一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株P(guān)719的噬菌體解聚酶Depo58及應(yīng)用的制作方法
一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌體解聚酶depo58及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
1.本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌體解聚酶depo58及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2.肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumoniae）是一種常見(jiàn)的人畜共患病原菌，近年來(lái)，多重耐藥肺炎克雷伯菌已成為醫(yī)源性感染的最主要病原體之一，該細(xì)菌不但對(duì)人類公共衛(wèi)生事業(yè)造成了巨大威脅，而且在一定程度影響了動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。
3.大多數(shù)肺炎克雷伯菌具有合成和分泌莢膜多糖的能力，莢膜多糖作為細(xì)菌的天然屏障可維持細(xì)菌毒力、粘附、阻斷一些抗生素滲透，作為肺炎克雷伯菌的重要毒力因子，莢膜多糖對(duì)公眾健康構(gòu)成巨大威脅，此外，一些肺炎克雷伯菌可形成生物被膜，即由細(xì)菌自身產(chǎn)生的胞外多糖基質(zhì)、脂蛋白、纖維蛋白等所包裹的細(xì)菌細(xì)胞所形成的膜狀結(jié)構(gòu)，能顯著提高細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性及逃避宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別的能力，從而加速細(xì)菌在病灶內(nèi)的定植，因此，生物被膜是醫(yī)院內(nèi)細(xì)菌感染的主要致病因素，另外，生物被膜能夠穩(wěn)定地附著于醫(yī)用器械表面，通過(guò)常規(guī)物理化學(xué)手段難以清除，這給防控醫(yī)療繼發(fā)感染帶來(lái)了嚴(yán)峻考驗(yàn)。
4.噬菌體解聚酶（depolymerase）通過(guò)降解細(xì)菌表面多糖，進(jìn)而引導(dǎo)噬菌體吸附于宿主外膜蛋白。該酶通過(guò)隨機(jī)攻擊糖苷鍵以釋放聚合物的重復(fù)單元，實(shí)現(xiàn)靶向降解莢膜多糖，諸多國(guó)內(nèi)外研究表明，噬菌體解聚酶可有效清除并抑制生物被膜的形成，在控制病原感染等公共衛(wèi)生領(lǐng)域具備一定的應(yīng)用潛力。但是，不同來(lái)源、不同核酸序列以及不同蛋白結(jié)構(gòu)的噬菌體解聚酶，對(duì)不同類型的莢膜多糖和生物被膜所表現(xiàn)的降解性能也是有非常大的差別。
5.例如，文獻(xiàn)：“biological properties and genomics analysis of vb_kpns_gh-k3, a klebsiella phage with a putative depolymerase-like protein，virus genes (2019) 55:696
–
706”公開(kāi)了一種噬菌體解聚酶樣蛋白，該蛋白表明只對(duì)k2型起作用，對(duì)kl2型的肺炎克雷伯菌的莢膜多糖和生物被膜并沒(méi)有降解效果。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
6.本發(fā)明的目的在于提供一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌體解聚酶depo58及應(yīng)用，以解決上述背景技術(shù)中提出的肺炎克雷伯菌可形成生物被膜，即由細(xì)菌自身產(chǎn)生的胞外多糖基質(zhì)、脂蛋白、纖維蛋白等所包裹的細(xì)菌細(xì)胞所形成的膜狀結(jié)構(gòu)，能顯著提高細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性及逃避宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別的能力，從而加速細(xì)菌在病灶內(nèi)的定植，生物被膜是醫(yī)院內(nèi)細(xì)菌感染的主要致病因素，另外，生物被膜能夠穩(wěn)定地附著于醫(yī)用器械表面，通過(guò)常規(guī)物理化學(xué)手段難以清除，這給防控醫(yī)療繼發(fā)感染帶來(lái)了嚴(yán)峻考驗(yàn)，同時(shí)噬菌體解聚酶樣蛋白，該蛋白表明只對(duì)kl2型起作用，對(duì)其他k型的肺炎克雷伯菌的莢膜多糖和生物被膜并沒(méi)有降解效果。
7.為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌體解聚酶depo58及應(yīng)用，該噬菌體解聚酶depo58的制備與對(duì)肺炎克雷伯菌莢膜多糖降解包括如下步驟：s1.通過(guò)pcr方法獲得肺炎克雷伯菌噬菌株p719第58位開(kāi)放閱讀框的depo58基因片段，將該depo58基因片段連接至pet28a質(zhì)粒上，得到pet28a-depo58質(zhì)粒；s2.將pet28a-depo58質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21，篩選得到bl21-depo58大腸桿菌，將該bl21-depo58大腸桿菌在1l含有50
?μ
g/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；s3.向上述lb液體培養(yǎng)基中加入異丙基-β-d-硫代半乳糖苷至終濃度為0.3 mm，并在16℃和180轉(zhuǎn)/分振蕩誘導(dǎo)表達(dá)16小時(shí)；s4.將誘導(dǎo)表達(dá)的bl21-depo58菌液離心集菌離心后進(jìn)行超聲破碎，將上清液樣品加入ni-nta親和層析柱，洗滌ni柱以去除雜蛋白，最后收集洗脫液并經(jīng)超濾得到純化的噬菌體解聚酶depo58；s5.將含有100μl對(duì)數(shù)期細(xì)菌的0.5%半固體lb培養(yǎng)基均勻平鋪在固體lb培養(yǎng)基上，自然晾干后，取5
?μ
l稀釋濃度的dpo58滴在雙層平板上，緩沖液作為陰性對(duì)照，37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過(guò)夜，濃度為100
?μ
g/ml~0.097
?μ
g/ml的噬菌體解聚酶depo58使平板上形成半透明的斑點(diǎn)；優(yōu)選的：所述肺炎克雷伯菌噬菌株p719，名為klebsiellaphage p719。
8.優(yōu)選的：所述該噬菌體解聚酶depo58為肺炎克雷伯菌噬菌株p719第58位開(kāi)放閱讀框的原核表達(dá)和純化產(chǎn)物。
9.優(yōu)選的：所述該噬菌體解聚酶depo58的核苷酸序列如seqidno：1所示。
10.優(yōu)選的：所述肺炎克雷伯菌包括kl2型肺炎克雷伯菌。
11.優(yōu)選的：所述s1中肺炎克雷伯菌噬菌株p719第58位開(kāi)放閱讀框的depo58基因pcr產(chǎn)物經(jīng)純化后連接至pet28a質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)為ndei和xhoi。
12.優(yōu)選的：所述用于構(gòu)建解聚酶表達(dá)載體的上游引物f（seqidno:3）的dna序列為：5
’?
gtgccgcgcggcagccatatggcactatacagacaaggcaaa-3’。
13.優(yōu)選的：所述用于構(gòu)建解聚酶表達(dá)載體下游引物r（seqidno:4）的dna序列為：5
’?
gtggtggtggtggtgctcgagttagataaagtttattagaacgccatcg-3’。
14.優(yōu)選的：所述該解聚酶depo58可對(duì)kl2型肺炎克雷伯菌莢膜多糖降解。
15.與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：該基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌體解聚酶depo58及應(yīng)用；1、本發(fā)明公開(kāi)了一種肺炎克雷伯菌噬菌株p719，通過(guò)對(duì)肺炎克雷伯菌噬菌株p719第58位開(kāi)放閱讀框（orf58），進(jìn)行原核表達(dá)和純化而獲得了噬菌體解聚酶depo58，該解聚酶能夠清除kl2型肺炎克雷伯菌所形成的莢膜多糖；2、該噬菌體解聚酶depo58可對(duì)細(xì)菌自身產(chǎn)生的胞外多糖基質(zhì)、脂蛋白、纖維蛋白等所包裹的細(xì)菌細(xì)胞所形成的膜狀結(jié)構(gòu)的形成具有高效的抑制作用，可廣泛應(yīng)用于制備抗生素替代制劑及醫(yī)療器械消毒劑中，具有顯著地臨床效果。
附圖說(shuō)明
16.圖1為本發(fā)明的噬菌體解聚酶depo58的電泳圖；圖2為本發(fā)明噬菌體解聚酶depo58的sds-page電泳圖；圖3為不同濃度的解聚酶depo58對(duì)kl2型肺炎克雷伯菌kp125的抑制效果圖。
具體實(shí)施方式
17.下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
18.本發(fā)明提供了一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌體解聚酶depo58及應(yīng)用；實(shí)施例1本技術(shù)方案提供一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌體解聚酶depo58及應(yīng)用，噬菌體解聚酶depo58的制備其具體步驟如下：s1：目的產(chǎn)物擴(kuò)增設(shè)計(jì)用于構(gòu)建解聚酶表達(dá)載體的引物：上游引物f（seqidno:3）的dna序列為：5
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gtgccgcgcggcagccatatggcactatacagacaaggcaaa-3’；下游引物r（seqidno:4）的dna序列為：5
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gtggtggtggtggtgctcgagttagataaagtttattagaacgccatcg-3’。
19.pcr擴(kuò)增程序?yàn)?5℃變性3min；95℃變性15s；50℃退火15s；72℃延伸2min；并進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。
20.將來(lái)自肺炎克雷伯菌噬菌株p719第58位開(kāi)放閱讀框的depo58基因pcr產(chǎn)物經(jīng)純化后連接至pet28a質(zhì)粒：酶切位點(diǎn)ndei和xhoi；s2：將pet28a-depo58質(zhì)粒加入到100μl大腸桿菌bl21（de3）感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁進(jìn)行液體均勻混勻，隨后在冰上靜置30min，將靜置后的液體置于42℃水浴熱激45sec后，隨后迅速置于冰上靜置2min；向離心管中加入900μlsoc液體培養(yǎng)基，混勻后置于37℃，180rpm搖床中復(fù)蘇1h。
21.并離心3min，棄掉900μl上清，用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸后，均勻涂布在含卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基平板上。
22.將平板正置于37℃培養(yǎng)箱10min，待菌液被完全吸收后，倒置平板，過(guò)夜培養(yǎng)；使用通用t7引物擴(kuò)增，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳篩選得到bl21-depo58陽(yáng)性克隆大腸桿菌，瓊脂糖凝膠電泳圖見(jiàn)附圖1，其中，泳道m(xù)為marker，泳道1，2為隨機(jī)挑選的單菌落pcr產(chǎn)物。
23.s3：將bl21-depo58在1l含有50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（od
600 0.6~1.0）；s4：向培養(yǎng)液中加入異丙基-β-d-硫代半乳糖苷至終濃度為0.3mm，16℃、180轉(zhuǎn)/分
振蕩培養(yǎng)16小時(shí)；s5：將誘導(dǎo)表達(dá)的bl21-depo58菌液離心集菌（6000轉(zhuǎn)/分，10分鐘），使用預(yù)冷的pbs洗滌菌體2~3次，然后用適量的蛋白純化緩沖液懸浮菌體。懸起的bl21-depo58菌液經(jīng)冰浴后，進(jìn)行超聲破碎（工作3秒，間歇6秒，全過(guò)程冰浴），離心并吸取上清；將上清液樣品輕輕加入平衡后的ni-nta親和層析柱，待上清液與ni柱充分結(jié)合后，收集流出液以待后續(xù)分析。依次使用含50 mm咪唑、100 mm咪唑、250 mm咪唑的洗滌緩沖液各4個(gè)柱體積，洗滌ni柱以去除雜蛋白；然后用4個(gè)柱體積含500mm咪唑的洗脫液，洗脫目的蛋白。收集洗脫液后經(jīng)超濾得到純化的噬菌體解聚酶depo58，其核苷酸序列如seqidno：1所示；氨基酸序列如seqidno：2所示。使用bca蛋白定量試劑盒對(duì)純化后的噬菌體解聚酶depo58進(jìn)行濃度測(cè)定，分裝并保存于-80℃冰箱。
24.s6：sds-page電泳分析配制12％的分離膠和5％的濃縮膠，如下表1和表2所示：表1sds-page分離膠（12%）溶液成分體積（ml）ddh2o3.330%丙烯酰胺4.01.5mol/ltris
·
hcl（ph8.8）2.510％sds0.110％過(guò)硫酸胺（ap）0.1temed0.004total10表2sds-page濃縮膠（5%丙烯酰胺）溶液成分體積（ml）ddh2o6.830%丙烯酰胺1.71.5mol/ltris
·
hcl（ph8.8）1.2510％sds0.110％過(guò)硫酸胺（ap）0.1temed0.01total10純化樣品煮沸10分鐘后上樣，濃縮膠電壓80v，20min，分離膠電壓120v，電泳1.5h，考馬斯亮藍(lán)染，脫觀察，在~80kda處有明顯的條帶出現(xiàn)，純化蛋白電泳圖見(jiàn)附圖2，其中，泳道1為marker，泳道2為純化蛋白。
25.實(shí)施例2本技術(shù)方案提供一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌體解聚酶depo58分別清除kl2型細(xì)菌莢膜多糖，其具體步驟如下：s1、采用斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)噬菌體解聚酶depo58對(duì)大腸桿菌生物被膜的抑制活性，將含有100μl對(duì)數(shù)期細(xì)菌的0.5%半固體lb培養(yǎng)基均勻平鋪在固體lb培養(yǎng)基上，自然晾干后，5?μ
l一系列稀釋濃度的dpo58 （100
?μ
g/ml、25
?μ
g/ml、5.256
?μ
g/ml、1.56
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g/ml、0.39
?μ
g/ml和0.097
?μ
g/ml、0.024
μ
g/ml和0.006
?μ
g/ml）滴在雙層平板上，緩沖液作為陰性對(duì)照，37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過(guò)夜，濃度為100
?μ
g/ml~0.097
?μ
g/ml的噬菌體解聚酶depo58使平板上形成半透明的斑點(diǎn)，如圖3所示。
26.進(jìn)而可以得出通過(guò)對(duì)肺炎克雷伯菌噬菌株p719第58位開(kāi)放閱讀框（orf58），進(jìn)行原核表達(dá)和純化而獲得噬菌體解聚酶depo58，該解聚酶能夠清除kl2型肺炎克雷伯菌所形成的莢膜多糖，對(duì)肺炎克雷伯菌進(jìn)行有效的抑制作用，可廣泛應(yīng)用于制備抗生素替代制劑及醫(yī)療器械消毒劑中，具有顯著地臨床效果。
27.本說(shuō)明書(shū)中未作詳細(xì)描述的內(nèi)容屬于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)。
28.盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。
29.序 列 表《120》 一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌體解聚酶depo58及應(yīng)用《141》
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2021-11-01《160》
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4《170》
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siposequencelisting 1.0《210》
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1《211》
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2292《212》
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dna《213》
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k.peneumoniae《400》
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1atggcactatacagacaaggcaaagccgcgatggacgcaaacggcatcgtcaccgggactggaactaactggcaatcagcgctaacgctaattcgcccaggcgctacgatcctgtttttatcgtccccgattcaaatggcggtagttaacaaggttgtaagtgatacgcaaatcaatgctatctccacaaacggcgcggctgttccgtccagtgattacgcgatcctgttaagcgactccctgaccgttgacggcctggcgcaggatgttgcggaaactctgcgttactaccaatcgcaggagaccgtcattgctgaggcggtagatttctttaaggactttgatttatccactttgcaagaattggtagaacaggcaaaagaggaagctgccgcaagccagcagtcagcatcagcaagccagcagtcagcatcagcaagtcagcaggcatcggcagcaagtcagcaggcagcggcagcaagtcagcaggcagcggcatcaagtcagcaggcagcagatgacgctgaagcaactcgcgatgaaattcagcagatcattgatgattccggcgaacagtcaacgctggttgtattggctcagccaaatggtgctaaaaacatagggcgctgtagtgacattgcgaccctacggacaatagagccgacattaccaaaccaaaagatagaagtcataaaatatgcctcaggctacaagccaataactggctattttgagtatgatcaaactgacagtacatccgttgatgacggaggtatctgcattgtcactgctggtggaaagcgctggaagcggatttttgatggtgcagtaaacgttgcatggttcggtattccatcggatggcgatataaccaacgctatcaataaggcgatttcatatgccaaaccaaaacgtttgggtttagttatctctgctggacagtataaatacactggttcggaaatgctggaaattgacttgggatttatatccttagtctgccatgtaggttgcgcgtcaatagatttttctggtgtaacctccacttacgccattaacgtctattcatcagcaacatatccagccccactgtaccgcaacacagtcaacaagctgtccgggattgaatgctttggtgctaaagttgctggtaaaaatggattacttatcggcaggcccggtggcgcgcaatattataatggacagtgctgcatagaacattgctcattccatgacttcgattatgtagtttcttgcgcaaacagcacctggaggtacaagttc
aatgagtgtgttattactaagggaataacttcgatattctatgctccggctggtcttttagattcaggcgagagcataacgtttaatggtgggatggttgcagactcaagcggtgcaccgatcataattgcatgtgacgctttcaatcttggccttgacggcacatcaactcttaatacaagagttcagatcaccggaaatggggctacagtatcaatgtctggaatgggtaacatagaaaaccctggacagtcggtgtggtatccttacgttacctgtactggcgctggtgcaagatttattctttctgaaagcacactgaccattaatcagccattagcacaaacacagcctataatttatgtcggaataaacgcattcataatatttaatgtggttaaatttcctggtaatccatacaaattcgaacagaactcatcggatatggttcgggcatttgttgaggggcctggatctgtaatgtgcaatgcttgtactagcgacatagcatcaggagccggaaacattcctgtacaccgatctttgtcacctgtttataattcaggttttgagaagggtaataataccggatggtcaattaataacgctggttctgcatcacaaactgccgttgtgtctgcggagtatgcgaagtctgggtcatacggcatgaggatgacttcaatcgccgggttgagcatttttgcaactcagcggtttaacgtaaaaccaggacagtattatatgacctctttttgggcaagggttgtaaacatcggcgcaaatgggaatgcggcgggaaatataaacctctcattctacagccaaaacggaacacagattgctggccctacagctaaccttccggttaacgttgcagattgggctgtttatggtaactttataagaggtatcgttcctcctggagcagaaacggcagttatttctatgcgcgcgtatgatggcgcagttgtcgatttcgatggcgttctaataaactttatctaa《210》
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3《211》
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30。
技術(shù)特征：
1.一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌體解聚酶depo58及應(yīng)用，其特征在于：該噬菌體解聚酶depo58的制備與對(duì)肺炎克雷伯菌莢膜多糖降解包括如下步驟：s1.通過(guò)pcr及基因片段純化獲得肺炎克雷伯菌噬菌株p719第58位開(kāi)放閱讀框的depo58基因片段，將該depo58基因片段連接至pet28a質(zhì)粒上，得到pet28a-depo58質(zhì)粒；s2.將pet28a-depo58質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21，篩選得到bl21-depo58大腸桿菌，將該bl21-depo58大腸桿菌在1l含有50
?μ
g/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；s3.向上述lb液體培養(yǎng)基中加入異丙基-β-d-硫代半乳糖苷至終濃度為0.3 mm，并在16℃和180轉(zhuǎn)/分振蕩誘導(dǎo)表達(dá)16小時(shí)；s4.將誘導(dǎo)表達(dá)的bl21-depo58菌液離心集菌離心后進(jìn)行超聲破碎，將上清液樣品加入ni-nta親和層析柱，洗滌ni柱以去除雜蛋白，最后收集洗脫液并經(jīng)超濾得到純化的噬菌體解聚酶depo58；s5.隨后將含有100
?μ
l對(duì)數(shù)期細(xì)菌的0.5%半固體lb培養(yǎng)基均勻平鋪在固體lb培養(yǎng)基上，自然晾干后，取5
?μ
l稀釋濃度的dpo58滴在雙層平板上，緩沖液作為陰性對(duì)照，37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過(guò)夜，濃度為100、25、6.256、1.56、0.39和0.097
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g/ml的噬菌體解聚酶depo58使平板上形成半透明的斑點(diǎn)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌體解聚酶depo58及應(yīng)用，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌噬菌株p719，名為klebsiellaphage p719。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌體解聚酶depo58及應(yīng)用，其特征在于：所述該噬菌體解聚酶depo58為肺炎克雷伯菌噬菌株p719第58位開(kāi)放閱讀框的原核表達(dá)和純化產(chǎn)物。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌體解聚酶depo58及應(yīng)用，其特征在于：所述該噬菌體解聚酶depo58的核苷酸序列如seqidno：1所示。氨基酸序列如seq id no：2所示。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌體解聚酶depo58及應(yīng)用，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌包括kl2型肺炎克雷伯菌。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌體解聚酶depo58及應(yīng)用，其特征在于：所述s1中肺炎克雷伯菌噬菌株p719第58位開(kāi)放閱讀框的depo58基因pcr產(chǎn)物經(jīng)純化后連接至pet28a質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)為ndei和xhoi。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌體解聚酶depo58及應(yīng)用，其特征在于：所述用于構(gòu)建解聚酶表達(dá)載體的上游引物f（seqidno:3）的dna序列為：5
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gtgccgcgcggcagccatatggcactatacagacaaggcaaa-3’。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌體解聚酶depo58及應(yīng)用，其特征在于：所述用于構(gòu)建解聚酶表達(dá)載體下游引物r（seqidno:4）的dna序列為：5
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gtggtggtggtggtgctcgagttagataaagtttattagaacgccatcg-3’。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌體解聚酶depo58及應(yīng)用，其特征在于：該解聚酶depo58可對(duì)kl2型肺炎克雷伯菌莢膜多糖降解。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于肺炎克雷伯菌噬菌株P(guān)719的解聚酶Depo58及應(yīng)用，該噬菌體解聚酶Depo58的制備包括如下步驟：S1.通過(guò)PCR及基因片段純化獲得肺炎克雷伯菌噬菌株P(guān)719第58位開(kāi)放閱讀框的depo58基因片段，將該depo58基因片段連接至pET28a質(zhì)粒上，得到pET28a-depo58質(zhì)粒；S2.將pET28a-depo58質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21。基于肺炎克雷伯菌噬菌株P(guān)719的噬菌體解聚酶Depo58及應(yīng)用：通過(guò)對(duì)肺炎克雷伯菌噬菌株P(guān)719第58位開(kāi)放閱讀框（orf58），進(jìn)行原核表達(dá)和純化而獲得了噬菌體解聚酶Depo58，該解聚酶能夠清除KL2型肺炎克雷伯菌所形成的莢膜多糖，并且具有對(duì)生物被膜的形成具有高效的抑制作用的潛力，可廣泛應(yīng)用于制備抗生素替代制劑及醫(yī)療器械消毒劑中，具有顯著地臨床效果。具有顯著地臨床效果。具有顯著地臨床效果。
