一種多指標檢測裝置及一種試劑盒，及其應用

本發明涉及生物檢測、環境監測、臨床檢測技術領域，具體涉及一種檢 測裝置。

現有技術中用于生物檢測的方法很多，例如免疫印跡法、酶聯免疫法 （ELISA法）和化學發光法等免疫分析方法。但這些免疫分析方法需要比較 長的分析時間，通量很小，每次只能檢測一種項目指標。現有的高通量的生 物芯片技術雖然實現了通量高，但是整個反應在很小的空間內進行，雖然最 終使用的樣本量很少，試劑量也不多，但具有檢測靈敏度較低和檢測的線性 范圍較窄的缺陷。

現有技術中，常用的檢測裝置是微孔板，微孔板上有多個獨立的檢測孔， 通常為96孔板或384孔板。每一塊板只能檢測一種項目，但必須可以同時進 行96或384人份的這種項目的檢測。使用時將每一個樣品加入到檢測孔中， 之后檢測全部樣品的這一項指標。當需要檢測一個樣品的多項指標時，就需 要多個這樣的微孔板，實驗時將樣品分別加入到不同的微孔板中，例如，當 檢測一人份樣本，即檢測同一個人的血液樣品的8項指標時，需要將樣品分 別加入到8個不同項目微孔板的相應檢測孔中，之后再進行檢測，而每個微 孔板剩余的檢測人份數就不能用了，造成極大浪費，或者一直等到還有95個 其他也同時做這8項檢測的樣本一起做，這樣就需要等待較長時間。同時因 為操作的試劑太多，也延長了檢測過程，容易產生誤差。

為了解決現有技術中檢測一份樣品的多項指標時，需要使用不同項目指 標的檢測試劑，并將樣品分別加入到這些試劑的反應容器中，而導致的價格 昂貴和操作非常不便的缺陷，本發明提供一種多指標檢測裝置。本發明提供 的檢測裝置能夠通過一次加樣，將樣品加入到多個檢測孔中，以對樣品的多 項指標進行檢測，操作方便快捷。

為了解決上述技術問題，本發明采用下述技術方案：

本發明提供一種多指標檢測裝置，所述檢測裝置包括至少一個多孔檢測 條，所述多孔檢測條上設置有至少兩個檢測孔，所述檢測孔包括下部，底部， 和上部；所述的檢測孔的底部是封閉的，所述檢測孔的下部相互獨立，上部 相互連通。

上述多孔檢測條亦可稱為多孔連通板，或微孔板，或連通微孔板。上述 檢測孔也可稱為微孔。

檢測過程中，由于所述檢測孔的下部相互獨立，不同檢測孔的下部和底 部可以同時包被不同的生物活性物質，又由于同一檢測條中的檢測孔的上部 是相互連通的，所以，向檢測孔加入樣品的過程中，該樣品注滿檢測條內一 個檢測孔的下部時，就會流入相鄰的檢測孔，這樣，通過一次加樣操作，就 能夠把樣品加到同一檢測條的全部檢測孔中，節省了加樣時間。

所述不同的檢測孔中可以包被相同的檢測試劑，也可以包被不同的檢測 試劑，所述檢測試劑包括生物材料、高分子合成材料、受體或藥物分子的結 合靶物質。當多孔檢測條包括n個檢測孔時，同一檢測條的檢測孔的底部和 下部可以包被最多n個不同的檢測試劑，所述n為大于或等于2的正整數， 通常為2?12。

所述檢測裝置包括m個多孔檢測條，所述m為大于或等于1的正整數， 通常為1?12。

因此，本發明提供的多指標檢測裝置可以實現高通量檢測，能夠同時檢 測m個樣本中的n種不同的物質，即，能夠同時檢測多個樣本中的多種不同 的物質，而且，本發明提供的檢測方法操作簡單，性能不低于現有非高通量 的檢測技術（如ELISA和化學發光等），節省時間，高效準確。

進一步的，n為8，m為12。當8個檢測孔內包被有8種不同的檢測試劑 時，該裝置能夠同時檢測12人份樣品的8項不同的指標，這是現有的微孔板 所做不到的。

進一步的，所述檢測孔的上部通過連接通道相互連通，所述檢測孔的上 部周圍設置有面板。

進一步的，所述裝置還包括支架，所述多孔檢測條安裝固定在所述支架 上。

進一步的，所述同一檢測條上相鄰的檢測孔的下部有間隙，上部通過連 接通道相連通。

進一步的，所述多孔檢測條的兩端還包括支撐板，且兩端的支撐板的形 狀不相同。

進一步的，所述裝置包括1?12個多孔檢測條；所述多孔檢測條上設置有 8?12個檢測孔。

進一步的，所述支架上設置有通孔，所述多孔檢測條通過所述通孔安裝 固定在支架上。

進一步的，所述檢測孔下部的橫截面為圓形或正方形；所述通孔的橫截 面為圓形或正方形；所述檢測孔的下部嵌入所述通孔中。

進一步的，所述支架包括框架，縱向分隔條，橫向分隔條；縱向分隔條 和橫向分隔條相互交叉，與框架一起，形成了多個通孔。所述支架縱向上的 通孔數與檢測條上的檢測孔的數目相同，橫向上的通孔數與檢測條的數目相 同。所述通孔的直徑或邊長為5?20mm。

所述連接通道為矩形通道。

安裝時，所述檢測孔的下部嵌入通孔，所述橫向分隔條嵌入檢測孔的下 部之間的間隙，所述支撐板支撐在框架上，所述連接通道支撐在橫向分隔條 上。

進一步的，所述多孔檢測條由聚苯乙烯材料制備而成。

本發明還提供一種試劑盒，所述試劑盒包括上述多指標檢測裝置，所述 檢測裝置的檢測孔的底部和下部包被有生物材料，人工合成的高分子材料、 受體或藥物分子的結合靶物質。優選的，不同的檢測孔內包被不同的生物材 料。

進一步的，上述微孔內可以包被抗體、包被抗原、或其組合。

進一步的，所述生物材料選自谷氨酸脫羧酶（GAD）抗原、胰島素（Ins） 抗原和酪氨酸磷酸酶抗原（IA2)、抗人IgG抗體或其組合；優選的，GAD抗 原包被濃度為0.01?0.1ug/ml；Ins抗原包被濃度為0.01?0.1ug/ml；IA2抗原包 被濃度為0.01?0.1ug/ml；抗人IgG抗體包被濃度為1?10ug/ml。所述抗人IgG 抗體選自鼠抗人IgG抗體，兔抗人IgG抗體或羊抗人IgG抗體。

進一步的，上述GAD抗原包被濃度為0.05ug/ml；Ins抗原包被濃度為 0.05ug/ml；IA2抗原包被濃度為0.05ug/ml；抗人IgG抗體包被濃度為2ug/ml。

采用現有方法將上述生物材料包被在微孔的底部和上部的內表面。

通常：包被方法包括下述步驟：

（1）將生物材料包被或吸附在微孔底部和下部的內表面；

（2）用封閉劑封閉步驟（1）中的微孔底部和下部的內表面，封閉之后棄去 封閉液，洗滌微孔底部和下部；

（3）干燥，即得所述連通微孔板。

采用pH7.4?9.6的碳酸鹽或磷酸鹽緩沖液將抗原或抗體稀釋成指定的濃 度，在2?8℃，優選在3?4℃條件下包被10?30小時，優選包被14?16小時；或 在37℃條件下包被2?5小時，包被的濃度依據固相載體和包被物的性質調整。

常用的封閉劑有0.05%?10%的BSA、10%?100%的新生牛血清、1%明膠、 5%脫脂奶粉。本發明采用的封閉劑和穩定劑優選100%新生牛血清（指未稀釋 的新生牛血清），由新出生10天內的小牛采血制成，蛋白含量為3.5%?5%（w/v， g/100ml）。本發明所述的抗原/抗體和標記抗原/抗體可以采用現有制備方法制 備，也可以從市場購得。

本發明還提供上述的試劑盒的使用方法，所述使用方法包括下述步驟：

（1）制備一種標記物工作液。所述標記物工作液包括標記物、稀釋劑， 所述標記物為標記的生物材料，該標記物能夠與待測樣品中的特定物質起反 應并與該物質結合在一起，而該物質能夠與本發明提供的多指標檢測裝置的 微孔中包被的生物材料起反應并結合在一起。所述生物材料選自抗體、抗原、 肽、DA、RA、蛋白質或其組合。

（2）將待測樣品稀釋；

（3）將步驟（2）所得的稀釋后的樣品通入連通微孔板的微孔中，并在 上部形成連通，溫育30分鐘至2小時；之后，向連通微孔板的微孔中通入PBS 沖洗3?4次，之后棄去PBS；

（4）向連通微孔板的微孔內通入步驟（1）所得的標記物工作液，溫育 30分鐘至2小時；之后，再用PBS沖洗3?4次，之后棄去PBS；

（5）向微孔板內加入相應試劑，根據試劑性質，檢測反應區域的顯、 發光或反射性；

（6）根據步驟（5）的結果確定樣品中的目標物質。

進一步的，上述步驟（2）中，用PBS稀釋待測樣品，樣品與PBS的重 量比或體積比為1:100?1000。

進一步的，上述標記物工作液包括：

（1）抗人IgG抗體的標記抗體（酶標二抗），所述標記抗體的濃度為 0.1?1.0ug/ml；

（2）穩定劑。

優選的，采用的稀釋劑和穩定劑均為未稀釋的新生牛血清。

進一步的，上述用于標記的物質可以是酶、同位素、有機熒光染料或熒 光量子點。用于標記抗體的酶較多，常用的有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、 葡萄糖氧化物酶和β?半乳糖苷酶等。

上述多指標檢測裝置主要用于高效篩選，環境監測，生物分析，臨床檢 測，食品安全檢測，動物檢測等用途。

在某些藥物分子的研發和篩選中，可以將一系列受體或藥物分子的結合 靶物質固定在上述連通微孔板的微孔的底部和上部的內表面，然后將篩選的 物質一次加樣，加到該連通微孔板的所有微孔中。如果同時篩選多種物質， 則同時將多種物質分別加入到不同的連通微孔板的微孔中，以確定哪些分子 能與哪種受體或靶物質相結合，從而實現高效篩選；同樣原理也可以用于監 測環境中存在哪些污染物質或確定引起污染的物質的特征；多指標檢測裝置 也可以用于生物分子的相互作用分析，從而揭示生物分子之間的相互關系； 在臨床檢測及監測方面也有重要的應用，可用于腫瘤標志物、激素、病毒、 抗生素、等的聯合檢測。在食品安全檢測方面，可以用于檢測食品內是 否含有禁用的物質，如三聚氰氨、瘦肉精；可以測定食品中的農藥殘留、抗 生素殘留、毒素（如）等。

與現有技術相比，本發明提供的多指標檢測裝置能夠通過一次加樣，將 樣品加入到多個檢測孔中，以對樣品的多項指標進行檢測，節省了加樣時間， 操作方便快捷；加樣簡單易學，適合基層醫療單位使用；一份樣本的不同指 標的測定可以在一條微孔板上實現，反應條件均一，可以避免反應條件的不 同而引起的變異，從而使結果更加準確。與現有的高通量生物芯片相比，本 發明提供的多指標檢測裝置可以實現高通量檢測，能夠同時檢測多個樣本中 的多種不同的物質，而且，本發明提供的檢測方法操作簡單，性能不低于現 有非高通量的檢測技術（如ELISA和化學發光等），節省時間，高效準確。

利用本發明提供的多指標檢測裝置進行生物檢測，準確率高，抗干擾性 強，檢測靈敏度和特異性靈敏度均較高，而且制備工藝簡單，檢測操作方便 且易掌握，生產成本低，檢測費用少，不僅適合專業檢測機構使用，也適合 例行體檢、采/供血、疫情檢測、醫療臨床檢測等方面的使用。本發明提供的 試劑盒可以實現高通量檢測，并且，檢測靈敏度高，檢測的線性范圍更寬。 本發明提供的多指標檢測裝置和試劑盒可廣泛應用于生物檢測、環境監測、 臨床檢測技術領域。

圖1為本發明提供的一種多指標檢測裝置的結構示意圖；

圖2為一種多指標檢測裝置的多孔檢測條的結構示意圖；

圖3為圖2所示檢測條的俯視圖；

圖4為圖2所示檢測條的剖面示意圖；

圖5為包被抗原/抗體的檢測條的剖面示意圖；

圖6為本發明提供的又一種多指標檢測裝置的結構示意圖；

圖7為圖6所示多指標檢測裝置的剖視圖。

其中，1為支架，2為多孔檢測條，11為框架，12為縱向分隔條，13為 橫向分隔條，101為通孔；201為檢測孔，2010為檢測孔的底部，2011為檢 測孔的下部，2012為檢測孔的上部，202為連接通道，203為檢測條上一端的 支撐板，204為檢測條上另一端的支撐板，205為檢測條上的面板。

如圖1至圖4所示，本發明提供的多指標檢測裝置包括支架1和多孔檢 測條2，所述支架1包括框架11，縱向分隔條12，橫向分隔條13；縱向分隔 條12和橫向分隔條13相互交叉，與框架一起，形成了多個通孔101。

多孔檢測條2上設置有檢測孔201，所述檢測孔201包括下部2011，底 部2010，和上部2012。所述檢測孔201的下部2011相對獨立，且底部2010 是封閉的，相鄰的檢測孔201的下部2011之間有間隙，上部2012通過連接 通道202相連通。所述多孔檢測條2還包括支撐板203和204，支撐板203的 形狀與支撐板204不同，這樣便于區分多孔檢測條的安裝方向，也便于安裝 和拆卸多孔檢測條。

安裝時，所述檢測孔201的下部2011嵌入通孔101，所述橫向分隔條13 嵌入檢測孔201的下部2011之間的間隙，所述支撐板203和204支撐在框架 11上，所述連接通道202支撐在橫向分隔條13上。

如圖6至圖7所示，本發明提供的一種多指標檢測裝置，該裝置包括一 個多孔檢測條2，所述多孔檢測條2上設置有2到12個檢測孔，所述檢測孔 包括下部2011，底部2010，和上部2012；所述檢測孔的底部2010是封閉的， 所述檢測孔的下部2011相互獨立，上部2012相互連通。

實施例1

如圖6至圖7所示，本發明提供的一種多指標檢測裝置，該裝置包括一 個多孔檢測條2，所述多孔檢測條2上設置有8個檢測孔，所述檢測孔包括下 部2011，底部2010，和上部2012；所述檢測孔的底部2010是封閉的，所述 檢測孔的下部2011相互獨立，上部2012通過連接通道202相互連通。所述 檢測孔的上部周圍設置有面板205。面板205便于手持，以進行相關的檢測操 作。

本實施例提供的多指標檢測裝置不需要支架，可以獨立使用。

實施例2

一種多指標檢測裝置，所述多孔檢測條2上設置有8個檢測孔201（可稱 為8孔連通板)，所述檢測孔201的下部2011相對獨立，且底部2010是封閉 的，相鄰的檢測孔201的下部2011之間有間隙，檢測孔201的上部2012通 過連接通道202相連通；所述支架1縱向上的通孔數與檢測條上的檢測孔的 數目相同，為8個，橫向上的通孔數為12個，即該支架上可安裝12個檢測 條。該多指標檢測裝置可以同時檢測一個樣本的8個項目指標。進一步的， 所述檢測裝置，可以同時容納12個樣品，進而用于檢測12個樣品的8項指 標。使用前先于多孔檢測條底部（2010）和下部（2011）處包被生物活性物 質，因它們是相互不相通的，因此可以包被上8種不同的生物活性物質；又 由于同一檢測條中的檢測孔的上部是相互連通的，所以，向檢測孔加入樣品 的過程中，該樣品注滿檢測條內一個檢測孔的下部時，就會溢過連接通道202 流入相鄰的檢測孔，這樣，通過一次加樣操作，就能夠把樣品加到同一檢測 條的全部檢測孔中，以對樣品的多項指標進行檢測，節省了加樣時間，進一 步提高了檢測效率。

實施例3

一種多指標檢測裝置，所述多孔檢測條2上設置有12個檢測孔201（可 稱為12孔連通板)，所述檢測孔201的下部2011相對獨立，且底部2010是封 閉的，相鄰的檢測孔201的下部2011之間有間隙，檢測孔201的上部2012 通過連接通道202相連通；所述支架1縱向上的通孔數與檢測條上的檢測孔 的數目相同，為12個，橫向上的通孔數為8個，即該支架上可安裝8個多孔 檢測條。該多指標檢測裝置可以同時檢測一個樣本的12個項目指標。進一步 的，所述檢測裝置，可以同時容納8個樣品，進而用于檢測8個樣品的12項 指標。

由于上述多孔檢測條是相互獨立地安裝在支架上，因此可以根據實際需 要使用一個或多個多孔檢測條，以實現對一人份或多人份樣品的多項指標的 檢測。

當然，上述多孔檢測條可以根據需要包括2個或多于2個檢測孔，例如， 包括8或12個檢測孔。所述支架可以根據需要安裝1個或多個，例如1?12 個檢測條。

實施例4一種試劑盒

本實施例提供的試劑盒包括本發明所述的多指標檢測裝置，所述檢測裝 置的檢測孔的底部和下部的內表面包被有生物材料。

本實施例所用的材料和設備均為現有材料和設備，例如：GAD抗原，Ins 抗原，IA2抗原，anti?人IgG?HRP的生產廠家如表1所示，

表1原料名稱，貨號和生產廠家

上述試劑盒的制備方法包括下述步驟：

（1）包被抗原及抗體

如圖5所示，在連通微孔板的微孔中分別加入GAD抗原，Ins抗原，IA2 抗原，抗人IgG抗體，包被抗體或抗原采用0.02mol/L?pH7.4的磷酸鹽緩沖液 稀釋成指定的濃度，在2?8℃條件下包被15小時，使之固定在微孔底部和下 部的內表面。GAD抗原包被濃度為0.05ug/ml；Ins抗原包被濃度為0.05ug/ml； IA2抗原包被濃度為0.05ug/ml；抗人IgG抗體包被濃度為2ug/ml。

（2）封閉：

棄去包被液體，在連通微孔板的微孔中分別加入未稀釋的新生牛血清， 封閉60分鐘后，通入PBS沖洗三次。

上述未稀釋的新生牛血清的蛋白含量為3.5%?5%（w/v，g/100ml）。

（3）干燥，即得本發明所述的多孔檢測條(或稱連通微孔板)；

（4）將步驟（3）所得的連通微孔板安裝到支架上，即得本發明所述的試劑 盒。

（5）如圖5所示，上述多孔檢測條的8個微孔分別標記為A、B、C、D、E、 F、G、H。各個微孔內包被的生物材料如下所示：

A孔未包被任何抗原，只用新生牛血清封閉，為空白孔；B孔包被GAD抗原； C孔包被GAD抗原；D孔包被Ins抗原；E孔包被Ins抗原；F孔包被IA2抗 原；G孔包被IA2抗原；H孔包被抗人IgG抗體，為陽性孔。其中Ａ孔為空 白對照，Ｇ孔為陽性對照。H孔也可以為空白對照孔，陽性孔不是必須的， 而空白對照孔是必須的。

（6）依次加入稀釋的待測樣品和標記物工作液：

向上述步驟（5）所述的連通微孔板的微孔中通入待測樣品與PBS按1:100 比例（重量比或體積比）混合的混合溶液，反應1小時后，向微孔內通入PBS 沖洗3?4次后，棄去PBS；向連通微孔板的微孔中通入酶結合物（即標記物工 作液），所述酶結合物為抗人IgG的標記抗體（即酶標二抗，其濃度為5ug/ml）， 前述標記抗體的稀釋劑和/或穩定劑為100%新生牛血清（即未稀釋的新生牛血 清）。

（7）向微孔內通入PBS沖洗3?4次后，棄去PBS，在反應區域內加入魯米諾；

（8）檢測反應區域的發光亮度。

根據步驟（8）的檢測結果，根據各個微孔的信號值與空白孔的信號值的 比例來確定微孔中是否存在相應的抗體，從而定性檢測樣品中是否存在GAD 抗體、IA2抗體和Ins抗體。

實施例5試劑盒的使用方法

先制備標記物工作液。采用現有技術中的常用方法制備。

通常，所述標記物工作液的制備方法，以抗體（IgG）為例，包括下述步 驟：

（1）取4mg?HRP溶于0.5mL蒸餾水，加入1%（w/v）的2，4?二硝基氟 苯（DFB）無水乙醇溶液0.1mL，室溫（20±5℃）下輕微攪拌2?3h。

（2）加入0.08mol/L?aIO4水溶液1mL，室溫下避光輕攪30?60min，溶 液呈黃綠。

（3）加入0.2mol/L乙二醇水溶液1mL，室溫（20±5℃）下輕攪2?3h， 終止氧化反應。

（4）加入5mg抗體（IgG），裝入透析袋，置于濃度為0.05mol/L，pH9.1 的碳酸鹽緩沖液（無水碳酸鈉1.5g，碳酸氫鈉2.93g，溶于1000mL蒸餾水） 1000mL中，3?4℃透析10?30小時，更換3次緩沖液。

（5）取出透析袋中液體，加入濃度為6mg/mL的aHB4水溶液0.2mL， 在2?8℃的條件下透析2?3小時。

（6）步驟（5）所得的液體經過凝膠過濾柱分離去除游離的抗體或抗原 分子和酶分子，得到抗體或抗原的酶結合物。

（7）向步驟（6）所得產物內加入等體積甘油，用新生牛血清將酶結合 物稀釋至2?30μg/ml，即得抗體或抗原的酶結合物，低溫保存備用。

上述步驟所得的酶標記的抗體或抗原使用新生牛血清，并只用新生牛血 清作為稀釋劑和穩定劑。將標記的抗體稀釋到指定的濃度，即得到標記物工 作液。

本發明制備的試劑盒的使用方法，包括下述步驟：

（1）分別取樣，分別將待測樣品與PBS相混合；

（2）將步驟（1）所得的混合液分別通入連通微孔板的微孔內，培育30分鐘 至2小時；

（3）向微孔內通入PBS沖洗3?4次后，棄去PBS，將上述標記物工作液通入 連通微孔板的微孔內，培育30分鐘至2小時；

（3）向微孔內通入PBS沖洗3?4次后，棄去PBS，在反應區域內加入魯米諾 或TMB；

（4）檢測反應區域的相對發光強度或OD值；

（5）根據步驟（4）的結果確定樣品中的目標抗體或抗原。

當檢測一人份樣品的多項指標時，使用一個連通微孔板；當檢測多人份 樣品的多項指標時，使用多個連通微孔板。

本發明所用的檢測裝置為現有常用的儀器，如化學發光成像系統 ChemiScope?Mini，上海勤翔科學儀器有限公司生產。

本發明提供的多指標檢測裝置，以實施例4中所述的連通微孔板為例， 當使用一個連通微孔板時，可同時檢測一人份樣品中GAD抗體、IA2抗體、 Ins抗體三項指標；當同時使用多個連通微孔板時，可同時定性或定量檢測多 人份樣品中GAD抗體、IA2抗體、Ins抗體三項指標。這進一步說明了，本 發明提供的多指標檢測裝置不僅節省加樣時間，而且可以實現高通量檢測， 并且，檢測靈敏度高，檢測的線性范圍更寬。本發明提供的試劑盒可以實現 高通量檢測，并且，檢測靈敏度高，檢測的線性范圍更寬。

以上所述，僅為本發明的較佳實施例而已，并非用于限定本發明的保護 范圍。凡是根據本發明內容所做的均等變化與修飾，均涵蓋在本發明的專利 范圍內。