鼻腔黏膜來源間充質干細胞的制備方法與流程
1.本發明涉及一種鼻腔黏膜來源間充質干細胞的制備方法，屬于間充質干細胞的培養技術領域。
背景技術：
2.間充質干細胞(mesenchymal stem cell，mscs)一種具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞，廣泛存在于全身多種組織中，可以在體外條件下進行培養擴增。在特定的誘導條件下，mscs可分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞等。mscs的免疫原性較弱，異體移植不會引起嚴重的免疫排斥反應。移植后的mscs能夠主動遷移到組織損傷部位，參與免疫調節和組織損傷修復。這些特性賦予了mscs在組織工程和再生醫學領域廣闊的應用前景，使其成為細胞領域最具臨床應用價值的干細胞。
3.mscs最早來源于骨髓。1970年，friedenstein首先發現骨髓中有一組貼壁生長的細胞，其形狀與成纖維細胞相似，呈克隆性增殖，稱為骨髓間充質干細胞(friedenstein a.j.；1970.)。除骨髓外，mscs也可來自脂肪、牙周和牙髓等其他成體組織。此外，新生兒附屬組織，諸如臍帶和胎盤等，也是mscs的另一類來源。不同來源的mscs蛋白質表達譜系不同，其特性和在中發揮的功能也有差異。例如，牙髓來源的mscs，更多地用于牙齦骨缺陷的再生(zha k,et al 2022.)；腸道來源的mscs，在腸道炎癥和損傷過程中，通過特異調控腸道干細胞微環境的rspo1-wnt信號，參與腸道上皮組織的損傷修復(wu,n.et al.2021.)。然而，鼻腔黏膜組織是否存在mscs、有哪些功能、有哪些臨床應用，還知之甚少。
4.mscs常用的分離培養方法是酶消化法和組織塊貼壁培養法。酶消化法可以獲得大量原代細胞，但是由于提取過程中消化酶的破壞，細胞貼壁效果、形態較差，且消化時間在大規模生產過程中難于統一量化，且分離提取成本較高，處理時間相對較長。傳統的組織塊培養法的缺點是組織塊經常貼壁不牢，加培養基后容易漂浮。
5.變應性鼻炎(allergic rhinitis，ar)，俗稱“過敏性鼻炎”，是臨床常見的鼻部炎癥疾病，由于環境污染等因素，全球發病率逐年上升，且具有低齡化傾向。過敏性鼻炎因其易復發性，嚴重干擾人們的工作、生活和社交，給患者造成精神狀態低下、失眠、心理障礙等負面影響。目前過敏性鼻炎的方法主要有藥物和特異性免疫。藥物(比如激素)只能控制癥狀，不能逆轉免疫失衡狀態；特異性免疫周期長，但首先要明確過敏源，然后對患者進行脫敏，以阻止病情發展。
6.近年來有人提出免疫反應失衡學說，認為過敏性鼻炎發病主要由于th1/th2細胞免疫失衡，同時存在調節性t細胞(treg細胞)數量和/或功能的缺陷(li c,et al.2017；sun li,et al.2020)。zhao等報道靜脈注射小鼠骨髓來源的mscs，在ar動物模型中可以調節自身免疫平衡，減輕變應性鼻炎的癥狀(zhao n,et al.2016.)。研究還發現，mscs可以遷移并定植到鼻腔黏膜，通過免疫調節恢復th1/th2免疫平衡和上調treg細胞，從而糾正細胞免疫失衡。
7.臨床上，鼻中隔偏曲或鼻甲肥大手術中的鼻黏膜組織，通常被當作醫療廢棄物丟
棄，造成了資源的浪費。為合理利用生物資源，有必要研發一種鼻腔黏膜間充質干細胞的培養方法。
技術實現要素：
8.針對上述現有技術，本發明提供了一種鼻腔黏膜來源間充質干細胞的制備方法。
9.本發明是通過以下技術方案實現的：
10.一種鼻腔黏膜來源間充質干細胞的制備方法，包括以下步驟：
11.(1)取人鼻腔黏膜組織樣本，清洗，剪成0.5～3mm3大小的組織塊；
12.進一步地，所述鼻腔黏膜組織樣本，是手術后獲得的，在醫院倫理批準及病人知情同意的情況下，將手術后獲得的鼻腔黏膜組織樣本迅速置于高糖的dmem培養基(gibco)中，于4～25℃下保存并運回實驗室；
13.進一步地，所述清洗的具體方式為：將鼻腔黏膜組織樣本放入培養皿中，用含有10
×
青霉素-鏈霉素-兩性霉素b(gibco)的dpbs(賽維爾)清洗3～5遍，徹底去除黏膜上可能粘附的灰塵或細菌，確保樣本無污染；
14.(2)將組織塊放入dmem完全培養基中，浸潤3～5秒后取出(注意：組織塊潤洗后其表面帶有的培養基要適量，液體太少組織會脫水引起細胞死亡，液體太多倒置培養時，組織塊不能貼壁)，置于t25細胞培養瓶(thermo)底部，相鄰組織塊的間距控制在0.3～0.7cm，將t25培養瓶倒置于37℃、5％co2培養箱中貼壁培養；
15.(3)貼壁培養6～8小時，將倒置的t25培養瓶正置，加入間充質干細胞完全培養基，重新放入37℃、5％co2培養箱中培養；
16.所述間充質干細胞完全培養基選自yinfeng bio間充質干細胞培養基，該培養基化學成分明確，無血清，對mscs有選擇性；
17.(4)待細胞從組織塊爬出后換液，以后每隔3天吸棄舊培養基，加入新鮮培養基，在相差顯微鏡下逐日觀察細胞形態和生長情況，培養至細胞80％～90％融合時，即可用胰酶消化傳代，傳代細胞繼續擴大培養或凍存。
18.利用上述方法培養即可快速獲得大量鼻腔黏膜來源間充質干細胞，并且能長時間維持間充質干細胞的增殖和分化能力，凍存仍然具有干細胞活性。該方法獲得的細胞滿足2006年國際細胞協會(isct)對msc的定義標準：
①
可貼壁生長；
②
細胞表面表達特定的特異性標記物；
③
具有向脂肪細胞、成骨細胞和軟骨細胞分化的能力。
19.本發明的鼻腔黏膜來源間充質干細胞的制備方法，既可減少酶消化法對于原代細胞的損傷，又能避免傳統組織塊培養法細胞不容易貼壁的缺點，簡單，可重復性強，操作簡單易行，成功率高，為鼻腔黏膜來源間充質干細胞未來應用于基礎科研和臨床奠定基礎。
20.本發明使用的各種術語和短語具有本領域技術人員公知的一般含義。
附圖說明
21.圖1：形態學結果鑒定示意圖。
22.圖2：表面標志物鑒定的結果示意圖。
23.圖3：三系分化能力鑒定的結果示意圖(骨細胞)。
24.圖4：三系分化能力鑒定的結果示意圖(脂肪細胞)。
25.圖5：三系分化能力鑒定的結果示意圖(軟骨細胞)。
26.圖6：小鼠體內鼻腔黏膜來源間充質干細胞的示蹤示意圖。
具體實施方式
27.下面結合實施例對本發明作進一步的說明。然而，本發明的范圍并不限于下述實施例。本領域技術人員能夠理解，在不背離本發明的精神和范圍的前提下，可以對本發明進行各種變化和修飾。
28.下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規儀器、試劑、材料等，可通過正規商業途徑獲得。下述實施例中所涉及的實驗方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規實驗方法，檢測方法等。
29.實施例1鼻腔黏膜來源間充質干細胞的制備
30.(一)細胞的分離培養：
31.(1)在醫院倫理批準及病人知情同意的情況下，將手術后獲得的鼻腔黏膜組織樣本迅速置于高糖的dmem培養基(gibco)中，于4～25℃下保存并運回實驗室；
32.在生物安全柜內，將鼻腔黏膜樣本放入培養皿中，用含有10
×
青霉素-鏈霉素-兩性霉素b(gibco)的dpbs(賽維爾)清洗5遍，徹底去除黏膜上可能粘附的灰塵或細菌，確保樣本無污染；
33.在培養皿中用無菌剪刀將清洗干凈的鼻腔黏膜組織樣本剪成1mm3大小的組織塊；
34.(2)將組織塊放入dmem完全培養基中，浸潤5秒后取出(注意：組織塊潤洗后其表面帶有的培養基要適量，液體太少組織會脫水引起細胞死亡，液體太多倒置培養時，組織塊不能貼壁)，置于t25細胞培養瓶(thermo)底部，相鄰組織塊的間距控制在0.5cm，將t25培養瓶倒置于37℃、5％co2培養箱中貼壁培養；
35.(3)貼壁培養6～8小時，將倒置的t25培養瓶正置，加入yinfeng bio間充質干細胞培養基，重新放入37℃、5％co2培養箱中培養；
36.(5)待細胞從組織塊爬出后換液，以后每隔3天吸棄舊培養基，加入新鮮培養基，在相差顯微鏡下逐日觀察細胞形態和生長情況，培養至細胞80％～90％融合時，即可用胰酶消化傳代，傳代細胞繼續擴大培養或凍存。
37.(二)鼻腔黏膜來源間充質干細胞的鑒定
38.a、形態學鑒定：培養3、5、10天的形態如圖1所示，從組織塊爬出的細胞貼壁生長，形態類似成纖維細胞，呈梭形；隨著細胞增殖密度增大呈旋渦狀排列。
39.b、表面標志物鑒定：通過流式細胞儀檢測cd34(biolegend)、cd73、cd44、cd45、cd90、cd105和hla-dr等基因在細胞里的表達，結果如圖2所示，由圖可知，符合間充質干細胞表面標志物鑒定。
40.c、三系分化能力鑒定
41.①
成骨分化：用poly-l-lysine(2μg/cm2)六孔板包被過夜，按10000個細胞/cm2種mscs到包被的平板中；37℃，5％co2培養箱中孵育，當細胞長到100％融合時，更換成骨分化培養基(sciencell)誘導分化，并在這一天開始計時；六孔板每4～5天更換一次培養基；在誘導成骨分化過程中，細胞容易因培養基的改變從板上脫落，在換液時需要非常小心；分化
14～16天時，細胞可固定，用茜素紅染，鏡下觀察、拍照。結果如圖3所示，由圖可知，鼻腔黏膜間充質干細胞具有成骨分化潛能。
42.②
成脂分化：用poly-l-lysine(2μg/cm2)六孔板包被過夜，按10000個細胞/cm2種mscs到包被的平板中；37℃，5％co2培養箱中孵育，當細胞長到100％融合時，更換成脂分化培養基(sciencell)誘導分化，并在這一天開始計時；六孔板每3天更換一次培養基；在誘導成脂分化過程中，細胞容易因培養基的改變而從板上脫落，換液時需要非常小心；分化誘導6天，可初見脂滴，分化18～21天后，細胞可固定，油紅o染。鏡下觀察、拍照。結果如圖4所示，由圖可知，鼻腔黏膜間充質干細胞具有成脂分化潛能。
43.③
成軟骨分化：將2.5x105個mscs轉移到15ml離心管中，室溫下150g離心5min；加入0.5ml成軟骨誘導分化培養液(sciencell)重懸，擰松離心管管蓋以便于氣體交換，將其放置于37℃，5％co2培養箱中培養；當細胞團出現聚攏現象時(一般為24h或者48h)，輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底，懸浮在培養液中；每隔2～3天更換成軟骨誘導分化培養液，每管約0.5ml；換液后，輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底懸浮在液體中；21～28天后，4％中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片，阿利新藍染，鏡下觀察和拍照。結果如圖5所示，由圖可知，鼻腔黏膜間充質干細胞具有成骨分化潛能。
44.(三)小鼠體內鼻腔黏膜來源間充質干細胞的示蹤
45.(1)將1x106個mscs復蘇至t75培養瓶中，37℃，5％co2培養箱中培養，當細胞長到60％融合時，使用gfp-fluc慢病毒以moi＝100來感染mscs；
46.(2)感染72h后，熒光顯微鏡下成像，根據gfp陽性細胞評估感染效率；
47.(3)慢病毒感染72h后，胰酶消化，收集mscs；
48.(4)將收集的mscs移植到肺纖維化模型小鼠體內，進行；
49.(5)移植4天后，小鼠注射熒光素底物進行活體成像，可以定位移植后mscs在小鼠體內的位置。結果如圖6所示，由圖可知，鼻腔黏膜間充質干細胞可以先體外標記，移植后通過活體成像追蹤其存活并分布于呼吸道，揭示其將來用于呼吸系統疾病干細胞的潛力。
50.給本領域技術人員提供上述實施例，以完全公開和描述如何實施和使用所主張的實施方案，而不是用于限制本文公開的范圍。對于本領域技術人員而言顯而易見的修飾將在所附權利要求的范圍內。
