一種黨參再生體系的種子滅菌方法
1.本發明屬于黨參植物的種苗育種技術領域，尤其涉及一種黨參再生體系的種子滅菌方法。
背景技術：
2.黨參為桔梗科campanulaceae黨參屬codonopsis素花黨參c.pilosula nannf. var，modesta(nannf.)l.t.shen或川黨參c.tangshen oliv的干燥根,是我國重點保護的珍稀瀕危藥用植物之一。味甘、平，歸脾、肺經。有補中益氣，健脾益肺，是常用的傳統補益藥有增強免疫力、擴張血管、降壓、改善微循環、增強造血功能等作用。此外對化療放療引起的白細胞下降有提升作用。黨參已被列入藥食同源名錄，隨著經濟的發展和人民生活水平的提高，黨參除了作藥用外，已大量用于各種保健品和功能食品，今后國內黨參的需求量將會大幅度增長。為適應消費結構升級的需要，增加優質特黨參的供給，品種培優、品質提升成為黨參育種的重點。
3.黨參的生產方式為種子直播和育苗移栽。種子直播時，因黨參種子細小，幼苗喜陰，怕熱，怕陽光直曬。因此黨參苗期的常見問題為出苗、保苗、齊苗困難。育苗移栽時，育苗周期為1-2年方可移栽，周期較長且除草困難、費工費時。黨參的育種工作現在仍處于常規育種階段，多采用混合選擇法和系統選育法進行育種，這2種方法不僅育種周期長，對品種的改良能力也有限。隨著生物技術的發展，黨參在生物技術育種方面有所突破。
4.利用組織培養手段進行種苗快繁，不僅周期短，繁殖系數高，還可很大程度降低黨參苗期風險，解決出苗、保苗、齊苗的難題。建立黨參再生體系對黨參植物的種苗快繁、遺傳轉化，生物育種技術或者分子生物學方面的研究將具有重要意義。
5.黨參種子作為再生體系穩定的外植體來源,質量較小，千粒重僅為0.349g，在組織培養中進行滅菌時，常出現以下問題：1、將種子直接浸入滅菌液中時,因種子質量太小，時常漂浮在液面上，不僅導致滅菌不徹底，污染率較高，還使滅完菌的種子從液體中分離十分困難。2、將種子進行隔離、包裹處理后，種子量少時,仍會漂浮在液面上；種子量多時，雖然會沉入液面下，但會出現與水流同速旋轉相對速度為0的情況，沖洗、滅菌效果依然較差。
技術實現要素：
6.為了解決以上問題，本發明提供了一種黨參再生體系的種子滅菌方法。
7.本發明是這樣實現的：一種黨參再生體系的種子滅菌方法，包括以下步驟:(1)挑選顆粒飽滿,無病蟲害的黨參種子,用紗布包裹后，用自來水清洗3-5遍，清洗結束后，自然風干備用；(2)將黨參種子包裹于細紗布中，用木夾子收口，用細繩一端系在木夾子上；(3)黨參種子隔離、包裹處理好后用無菌水浸洗2遍,每次2min,種子浸入無菌水中時,細繩外漏于盛裝無菌水的容器外，浸洗后提細繩將黨參種子從液體中拉出；(4)用酒精浸泡過的鑷子，在酒精燈上灼燒冷卻后，擠壓紗布包的多余水分，至無
水滴滲出；(5)將黨參種子轉入盛裝有滅菌液的容器中，迅速做好密封，細繩外漏于盛裝滅菌液的容器外，順時針、逆時針反復搖晃盛裝有滅菌液容器進行滅菌；(6)滅菌液處理過的黨參種子將轉入無菌水浸洗，(7)無菌水浸洗過的黨參種子放在無菌濾紙上吸干水份,播種備用。
8.進一步的，所述的滅菌液為質量百分濃度為10％的naclo溶液。
9.進一步的，所述盛裝有滅菌液的容器為磨口試劑瓶，使用瓶塞密封。
10.進一步的，步驟(5)中順時針、逆時針反復搖晃盛裝有滅菌液容器60～120s 進行滅菌。
11.進一步的，步驟(6)中黨參種子用無菌水浸洗3-5遍，每次2min。
12.本發明采用細紗布包裹黨參種子易于通過擠壓掠去多余水分。用木夾子收口，利用木夾的重力牽引紗布沉入液面以下，即使種子量極少時，也不會漂浮在液面；滅菌結束后，易于解扣打開紗布，取出種子；振蕩時，木夾將紗布牽引固定，整體與水流轉速不一致，存在相對速度，沖刷充分，滅菌徹底。采用長細繩牽引，滅菌結束后，便于從滅菌液中拉出，而且使用細繩不影響滅菌容器密封，防止揮發，導致滅菌效果變差。本發明方法方法操作簡單，成本低廉，滅菌效果極好，對種子的損傷程度低，可獲得生長健壯的無菌實生苗，是一種高效的滅菌技術。且該方法下制備的外植體愈傷組織形成率高，為黨參再生體系的建立奠定了良好的關鍵的技術基礎。
附圖說明
13.圖1為本發明的細紗布包裹黨參種子浸泡示意圖。
14.圖中：1-燒杯，2-木夾子，3-夾子彈性緊固件，4-紗布，5-無菌水，6-細繩。
具體實施方式
15.下面結合具體實施方式對本發明做進一步的詳細說明，以使本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。實施例
16.滅菌實驗1材料與方法1.1供試材料，試驗用黨參種子來源于山西農業大學經濟作物研究所藥用植物資源圃，為當年收獲的新種子，發芽率為97％以上。
17.1.2試驗方法1.2.1種子隔離、包裹處理挑選顆粒飽滿,無病蟲害的黨參種子,稱取8g(約22860粒)，平分成36份,每份約0.22g, 用紗布包裹后，用自來水清洗3-5遍，清洗結束后，自然風干備用。滅菌前對種子進行隔離、包裹處理,滅菌時采用以下4種方法將種子置于滅菌液中進行沖洗滅菌:(1) 將種子置于能合攏閉口的鐵過濾網，沖洗滅菌時，連同鐵過濾網浸入無菌水和滅菌液中。(2)將種子用細紗布包裹，短細繩扎口后，完全浸入無菌水和滅菌液中。(3)將種子用細紗布包裹，用長細繩扎口，包裹的種子浸入無菌水和滅菌液中,細繩外漏于滅菌容器外，用于牽引包
裹。(4)將種子包裹于細紗布中，用木夾子收口，再用8-10cm 長的細繩系在木夾子上，木夾收口包裹后的種子浸入無菌水和滅菌液中,細繩外漏于滅菌容器外，用于牽引包裹，如圖1所示，用木夾子收口，所述的木夾子包括彈性緊固件3，整個木夾子的平均密度大于水，分析如下：木夾子2長時間在水中浸泡，本身與水的密度相當，夾子彈性緊固件3為金屬，大于水的密度，使整個木夾子的平均密度大于水(木夾子可從市面直接購得)，利用木夾的重力牽引紗布沉入液面以下，即使種子量極少時，也不會漂浮在液面，具體實施時夾子彈性緊固件不與無菌水(浸泡液)接觸。
18.1.2.2不同滅菌劑和滅菌方法采用0.1％和10％nacio兩種滅菌液進行滅菌，種子隔離、包裹處理好后用無菌水浸洗2遍,每次2min,然后提細線或用鑷子,將種子從液體中拉出或夾出，用酒精浸泡過的鑷子，在酒精燈上灼燒冷卻后，擠壓紗布包的多余水分，至無水滴滲出，隨后將種子轉入250ml磨口試劑瓶內(內裝60-70ml0.1％溶液或10％nacio),迅速塞好瓶塞。順時針、逆時針反復搖晃進行滅菌，接著轉入無菌水浸洗3-5遍，每次2min最后將浸洗過的種子放在無菌濾紙上吸干水份,隨即進行播種。
19.1.2.3不同滅菌處理種子4種不同隔離、包裹方法為1.2.1所述，分別記為a、b、c、d；滅菌液分為0.1％和10％naclo兩種，分別記為1、2；0.1％滅菌時長分為5個時間間隔，分別為30s、60s、120s、180s、240s；10％nacio滅菌時長分為4個時間間隔，分別為5min、 10min、15min、20min；共36個處理。3次重復。
20.驗證實驗1.3培養條件滅菌后的種子接種于ms空白培養基中,每皿播種40粒。光照12小時，光照強度2000lx。
21.1.4愈傷組織的誘導及繼代1.4.1愈傷組織誘導取生長35天的黨參無菌實生苗的葉片和莖段，葉片沿葉緣剪1圈,莖段切成0.7-1.0cm 的長度，接種在ms+6-ba(0.3mg/l)+2,4-d(0.6mg/l)+kt(0.3mg/l)的培養基上，暗培養，溫度25
±
1℃。3周后開始出現愈傷組織，30天后統計愈傷組織誘導率。
22.1.4.2愈傷組織繼代將不同外植體誘導的愈傷組織轉入原培養基上進行繼代培養,光/暗周期為16/8h,溫度25
±
1℃。
23.1.5測定項目一周后種子開始破皮，20天后統計種子成活率，死亡率，污染率。
24.成活率(％)＝發芽的種子數/接種的種子數
×
100％；死亡率(％)＝未發芽的種子數/接種的種子數100％；污染率(％)＝污染的種子數/接種的種子數
×
100％，愈傷組織形成率(％)＝形成愈傷組織的外植體數/接種的外植體總數
×
100％。
25.試驗數據采用spss.18進行統計和分析。
26.2結果
2.1不同滅菌處理對種子污染率、成活率的影響表1不同滅菌處理對種子污染率、成活率的影響
由表1可知污染率范圍為0～92.7％,處理編號31、32的污染率最低,且為0％。此外污染率小于5％的處理有編號30、36、23、29、35,分別為2.17％、2.67％、3.17％、3.83％、 4.33％，其他處理的污染率均高于5％。成活率范圍為0.8～91.3％，處理編號29的成活率最高，且為91.33％；處理編號30的成活率次之，且為82.00％；處理編號28的成活率為60.83％，居第3；其它處理的成活率均小于60％。本試驗目的在于篩選污染率低，成活率高的滅菌方法，因此結合污染率、成活率篩選出處理編號31、32、30、 36、23、29、35、28為初步研究結果，對以上8個處理采用spss18進行方差分析結果見表2：表2 8個不同處理對種子污染率、成活率的顯著性影響處理滅菌用時處理編號污染率(％)成活率(％)d1180s310.00
±
0.00
aa
4.33
±
0.29
fe
d1240s320.00
±
0.00
aa
0.83
±
0.76
ge
d1120s302.17
±
1.89
abab
82.00
±
0.87
bb
d220min362.67
±
2.36
abab
33.67
±
3.88
ed
c1240s233.17
±
0.76
bab
4.83
±
0.76
fe
d160s293.83
±
2.08
bb
91.33
±
2.75
aa
d215min354.33
±
0.76
bb
56.50
±
2.00
dc
d130s2839.00
±
1.32
cc
60.83
±
1.26
cc
由表2可知，8個處理中污染率范圍為0.00～39.00％,處理31、32污染率最低且極顯著低于其它處理。其它處理污染率由低到高依次為處理編號30、36、23、29、35、 28，處理30、36、23、29、35之間差異不顯著，但這5個處理顯著低于處理28。
27.由表2還可知，7個處理中成活率范圍為0.83～91.33％，處理編號29的成活率最高且極顯著高于其它處理。其它處理成活率由高到低依次為處理編號30、28、35、 36、23、31、32，處理30的成活率極顯著高于處理28、35、36、23、31、32，處理 28和35之間差異顯著。處理3編號5、36、23、31、32的成活率低于56.5％，于實驗目的而言，意義不大。因此結合污染率與成活率，篩選出處理29為最佳結果，處理編號30次之。處理編號29成活率可達到91.33％,處
理編號30的成活率可達到82.00％。
28.2.2不同滅菌處理對愈傷組織的影響采用處理29、30獲得無菌實生苗，分別取實生苗的葉片和莖段進行愈傷組織誘導。 葉片每個處理接種65個外植體，莖段每個處理接種45個外植體,3次重復。愈傷組織 誘導率結果見表3：表3不同滅菌處理對愈傷組織誘導的影響由表3可知，2種處理下葉片和莖段的愈傷組織誘導率為72.3～94.8％，處理29下以 莖段為外植體的愈傷誘導率最高，處理編號30下以葉片為外植體的誘導率最低。處 理編號29的誘導率略高于處理編號30的誘導率，但誘導率均高于70％。莖段接種約 10d后，外植體兩端逐漸膨大、變白，接種約18d后，開始從膨大處長出淡黃、 疏松易碎的愈傷組織，經繼代培養2周后，愈傷組織淡黃、質地緊密、長勢良好。 葉片接種約14d后，外植體開始卷曲、膨大，約20d后，葉片邊緣逐漸形成淡黃綠 、質地緊密的愈傷組織，經繼代培養2周后，愈傷組織淡黃、質地緊密、長勢良 好。因此處理編號29、30下的無菌實生苗，其葉片和莖段均可誘導出長勢良好的外 植體，且誘導率比較高。
29.通過本發明實驗最終得出建立黨參再生體系時，種子滅菌的最佳方法為：挑選顆粒飽滿,無病蟲害的黨參種子,稱取0.35g(約1000粒)，用紗布包裹后，用自來水清洗3-5遍，清洗結束后，自然風干備用。滅菌前將備好的種子包裹于細紗布中，用木夾子收口，再用8-10cm長的細繩系在木夾子上。包裹好種子后用無菌水浸洗2遍,每次2min,然后提細線,將種子從液體中拉出，用酒精浸泡過的鑷子，在酒精燈上灼燒冷卻后，擠壓紗布包的多余水分，至無水滴滲出，隨后將種子轉入250ml磨口試劑瓶內 (內裝60-70ml0.1％溶液),迅速塞好瓶塞。順時針、逆時針反復搖晃60～120s 進行滅菌，接著轉入無菌水浸洗3-5遍，每次2min，最后將浸洗過的種子放在無菌濾紙上吸干水份,隨即播種。該方法操作簡單，成本低廉，滅菌效果極好，對種子的損傷程度低，該方法下制備的外植體愈傷組織誘導率高、長勢良好，為黨參再生體系的建立奠定了良好的技術基礎。
30.本發明實驗研究結論為采用方法4進行包裹種子后滅菌60s效果最佳，成活率達到91.3％。污染率為3.8％。滅菌30s發芽率95％以上，15天后污染率50％以上。 120s發芽率50％。180s發芽率20％。240s發芽率0％，殺死種子或種子損傷推遲出苗，出苗率僅為2～3％。
31.1、隨著滅菌時間加長，污染率降低，但種子死亡率也升高，180s時，種子死亡率接近98％，240s時幾乎全部死亡。
32.2、同等條件下(相同滅菌劑、相同滅菌時長)，處理d的種子包裹方法下，滅菌效果最優。
33.3、無論哪種處理下，滅菌達到180s時，死亡率都接近98％，240s時幾乎全部死亡，處理a除外，因與鐵發生置換反應，將無機汞轉換為單質汞，毒性降低，滅菌效果變差。
34.4、處理d顯著由于處理c的原因為：搖晃滅菌容器時，木夾在液體中與器壁發生碰撞，引起震蕩，使包裹的種子沖洗更徹底。
35.5、處理a接近于處理c，僅次于處理d，但處理a因對鐵有腐蝕作用，滅菌后接種的種子周圍出現疑似鐵銹的物質，雖然沒有細菌，真菌等污染出現，但致使種子出苗延遲，生長極其緩慢。
36.以上所述僅是本發明的較佳實施方式，故凡依本發明專利申請范圍所述的構造、特征及原理所做的等效變化或修飾，均包括于本發明專利申請范圍內。
