml預(yù)熱的新鮮完全培養(yǎng)基中，并接種在100mm培養(yǎng)板中，保持在37℃。培養(yǎng)5天后，a-549、ht-29 amp;a357細(xì)胞幾乎70％-80％匯合，而mcf-7細(xì)胞生長緩慢。將細(xì)胞板從培養(yǎng)箱中取出，小心去除培養(yǎng)基，然后用3-5ml d-pbs洗滌兩次。然后使用5ml 0.25％胰蛋白酶-0.53mm edta收獲來自每個100mm板的細(xì)胞。5-10分鐘后，加入5ml新鮮培養(yǎng)基以中和胰蛋白酶-edta的作用，將細(xì)胞以250g離心5分鐘。離心后，小心去除上清液，將細(xì)胞沉淀物重新懸浮于2ml新鮮培養(yǎng)基中。對于每個細(xì)胞系，將10μl細(xì)胞懸浮液
與10μl臺盼藍(lán)混合以染死細(xì)胞，并在顯微鏡下通過血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。在這項(xiàng)研究中，使用了四個96孔板，每個細(xì)胞系一個。待接種的細(xì)胞數(shù)根據(jù)前面的實(shí)施例確定(接種細(xì)胞計(jì)數(shù)：實(shí)施例1和2中1x104/cm2)。假設(shè)96孔板的每個孔的面積為0.32cm2，則需要3.2x104/ml細(xì)胞。用在100μl培養(yǎng)基中的3200個細(xì)胞接種每個孔。用以下濃度的hc-ha/ptx3和ha(作為對照)處理細(xì)胞：0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100(μg/ml)，一式三份。使用了兩個未經(jīng)處理的樣品：未經(jīng)wst-1試劑處理的樣品和未經(jīng)wst-1試劑處理的樣品(作為wst-1測定的對照)。為避免移液錯誤，將細(xì)胞在培養(yǎng)基中稀釋至最終體積為8ml，如表2所示。表2：在100μl培養(yǎng)基中產(chǎn)生3200個細(xì)胞的稀釋方案
[0274]
在37℃孵育過夜后，在明場顯微鏡下以放大倍率分別為10x和20x捕獲細(xì)胞形態(tài)。純化的hc-ha/ptx3[am2p(f 3-9)；于2018年2月2日純化；儲備量＝25.78μg]和hmw-ha(healon；貨號ce0344；批號up30583；失效日期：2018年12月；儲備濃度＝10mg/ml)用相應(yīng)的培養(yǎng)基連續(xù)稀釋以獲得所需的濃度(即0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)。用連續(xù)劑量的純化hc-ha/ptx3或ha處理細(xì)胞，并在37℃培養(yǎng)箱保持48小時。在處理前和處理24小時和48小時后，在顯微鏡下(10x和20x放大倍率的明場)記錄細(xì)胞形態(tài)。按照制造商的說明(od450或od450
–
od670)在48小時時通過wst-1(貨號10008883，cayman chemical company，annarbor，mi)測量每個細(xì)胞系的代謝活性。
[0275]
hc-ha/ptx3或hmw-ha對人癌癥上皮細(xì)胞形態(tài)的影響：a.a-375(黑素瘤)：正常情況下，細(xì)胞增殖迅速并且很好地附著在表面。i.hc-ha/ptx3處理：24小時后：在25(μg/ml)時：細(xì)胞趨于紡錘形。在50(μg/ml)時：細(xì)胞變成紡錘形。在100(μg/ml)時：細(xì)胞是圓形和死亡的。48小時后：在6.25(μg/ml)時：細(xì)胞顯示出輕微失去細(xì)胞間粘附。在12.5(μg/ml)時：細(xì)胞失去更多的細(xì)胞間粘附。細(xì)胞傾向于單獨(dú)生長而不是成團(tuán)生長。在25(μg/ml)時：》80％的細(xì)胞正在收縮，呈紡錘形，其余細(xì)胞呈圓形。在50(μg/ml)時：》60％細(xì)胞死亡并呈圓形，其余細(xì)胞呈紡錘形。在100(μg/ml)時：所有細(xì)胞都呈圓形并死亡。參見圖13。ii.ha處理：沒有觀察到ha的顯著影響。iii.結(jié)果表明，隨著hc-ha/ptx3濃度的增加，一般而言a-375細(xì)胞按以下步驟以劑量依賴性方式改變形態(tài)：
[0276]
正常上皮細(xì)胞相互粘附》細(xì)胞失去細(xì)胞間附著并變成紡錘形。細(xì)胞收縮》細(xì)胞變圓并且死亡。a.ht-29(結(jié)腸癌)：細(xì)胞通常呈圓形并聚集生長。每個聚合體看起來像球。i.hc-ha/ptx3處理：24小時后：在50(μg/ml)時：細(xì)胞失去粘附并被分離。在100(μg/ml)時：細(xì)胞呈圓珠狀，存活較少。48小時后：在1.56(μg/ml)時：細(xì)胞間粘附逐漸喪失。在
6.25(μg/ml)時：每個團(tuán)塊中《10個細(xì)胞相互粘附。細(xì)胞失去更多的細(xì)胞間粘附。在25(μg/ml)時：細(xì)胞傾向于單個而不是聚集生長。在50(μg/ml)時：細(xì)胞單個生長。在100(μg/ml)時：單個細(xì)胞呈圓形，存活較少。參見圖14。ii.ha處理：沒有觀察到ha的顯著影響。iii.隨著hc-ha/ptx3濃度以劑量依賴性方式增加，一般而言ht-29細(xì)胞按以下步驟改變形態(tài)：
[0277]
》20個細(xì)胞相互粘附。看起來像葡萄。》細(xì)胞間粘附逐漸松動》《10個細(xì)胞在每個團(tuán)塊中相互粘附》細(xì)胞逐漸從團(tuán)塊中出來。細(xì)胞間和細(xì)胞基質(zhì)的粘附性降低，而不是呈聚集。》單個圓形細(xì)胞存活較少。a.a549(肺癌)：通常細(xì)胞是上皮細(xì)胞并迅速增殖。i.hc-ha/ptx3處理：24小時后：在25(μg/ml)時：細(xì)胞形態(tài)略微變?yōu)樗笮巍Ｔ?0(μg/ml)時，細(xì)胞傾向于更多的紡錘形。在100(μg/ml)時：所有細(xì)胞均未死亡。死細(xì)胞是圓形的。48小時后：在12.5(μg/ml)時：細(xì)胞形態(tài)略微變?yōu)榧忓N形。在50(μg/ml)時：細(xì)胞傾向于更多的紡錘形。在100(μg/ml)時：所有細(xì)胞均未死亡。死細(xì)胞是圓形的。參見圖15。ii.ha處理：沒有觀察到ha的顯著影響。iii.在hc-ha/ptx3處理下，一般而言a-549細(xì)胞按以下步驟改變其形態(tài)：
[0278]
細(xì)胞增殖。細(xì)胞間粘附。》細(xì)胞圓形 amp;點(diǎn)狀。死亡a.mcf-7(乳腺癌)：通常細(xì)胞是上皮細(xì)胞。緩慢生長。相互粘附。聚集生長。i.hc-ha/ptx3處理：24小時后：在50μg/ml之前無影響。在100(μg/ml)時：圓珠狀細(xì)胞死亡。48小時后，影響相同。參見圖16。ii.ha處理：沒有觀察到ha的顯著影響。iii.在hc-ha/ptx3處理下，一般而言mcf-7細(xì)胞按以下步驟改變其形態(tài)：
[0279]
細(xì)胞聚集生長》細(xì)胞解離。死亡。
[0280]
hc-ha/ptx3或hmw-ha對癌細(xì)胞系代謝活性的影響：
[0281]
a375：a-375細(xì)胞代謝以劑量依賴性方式顯著降低。用hc-ha/ptx3處理48小時后，細(xì)胞代謝從1.56μg/ml開始發(fā)生顯著變化。沒有觀察到ha的顯著影響。(圖17a)
[0282]
ht-29：ht-29細(xì)胞代謝以劑量依賴性方式顯著降低。用hc-ha/ptx3處理48小時后，細(xì)胞代謝活性從6.25μg/ml開始發(fā)生顯著變化。沒有觀察到ha的顯著影響。(圖17b)
[0283]
a549：a549細(xì)胞代謝以劑量依賴性方式顯著降低。用hc-ha/ptx3處理48小時后，細(xì)胞代謝活性從0.78μg/ml開始變化。沒有觀察到ha的顯著影響。(圖17d)
[0284]
mcf-7：mcf-7顯示對hc-ha/ptx3的敏感性最低。在高濃度(50μg/ml)下可以觀察到hc-ha/ptx3的顯著影響，但影響不如在a375和ht-29等其他細(xì)胞系中觀察到的那么強(qiáng)。(圖17c)
[0285]
hc-ha/ptx3抑制細(xì)胞聚集、細(xì)胞間連接、細(xì)胞形狀和細(xì)胞粘附，從而以劑量依賴性方式抑制所測試的所有4種癌細(xì)胞類型的細(xì)胞代謝活性。相比之下，透明質(zhì)酸對所有四種細(xì)胞類型的細(xì)胞形態(tài)和代謝活性沒有顯著影響。這些影響發(fā)生得很快，例如，在24小時內(nèi)，強(qiáng)烈表明hc-ha/ptx3在與cd44結(jié)合后會導(dǎo)致細(xì)胞骨架/膜相互作用發(fā)生變化，這是特異性的并且與hmw ha不同。
[0286]
在4種細(xì)胞系中，a375和ht-29對hc-ha/ptx3比a549和mcf-7更敏感。由于mcf-7不
顯著表達(dá)cd44，這四種腫瘤細(xì)胞之間的差異可能與cd44表達(dá)的程度有關(guān)。
[0287]
a375和ht-29在與hc-ha/ptx3接觸后在細(xì)胞間粘附和底物粘附方面的變化是不同的。對于a375，脫離后出現(xiàn)形態(tài)變化：細(xì)胞首先變成紡錘形，然后變成圓形。相比之下，ht-29沒有表現(xiàn)出任何形態(tài)變化。細(xì)胞從一開始就保持圓形。在高濃度的hc-ha/ptx3下，它們逐漸失去了細(xì)胞間附著。這些結(jié)果表明，在不同類型的癌癥中，hc-ha/ptx3可能通過不同的途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附信號傳導(dǎo)。
[0288]
在這些癌細(xì)胞系中觀察到的主要事件是：細(xì)胞代謝活性的抑制，導(dǎo)致細(xì)胞形狀改變，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。實(shí)施例5：確定hc-ha/ptx3和ha對間充質(zhì)細(xì)胞的影響。
[0289]
在實(shí)施例2和4中，已鑒定hc-ha/ptx3影響正常前列腺上皮細(xì)胞的形態(tài)和代謝活性，與對腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和代謝活性的影響相似。為了解決這種影響是否也適用于正常間充質(zhì)細(xì)胞，檢查了hc-ha/ptx3是否也對一系列間充質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和代謝活性產(chǎn)生類似的影響。
[0290]
分別使用了三種正常的間充質(zhì)原代細(xì)胞：(a)角膜緣微環(huán)境細(xì)胞(lnc)、(b)人小梁網(wǎng)(htm)和(c)人角膜成纖維細(xì)胞(hcf)。細(xì)胞在它們各自的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)。lnc在hscm培養(yǎng)基中在5％基底膠(無血清)上培養(yǎng)。htm細(xì)胞在具有5％ fbs的escm培養(yǎng)基中5％基底膠上培養(yǎng)。hcf細(xì)胞僅在具有5％ fbs的dmem中在塑料上培養(yǎng)。在6孔板的每個孔中培養(yǎng)細(xì)胞。對于lnc和htm細(xì)胞，首先用1000μl 5％基底膠包被孔，并在37℃孵育1小時。隨后，將細(xì)胞接種在每個孔中在1000μl培養(yǎng)基中。在細(xì)胞達(dá)到充分匯合后，將它們用胰蛋白酶消化，然后以200g短暫離心5分鐘。除去培養(yǎng)基并用新鮮培養(yǎng)基補(bǔ)充細(xì)胞沉淀物。將96孔板的選定孔包被50μl 5％基底膠，并在37℃孵育1小時。之后，將lnc和htm細(xì)胞接種在基底膠包被的96孔板中，并在37℃孵育過夜。在每個孔中，將3200個細(xì)胞接種在100μl培養(yǎng)基中。第二天，將細(xì)胞用一系列劑量(由ha濃度定義，例如0、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml，n＝3)的純化的hc-ha/ptx3和ha處理。hc-ha/ptx3和ha的濃度通過如實(shí)施例3中所做的連續(xù)稀釋計(jì)算。分別在處理15-30分鐘、1小時、5小時、24小時和48小時后記錄細(xì)胞形態(tài)。孵育48小時后，根據(jù)制造商的說明(od450或od450
–
od670)，通過wst-1(貨號10008883,cayman chemical company,ann arbor,mi)測量細(xì)胞代謝活性。
[0291]
使用25至100μg/ml hc-ha/ptx3在15分鐘內(nèi)觀察到角膜緣微環(huán)境細(xì)胞(lnc)形態(tài)的變化。然而，在與hc-ha/ptx3孵育較長時間(1小時)后，細(xì)胞再次恢復(fù)到原始形狀。細(xì)胞形態(tài)沒有進(jìn)一步改變(參見圖18a)。
[0292]
用高劑量hmw-ha(100μg/ml)處理的細(xì)胞收縮更多并變成線狀(圖18b)。當(dāng)用100μg/ml hc-ha/ptx3處理48小時時，lnc變得扁平但相對較短。圖18c顯示在與100μg/ml hc-ha/ptx3或hmw-ha孵育48小時后lnc(角膜緣微環(huán)境細(xì)胞)的代表性明場顯微圖像(比例尺50μm)。
[0293]
lnc在代謝上對hc-ha/ptx3具有很強(qiáng)的抗性。孵育48小時后，總體細(xì)胞代謝活性保持在75％左右，表明hc-ha/ptx3對lnc的影響很小，盡管隨著hc-ha/ptx3濃度的逐漸增加，細(xì)胞代謝活性迅速下降。hc-ha/ptx3的顯著影響始于濃度12.5μg/ml。用hmw-ha處理時未檢測到lnc代謝活性的顯著變化。圖19顯示與不同濃度(1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/ml)的hc-ha/ptx3孵育48小時后，通過wst-1測定評估的角膜緣微環(huán)境細(xì)胞中的代謝活性
ha/ptx3起反應(yīng)。表3.用高濃度hc-ha/ptx3(例如100μg/ml)處理48小時的時候間充質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間的差異。實(shí)施例6：確定hc-ha/ptx3在抑制人正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中的細(xì)胞增殖中的作用。
[0301]
我們在實(shí)施例4中觀察到，a375(黑素瘤)細(xì)胞的代謝活性(通過wst-1測量)和形態(tài)對hc-ha/ptx3敏感。隨著hc-ha/ptx3濃度的增加，代謝活性受到抑制，細(xì)胞形態(tài)由上皮細(xì)胞形變?yōu)樗笮危缓笞優(yōu)閳A形，失去細(xì)胞間和細(xì)胞-基質(zhì)粘附。由于細(xì)胞代謝活性與細(xì)胞增殖率成正比，因此將通過量化增殖細(xì)胞的dna含量將確定hc-ha/ptx3在抑制細(xì)胞增殖中的作用。通過brdu細(xì)胞增殖檢測試劑盒(貨號6813；cell signaling technology,usa)使用抗brdu抗體檢測在細(xì)胞增殖過程中摻入到細(xì)胞dna中的5-溴-2'-脫氧尿苷(brdu)。
[0302]
考慮到實(shí)施例4中的結(jié)果，其中從25μg/ml起的hc-ha/ptx3開始在24小時處理后a375細(xì)胞顯示出顯著的形態(tài)變化，用以下濃度的hc-ha/ptx3處理細(xì)胞：0、25、50和100μg/ml，持續(xù)24小時。將100μg/ml的ha用作對照，因?yàn)閔a對細(xì)胞形態(tài)和代謝活性缺乏顯著影響，如實(shí)施例5所示。基于這項(xiàng)初步研究，對增殖測定方案進(jìn)行了優(yōu)化并應(yīng)用于評估hc-ha/ptx3對人前列腺細(xì)胞(正常 amp;癌癥)的影響。測試組如表4所示。
[0303]
a375細(xì)胞接種在96孔板中(3200個細(xì)胞在100μl培養(yǎng)基/孔中)并孵育過夜。用上述濃度的hc-ha/ptx3和ha處理細(xì)胞48小時。每孔加入10μl 10xbrdu溶液，將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中4小時。去除培養(yǎng)基，以100μl/孔加入固定/變性溶液，保持30分鐘。去除溶液，以100μl/孔加入1x檢測抗體溶液，保持1小時。去除溶液并用洗滌緩沖液適當(dāng)洗滌三次，然后在室溫下以100μl/孔加入1x hrp綴合二抗溶液，保持30分鐘。去除溶液并用洗滌緩沖液適當(dāng)洗滌三次，并在室溫下以100μl/孔添加tmb底物保持30分鐘。以100μl/孔添加stop溶液，并且在450nm處讀取吸光度。表4：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)-a375細(xì)胞
[0304]
在a375(黑素瘤)細(xì)胞中研究了hc-ha/ptx3和ha的抗增殖活性。用不同濃度的hc-ha/ptx3(25、50 amp;100μg/ml)和100μg/ml ha孵育48小時對a375細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)出如實(shí)施例4中觀察到的相同影響(圖26a)。brdu摻入測定顯示hc-ha/ptx3以劑量依賴性方式顯著抑制a375細(xì)胞生長(p《0.005)，而ha沒有顯著貢獻(xiàn)(圖26b)。從學(xué)生t檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)顯著性(p值)。半對數(shù)線性回歸分析確定hc-ha/ptx3對a375細(xì)胞生長具有線性抑制作用(r2＝0.9681)。(圖26c)使用brdu細(xì)胞增殖檢測試劑盒(貨號6813；cell signaling technology,usa)對前列腺細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞增殖分析表5：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)——prec、pnt2、pc-3 amp;lncap細(xì)胞
[0305]
將prec、pnt2、pc-3和lncap細(xì)胞以3.2x103個細(xì)胞/孔接種在96孔板中并孵育過夜。然后用五種濃度的hc-ha/ptx3(1.56、3.13、6.25、12.5 amp;25μg/ml)和100μg/ml hmw-ha處理細(xì)胞48小時，一式三份，如表5所示。最后，將10μm brdu添加到孔中，并將細(xì)胞孵育4小時。去除培養(yǎng)基，并且以100μl/孔添加固定/變性溶液30分鐘。去除溶液，添加1x檢測抗體溶液，并在室溫下以100μl/孔添加1x hrp綴合的二抗溶液30分鐘。去除溶液并用洗滌緩沖液適當(dāng)洗滌三次，并在室溫下以100μl/孔添加tmb底物30分鐘。以100μl/孔添加stop溶液，并且在
450nm處讀取吸光度。
[0306]
通過明場相差顯微鏡對prec細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)分析(圖27a)和brdu摻入測定證明hc-ha/ptx3對prec細(xì)胞具有抗增殖作用。ha不抑制細(xì)胞增殖。在本實(shí)驗(yàn)中，使用的hc-ha/ptx3的最大濃度為25μg/ml。在12.5和25μg/ml hc-ha/ptx3時，o.d.值變?yōu)樨?fù)值，表明孔中沒有細(xì)胞。由于分析過程中的偏差，這些數(shù)據(jù)可能無法表明hc-ha/ptx3暴露的影響。
[0307]
圖27a和27b顯示hc-ha/ptx3以劑量依賴性方式抑制prec細(xì)胞增殖，而hmw-ha(圖27c)對細(xì)胞增殖沒有顯著影響，如通過brdu細(xì)胞增殖檢測試劑盒#6813(cell signaling,usa)檢測。圖27a以兩個放大倍率(10x amp;20x)顯示prec細(xì)胞形態(tài)的明場圖像；圖27b和27c顯示brdu細(xì)胞增殖測定曲線。從學(xué)生t檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)顯著性(p值)。
[0308]
通過明場相差顯微鏡和pnt2細(xì)胞的brdu摻入測定進(jìn)行的細(xì)胞形態(tài)分析證明了hc-ha/ptx3對pnt2細(xì)胞的抗增殖作用。ha不抑制細(xì)胞增殖。通常細(xì)胞聚集生長。隨著hc-ha/ptx3濃度的增加，它抑制細(xì)胞-細(xì)胞粘附(圖28a)。在brdu測定中，由于高標(biāo)準(zhǔn)誤差，未觀察到hc-ha/ptx3的顯著影響(圖28b)。p值大于0.05。brdu數(shù)據(jù)顯示與較早期wst-1數(shù)據(jù)相似。
[0309]
hc-ha/ptx3以劑量依賴性方式抑制pnt2細(xì)胞增殖，而hmw-ha對細(xì)胞增殖沒有顯著影響，如通過brdu細(xì)胞增殖檢測試劑盒#6813(cell signaling,usa)檢測。pnt2細(xì)胞以3.2x103個細(xì)胞/孔接種在96孔板中并孵育過夜。然后用五種濃度的hc-ha/ptx3(1.56、3.13、6.25、12.5 amp;25μg/ml)和兩種濃度的hmw-ha(25 amp;100μg/ml)處理細(xì)胞48小時，一式三份。最后，將10μm brdu添加到孔中，并將細(xì)胞孵育4小時。
[0310]
hc-ha/ptx3，但不是ha，對pc-3前列腺癌細(xì)胞系具有抗增殖作用，如實(shí)施例7中所觀察到的。brdu測定顯示，在25μg/ml濃度下，hc-ha/ptx3顯著抑制pc-3的增殖(p＝0.04)。brdu數(shù)據(jù)顯示與wst-1數(shù)據(jù)相似。
[0311]
hc-ha/ptx3以劑量依賴性方式抑制pc3細(xì)胞增殖，而hmw-ha對細(xì)胞增殖沒有顯著影響，如通過brdu細(xì)胞增殖檢測試劑盒#6813(cell signaling,usa)所檢測。pc3細(xì)胞以3.2x103個細(xì)胞/孔接種在96孔板中并孵育過夜。然后用五種濃度的hc-ha/ptx3(1.56、3.13、6.25、12.5 amp;25μg/ml)和兩種濃度的hmw-ha(25 amp;100μg/ml)處理細(xì)胞48小時，一式三份。最后，將10μm brdu添加到孔中，并將細(xì)胞孵育4小時。圖29a顯示pc3細(xì)胞形態(tài)的明場圖像。圖29b顯示brdu細(xì)胞增殖測定曲線。
[0312]
在hc-ha/ptx3處理下，lncap的細(xì)胞形態(tài)以劑量依賴性方式發(fā)生變化。出人意料的是，盡管lncap是癌細(xì)胞，但它的增殖不如pc-3或pnt2或prec細(xì)胞快。這一觀察結(jié)果在所有細(xì)胞類型的brdu數(shù)據(jù)中得到了很好的證實(shí)。在未經(jīng)處理的情況下，lncap細(xì)胞的o.d.值為0.5，而其余其他細(xì)胞的值為》0.75。有趣的是，對于lncap，即使在高濃度的hc-ha/ptx3下，細(xì)胞仍保持聚集生長，但它們的形態(tài)發(fā)生了變化，因此暗示hc-ha/ptx3對細(xì)胞-基質(zhì)附著而不是細(xì)胞-細(xì)胞粘附的影響更多。hc-ha/ptx3濃度為3.13和12.5μg/ml以及ha為100μg/ml時的高標(biāo)準(zhǔn)誤差代表錯誤的圖。由于空白樣品中的移液錯誤，在25μg/ml hc-ha/ptx3時的o.d.值是負(fù)的(參見圖30a)。可以在對象孔中觀察到足夠的細(xì)胞(參見圖30b)。
[0313]
hc-ha/ptx3以劑量依賴性方式抑制lncap細(xì)胞增殖，而hmw-ha對細(xì)胞增殖沒有顯著影響，如通過brdu細(xì)胞增殖檢測試劑盒#6813(cell signaling,usa)檢測。lncap細(xì)胞以3.2x103個細(xì)胞/孔接種在96孔板中并孵育過夜。然后用五種濃度的hc-ha/ptx3(1.56、3.13、6.25、12.5 amp;25μg/ml)和兩種濃度的hmw-ha(25 amp;100μg/ml)處理細(xì)胞48小時，一式三
份。最后，將10μm brdu添加到孔中，并將細(xì)胞孵育4小時。圖30a顯示lncap細(xì)胞形態(tài)的明場圖像。圖30b顯示brdu細(xì)胞增殖測定曲線。
[0314]
對四種類型的前列腺上皮細(xì)胞/細(xì)胞系(正常和癌癥)的brdu測定表明hc-ha/ptx3，而非hmw-ha，以劑量依賴性方式抑制細(xì)胞增殖。由于技術(shù)錯誤，prec和lncap的結(jié)果反映的印象與wst-1測定數(shù)據(jù)中觀察到的不同。然而，相應(yīng)的細(xì)胞形態(tài)圖像支持hc-ha/ptx3和ha對前列腺細(xì)胞的影響與先前實(shí)驗(yàn)中觀察到的相似。
[0315]
雖然已經(jīng)示出和在本文描述了優(yōu)選的實(shí)施方案，但是對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的是，僅通過舉例的方式來提供這樣的實(shí)施方案。現(xiàn)在可能會發(fā)生許多改變、變化和替換。應(yīng)當(dāng)理解，在實(shí)施所描述的方法中可以采用對本文描述的實(shí)施方案的各種替代方案。所附權(quán)利要求旨在限定實(shí)施方案的范圍，并且由此覆蓋這些權(quán)利要求范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)及其等同物。