一種轉錄組文庫的建庫方法及其應用與流程
1.本發明屬于基因測序領域，具體涉及一種轉錄組文庫的建庫方法及其應用。
背景技術：
2.轉錄組文庫有助于知悉轉錄物的集合，需要對逆轉錄成的cdna進行擴增后才能建庫。
3.目前的擴增方案主要分為兩類: 1. 基于pcr指數擴增技術：該技術要求cdna模板兩端都有通用引物序列，在smart-seq、seqwell、drop-seq、strt-seq、scrb-seq、10
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genomics以及microwell-seq等方案中通用引物序列是通過模板轉換作用獲得；在quartz-seq和matq-seq中是先通過末端轉移酶tdt在所有cdna末端添加相同重復堿基后以該重復堿基為延伸位置從而獲得通用引物序列；在bd rhapsody和seekone
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mm單細胞rna-seq技術方案中通過攜帶有通用序列的隨機引物進行二鏈合成獲得通用引物序列；2. 基于體外線性轉錄技術：在mars-seq、cell-seq和indrop等技術方案中需要將cdna合成二鏈后轉錄為大量的rna，然后將倍增的rna連接單鏈接頭后逆轉錄為dna進一步pcr擴增。在這些cdna擴增方案中模板轉換方案較為方便快捷，但其模板轉換效率只有20-60%，而且模板轉換效率嚴重依賴與rna 5’帽子結構，因此一條rna平均發生一次模板轉換，這極大的限制了使用二代測序對rna全長序列的分析，例如10
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genomics只能檢測單細胞rna的3’或者5’序列；體外線性轉錄技術和tdt技術方案雖然能實現對rna全長序列的分析，但其實驗流程復雜，時間浪費嚴重。更復雜的是，無論通過pcr指數擴增還是體外轉錄線性擴增最后得到的dna擴增產物還需要進一步的打斷、接頭連接與index擴增，整個流程最快也需要8小時才能完成，因此需要更加快速的而且能夠用于rna全長序列分析的高效率cdna擴增和建庫方案。
技術實現要素：
4.本發明提供一種轉錄組文庫的建庫方法及其應用，旨在提供一種快速的建庫方案。
5.為達到上述目的，本發明提供一種轉錄組文庫構建方法，包括以下步驟：步驟s1:提供待檢測rna反應體系，所述待檢測rna反應體系含有待檢測rna；步驟s2:采用步驟a)或步驟b)中的任一方式獲取雙鏈產物：步驟a)：采用逆轉錄引物對所述待檢測rna進行逆轉錄反應，得到mrna/cdna雜合鏈即為所述雙鏈產物，所述逆轉錄引物依次包含通用引物序列以及逆轉錄序列，所述逆轉錄序列可與所述待檢測rna結合進行逆轉錄，所述通用引物序列用以在cdna的一端引入引物結合位點；步驟b)：采用逆轉錄引物對所述待檢測rna進行逆轉錄反應，得到mrna/cdna雜合鏈，再以所述mrna/cdna雜合鏈中的cdna為模板進行二鏈合成，得到所述雙鏈產物，所述逆轉錄引物依次包含通用引物序列以及逆轉錄序列，所述逆轉錄序列可與所述待檢測rna結合進行逆轉錄，所述通用引物序列用以在cdna的一端引入引物結合位點；
步驟s3:采用含有相同兩個接頭的轉座酶對所述雙鏈產物進行切割，得到片段化的雙鏈產物；步驟s4:采用pcr體系與所述片段化的雙鏈產物反應，得到轉錄組文庫；其中，所述pcr體系包含擴增酶及擴增引物，所述擴增酶具有鏈替代活性，所述擴增引物包含第一引物與第二引物，所述第一引物包含與所述通用引物序列相同的引物結合序列，所述第二引物包含與所述接頭序列相同的接頭結合序列，且所述第一引物和/或所述第二引物還包含文庫標簽。
6.可選地，所述待檢測rna反應體系為含有所述待檢測rna的懸液或含有所述待檢測rna的細胞懸液。
7.可選地，所述逆轉錄序列為固定序列、隨機序列或者半隨機序列；和/或，所述第一引物還包含第一接頭測序接頭序列，所述第一接頭測序接頭序列與所述引物結合序列連接；和/或，所述第二引物還包含第二接頭測序接頭序列，所述第二接頭測序接頭序列與所述接頭結合序列連接。
8.此外，本發明提供一種單細胞轉錄組文庫構建方法，包括以下步驟：步驟s1:提供多個單細胞的待檢測rna體系，各所述單細胞的待檢測rna體系含有單細胞的待檢測rna；步驟s2:采用步驟a)或步驟b)中的任一方式獲取雙鏈產物：步驟a)：采用多組逆轉錄引物對多個單細胞的所述待檢測rna體系一一對應進行逆轉錄反應，得到mrna/cdna雜合鏈即為所述雙鏈產物，各組所述逆轉錄引物包含多條逆轉錄引物，各所述逆轉錄引物依次包含通用引物序列、細胞標簽以及逆轉錄序列，所述逆轉錄序列可與所述待檢測rna結合進行逆轉錄，所述通用引物序列用以在cdna的一端引入引物結合位點，同一組的所述多條逆轉錄引物含有的細胞標簽相同，不同組的所述多條逆轉錄引物含有的細胞標簽不同；步驟b)：采用多組逆轉錄引物對多個單細胞的所述待檢測rna體系一一對應進行逆轉錄反應，得到mrna/cdna雜合鏈，再以所述mrna/cdna雜合鏈中的cdna為模板進行二鏈合成，得到所述雙鏈產物，各組所述逆轉錄引物包含多條逆轉錄引物，各所述逆轉錄引物依次包含通用引物序列、細胞標簽以及逆轉錄序列，所述逆轉錄序列可與所述待檢測rna結合進行逆轉錄，所述通用引物序列用以在cdna的一端引入引物結合位點，同一組的所述多條逆轉錄引物含有的細胞標簽相同，不同組的所述多條逆轉錄引物含有的細胞標簽不同；步驟s3:采用含有相同兩個接頭的轉座酶對所述雙鏈產物進行切割，得到片段化的雙鏈產物；步驟s4:采用pcr體系與所述片段化的雙鏈產物反應，得到轉錄組文庫；其中，所述pcr體系包含擴增酶及擴增引物，所述擴增酶具有鏈替代活性，所述擴增引物包含第一引物與第二引物，所述第一引物包含與所述通用引物序列相同的引物結合序列，所述第二引物包含與所述接頭序列相同的接頭結合序列，且所述第一引物和/或所述第二引物還包含文庫標簽。
9.可選地，所述步驟s1包括：各所述單細胞的待檢測rna體系為含有一個單細胞的待檢測rna的油包水體系或
含有一個單細胞的待檢測rna的微孔體系。
10.可選地，所述步驟s2中，各所述逆轉錄引物還包含分子標簽，所述分子標簽與所述細胞標簽連接，且所述多條逆轉錄引物的分子標簽不同。
11.此外，本發明提供一種單細胞轉錄組文庫構建方法，包括以下步驟：步驟s1:提供多個單細胞的待檢測rna體系，各所述單細胞的待檢測rna體系含有單細胞的待檢測rna；步驟s2:采用步驟a)或步驟b)中的任一方式獲取雙鏈產物：步驟a)：采用多組逆轉錄引物對多個單細胞的所述待檢測rna體系一一對應進行逆轉錄反應，得到mrna/cdna雜合鏈即為所述雙鏈產物，各組所述逆轉錄引物包含多條逆轉錄引物，各所述逆轉錄引物依次包含通用引物序列以及逆轉錄序列，所述逆轉錄序列可與所述待檢測rna結合進行逆轉錄，所述通用引物序列用以在cdna的一端引入引物結合位點；步驟b)：采用多組逆轉錄引物對多個單細胞的所述待檢測rna體系一一對應進行逆轉錄反應，得到mrna/cdna雜合鏈，再以所述mrna/cdna雜合鏈中的cdna為模板進行二鏈合成，得到所述雙鏈產物，各組所述逆轉錄引物包含多條逆轉錄引物，各所述逆轉錄引物依次包含通用引物序列以及逆轉錄序列，所述逆轉錄序列可與所述待檢測rna結合進行逆轉錄，所述通用引物序列用以在cdna的一端引入引物結合位點；步驟s3:采用含有相同兩個接頭的轉座酶對所述雙鏈產物進行切割，得到多個單細胞的片段化的雙鏈產物；步驟s4:提供多組標簽體，將多組所述標簽體與多個所述單細胞的片段化的雙鏈產物一一對應進行連接反應，得到多個標記的單細胞的片段化的雙鏈產物，其中，每組標簽體含有多個標簽，各所述標簽依次包含引物結合序列1、細胞標簽和連接接頭，所述連接接頭可與所述接頭連接，且不同組的多個所述標簽的所述細胞標簽不同，同一組的多個所述標簽的所述細胞標簽相同；步驟s5:采用pcr體系與所述片段化的雙鏈產物反應，得到單細胞轉錄組文庫；其中，所述pcr體系包含擴增酶及擴增引物，所述擴增酶具有鏈替代活性，所述擴增引物包含第一引物與第二引物，所述第一引物包含與所述引物結合序列1相同的序列，所述第二引物包含與通用引物序列相同的序列，且所述第一引物和/或所述第二引物還包含文庫標簽。
12.可選地，各所述逆轉錄引物還包含分子標簽，所述分子標簽連接于所述通用引物序列以及逆轉錄序列之間，多條所述逆轉錄引物的所述分子標簽不同；或，各所述標簽還可包含分子標簽，所述分子標簽連接于所述細胞標簽和連接接頭之間，多條所述標簽的所述分子標簽不同。
13.可選地，多個所述單細胞中，至少包含來源于兩個樣品的單細胞，各所述逆轉錄引物還包含樣品標簽，所述樣品標簽連接于所述通用引物序列以及逆轉錄序列之間，多組所述逆轉錄引物中，與來源于同一樣品的多個單細胞的所述待檢測rna體系進行所述逆轉錄反應的所述逆轉錄引物的所述樣品標簽相同，與來源于不同樣品的多個單細胞的所述待檢測rna體系進行所述逆轉錄反應的所述逆轉錄引物的所述樣品標簽不同。
14.此外，本發明還提供一種測序方法，包括以下步驟：步驟a10:采用上述轉錄組文庫構建方法、采用上述任一單細胞轉錄組文庫構建方法構建測序文庫；
步驟a20:使用測序平臺對所述測序文庫進行測序。
15.本發明中，通過使用含有通用引物序列和逆轉錄序列的引物進行逆轉錄，采用含相同雙接頭的轉座酶進行切割并引入接頭序列，對切割后的雙鏈產物進行擴增，獲得轉錄組文庫。本發明建庫簡便、快速，不僅減少rna建庫時間，同時還能夠分析rna全長序列。
附圖說明
16.為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅為本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他相關的附圖。
17.圖1為本發明一實施例流程示意圖；圖2為本發明使用的細胞標簽微珠上的逆轉錄引物結構示意圖；圖3為本發明轉座子與普通轉座子結構對比的示意圖；圖4為本發明單細胞轉錄文庫的構建一實施例原理示意圖；圖5為本發明單細胞轉錄文庫的構建又一實施例原理示意圖；圖6為實施例1構建成功的3’單細胞rna測序文庫質控；圖7為單細胞文庫的測序策略；圖8為實施例2構建成功的固定單細胞文庫質控。
18.圖9為實施例3構建成功的固定混樣單細胞文庫質控。
19.本發明目的的實現、功能特點及優點將結合實施例，參照附圖做進一步說明。
具體實施方式
20.為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實施例僅僅是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例。
21.需要說明的是，實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。另外，全文中出現的“和/或”的含義，包括三個并列的方案，以“a和/或b”為例，包括a方案、或b方案、或a和b同時滿足的方案。此外，各個實施例之間的技術方案可以相互結合，但是必須是以本領域普通技術人員能夠實現為基礎，當技術方案的結合出現相互矛盾或無法實現時應當認為這種技術方案的結合不存在，也不在本發明要求的保護范圍之內。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
22.鑒于現有的轉錄組建庫流程復雜，效率低下的問題，本發明提供本發明提供一種轉錄組文庫構建方法，參見圖1，包括以下步驟：步驟s1:提供待檢測rna反應體系，所述待檢測rna反應體系含有待檢測rna；步驟s2:采用步驟a)或步驟b)中的任一方式獲取雙鏈產物：步驟a):采用逆轉錄引物對所述待檢測rna進行逆轉錄反應，得到mrna/cdna雜合鏈即為所述雙鏈產物，所述逆轉錄引物依次包含通用引物序列以及逆轉錄序列，所述逆轉
錄序列可與所述待檢測rna結合進行逆轉錄，所述通用引物序列用以在cdna的一端引入引物結合位點；步驟b):采用逆轉錄引物對所述待檢測rna進行逆轉錄反應，得到mrna/cdna雜合鏈，再以所述mrna/cdna雜合鏈中的cdna為模板進行二鏈合成，得到所述雙鏈產物，所述逆轉錄引物依次包含通用引物序列以及逆轉錄序列，所述逆轉錄序列可與所述待檢測rna結合進行逆轉錄，所述通用引物序列用以在cdna的一端引入引物結合位點；步驟s3:采用含有相同兩個接頭的轉座酶對所述雙鏈產物進行切割，得到片段化的雙鏈產物；步驟s4:采用pcr體系與所述片段化的雙鏈產物反應，得到轉錄組文庫；其中，所述pcr體系包含擴增酶及擴增引物，所述擴增酶具有鏈替代活性，所述擴增引物包含第一引物與第二引物，所述第一引物包含與所述通用引物序列相同的引物結合序列，所述第二引物包含與所述接頭序列相同的接頭結合序列，且所述第一引物和/或所述第二引物還包含文庫標簽。
23.本發明中，通過使用含有通用引物序列和逆轉錄序列的引物進行逆轉錄，采用含相同雙接頭的轉座酶進行切割并引入接頭序列，對切割后的雙鏈產物進行擴增，獲得轉錄組文庫。本發明建庫簡便、快速，不僅減少rna建庫時間，同時還能夠分析rna全長序列。
24.需要說明的是，在所述步驟s1中，可根據具體情況選擇對應的反應體系，在一些實施例中，所述待檢測rna反應體系為含有所述待檢測rna的懸液或含有所述待檢測rna的細胞懸液，所述細胞懸液可以是新鮮細胞也可以是固定透化細胞。
25.需要說明的是，本發明說明的固定透化細胞是將待檢測細胞先進行固定處理，使其rna固定于細胞內，避免其向細胞外擴散，導致rna損失及細胞污染；后經透化處理，細胞膜通透性增強，便于試劑的進入。
26.具體地，在一些實施例中，含有所述待檢測rna的固定透化細胞的包括以下制備步驟：將單細胞采用固定液進行固定后，采用透化試劑進行處理，得到所述固定透化細胞。
27.所述固定液包含交聯性質的甲醛、多聚甲醛固定、非交聯性質的醇類、酸類中的至少一種，所述透化試劑包含活性表面物質。
28.需要說明的是，在所述步驟s2中，由于轉座酶的切割對象是雙鏈產物，因此，在可以構建雙鏈產物的前提下，可以根據實際檢測需要選擇所述步驟s2中（a）或（b）中的任意方式獲取雙鏈產物，選取步驟（a）獲取方式更為簡單，測序時間進一步縮短，而選擇（b）由于最終產物為雙鏈dna，結構更加穩定，更加易于長時間的保存。
29.在一些實施例中，所述逆轉錄序列可根據需要選擇，例如，在對于真核生物，所述逆轉錄序列可以選取固定序列、隨機序列或半隨機序列；當設計成固定序列時，可以逆轉錄出靶向序列，當固定序列可為oligo-（dt）n序列，n的數量在10~100之間時，可對含有polya的序列進行測序；例如，也可設計成隨機序列或半隨機序列，可實現基因全序列檢測。
30.在一些實施例中，所述逆轉錄引物可負載在一個負載體上，參見圖2，可以理解的是，所述通用引物序列與所述負載體連接，并所述通用引物序列與所述負載體可在特定條件下斷裂，以此保證所述逆轉錄序列與rna結合進行逆轉錄。具體地，在靠近所述通用引物
序列端部設計一個斷點與所述通用引物序列連接，所述斷點可為pc linker等等。
31.參見圖3中的a，常規轉座酶包埋的兩種不同接頭，經該轉座酶切割后，會引入兩個不同的接頭，在本發明的單細胞轉錄組中使用常規轉座酶的結果是在測序文庫中會存在部分不完整的單細胞轉錄組文庫，影響測序產出及測序基因數等指標。而在本發明步驟s3中，采用含有相同接頭的轉座酶(圖3中的b或c)，最終會實現只在其中一端引入接頭，而另一端的接頭由逆轉錄引物引入，則可避免上述問題的發生。在一些實施例中，所述轉座酶為含有相同雙接頭的t5轉座酶。
32.需要說明的是，在所述步驟s4中：所述第一引物還包含第一接頭測序接頭序列，所述第一接頭測序接頭序列與所述引物結合序列連接；所述通用引物序列、引物結合序列以及第一測序接頭序列可以根據測序需要進行設計；所述通用引物序列可以包含read1 sequence primer的全部或部分序列；所述引物結合序列包含與通用引物序列相同的序列；所述第一測序接頭序列設計成為illumina測序平臺可識別的p5序列。
33.當所述第一引物含有文庫標簽時，所述文庫標簽設于所述第一接頭測序接頭序列與所述引物結合序列之間。
34.所述第二引物還包含第二接頭測序接頭序列，所述第二接頭測序接頭序列與所述接頭結合序列連接。可以理解的是，接頭結合序列、接頭以及第二測序接頭序列可以根據測序需要進行設計，例如，所述接頭包含read2 sequence primer的全部或部分序列，用以cdna的另一端引入引物結合位點；所述接頭結合序列包含與所述接頭序列相同的序列。所述第二測序接頭序列可以設計成illumina測序平臺可識別的p7序列。
35.當所述第二引物含有文庫標簽時，所述文庫標簽設于所述第二接頭測序接頭序列與所述接頭結合序列之間。
36.在一些實施例中，所述步驟s4包括：步驟s401:采用擴增引物對片段化的雙鏈產物進行擴增；步驟s402:進行片段分選，得到得到長度合適的轉錄組文庫。
37.鑒于現有的單細胞轉錄組檢測靈敏度低及建庫過程繁瑣等問題，本發明將上述轉錄組文庫構建方法應用于單細胞轉錄組文庫的構建，為此，本發明一種單細胞轉錄組文庫構建方法，參見圖4，包括以下步驟：步驟s1:提供多個單細胞的待檢測rna體系，各所述單細胞的待檢測rna體系含有單細胞的待檢測rna；步驟s2:采用步驟a)或步驟b)中的任一方式獲取雙鏈產物：步驟a)：采用多組逆轉錄引物對多個單細胞的所述待檢測rna體系一一對應進行逆轉錄反應，得到mrna/cdna雜合鏈即為所述雙鏈產物，各組所述逆轉錄引物包含多條逆轉錄引物，各所述逆轉錄引物依次包含通用引物序列、細胞標簽以及逆轉錄序列，所述逆轉錄序列可與所述待檢測rna結合進行逆轉錄，所述通用引物序列用以在cdna的一端引入引物結合位點，同一組的所述多條逆轉錄引物含有的細胞標簽相同，不同組的所述多條逆轉錄引物含有的細胞標簽不同；步驟b)：采用多組逆轉錄引物對多個單細胞的所述待檢測rna體系一一對應進行逆轉錄反應，得到mrna/cdna雜合鏈，再以所述mrna/cdna雜合鏈中的cdna為模板進行二鏈
合成，得到所述雙鏈產物，各組所述逆轉錄引物包含多條逆轉錄引物，各所述逆轉錄引物依次包含通用引物序列、細胞標簽以及逆轉錄序列，所述逆轉錄序列可與所述待檢測rna結合進行逆轉錄，所述通用引物序列用以在cdna的一端引入引物結合位點，同一組的所述多條逆轉錄引物含有的細胞標簽相同，不同組的所述多條逆轉錄引物含有的細胞標簽不同；步驟s3:采用含有相同兩個接頭的轉座酶對所述雙鏈產物進行切割，得到片段化的雙鏈產物；步驟s4:采用pcr體系與所述片段化的雙鏈產物反應，得到轉錄組文庫；其中，所述pcr體系包含擴增酶以及擴增引物，所述擴增酶具有鏈替代活性，所述擴增引物包含第一引物與第二引物，所述第一引物包含與所述通用引物序列相同的引物結合序列，所述第二引物包含與所述接頭序列相同的接頭結合序列，所述接頭結合序列包含與所述接頭序列相同的序列，且所述第一引物和/或所述第二引物還包含文庫標簽。
38.本發明中，通過使用含有通用引物序列和逆轉錄序列的引物進行逆轉錄，采用含相同雙接頭的轉座酶進行切割并引入接頭序列，對切割后的雙鏈產物進行擴增，獲得轉錄組文庫。本發明建庫簡便、快速，不僅減少rna建庫時間，同時還能夠分析rna全長序列。
39.需要說明的是，在所述步驟s1中，可根據具體情況選擇對應的反應體系，在一些實施例中，所述待檢測rna反應體系為含有所述待檢測rna的懸液或含有所述待檢測rna的細胞懸液，所述細胞懸液可以是新鮮細胞也可以是固定透化細胞。
40.需要說明的是，本發明說明的固定透化細胞是將待檢測細胞先進行固定處理，使其rna固定于細胞內，避免其向細胞外擴散，導致rna損失及細胞污染；后經透化處理，細胞膜通透性增強，便于試劑的進入。
41.具體地，在一些實施例中，含有所述待檢測rna的固定透化細胞的包括以下制備步驟：將單細胞采用固定液進行固定后，采用透化試劑進行處理，得到所述固定透化細胞。
42.所述固定液包含交聯性質的甲醛、多聚甲醛固定、非交聯性質的醇類、酸類中的至少一種，所述透化試劑包含活性表面物質。
43.需要說明的是，在所述步驟s2中，由于轉座酶的切割對象是雙鏈產物，因此，在可以構建雙鏈產物的前提下，可以根據實際檢測需要選擇所述步驟s2中（a）或（b）中的任意方式獲取雙鏈產物，選取步驟（a）獲取方式更為簡單，測序時間進一步縮短，而選擇（b）由于最終產物為雙鏈dna，結構更加穩定，更加易于長時間的保存。
44.在一些實施例中，所述逆轉錄序列可根據需要選擇，例如，在對于真核生物，所述逆轉錄系列可以選取固定序列、隨機序列或半隨機序列；當設計成固定序列時，可以逆轉錄出靶向序列，當固定序列可為oligo-（dt）n序列，n的數量在10~100之間時，可對含有polya的序列進行測序；例如，也可設計成隨機序列或半隨機序列，可實現基因全序列檢測。
45.在一些實施例中，所述逆轉錄引物可負載在一個負載體上，參見圖2，可以理解的是，所述通用引物序列與所述負載體連接，并所述通用引物序列與所述負載體可在特定條件下斷裂，以此保證所述逆轉錄序列與rna結合進行逆轉錄。具體地，在靠近所述通用引物序列端部設計一個斷點與所述通用引物序列連接，所述斷點可為pc linker等等。
46.參見圖3中的a，常規轉座酶包埋的兩種不同接頭，經該轉座酶切割后，會引入兩個
不同的接頭，在本發明的單細胞轉錄組中使用常規轉座酶的結果是在測序文庫中會存在部分不完整的單細胞轉錄組文庫，影響測序產出及測序基因數等指標。而在本發明步驟s3中，采用含有相同接頭的轉座酶(圖3中的b或c)，最終會實現只在其中一端引入接頭，而另一端的接頭由逆轉錄引物引入，則可避免上述問題的發生。在一些實施例中，所述轉座酶為含有相同雙接頭的t5轉座酶。
47.需要說明的是，在所述步驟s4中：所述第一引物還包含第一接頭測序接頭序列，所述第一接頭測序接頭序列與所述引物結合序列連接；所述通用引物序列、引物結合序列以及第一測序接頭序列可以根據測序需要進行設計；所述通用引物序列可以包含read1 sequence primer的全部或部分序列；所述引物結合序列包含與通用引物序列相同的序列；所述第一測序接頭序列設計成為illumina測序平臺可識別的p5序列。
48.當所述第一引物含有文庫標簽時，所述文庫標簽設于所述第一接頭測序接頭序列與所述引物結合序列之間。
49.所述第二引物還包含第二接頭測序接頭序列，所述第二接頭測序接頭序列與所述接頭結合序列連接。可以理解的是，接頭結合序列、接頭以及第二測序接頭序列可以根據測序需要進行設計，例如，所述接頭包含read2 sequence primer的全部或部分序列，用以cdna的另一端引入引物結合位點；所述接頭結合序列包含與所述接頭序列相同的序列。所述第二測序接頭序列可以設計成illumina測序平臺可識別的p7序列。
50.當所述第二引物含有文庫標簽時，所述文庫標簽設于所述第二接頭測序接頭序列與所述接頭結合序列之間。
51.在一些實施例中，使用pcr擴增酶或者包含有鏈替代活性的多聚酶進行所述擴增。在酶的作用下在反應過程中形成完整的雙鏈結構。
52.在一些實施例中，所述步驟s4包括：步驟s401:采用擴增引物對片段化的雙鏈產物進行擴增；步驟s402:進行片段分選，得到得到長度合適的轉錄組文庫。
53.此外，本發明還提供了單細胞轉錄組文庫另一種構建方法，參見圖5，包括以下步驟：步驟s1:提供多個單細胞的待檢測rna體系，各所述單細胞的待檢測rna體系含有單細胞的待檢測rna；步驟s2:采用步驟a)或步驟b)中的任一方式獲取雙鏈產物：步驟a)：采用多組逆轉錄引物對多個單細胞的所述待檢測rna體系一一對應進行逆轉錄反應，得到mrna/cdna雜合鏈即為所述雙鏈產物，各組所述逆轉錄引物包含多條逆轉錄引物，各所述逆轉錄引物依次包含通用引物序列以及逆轉錄序列，所述逆轉錄序列可與所述待檢測rna結合進行逆轉錄，所述通用引物序列用以在cdna的一端引入引物結合位點；步驟b)：采用多組逆轉錄引物對多個單細胞的所述待檢測rna體系一一對應進行逆轉錄反應，得到mrna/cdna雜合鏈，再以所述mrna/cdna雜合鏈中的cdna為模板進行二鏈合成，得到所述雙鏈產物，各組所述逆轉錄引物包含多條逆轉錄引物，各所述逆轉錄引物依次包含通用引物序列以及逆轉錄序列，所述逆轉錄序列可與所述待檢測rna結合進行逆轉錄，所述通用引物序列用以在cdna的一端引入引物結合位點；
步驟s3:采用含有相同兩個接頭的轉座酶對所述雙鏈產物進行切割，得到多個單細胞的片段化的雙鏈產物；步驟s4:提供多組標簽體，將多組所述標簽體與多個所述單細胞的片段化的雙鏈產物一一對應進行連接反應，得到多個標記的單細胞的片段化的雙鏈產物，其中，每組標簽體含有多個標簽，各所述標簽依次包含引物結合序列1、細胞標簽和連接接頭，所述連接接頭可與所述接頭連接，且不同組的多個所述標簽的所述細胞標簽不同，同一組的多個所述標簽的所述細胞標簽相同；步驟s5:采用pcr體系與所述片段化的雙鏈產物反應，得到單細胞轉錄組文庫；其中，所述pcr體系包含擴增酶及擴增引物，所述擴增酶具有鏈替代活性，所述擴增引物包含第一引物與第二引物，所述第一引物包含與所述引物結合序列1相同的序列，所述第二引物包含與通用引物序列相同的引物結合序列2，且所述第一引物和/或所述第二引物還包含文庫標簽。
54.需要說明的是，在所述步驟s1中，可根據具體情況選擇對應的反應體系，在一些實施例中，所述待檢測rna反應體系為含有所述待檢測rna的細胞懸液或含有所述待檢測rna的固定透化細胞。
55.需要說明的是，本發明說明的固定透化細胞是將待檢測細胞先進行固定透化處理后，使其rna固定于細胞內，避免其向細胞外擴散，導致rna損失及細胞污染；后經透化處理，細胞膜通透性增強，便于試劑的進入。
56.需要說明的是的，單細胞建庫時，需要對單細胞進行隔離，使其避免污染，具體地，在一些實施例中，所述步驟s1包括：各所述單細胞的待檢測rna體系為含有一個單細胞rna的油包水體系或含有一個單細胞rna的微孔體系。進一步地，當集成多個隔離的單細胞體系時，可以進行高通量的單細胞建庫，例如微流控芯片等等。
57.在一些實施例中，所述步驟s2中，各所述逆轉錄引物還包含分子標簽，所述分子標簽連接于所述通用引物序列以及逆轉錄序列之間，多條所述逆轉錄引物的所述分子標簽不同。通過引入分子標簽，可以分辨每條測序序列。
58.當然，分子標簽還可以通過標簽引入，具體地，在一些實施例中，各所述標簽還可包含分子標簽，所述分子標簽連接于所述細胞標簽和連接接頭之間，多條所述標簽的所述分子標簽不同。
59.在一些實施例中，所述逆轉錄引物可負載在一個負載體上，參見圖2，可以理解的是，所述通用引物序列與所述負載體連接，并所述通用引物序列與所述負載體可在特定條件下斷裂，以此保證所述逆轉錄序列與rna結合進行逆轉錄。
60.具體地，在靠近所述通用引物序列端部設計一個斷點與所述通用引物序列連接，所述斷點可為pc linker等等。
61.需要說明的是，由于轉座酶的切割對象是雙鏈產物，因此，在可以構建雙鏈產物的前提下，可以根據實際檢測需要選擇所述步驟s2中（a）或（b）中的任意方式獲取雙鏈產物，選取步驟（a）獲取方式更為簡單，實驗操作時間進一步縮短，而選擇（b）由于最終產物為雙鏈dna，結構更加穩定，更加易于長時間的保存。
62.在一些實施例中，所述逆轉錄序列可根據需要選擇，例如，在對于真核生物，所述逆轉錄系列可以選取固定序列、隨機序列或半隨機序列；當設計成固定序列時，可以逆轉錄
出靶向序列，當固定序列可為oligo-（dt）n序列，n的數量在10~100之間時，可對含有polya的序列進行測序；例如，也可設計成隨機序列或半隨機序列，可實現基因全序列檢測。
63.在一些實施例中，多個所述單細胞中，至少包含來源于兩個樣品的單細胞，各所述逆轉錄引物還包含樣品標簽，所述樣品標簽連接于所述通用引物序列以及逆轉錄序列之間，多組所述逆轉錄引物中，與來源于同一樣品的多個單細胞的所述待檢測rna體系進行所述逆轉錄反應的所述逆轉錄引物的所述樣品標簽相同，與來源于不同樣品的多個單細胞的所述待檢測rna體系進行所述逆轉錄反應的所述逆轉錄引物的所述樣品標簽不同。
64.參見圖3中的a，常規轉座酶包埋的兩種不同接頭，經該轉座酶切割后，會引入兩個不同的接頭，在本發明的單細胞轉錄組中使用常規轉座酶的結果是在測序文庫中會存在部分不完整的單細胞轉錄組文庫，影響測序數據量產出及測序基因數等指標。而在本發明步驟s3中，采用含有相同接頭的轉座酶(圖3中的b或c)，最終會實現只在其中一端引入接頭，而另一端的接頭由逆轉錄引物引入，則可避免上述問題的發生。可以理解的是所述通用引物序列與所述連接接頭可根據測序平臺進行設計，所述通用引物序列與所述連接接頭連接后可成為read1 sequence primer序列。在一些實施例中，所述轉座酶為含有相同雙接頭的t5轉座酶。
65.在一些實施例中，所述接頭與所述連接接頭采用介導引物連接，所述介導引物包括第一連接區域與第二連接區域，所述第一連接區域與所述接頭互補，所述第二連接區域與所述連接接頭互補。
66.在一些實施例中，所述步驟s4中，每組標簽體還含有一個微珠，所述微珠與多個所述標簽的所述引物結合序列1連接，且所述連接可在提供一定條件下進行斷裂。具體地，在所述引物結合序列1的一端設計一個斷點，所述斷點與所述微珠連接，所述斷點為pc linker等等。
67.需要說明的是，在所述步驟s5中，在一些實施例中，所述第一引物包含與引物結合序列1相同的序列；可以理解的是引物結合序列1、接頭、連接接頭可根據測序平臺進行設計，接頭以及連接接頭包含read1 sequence primer的全部或部分序列，例如引物結合序列1設計成為illumina測序平臺可識別的p5序列。
68.在一些實施例中，所述第二引物還包含第二接頭測序接頭序列，所述第二接頭測序接頭序列與所述引物結合序列2連接。可以理解的是，引物結合序列2、通用引物序列以及第二測序接頭序列可以根據測序需要進行設計，例如，引物結合序列2、通用引物序列包含read2 sequence primer的全部或部分序列，用以cdna的另一端引入引物結合位點；所述第二測序接頭序列可以設計成illumina測序平臺可識別的p7序列。
69.當所述第二引物含有文庫標簽時，所述文庫標簽設于所述第二接頭測序接頭序列與所述接頭結合序列之間。
70.在一些實施例中，所述步驟s4包括：步驟s401:采用擴增引物對片段化的雙鏈產物進行擴增；步驟s402:進行片段分選，得到得到長度合適的轉錄組文庫。
71.此外，本發明提供一種測序方法，包括以下步驟：步驟a10:采用上述轉錄組文庫構建方法、采用上述任一單細胞轉錄組文庫構建方法構建測序文庫；
步驟a20:使用測序平臺對所述測序文庫進行測序。
72.采用上述建庫方法建庫后，通過測序平臺可對文庫產物進行測序。
73.以下結合具體實施例和附圖對本發明的技術方案作進一步詳細說明，應當理解，以下實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
74.實施例1一、使用含有read2 seqprimer序列的轉座子包埋轉座酶1. 購買高轉座活性的tn5轉座酶（南京諾維贊），該轉座酶可以特異性識別轉座子兩端反向重復的me序列(mosaic end)，形成轉座復合體后無偏好性地將轉座子插入目標序列中；2. 按以下序列合成引物并溶解至10μm的濃度:primera : ctgtctcttatacacatct為me序列的正向序列primerb：gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacag，其中agatgtgtataagagacag為me序列的反向序列，gtctcgtgggctcgg為read2 sequencing primer部分序列；3. 將兩種引物等量混合后按照以下溫度條件退火，命名為rd2n mix：4. 按以下配方將rd2n mix包埋進轉座酶：5. 混勻后置于30℃反應1 h。反應產物命名為tte mix，-30 ~
??
15℃保存。
75.二、構建高通量3’單細胞rna測序文庫1. 抽取外周血并獲得新鮮的pbmc細胞（外周血單核細胞），重懸于pbs中，進行細胞計數，確定單位體積中的細胞個數；
2. 油包水液滴生成及細胞標記2.1試劑準備2.1.1提前將seekone
??
dd 3’單細胞文庫構建試劑盒中的barcoded beads從-80℃中取出，平衡至室溫；具體序列如下：5
’?
ctacacgacgctcttccgatctjjjjjjjjjjjjjjjjjnnnnnnnnnnnntttttttttttttttttttttttttttttt-3’其中，ctacacgacgctcttccgatct為read1 sequencing primer，jjjjjjjjjjjjjjjjj為cell barcode，nnnnnnnnnnnn為分子標簽，tttttttttttttttttttttttttttttt為與mrna中的polya互補配對，其中，每個j和n均選自atcg中的任一堿基。
76.2.1.2按照下表配置反應體系，表中的試劑為北京尋因公司已經市售的seekone
??
dd根據細胞濃度計算細胞數為2000時的上樣體積（μl）和補加nuclease-free water體積（μl），先加入相應的nuclease-free water至mix吹打混勻后，再加入單細胞懸液（細胞懸液加入前需吹打混勻），共計34.2 μl；最終單細胞混合液總體積為80 μl。
77.2.2 按照seekone
??
dd 3’單細胞文庫構建試劑盒說明書向芯片中加入對應試劑；芯片通道1：吸取78μl步驟2.1中的細胞相試劑，避免產生氣泡；芯片通道2：將室溫平衡好的barcoded beads充分振蕩30 sec，瞬時離心5 sec，確保barcoded beads液體內沒有氣泡，用移液器吸取40 μl，吸頭尖插入對應的孔位底部，緩慢注入，不要產生氣泡；芯片通道3：吸取240μl carrier oil，插入標簽3對應的孔位，緩慢注入，不要產生氣泡；2.3 將gasket掛載于芯片夾具上層，確保gasket孔和芯片孔對齊。
78.2.4 seekone
??
dd儀器運行按照seekone
??
dd 3’單細胞文庫構建試劑盒說明書操作流程將芯片放入seekone
??
dd儀器中，開始運行程序；2.5油包水液滴轉移程序運行結束后，點擊彈出按鈕，取出芯片。使用移液器將對應孔內生成的油包水
轉移至新的0.2ml的pcr管中；2.6逆轉錄將步驟2.5中裝有油包水的pcr管，放入pcr儀中運行下列程序，pcr熱蓋85℃，體積100μl；3. 逆轉錄產物回收3.1 反應結束后，向上述pcr管中加入100μl demulsion agent 試劑，室溫靜置2 min，瞬時離心；3.2 從pcr管底部緩慢吸取120 μl 透明油相丟棄，不要吸到粉紅反應液；3.3 加入180 μl振蕩混勻后的cleanup beads，輕輕緩慢吹打至少15次，室溫孵育10 min；3.4 孵育結束后，將pcr管置于磁力架上吸附至溶液澄清，去除上清；3.5 保持在磁力架上加入300 μl 80%乙醇，約30 sec后去除上清；重復此步驟一次；3.6 瞬時離心，用10 μl移液器去除所有殘留的上清；3.7 室溫靜置2 min使乙醇揮發，加入22.5 μl nuclease-free water充分懸浮磁珠，室溫靜置2 min；3.8 置于磁力架上吸附至溶液澄清，轉移上清22 μl至新的0.2 ml pcr管中。
79.4. 轉座酶打斷4.1 于室溫解凍5
?×?
tagment buffer l，上下顛倒混勻后備用4.2在根據說明書（諾維贊td501）在滅菌pcr管中依次添加各反應組分，混勻后置于pcr儀中50℃反應10min后冷卻至10℃；
4.3 使用1
×?
dna分選磁珠純化得到22.5μl的打斷dna溶液液。
80.5. 鏈替代延伸并擴增文庫5.1 根據說明書（諾維贊td501），按以下體系吹勻后進行擴增以添加文庫接頭和樣本標簽：其中p5 引物和n7引物序列為：5.2 將pcr產物用dna clean beads進行分選得到文庫，文庫大小如圖6所示；5.3 illumina novaseq 6000測序，測序策略如圖7所示。該方案與傳統使用模板轉換方案（10
×?
genomics 3’單細胞轉錄組建庫試劑盒）的流程對比如下表所示，可以明顯看出實驗步驟與所需時間大幅降低。
81.實施例2
一、構建高通量固定單細胞rna測序文庫1. 獲取新鮮培養的k562細胞重懸于pbs中，然后使用4%多聚甲醛溶液固定10min并在0.2%(v/v) triton x-100水溶液中透化細胞膜，洗滌后pbs重懸新細胞，計量細胞濃度；2. 油包水液滴生成及細胞標記2.1試劑準備2.1.1提前將seekone
??
dd 全序列單細胞rna文庫構建試劑盒中的barcoded beads從-80℃中取出，平衡至室溫；2.1.2按照下表配置反應體系根據細胞濃度計算細胞數為2000時的上樣體積（μl）和補加nuclease-free water體積（μl），先加入相應的nuclease-free water至mix吹打混勻后，再加入單細胞懸液（細胞懸液加入前需吹打混勻），共計34.2 μl；最終單細胞混合液總體積為80 μl。注意，與seekone
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dd 3’單細胞文庫構建試劑盒不同，該試劑盒中所用的逆轉錄引物為隨機引物，具體序列如下：5
’?
ctacacgacgctcttccgatctjjjjjjjjjjjjjjjjjnnnnnnnnnnnnttnnn-3’其中，ctacacgacgctcttccgatct為read1 sequencing primer，jjjjjjjjjjjjjjjjj為cell barcode，nnnnnnnnnnnn為分子標簽，ttnnn為逆轉錄序列，可與rna序列隨機結合，其中，每個j和n均選自atcg中的任一堿基。
82.2.2 按照seekone
??
dd 全序列單細胞rna文庫構建試劑盒說明書向芯片中加入對應試劑；芯片通道1：吸取78μl步驟2.1中的細胞相試劑，避免產生氣泡；芯片通道2：將室溫平衡好的barcoded beads充分振蕩30 sec，瞬時離心5 sec，確保barcoded beads液體內沒有氣泡，用移液器吸取40 μl，吸頭尖插入對應的孔位底部，緩慢注入，不要產生氣泡；芯片通道3：吸取240μl carrier oil，插入標簽3對應的孔位，緩慢注入，不要產生氣泡；2.3 將gasket掛載于芯片夾具上層，確保gasket孔和芯片孔對齊。
83.2.4 seekone
??
dd儀器運行按照seekone
??
dd 全序列單細胞rna文庫構建試劑盒說明書操作流程將芯片放
入seekone
??
dd儀器中，開始運行程序；2.5油包水液滴轉移程序運行結束后，點擊彈出按鈕，取出芯片。使用移液器將對應孔內生成的油包水轉移至新的0.2ml的pcr管中；2.6逆轉錄將步驟2.5中裝有油包水的pcr管，放入pcr儀中運行下列程序，pcr熱蓋85℃，體積100μl；3 細胞回收與轉座酶打斷3.1 反應結束后，向上述pcr管中加入100μl demulsion agent 試劑，室溫靜置2 min，瞬時離心；3.2 從pcr管底部緩慢吸取120 μl 透明油相丟棄，不要吸到粉紅反應液；此時逆轉錄后的固定細胞存在于粉紅水相中；3.3 配置轉座酶反應體系根據說明書（諾維贊td501）在滅菌pcr管中依次添加以下各反應組分并混勻：3.4 將粉紅水相轉移至1.5ml離心管，4℃條件下1000g離心5min，小心去除上層上清；重新加入1ml 含有0.1% triton x-100的1x pbs溶液，重復4℃條件下1000g離心5min后完全去除上清；3.5將轉座酶反應體系加入固定細胞中吹打混勻后轉移至pcr管，置于pcr儀中50℃反應10min后冷卻至10℃。
84.3.6 將轉座反應溶液轉移至1.5ml離心管，4℃條件下1000g離心5min，小心去除上
層上清；重新加入1ml含有0.1%(v/v)tritonx-100的1xpbs溶液，重復4℃條件下1000g離心5min后完全去除上清；3.7向管中加入蛋白酶k和2%（v/v）sds，55度反應1h進行解交聯反應；3.8反應結束后，向管中加入1倍體積的dnacleanbeads進行純化，50.5μl雙蒸水洗脫；3.9轉移50ul上清液至新的0.2ml離心管中。
85.4.文庫延伸及擴增4.1根據說明書（諾維贊td501）按以下體系配置擴增反應液：其中p5引物和n7引物序列為：4.2將上述配置好的擴增反應液加入步驟3.9的產物中，按照上表中的擴增程序pcr以添加文庫接頭和樣本標簽；4.3將pcr產物用dnacleanbeads進行分選得到文庫。如圖8所示，文庫片段主峰為230bp，無雜帶；4.4使用illumina測序儀按照圖7所示的測序策略測序，測序數據分析結果如下表所示。
86.在投入2000固定細胞時測序得到1018個細胞數據，細胞捕獲率50.9%。在平均每個細胞測95452條reads的情況下中位細胞的基因數為3123個基因，說明該方案可以較好檢測多聚甲醛固定細胞的單細胞轉錄組。其中有效基因map率低是因為大量核糖體rna被隨機引物逆轉錄導致，可以進一步使用細胞生物學和分子生物技術提高該指標，單純提高這兩個指標不影響本發明的創新性和實用性。
87.實施例3一、使用含有read1 seqprimer序列的轉座子包埋轉座酶1. 購買高轉座活性的tn5轉座酶（南京諾維贊），該轉座酶可以特異性識別轉座子兩端反向重復的me序列(mosaic end)，形成轉座復合體后無偏好性地將轉座子插入目標序列中；2. 按以下序列合成引物并溶解至10μm的濃度:primera : ctgtctcttatacacatct為me序列的正向序列primerc: tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacag，其中agatgtgtataagagacag為me序列的反向序列，tcgtcggcagcgtc為read1 sequencing primer部分序列；2. 將兩種引物等量混合后按照以下溫度條件退火，命名為rd1n mix：
4. 按以下配方將rd1n mix包埋進轉座酶：混勻后置于30℃反應1 h。反應產物命名為tte-1n mix，-30 ~
??
15℃保存。
88.二、構建高通量固定單細胞rna測序文庫1. 獲取新鮮培養的k562細胞（人）重懸于pbs中，然后使用4%多聚甲醛溶液固定10min并在0.2%(v/v) triton x-100水溶液中透化細胞膜，洗滌后pbs重懸細胞，計量細胞濃度；2.獲取新鮮培養的yac（鼠）細胞重懸于pbs中，然后使用4%多聚甲醛溶液固定10min并在0.2%(v/v) triton x-100水溶液中透化細胞膜，洗滌后pbs重懸細胞，計量細胞濃度；3. 逆轉錄反應3.1根據細胞濃度分別計算k562與yac上樣體積（μl）。
89.3.2按照下表配置2個逆轉錄反應體系，表中的試劑為北京尋因公司已經市售的seekone
??
dd試劑盒
3.3按照下述反應程序進行逆轉錄反應。
90.4 細胞回收與轉座酶打斷4.1 反應結束后，將逆轉錄產物分別轉移至1.5ml離心管，做好標記。加入1ml 含有0.1% triton x-100的1x pbs溶液，4℃條件下1000g離心5min，小心去除上層上清；重新加入1ml 含有0.1% triton x-100的1x pbs溶液，重復4℃條件下1000g離心5min后完全去除上清；4.2 配置轉座酶反應體系根據說明書（諾維贊td501）在滅菌pcr管中依次添加以下各反應組分并混勻：
4.3將轉座酶反應體系分別加入步驟4.1的固定細胞中吹打混勻后轉移至pcr管，做好標記，將pcr管置于pcr儀中50℃反應10min后冷卻至10℃。
91.5.細胞回收與連接反應5.1試劑準備提前將barcoded beads從-80℃中取出，平衡至室溫；具體序列如下：5
’?
aatgatacggcgaccaccgagatctacacnnnnnnnnnnnnnnnttgctgt-3’；其中，aatgatacggcgaccaccgagatctacac為引物結合序列1，nnnnnnnnnnnnnnn是細胞標簽，ttgctgt為接頭序列；5.2將步驟4.3反應產物分別轉移至1.5ml離心管，做好標記。加入1ml 含有0.1% triton x-100的1x pbs溶液，4℃條件下1000g離心5min，小心去除上層上清；重新加入1ml 含有0.1% triton x-100的1x pbs溶液，重復4℃條件下1000g離心5min后完全去除上清，pbs重懸細胞，并分別計算k562和yac細胞濃度；5.3按以下體系配置連接反應體系根據細胞濃度計算k562與yac細胞數分別為1000和2000時的上樣體積（μl）和補加nuclease-free water體積（μl），先加入相應的nuclease-free water至連接反應mix吹打混勻后，再加入單細胞懸液（細胞懸液加入前需吹打混勻），共計36μl；最終單細胞連接反應混合液總體積為80 μl。
92.5.4按照seekone
??
dd 3’單細胞文庫構建試劑盒說明書向芯片中加入對應試劑；芯片通道1：吸取78μl步驟5.3中的含細胞的連接試劑，避免產生氣泡；芯片通道2：將室溫平衡好的barcoded beads充分振蕩30 sec，瞬時離心5 sec，確保barcoded beads液體內沒有氣泡，用移液器吸取40 μl，吸頭尖插入對應的孔位底部，緩
慢注入，不要產生氣泡；芯片通道3：吸取240μl carrier oil，插入標簽3對應的孔位，緩慢注入，不要產生氣泡；5.5 將gasket掛載于芯片夾具上層，確保gasket孔和芯片孔對齊。
93.5.6 seekone
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dd儀器運行按照seekone
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dd 3’單細胞文庫構建試劑盒說明書操作流程將芯片放入seekone
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dd儀器中，開始運行程序；5.7 油包水液滴轉移程序運行結束后，點擊彈出按鈕，取出芯片。使用移液器將對應孔內生成的油包水轉移至新的0.2ml的pcr管中；5.8 連接反應將步驟5.7中裝有油包水的pcr管，放入pcr儀中運行下列程序，pcr熱蓋關閉，體積100μl；6 產物回收6.1 反應結束后，向上述pcr管中加入100μl demulsion agent 試劑，室溫靜置2 min，瞬時離心；6.2 從pcr管底部緩慢吸取120 μl 透明油相丟棄，不要吸到上層水相；此時連接后的固定細胞存在于上層水相中；6.3將上層水相溶液轉移至1.5ml離心管，4℃條件下1000g離心5min，小心去除上層上清；重新加入1ml 含有0.1% (v/v)triton x-100的1x pbs溶液，重復4℃條件下1000g離心5min后完全去除上清；6.4向管中加入蛋白酶k和2%（v/v）sds，55度反應1h進行解交聯反應；6.5反應結束后，向管中加入1倍體積的dna clean beads進行純化，30.5μl雙蒸水洗脫；6.6 轉移30ul上清液至新的0.2ml 離心管中。
94.7 文庫延伸及擴增7.1 根據說明書（諾維贊td501）按以下體系配置擴增反應液：
其中p5引物和n7引物序列為：7.2將上述配置好的擴增反應液加入步驟6.6的產物中，按照上表中的擴增程序pcr以添加文庫接頭和文庫標簽；7.3將pcr產物用dnacleanbeads進行分選得到文庫。如圖9所示，文庫片段主峰為268bp；7.4使用illumina測序儀將圖5中的產物測序，測序數據分析結果如下表所示。
95.以上僅為本發明的優選實施例，并非因此限制本發明的專利范圍，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應
包括在本發明的專利保護范圍內。
