一種尿液微量蛋白的富集、純化和保護方法
1.本技術屬于生物化學分析技術領域，具體涉及一種從尿液中富集、純化和保護尿液微量蛋白的方法。
背景技術：
2.尿液由人血漿經腎小球濾過和腎小管重吸收實現人體廢物排出，維持人體各體液的穩態平衡。正常生理狀態時，腎小球過濾膜具有分子篩屏障和電荷屏障的作用；微蛋白的分子量大約為70kd且帶有負電荷，因此不能通過腎小球的保護屏障，尿液中不會出現各種大量微蛋白。病理狀態時，尿液中微量蛋白出現的種類包括：α1-微球蛋白、α2-微球蛋白、β1-微球蛋白、β2-微球蛋白、轉鐵蛋白、iga 蛋白、肌紅蛋白、游離血紅蛋白、igg蛋白、尿白蛋白和視黃醇結合蛋白等；當腎小球分子篩屏障和電荷屏障發生病理改變而使其完整性受到損害，蛋白濾過增加超過腎小管髓袢的重吸收閾值，從而會在尿液中出現各微球蛋白，另外當腎小管的髓袢發生病理改變而使完整性受到損害，導致髓袢蛋白和離子的重吸收發生障礙而尿液中出現各種大量的微蛋白；在劇烈運動或勞累時，腎小球濾過膜具有分子篩屏障和電荷屏障出現非器質性病理改變時，在尿液中會出現血紅蛋白和肌紅蛋白。
3.尿液中蛋白的變化是評價泌尿系統損傷的重要臨床檢驗指標，從尿液中微量蛋白出現的種類不同可推斷出腎臟損傷的部位，如：尿液中α1-微球蛋白出現時，可推斷出腎小球過濾膜出現問題；尿液中 iga蛋白出現時，可推斷出腎小管髓袢損傷后蛋白重吸收出現問題，由此可推斷出腎小管的損傷，因此在尿液檢測中評價尿微量蛋白的變化，可以準確預測腎臟的損傷部位。臨床檢驗中，尿液中成分極為復雜和受飲食影響個體間差異較大，尿液中蛋白是微量同時存在大量非免疫反應蛋白，臨床上尿微量蛋白定量分析時24小時尿液樣本保存過程中，也會出現蛋白的降解或者變性腐敗，造成蛋白樣本與抗體不發生反應，從而導致檢測結果不準確，不能實現早期微量蛋白變化的準確分析，目前，保持尿液樣本中各微量蛋白的穩定是目前臨床上一個急需解決的問題，傳統的保護方法不能解決上述問題。
4.因此，本技術的目的是開發一種及時的尿液微量富集、純化和保護方法，以確保尿液樣本穩定以滿足臨床檢驗的合格樣本要求。
技術實現要素：
5.基于現有技術中存在的不足，本技術旨在提供一種尿液微量蛋白的富集、純化和保護方法。
6.本發明通過以下技術方案實現：一種尿液微量蛋白的富集、純化和保護方法，包括以下步驟：（1）尿液樣品除雜：取尿液樣品進行離心，去除尿液中的殘渣，保留上清液備用；（2）尿液微量蛋白鹽析沉淀：取步驟（1）得到的上清液加入蛋白鹽析沉淀飽和鹽溶液，靜置，得到固液分離的尿液；（3）尿液沉淀樣本離心：取步驟（2）中固液分離的尿液離心，去除上清液，保留離心
管底的沉淀蛋白，備用；（4）尿液微量蛋白重懸：使用去離子蒸餾水對步驟（3）中的沉淀蛋白進行溶解、重懸，移液器吹打混勻，得到重懸液；（5）尿液微量蛋白脫鹽：取步驟（4）重懸液在脫鹽分子篩柱上進行脫鹽過濾；得到脫鹽微量蛋白液；（6）尿液微量蛋白保護：取步驟（5）中的脫鹽微量蛋白液加入蛋白保護劑進行保護處理，即得到待檢測的尿液微量蛋白溶液。
7.其中，步驟（1）中所述的離心溫度為20-25℃，轉速為1500-2000rpm，時間為5-10min；優選地，所述的離心溫度為20-25℃，轉速為1800-2000rpm，時間為8-10min；再優選地，所述的離心溫度為20-25℃，轉速為2000rpm，時間為10min。
8.步驟（1）中所述的離心的目的是去除尿液中的白細胞、紅細胞、鱗狀上皮細胞、非鱗狀上皮細胞、內皮脫落細胞、細菌、透明管型、病理管型、鹽離子結晶等物質，上述物質去除后，可以獲得尿液上清液，離心速度不超過2500rpm，時間不超過20min，避免蛋白沉淀被去除。
9.步驟（2）中所述的蛋白鹽析沉淀飽和鹽溶液選自硫酸銨飽和鹽溶液、氯化銨飽和鹽溶液、氯化鈉飽和鹽溶液和硫酸鈉飽和鹽溶液的一種或多種；優選地，所述的蛋白鹽析沉淀飽和鹽溶液為硫酸銨飽和鹽溶液。
10.本技術所述的鹽析沉淀的主要原理為蛋白質表面的電荷被中和，破壞了其表面的水化膜，于是達到蛋白質沉淀的效果，鹽析沉淀蛋白可以完整保存蛋白活性。
11.步驟（2）中所述的上清液與蛋白鹽析沉淀飽和鹽溶液的體積比為1:2；所述的靜置時間為10min。
12.步驟（3）中所述的離心溫度為2-8℃，轉速為12000-14000rpm，時間為10-20min；優選地，所述的離心溫度為2-8℃，轉速為14000rpm，時間為 10-20min。
13.此條件下離心可以保護蛋白活性，避免蛋白的降解或變性，高速離心可確保上述沉淀蛋白得以全部重回收，最大程度保留尿液微量蛋白成分。
14.步驟（4）中采用去離子水對蛋白進行溶解和重懸，盡可能減少離子基團的引入，并使得蛋白得以復性得到活性蛋白。
15.步驟（5）中所述的分子篩選自交聯羥丙基葡聚糖分子篩sephadex lh-20、4%聚丙烯酰胺分子篩和瓊脂糖分子篩sepharose 6ff的一種或多種；優選為交聯羥丙基葡聚糖分子篩sephadex lh-20。
16.所述的脫鹽過濾的溫度為2-8℃，轉速為30-50rpm，時間為1min。
17.步驟（5）中進行蛋白脫鹽是因為使得蛋白復性需要去除其主要的鹽離子成分，而分子篩的孔狀結構可以最大程度保存溶液中的內水，使得蛋白溶液中的鹽離子等物質得以去除。
18.步驟（6）中所述的蛋白保護劑選自葡萄糖、羥乙基淀粉、eatd-2na、硫酸慶大霉素和bis-tris 的一種或多種；優選的地，所述的蛋白保護劑選自羥乙基淀粉、eatd-2na和bis-tris的混合物。
19.進一步優選地，所述的蛋白保護劑為的濃度比為1.0g/ml：0.001g/ml：0.02g/ml的
羥乙基淀粉、eatd-2na和bis-tris的混合物所述的蛋白保護劑對蛋白進行抗菌、抗氧化、抗降解從而保護尿液微量蛋白的活性，使得蛋白得以長期穩定保存。
20.步驟（6）中所述的脫鹽微量蛋白液與蛋白保護劑的體積比為2:1。
21.與現有技術相比，本技術的有益效果在于：（1）本技術對尿液進行離心除雜處理，控制離心溫度為20-25℃，轉速為1500-2000rpm，時間為5-10min，可以去除尿液中的白細胞、紅細胞、鱗狀上皮細胞、非鱗狀上皮細胞、內皮脫落細胞、細菌、透明管型、病理管型、鹽離子結晶等物質，從而獲得尿液上清液；（2）本技術對除雜后的尿液進行鹽析沉淀，采用硫酸銨飽和鹽溶液、氯化銨飽和鹽溶液、氯化鈉飽和鹽溶液或硫酸鈉飽和鹽溶液進行鹽析，能夠更好的使蛋白質表面的電荷被中和，破壞了其表面的水化膜，達到蛋白質沉淀的效果，鹽析沉淀蛋白可以完整保存蛋白活性；（3）本技術對鹽析沉淀后的尿液進行離心，控制離心溫度為2-8℃，轉速為12000-14000rpm，此條件可以保護蛋白活性，避免蛋白的降解或變性，高速離心可確保上述沉淀蛋白得以全部重回收，最大程度保留尿液微量蛋白成分；（4）本技術對尿液微量蛋白溶液進行脫鹽處理是因為使得蛋白復性需要去除其主要的鹽離子成分，而分子篩，尤其是交聯羥丙基葡聚糖分子篩的孔狀結構可以最大程度保存溶液中的內水，使得蛋白溶液中的鹽離子等物質得以去除。
22.（5）采用本技術提供的方法對尿液微蛋白進行富集、純化保護能夠使蛋白回收率大于99%；且得到保護的尿液微蛋白在37℃的恒溫條件下24小時熱穩定破壞后，蛋白保護劑對微量蛋白的穩定性具備保護效果。
附圖說明
23.圖1為本技術所述的尿液微量蛋白的富集、純化和保護方法流程圖。
具體實施方式
24.下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
25.實施例1一種尿液微量蛋白的富集、純化和保護方法包括以下步驟：（1）尿液樣品除雜：取5-10ml尿液樣品進行離心（溫度：25℃，轉速：2000rpm，時間：10min），去除尿液中的殘渣，保留上清液備用；（2）尿液微量蛋白鹽析沉淀：取步驟（1）得到的上清液1ml，加入硫酸銨飽和鹽溶液2ml，靜置10min，得到固液分離的尿液；（3）尿液沉淀樣本離心：取步驟（2）中固液分離的尿液離心（溫度：4℃，轉速：14000rpm，時間：15min），去除上清液，保留離心管底的沉淀蛋白，備用；（4）尿液微量蛋白重懸：使用200μl去離子蒸餾水對步驟（3）中的沉淀蛋白進行溶
解、重懸，移液器吹打混勻，得到重懸液；（5）尿液微量蛋白脫鹽：取200μl步驟（4）重懸液在交聯羥丙基葡聚糖分子篩（sephadex lh-20）上進行脫鹽過濾（溫度：4℃，轉速：50rpm，時間：1min），得到脫鹽微量蛋白液；（6）尿液微量蛋白保護：取200μl步驟（5）中的脫鹽微量蛋白液加入100μl蛋白保護劑（1.0g/ml羥乙基淀粉、0.001g/ml eatd-2na和0.02g/ml bis-tris）混勻進行保護處理，即得到待檢測的尿液微量蛋白溶液。
26.實施例2一種尿液微量蛋白的富集、純化和保護方法包括以下步驟：（1）尿液樣品除雜：取5-10ml尿液樣品進行離心（溫度：25℃，轉速：1500rpm，時間：10min），去除尿液中的殘渣，保留上清液備用；（2）尿液微量蛋白鹽析沉淀：取步驟（1）得到的上清液1ml，加入硫酸鈉飽和鹽溶液2ml，靜置10min，得到固液分離的尿液；（3）尿液沉淀樣本離心：取步驟（2）中固液分離的尿液離心（溫度：4℃，轉速：14000rpm，時間：15min），去除上清液，保留離心管底的沉淀蛋白，備用；（4）尿液微量蛋白重懸：使用200μl去離子蒸餾水對步驟（3）中的沉淀蛋白進行溶解、重懸，移液器吹打混勻，得到重懸液；（5）尿液微量蛋白脫鹽：取200μl步驟（4）重懸液在瓊脂糖分子篩柱（sepharose 6ff）上進行脫鹽過濾（溫度：4℃，轉速：30rpm，時間：1min），得到脫鹽微量蛋白液；（6）尿液微量蛋白保護：取200μl步驟（5）中的脫鹽微量蛋白液加入100μl蛋白保護劑（1.0g/ml 羥乙基淀粉、0.001g/ml eatd-2na 和 0.02g/ml bis-tris）混勻進行保護處理，即得到待檢測的尿液微量蛋白溶液。
27.實施例3一種尿液微量蛋白的富集、純化和保護方法包括以下步驟：（1）尿液樣品除雜：取5-10ml尿液樣品進行離心（溫度：25℃，轉速：1800rpm，時間：10min），去除尿液中的殘渣，保留上清液備用；（2）尿液微量蛋白鹽析沉淀：取步驟（1）得到的上清液1ml，加入氯化鈉飽和鹽溶液2ml，靜置10min，得到固液分離的尿液；（3）尿液沉淀樣本離心：取步驟（2）中固液分離的尿液離心（溫度：4℃，轉速：14000rpm，時間：15min），去除上清液，保留離心管底的沉淀蛋白，備用；（4）尿液微量蛋白重懸：使用200μl去離子蒸餾水對步驟（3）中的沉淀蛋白進行溶解、重懸，移液器吹打混勻，得到重懸液；（5）尿液微量蛋白脫鹽：取200μl步驟（4）重懸液在聚丙烯酰胺分子篩柱（4%）上進行脫鹽過濾（溫度：4℃，轉速：50rpm，時間：1min），得到脫鹽微量蛋白液；（6）尿液微量蛋白保護：取200μl步驟（5）中的脫鹽微量蛋白液加入100μl蛋白保護劑（1.0g/ml 羥乙基淀粉、0.001g/ml eatd-2na和0.02g/ml bis-tris）混勻進行保護處理，即得到待檢測的尿液微量蛋白溶液。
28.實施例4一種尿液微量蛋白的富集、純化和保護方法包括以下步驟：
（1）尿液樣品除雜：取5-10ml尿液樣品進行離心（溫度：25℃，轉速：2000rpm，時間：10min），去除尿液中的殘渣，保留上清液備用；（2）尿液微量蛋白鹽析沉淀：取步驟（1）得到的上清液1ml，加入氯化銨飽和鹽溶液2ml，靜置10min，得到固液分離的尿液；（3）尿液沉淀樣本離心：取步驟（2）中固液分離的尿液離心（溫度：4℃，轉速：12000rpm，時間：10min），去除上清液，保留離心管底的沉淀蛋白，備用；（4）尿液微量蛋白重懸：使用200μl去離子蒸餾水對步驟（3）中的沉淀蛋白進行溶解、重懸，移液器吹打混勻，得到重懸液；（5）尿液微量蛋白脫鹽：取200μl步驟（4）重懸液在瓊脂糖分子篩柱（sepharose 6ff）上進行脫鹽過濾（溫度：4℃，轉速：50rpm，時間：1min），得到脫鹽微量蛋白液；（6）尿液微量蛋白保護：取200μl步驟（5）中的脫鹽微量蛋白液加入100μl蛋白保護劑（1.0g/ml羥乙基淀粉、0.001g/ml硫酸慶大霉素和0.02g/ml bis-tris）混勻進行保護處理，即得到待檢測的尿液微量蛋白溶液。
29.陽性對照品和實施例1的區別僅在于采用正常志愿者的尿液中加入牛血清白蛋白作為陽性對照品，具體如下：（1）取0.01g牛血清白蛋白加入10ml正常志愿者的尿液中混勻，制備成為蛋白尿陽性標本；（2）尿液樣品除雜：取5-10ml尿液樣品進行離心（溫度：25℃，轉速：2000rpm，時間：10min），去除尿液中的殘渣，保留上清液備用；（3）尿液微量蛋白鹽析沉淀：取步驟（1）得到的上清液1ml，加入硫酸銨飽和鹽溶液2ml，靜置10min，得到固液分離的尿液；（4）尿液沉淀樣本離心：取步驟（2）中固液分離的尿液離心（溫度：4℃，轉速：14000rpm，時間：15min），去除上清液，保留離心管底的沉淀蛋白，備用；（5）尿液微量蛋白重懸：使用200μl去離子蒸餾水對步驟（3）中的沉淀蛋白進行溶解、重懸，移液器吹打混勻，得到重懸液；（6）尿液微量蛋白脫鹽：取200μl步驟（4）重懸液在交聯羥丙基葡聚糖分子篩（sephadex lh-20）上進行脫鹽過濾（溫度：4℃，轉速：50rpm，時間：1min），得到脫鹽微量蛋白液；（7）尿液微量蛋白保護：取200μl步驟（5）中的脫鹽微量蛋白液加入100μl蛋白保護劑（1.0g/ml羥乙基淀粉、0.001g/ml eatd-2na和0.02g/ml bis-tris）混勻進行保護處理，即得到待檢測的尿液微量蛋白溶液。
30.陰性對照品和實施例 1 的區別僅在于采用生理鹽水作為陰性對照品，具體如下：（1）取10ml生理鹽水，制備成為蛋白尿陰性標本；（2）尿液樣品除雜：取5-10ml尿液樣品進行離心（溫度：25℃，轉速：2000rpm，時間：10min），去除尿液中的殘渣，保留上清液備用；（3）尿液微量蛋白鹽析沉淀：取步驟（1）得到的上清液1ml，加入硫酸銨飽和鹽溶液2ml，靜置10min，得到固液分離的尿液；
（4）尿液沉淀樣本離心：取步驟（2）中固液分離的尿液離心（溫度：4℃，轉速：14000rpm，時間：15min），去除上清液，保留離心管底的沉淀蛋白，備用；（5）尿液微量蛋白重懸：使用200μl去離子蒸餾水對步驟（3）中的沉淀蛋白進行溶解、重懸，移液器吹打混勻，得到重懸液；（6）尿液微量蛋白脫鹽：取200μl步驟（4）重懸液在交聯羥丙基葡聚糖分子篩（sephadex lh-20）上進行脫鹽過濾（溫度：4℃，轉速：50rpm，時間：1min），得到脫鹽微量蛋白液；（7）尿液微量蛋白保護：取200μl步驟（5）中的脫鹽微量蛋白液加入100μl蛋白保護劑（1.0g/ml羥乙基淀粉、0.001g/ml eatd-2na和0.02g/ml bis-tris）混勻進行保護處理，即得到待檢測的尿液微量蛋白溶液。
31.對比例1和實施例1的區別僅在于未加入蛋白保護劑，其他步驟及操作實施例1相同；具體為：（1）尿液樣品除雜：取5-10ml尿液樣品進行離心（溫度：25℃，轉速：2000rpm，時間：10min），去除尿液中的殘渣，保留上清液備用；（2）尿液微量蛋白鹽析沉淀：取步驟（1）得到的上清液1ml，加入硫酸銨飽和鹽溶液2ml，靜置10min，得到固液分離的尿液；（3）尿液沉淀樣本離心：取步驟（2）中固液分離的尿液離心（溫度：4℃，轉速：14000rpm，時間：15min），去除上清液，保留離心管底的沉淀蛋白，備用；（4）尿液微量蛋白重懸：使用200μl去離子蒸餾水對步驟（3）中的沉淀蛋白進行溶解、重懸，移液器吹打混勻，得到重懸液；（5）尿液微量蛋白脫鹽：取200μl步驟（4）重懸液在交聯羥丙基葡聚糖分子篩（sephadex lh-20）上進行脫鹽過濾（溫度：4℃，轉速：50rpm，時間：1min），得到脫鹽微量蛋白液。
32.對比例2和實施例1的區別僅在于加入疊氮化鈉和蔗糖作為蛋白保護劑，其他步驟及操作實施例1相同；具體為：（1）尿液樣品除雜：取5-10ml尿液樣品進行離心（溫度：25℃，轉速：2000rpm，時間：10min），去除尿液中的殘渣，保留上清液備用；（2）尿液微量蛋白鹽析沉淀：取步驟（1）得到的上清液1ml，加入硫酸銨飽和鹽溶液2ml，靜置10min，得到固液分離的尿液；（3）尿液沉淀樣本離心：取步驟（2）中固液分離的尿液離心（溫度：4℃，轉速：14000rpm，時間：15min），去除上清液，保留離心管底的沉淀蛋白，備用；（4）尿液微量蛋白重懸：使用200μl去離子蒸餾水對步驟（3）中的沉淀蛋白進行溶解、重懸，移液器吹打混勻，得到重懸液；（5）尿液微量蛋白脫鹽：取200μl步驟（4）重懸液在交聯羥丙基葡聚糖分子篩（sephadex lh-20）上進行脫鹽過濾（溫度：4℃，轉速：50rpm，時間：1min），得到脫鹽微量蛋白液。
33.（6）尿液微量蛋白保護：取200μl步驟（5）中的脫鹽微量蛋白液加入100μl蛋白保護
劑（0.1g/ml疊氮化鈉和0.5g/ml蔗糖）混勻進行保護處理，即得到待檢測的尿液微量蛋白溶液。
34.對比例3和實施例1的區別僅在于尿液微量蛋白脫鹽步驟中采用的交聯葡聚糖分子篩柱（sephadex g-25），其他步驟及操作實施例1相同；具體為：（1）尿液樣品除雜：取5-10ml尿液樣品進行離心（溫度：25℃，轉速：2000rpm，時間：10min），去除尿液中的殘渣，保留上清液備用；（2）尿液微量蛋白鹽析沉淀：取步驟（1）得到的上清液1ml，加入硫酸銨飽和鹽溶液2ml，靜置10min，得到固液分離的尿液；（3）尿液沉淀樣本離心：取步驟（2）中固液分離的尿液離心（溫度：4℃，轉速：14000rpm，時間：15min），去除上清液，保留離心管底的沉淀蛋白，備用；（4）尿液微量蛋白重懸：使用200μl去離子蒸餾水對步驟（3）中的沉淀蛋白進行溶解、重懸，移液器吹打混勻，得到重懸液；（5）尿液微量蛋白脫鹽：取200μl步驟（4）重懸液在交聯葡聚糖分子篩柱（sephadex g-25）上進行脫鹽過濾（溫度：4℃，轉速：50rpm，時間：1min），得到脫鹽微量蛋白液；（6）尿液微量蛋白保護：取200μl步驟（5）中的脫鹽微量蛋白液加入100μl蛋白保護劑（1.0g/ml羥乙基淀粉、0.001g/ml eatd-2na和0.02g/ml bis-tris）混勻進行保護處理，即得到待檢測的尿液微量蛋白溶液。
35.對比例4和陽性對照例的區別僅在于采用作為交聯葡聚糖分子篩柱（sephadex-20）脫鹽，具體如下：（1）取0.01g牛血清白蛋白加入10ml正常志愿者的尿液中混勻，制備成為蛋白尿陽性標本；（2）尿液樣品除雜：取5-10ml尿液樣品進行離心（溫度：25℃，轉速：2000rpm，時間：10min），去除尿液中的殘渣，保留上清液備用；（3）尿液微量蛋白鹽析沉淀：取步驟（1）得到的上清液1ml，加入硫酸銨飽和鹽溶液2ml，靜置10min，得到固液分離的尿液；（4）尿液沉淀樣本離心：取步驟（2）中固液分離的尿液離心（溫度：4℃，轉速：14000rpm，時間：15min），去除上清液，保留離心管底的沉淀蛋白，備用；（5）尿液微量蛋白重懸：使用200μl去離子蒸餾水對步驟（3）中的沉淀蛋白進行溶解、重懸，移液器吹打混勻，得到重懸液；（6）尿液微量蛋白脫鹽：取200μl步驟（4）重懸液在交聯葡聚糖分子篩（sephadex-20）上進行脫鹽過濾（溫度：4℃，轉速：50rpm，時間：1min），得到脫鹽微量蛋白液；（7）尿液微量蛋白保護：取200μl步驟（5）中的脫鹽微量蛋白液加入100μl蛋白保護劑（1.0g/ml羥乙基淀粉、0.001g/ml eatd-2na和0.02g/ml bis-tris）混勻進行保護處理，即得到待檢測的尿液微量蛋白溶液。
36.效果測試試驗例1尿液微蛋白富集效果測定尿液微量蛋白的富集效果，采用同一份糖尿病腎病蛋白尿的志愿者尿液樣本
（已知尿液總蛋白濃度為200 mg/l），采用實施例1-4的方法進行富集，采用qubit3設備按照使用說明書的蛋白檢測方法進行蛋白測量，重復檢測5次，計算均值
±
標準差，結果如下表1：表1尿液微蛋白富集結果根據上表1的數據可以看出，采用本技術實施例1-4中公開的方法對尿液微量蛋白進行富集，可以使微量蛋白含量達到245mg/l以上，最高可以達到270mg/l，說明本技術提供的蛋白富集純化方法能夠更好的對微量蛋白進行提取。
37.試驗例2尿液微蛋白回收效果測定蛋白的回收效果，采用陽性對照例和對比例4方法進行富集和脫鹽處理，對回收的蛋白進行定量分析，采用qubit3設備按照使用說明書的蛋白檢測方法進行蛋白測量，重復檢測5次，計算均值，結果如下表2：表2尿液微蛋白回收結果實例蛋白含量（mg/ml）蛋白回收率bsa0.001——陽性對照例0.0009999%對比例40.0007070%根據上表2的數據可以看出，采用本技術陽性對照例和對比例4中公開的方法對尿液微量蛋白進行富集回收，采用交聯羥丙基葡聚糖分子篩（sephadex lh-20）蛋白回收率為99%，采用時交聯葡聚糖分子篩（sephadex
??
20）時蛋白回收率為70%，而采用說明本技術提供的蛋白富集純化方法能夠更好的對微量蛋白進行提取。
38.試驗例3尿液微量蛋白純化效果測定尿液微量蛋白的純化效果，同一份糖尿病腎病蛋白尿的志愿者尿液樣本，采用實施例1-4、陽性對照和陰性對照的富集純化方法進行純化，采用聚丙烯酰胺凝膠蛋白電泳儀對尿液微量蛋白進行檢測，結果如下表3所示：表3尿液微量蛋白純化結果
實例α1-微球蛋白α2-微球蛋白β1-微球蛋白β2-微球蛋白bsa蛋白iga白蛋白血紅蛋白實施例1√√√
??????
√√實施例2√√√
??????
√√實施例3√√√
??????
√√實施例4√√√
??????
√√陽性對照
????????
√
??
√
??
陰性對照
????????????????
注：“√”表示能夠檢出；
“??”
表示未檢出。
39.根據上表3的檢測結果可以看出，采用本技術實施例1-4的方法得到的蛋白的純化結果一致；且陽性對照和陰性對照結果與發明設計的預期一致，由此說明該種蛋白的純化效果滿足臨床樣本檢測要求。
40.采用離子譜儀測定尿液微量蛋白的純化分子篩脫鹽后的重懸蛋白溶液的na
+
和nh
4+
的離子濃度；實施例1-4和對比例4的蛋白脫鹽效果見表4；表4尿液微量蛋白純化液na
+
和nh
4+
濃度實例na+濃度nh4+濃度實施例10.00012mol/l0.000081mol/l實施例20.00014mol/l0.000083mol/l實施例30.00011mol/l0.000085mol/l實施例40.00012mol/l0.000081mol/l對比例30.00252mol/l0.000156mol/l根據上表4的檢測結果可以看出，采用本技術實施例1-4的方法得到的蛋白的純化脫鹽結果一致，而常見脫鹽分子篩柱的脫鹽效果明顯不如實施例的效果。
41.試驗例3尿液微量蛋白穩定性測試測定尿液微量蛋白的穩定性結果，在實施例中，同一份糖尿病腎病蛋白尿的志愿者尿液樣本（已知尿液總蛋白濃度為200 mg/l），采用實施例1-4和對比例1-2的進行富集純化和保護，在37℃的恒溫條件下24小時，對富集純化的蛋白進行熱破壞測試；通過高效液相譜儀對蛋白進行圖譜分析以確定其穩定性，結果如下表5所示：表5尿液微量蛋白的穩定性檢測實例液相譜圖實施例1譜峰正常，理論踏板數10000實施例2譜峰正常，理論踏板數12000實施例3譜峰正常，理論踏板數8000實施例4譜峰正常，理論踏板數9000對比例1蛋白譜峰變型，理論踏板數為0對比例2蛋白譜峰變型，理論踏板數為0由上表5的檢測結果可知，實施例1-4加入蛋白保護試劑可以保護尿液微量蛋白結構和活性穩定，該蛋白保護方法效果良好，而對比例1中沒有添加蛋白保護劑，而對比例2中加入常規的蛋白保護劑；在對比例1和2中實驗結果顯示：尿液微量蛋白結構改變和活性明顯降低，各微量蛋白譜峰變型，不能滿足臨床樣本檢測要求。
42.本發明方案所公開的技術手段不僅限于上述技術手段所公開的技術手段，還包括由以上技術特征任意組合所組成的技術方案。以上所述是本發明的具體實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發明的保護范圍。
