293細胞補料培養基及其制備和應用的制作方法
脯氨酸的濃度為80mg/l-379mg/l，所述甘氨酸的濃度為60mg/l-450mg/l，所述l-精氨酸鹽酸鹽的濃度為86mg/l-327mg/l，所述胱氨酸的濃度為45mg/l-645mg/l，所述谷氨酰胺的濃度為292mg/l-3504mg/l，所述l-組氨酸的濃度為84mg/l-630mg/l，所述l-異亮氨酸的濃度為65mg/l-475mg/l，所述l-亮氨酸的濃度為65mg/l-1575mg/l，所述l-賴氨酸鹽酸鹽的濃度為46mg/l-2190mg/l，所述l-甲硫氨酸的濃度為60mg/l-450mg/l，所述l-苯丙氨酸的濃度為52mg/l-990mg/l，所述l-絲氨酸的濃度為84mg/l-330mg/l，所述l-蘇氨酸的濃度為67mg/l-425mg/l，所述l-氨酸的濃度為32mg/l-1240mg/l，所述l-酪氨酸的濃度為78mg/l-1560mg/l，所述l-纈氨酸的濃度為88mg/l-1410mg/l。
12.在本發明的一些實施方式中，所述氯化膽堿的濃度為4mg/l-124.6mg/l，所述泛酸鈣的濃度為1.6mg/l-50mg/l，所述葉酸的濃度為2.3mg/l-60mg/l，所述煙酰胺的濃度為2.8mg/l-50mg/l，所述鹽酸吡哆醇的濃度為1.4mg/l-50mg/l，所述核黃素的濃度為0.8mg/l-40mg/l，所述鹽酸硫胺素的濃度為4mg/l-60mg/l，所述肌醇的濃度為4.2mg/l-108mg/l，所述維生素b12的濃度為2.8mg/l-20mg/l。
13.在本發明的一些實施方式中，所述九水硝酸鐵的濃度為0.01mg/l-10mg/l，所述七水氯化鎂的濃度為100mg/l-3005mg/l，所述氯化鉀的濃度為400mg/l-6000mg/l，所述磷酸二氫鈉的濃度為141mg/l-1700mg/l，所述硫酸銅的濃度為0.005mg/l-0.1mg/l，所述硫酸鋅的濃度為0.86mg/l-13mg/l，所述亞硒酸鈉的濃度為40mg/l-600mg/l。
14.在本發明的一些實施方式中，所述293細胞補料培養基包含120mg/l-160mg/l l-谷氨酸、180mg/l-220mg/l l-脯氨酸、135mg/l-160mg/l甘氨酸、110mg/l-130mg/l l-精氨酸鹽酸鹽、300mg/l-330mg/l胱氨酸、1700mg/l-2000mg/l谷氨酰胺、200mg/l-220mg/l l-組氨酸、300mg/l-350mg/l l-異亮氨酸、435mg/l-475mg/l l-亮氨酸、700mg/l-750mg/l l-賴氨酸鹽酸鹽、125mg/l-170mg/l l-甲硫氨酸、250mg/l-300mg/l l-苯丙氨酸、200mg/l-230mg/l l-絲氨酸、250mg/l-300mg/l l-蘇氨酸、650mg/l-700mg/l l-氨酸、700mg/l-760mg/l l-酪氨酸、350mg/l-400mg/l l-纈氨酸、30mg/l-40mg/l氯化膽堿、30mg/l-40mg/l泛酸鈣、5mg/l-6mg/l葉酸、30mg/l-40mg/l煙酰胺、7mg/l-8mg/l鹽酸吡哆醇、20mg/l-30mg/l核黃素、5mg/l-6mg/l鹽酸硫胺素、60mg/l-70mg/l肌醇、4mg/l-5mg/l維生素b12、0.2mg/l-1mg/l九水硝酸鐵、750mg/l-850mg/l七水氯化鎂、800mg/l-1200mg/l氯化鉀、500mg/l-600mg/l磷酸二氫鈉、0.005mg/l-0.05mg/l硫酸銅、3mg/l-4mg/l硫酸鋅、100mg/l-200mg/l亞硒酸鈉、5500mg/l-6500mg/l葡萄糖、125mg/l-175mg/l丙酮酸鈉、15mg/l-20mg/l次黃嘌呤、2.5mg/l-3.5mg/l胸腺嘧啶核苷和水。
15.在本發明的一些實施方式中，所述293細胞補料培養基的ph值為6.8-7.4。
16.在本發明的第二方面，提供第一方面所述的293細胞補料培養基的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：混合所述的氨基酸、維生素、無機鹽、葡萄糖、丙酮酸鈉、次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷和水，制備所述293細胞補料培養基。
17.在本發明的一些實施方式中，所述制備方法還包括將混合所得混合物的ph值調節至6.8-7.4的步驟。
18.在本發明的第三方面，提供一種293細胞的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：
19.將293細胞接種于生長培養基中培養，培養的過程中添加第一方面所述的293細胞
補料培養基，制備293細胞。
20.在本發明的一些實施方式中，添加的次數為1次-10次，每次添加的所述293細胞補料培養基的體積占所述生長培養基的體積的0.5％-10％。
21.在本發明的一些實施方式中，所述生長培養基為293無血清懸浮培養基。
22.在本發明的一些實施方式中，所述293細胞的類型為懸浮型。
23.在本發明的一些實施方式中，培養的時間為8d-16d。
24.在本發明的第四方面，提供一種腺病毒的生產方法，所述生產方法包括如下步驟：
25.將293細胞接種于生長培養基中進行第一階段培養，補加如第一方面所述的293細補料培養基，腺病毒接毒，進行第二階段培養。
26.在本發明的一些實施方式中，所述生產方法具有如下技術特征中的一個或者多個：
27.(1)所述生長培養基為293無血清懸浮培養基；
28.(2)所述293細胞的類型為懸浮型；
29.(3)補加的所述293細補料培養基的體積是所述生長培養基的體積的8％-12％；
30.(4)第一階段培養所得培養產物中的細胞密度為(3-4)
×
106cells/ml，補加所述293細補料培養基；
31.(5)第一階段培養的時間為48h-72h。
32.相對于傳統技術，本發明具備如下有益效果：
33.本發明通過氨基酸、維生素和無機鹽種類的選擇，并搭配葡萄糖、丙酮酸鈉、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷，形成特定配方的培養基配方，在采用生長培養基培養293細胞的過程中補加該培養基配方，能夠很好地維持細胞密度增長并保持較高的細胞活率，同時維持細胞蛋白抗體濃度持續升高。同時，本發明還發現該補料培養基可以作為部分病毒生產工藝中的補料，有助于提高病毒滴度。
附圖說明
34.為了更清楚地說明本技術實施例中的技術方案、更完整地理解本技術及其有益效果，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單的介紹。顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本技術的一些實施例，對本領域技術人員來說，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
35.圖1為本發明所述補料培養基和對比例培養細胞的活細胞密度和細胞活率隨時間的變化圖；
36.圖2為本發明所述補料培養基和對比例添加至轉染后的293細胞工藝中活細胞密度和細胞活率隨時間的變化圖；
37.圖3為本發明所述補料培養基和對比例添加至轉染后的293細胞工藝中所收獲蛋白抗體濃度隨著培養天數的變化圖；
38.圖4為實施例和對比例添加補料培養基后的腺病毒表達滴度隨著培養天數的變化圖；
39.圖5為實施例和對比例添加補料培養基后的腺相關病毒(aav)表達滴度隨著培養天數的變化圖。
具體實施方式
40.下面結合附圖、實施方式和實施例，對本發明作進一步詳細的說明。應理解，這些實施方式和實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍，提供這些實施方式和實施例的目的是使對本發明公開內容理解更加透徹全面。還應理解，本發明可以以許多不同的形式來實現，并不限于本文所描述的實施方式和實施例，本領域技術人員可以在不違背本發明內涵的情況下作各種改動或修改，得到的等價形式同樣落于本技術的保護范圍。此外，在下文的描述中，給出了大量具體的細節以便提供對本發明更為充分地理解，應理解，本發明可以無需一個或多個這些細節而得以實施。
41.除非另有定義，本文所使用的所有的技術和科學術語與屬于本發明的技術領域的技術人員通常理解的含義相同。本文中在本發明的說明書中所使用的術語只是為了描述實施方式和實施例的目的，不是旨在于限制本發明。
42.術語
43.除非另外說明或存在矛盾之處，本文中使用的術語或短語具有以下含義：
44.本文所使用的術語“和/或”、“或/和”、“及/或”的選擇范圍包括兩個或兩個以上相關所列項目中任一個項目，也包括相關所列項目的任意的和所有的組合，所述任意的和所有的組合包括任意的兩個相關所列項目、任意的更多個相關所列項目、或者全部相關所列項目的組合。需要說明的是，當用至少兩個選自“和/或”、“或/和”、“及/或”的連詞組合連接至少三個項目時，應當理解，在本技術中，該技術方案毫無疑問地包括均用“邏輯與”連接的技術方案，還毫無疑問地包括均用“邏輯或”連接的技術方案。比如，“a及/或b”包括a、b和a+b三種并列方案。又比如，“a，及/或，b，及/或，c，及/或，d”的技術方案，包括a、b、c、d中任一項(也即均用“邏輯或”連接的技術方案)，也包括a、b、c、d的任意的和所有的組合，也即包括a、b、c、d中任兩項或任三項的組合，還包括a、b、c、d的四項組合(也即均用“邏輯與”連接的技術方案)。
45.本發明中涉及“多個”、“多種”、“多次”、“多元”等，如無特別限定，指在數量上大于2或等于2。例如，“一種或多種”表示一種或大于等于兩種。
46.本文中所使用的“其組合”、“其任意組合”、“其任意組合方式”等中包括所列項目中任兩個或任兩個以上項目的所有合適的組合方式。
47.本文中，“合適的組合方式”、“合適的方式”、“任意合適的方式”等中所述“合適”，以能夠實施本發明的技術方案、解決本發明的技術問題、實現本發明預期的技術效果為準。
48.本文中，“優選”、“更好”、“更佳”、“為宜”僅為描述效果更好的實施方式或實施例，應當理解，并不構成對本發明保護范圍的限制。
49.本發明中，“進一步”、“更進一步”、“特別”等用于描述目的，表示內容上的差異，但并不應理解為對本發明保護范圍的限制。
50.本發明中，“可選地”、“可選的”、“可選”，指可有可無，也即指選自“有”或“無”兩種并列方案中的任一種。如果一個技術方案中出現多處“可選”，如無特別說明，且無矛盾之處或相互制約關系，則每項“可選”各自獨立。
51.本發明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，術語“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等僅用于描述目的，不能理解為指示或暗示相對重要性或數量，也不能理解為隱含指明所指示的技術特征的重要性或數量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第
四”等僅起到非窮舉式的列舉描述目的，應當理解并不構成對數量的封閉式限定。
52.本發明中，以開放式描述的技術特征中，包括所列舉特征組成的封閉式技術方案，也包括包含所列舉特征的開放式技術方案。
53.本發明中，涉及到數值區間(也即數值范圍)，如無特別說明，可選的數值分布在上述數值區間內視為連續，且包括該數值范圍的兩個數值端點(即最小值及最大值)，以及這兩個數值端點之間的每一個數值。如無特別說明，當數值區間僅僅指向該數值區間內的整數時，包括該數值范圍的兩個端點整數，以及兩個端點之間的每一個整數，在本文中，相當于直接列舉了每一個整數，比如t為選自1～10的整數，表示t為選自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10構成的整數組的任一個整數。此外，當提供多個范圍描述特征或特性時，可以合并這些范圍。換言之，除非另有指明，否則本文中所公開之范圍應理解為包括其中所歸入的任何及所有的子范圍。
54.本發明中的溫度參數，如無特別限定，既允許為恒溫處理，也允許在一定溫度區間內存在變動。應當理解的是，所述的恒溫處理允許溫度在儀器控制的精度范圍內進行波動。允許在如
±
5℃、
±
4℃、
±
3℃、
±
2℃、
±
1℃的范圍內波動。
55.本發明中，％(w/w)與wt％均表示重量百分比，％(v/v)指體積百分比，％(w/v)指質量體積百分數。
56.在本發明提及的所有文獻都在本技術中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。除非和本技術的發明目的和/或技術方案相沖突，否則，本發明涉及的引用文獻以全部內容、全部目的被引用。本發明中涉及引用文獻時，相關技術特征、術語、名詞、短語等在引用文獻中的定義也一并被引用。本發明中涉及引用文獻時，被引用的相關技術特征的舉例、優選方式也可作為參考納入本技術中，但以能夠實施本發明為限。應當理解，當引用內容與本技術中的描述相沖突時，以本技術為準或者適應性地根據本技術的描述進行修正。
57.293細胞無血清培養基眾多，既有提高細胞密度的培養基，又有提高瞬時轉染或蛋白表達的培養基，還有提高病毒表達方面的專用培養基，例如cn109294976a、cn104450607b、cn104450607b、cn111793595a、cn112501113b、cn111826341a記載的培養基，以及市售的dmem培養基。然而這些培養基并不適用于作為補料培養基應用293細胞的培養。目前還缺少在生產過程中一次或多次添加的293細胞補料培養基，以補充持續培養工藝中實際營養成分與293細胞所需營養成分的匹配。市面上已報道的補料培養基有cho細胞補料培養基，通常屬于cho細胞專用培養基，不適用于293細胞的培養。
58.為此，本發明通過氨基酸、維生素和無機鹽的選擇，以及葡萄糖、丙酮酸鈉、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的搭配，形成特定配方的培養基配方，在采用生長培養基培養293細胞的過程中補加該培養基配方，能夠很好地維持細胞密度增長并保持較高的細胞活率，同時維持細胞蛋白抗體濃度持續升高。
59.本發明提供的293細胞補料培養基：不含碳酸氫鈉，不存在該補料培養基因為長時間放置引起的二氧化碳溢出的情況，狀態穩定；添加了谷氨酰胺，以補充293細胞對于谷氨酰胺需求量大的情況；不含氯化鈣在內的ca
2+
成分，更適用于293細胞的培養；通過單次或多次補加，在延長293細胞生長周期、維持高密度生長和活率方面效果良好，可以應用于重組蛋白、單抗或病毒表達的生產過程中；培養基成分明確，無血清無蛋白無動物來源，利于下
谷氨酸、180mg/l-220mg/l l-脯氨酸、135mg/l-160mg/l甘氨酸、110mg/l-130mg/l l-精氨酸鹽酸鹽、300mg/l-330mg/l胱氨酸、1700mg/l-2000mg/l谷氨酰胺、200mg/l-220mg/l l-組氨酸、300mg/l-350mg/l l-異亮氨酸、435mg/l-475mg/l l-亮氨酸、700mg/l-750mg/l l-賴氨酸鹽酸鹽、125mg/l-170mg/l l-甲硫氨酸、250mg/l-300mg/l l-苯丙氨酸、200mg/l-230mg/l l-絲氨酸、250mg/l-300mg/l l-蘇氨酸、650mg/l-700mg/l l-氨酸、700mg/l-760mg/l l-酪氨酸、350mg/l-400mg/l l-纈氨酸、30mg/l-40mg/l氯化膽堿、30mg/l-40mg/l泛酸鈣、5mg/l-6mg/l葉酸、30mg/l-40mg/l煙酰胺、7mg/l-8mg/l鹽酸吡哆醇、20mg/l-30mg/l核黃素、5mg/l-6mg/l鹽酸硫胺素、60mg/l-70mg/l肌醇、4mg/l-5mg/l維生素b12、0.2mg/l-1mg/l九水硝酸鐵、750mg/l-850mg/l七水氯化鎂、800mg/l-1200mg/l氯化鉀、500mg/l-600mg/l磷酸二氫鈉、0.005mg/l-0.05mg/l硫酸銅、3mg/l-4mg/l硫酸鋅、100mg/l-200mg/l亞硒酸鈉、5500mg/l-6500mg/l葡萄糖、125mg/l-175mg/l丙酮酸鈉、15mg/l-20mg/l次黃嘌呤、2.5mg/l-3.5mg/l胸腺嘧啶核苷和水。
69.在本發明的一些實施方式中，所述293細胞補料培養基的ph值為6.8-7.4。ph值例如為6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4。
70.本發明提供一種293細胞補料培養基的配方，進而提供該補料培養基的配制方法，實施例還涉及部分補料培養基添加策略，通過單次或多次添加該補料培養基策略，維持293細胞密度和活率，適用于規模化培養，并有利于重組蛋白、單抗、病毒及載體的復制表達
71.本發明的第二方面
72.本發明提供第一方面所述的293細胞補料培養基的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：混合所述的氨基酸、維生素、無機鹽、葡萄糖、丙酮酸鈉、次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷和水，制備所述293細胞補料培養基。
73.在本發明的一些實施方式中，所述水的溫度為30℃-50℃。例如30℃、35℃、40℃、45℃、50℃。
74.在本發明的一些實施方式中，所述制備方法還包括將混合所得混合物的ph調節至6.8-7.4的步驟。例如將ph調節至6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4。
75.在本發明的一些實施方式中，所述制備方法還包括對混合所得混合物進行除菌的步驟。除菌的方式可以為過濾除菌，例如用0.22微米孔徑的過濾器過濾除菌。
76.本發明的第三方面
77.本發明提供一種293細胞的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：
78.將293細胞接種于生長培養基中培養，培養的過程中添加第一方面所述的293細胞補料培養基，制備293細胞。
79.在本發明的一些實施方式中，添加的次數為1次-10次，每次添加的所述293細胞補料培養基的體積占所述生長培養基的體積的0.5％-10％。添加的次數例如1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次。每次添加的所述293細胞補料培養基的體積占所述生長培養基的體積的0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％。補加可以是培養的第一天、也可以為規定間隔的補加策略，還可以是連續多次補加等。
80.在本發明的一些實施方式中，培養的方式包括但不限于：批次培養、補料批次培養、灌流培養等方式。
81.在本發明的一些實施方式中，所述生長培養基為293無血清懸浮培養基。本發明中的293細胞均可通過商業化途徑獲得，狀態穩定，分散性較好，完全適應在無血清懸浮生長培養基中進行懸浮培養，能夠規模化生產。
82.在本發明的一些實施方式中，所述293細胞的類型為懸浮型。包括：atcc crl-1573。
83.在本發明的一些實施方式中，培養的時間為8d-16d。例如為8d、9d、10d、11d、12d、13d、14d、15d、16d。
84.在本發明的一些實施方式中，培養的條件包括：36.5℃-37.5℃、4.5％-5.5％co2、110rpm-130rpm。培養的溫度例如為36.5℃、37℃、37.5℃。co2的濃度例如4.5％、5％、5.5％。轉速例如為110rpm、115rpm、120rpm、125rpm、130rpm。
85.在本發明的一些實施方式中，所述hek293細胞的接種接種密度為0.5
×
106cells/ml-1.5
×
106cells/ml。例如為0.5
×
106cells/ml、1
×
106cells/ml、1.5
×
106cells/ml。
86.在本發明的一些實施方式中，培養的過程中，細胞每隔3天進行傳代，密度在2.0
×
106cells/ml-5.0
×
106cells/ml，活率在90％以上。
87.本發明的第四方面
88.本發明提供一種腺病毒的生產方法，所述生產方法包括如下步驟：
89.將293細胞接種于生長培養基中進行第一階段培養，補加如第一方面所述的293細補料培養基，腺病毒接毒，進行第二階段培養。
90.在本發明的一些實施方式中，所述生產方法具有如下技術特征中的一個或者多個：
91.(1)所述生長培養基為293無血清懸浮培養基；
92.(2)所述293細胞的類型為懸浮型；
93.(3)補加的所述293細補料培養基的體積是所述生長培養基的體積的8％-12％；
94.(4)第一階段培養所得培養產物中的細胞密度為(3-4)
×
106cells/ml，補加所述293細補料培養基；
95.(5)第一階段培養的時間為48h-72h。
96.本發明中，補加的所述293細補料培養基的體積是所述生長培養基的體積的例如8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％。
97.本發明中，第一階段培養所得培養產物中的細胞密度例如為3
×
106cells/ml、3.1
×
106cells/ml、3.2
×
106cells/ml、3.3
×
106cells/ml、3.4
×
106cells/ml、3.5
×
106cells/ml、3.6
×
106cells/ml、3.7
×
106cells/ml、3.8
×
106cells/ml、3.9
×
106cells/ml、4
×
106cells/ml，補加所述293細補料培養基。
98.本發明中，第一階段培養的時間例如為48h、50h、52h、54h、56h、58h、60h、62h、64h、66h、68h、70h、72h。
99.具體實施例
100.下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，優先參考本發明中給出的指引，還可以按照本領域的實驗手冊或常規條件，還可以按照制造廠商所建議的條件，或者參考本領域已知的實驗方法。
101.下述的具體實施例中，涉及原料組分的量度參數，如無特別說明，可能存在稱量精度范圍內的細微偏差。涉及溫度和時間參數，允許儀器測試精度或操作精度導致的可接受的偏差。
102.實施例1、hek293細胞補料培養基及其補料培養效果
103.1、hek293細胞補料培養基及其制備
104.按照表1所示成分配制hek293細胞補料培養基，成分及配方與基礎配方dmem培養基成分及含量對比如下：
105.表1
106.107.所述hek293細胞補料培養基的制備方法包括如下步驟：
108.(1)按表1稱取各成分，按類型分成氨基酸、維生素、無機鹽和其他組分(包括葡萄糖、丙酮酸鈉、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷)；
109.(2)使用純化水溶解分別溶解(1)所述各組分，水溫控制在30℃-50℃之間。過程中可加入一定量的5m氫氧化鈉以促進混合物的溶解；
110.(3)將(2)所述各組分溶解物混合，使用鹽酸或氫氧化鈉調節ph至6.9-7.10，使用純化水定容，0.22微米濾器除菌過濾，即得所述hek293細胞補料培養基。
111.參照上述制備方法，按照表2所示成分及濃度配制對照培養基配方。
112.表2
113.[0114][0115]
2、hek293細胞補料培養基細胞測試方案
[0116]
生長培養基：cd hek293 374；
[0117]
測試細胞：hek293懸浮型細胞；
[0118]
培養容器：corning 250ml帶濾膜三角搖瓶；
[0119]
接種密度和工作體積：1
×
106cells/ml，50ml；
[0120]
培養條件：37℃，5％co2，120
±
5rpm(搖床軌道直徑25mm)；
[0121]
補料培養基：表1和表2所示的補料培養基配方；
[0122]
補料培養基添加策略：不補加作為空白對照；第4、6、8、10天各補加1次，每次補加比例為工作體積的5％。
[0123]
培養天數：14天，期間不再添加葡萄糖之外的其他成分。
[0124]
hek 293細胞按照1
×
106cells/ml密度接種在生長培養基中，工作體積50ml，在250ml搖瓶中進行流加培養，每天取樣進行細胞計數，監測細胞密度和細胞活率。
[0125]
實驗設置兩個補料培養基添加策略(見下表3)：
[0126]
a.在培養過程中不添加補料培養基，作為空白對比；
[0127]
b.分別在培養第4天、第6天、第8天、第10天分別添加5％比例的表1和表2所示的補料培養基。培養至第14天，期間維持殘糖量在3g/l-6g/l，監測細胞的密度和活率隨培養時間的變化。
[0128]
表3
[0129][0130][0131]
3、實施例和對比例細胞培養效果
[0132]
表1的配方1至配方3與表2的對照配方1至對照配方4的細胞培養結果見附圖1和表4。
[0133]
表4
[0134][0135][0136]
表1的配方1至配方3相對于表2的對照配方1至對照配方4，營養成分更適合293細胞的培養，可用于維持293懸浮細胞高密度全懸浮生長及維持較高活率，進而可提高293細胞相關產品的產能。
[0137]
4、轉染及蛋白表達方面的效果
[0138]
(1)實驗材料
[0139]
1)細胞株：expi293f。
[0140]
2)生長轉染培養基：expi293 expression medium(gibco)。
[0141]
3)補料培養基：
[0142]
表1中的配方1和表2中的對照配方1所示的補料培養基；
[0143]
對比例為gibco轉染和促表達專用的商業化產品(expi293 enhancer 1&enhancer 2)。
[0144]
4)培養容器和體積：corning 250ml帶濾膜三角搖瓶，50ml。
[0145]
5)轉染密度：3
×
106cells/ml。
[0146]
6)培養條件：37℃，5％co2，120
±
5rpm(搖床軌道直徑25mm)。
[0147]
7)轉染方式：expifectamine 293transfection kit(gibco)。
[0148]
(2)實驗方法
[0149]
按照expifectamine 293transfection kit說明書的操作步驟進行細胞培養和轉染，轉染體積50ml，轉染細胞密度3
×
106cells/ml，轉染后放置于37℃，5％co2，120
±
5rpm(搖床軌道直徑25mm)培養條件下培養。轉染第1天后開始補加補料培養基，過程中不再補加任何其他試劑，包括葡萄糖。轉染后每隔24h監測細胞密度和細胞活率，48h后開始跟蹤蛋白表達情況。試驗周期8天。
[0150]
補料培養基添加策略設置如下：
[0151]
表5
[0152]
條件expi293 enhancer 1expi293 enhancer 2表1配方1/表2對照配方1對比例第1天補加5
‰
第1天補加5％/實施例//第1天補加10％
[0153]
(3)實施例與對比例實驗結果
[0154]
實驗結果見圖2、圖3和表6。
[0155]
圖2為實施例和對比例添加至轉染后的293細胞工藝中活細胞密度和細胞活率隨時間的變化圖。
[0156]
圖3為實施例和對比例添加至轉染后的293細胞工藝中所收獲蛋白抗體濃度隨著培養天數的變化圖。
[0157]
表6
[0158][0159]
根據圖2、圖3和表6結果，在同一轉染條件、同一生長轉染培養基的條件下，優選補料培養基配方與對比例相比，不僅提高了細胞密度和維持活率，同時獲得更多的瞬時表達抗體。
[0160]
5、病毒培養方面的效果
[0161]
(1)實驗材料
[0162]
1)細胞株：hek293懸浮細胞株。
[0163]
2)生長及生產培養基：hek293 sfm 615。
[0164]
3)補料培養基：
[0165]
表1和表2所示的補料培養基(表1所示配方1以及表2所示對照配方1)；
[0166]
對比例為原有批次工藝，不添加補料。
[0167]
4)培養容器和體積：corning 250ml帶濾膜三角搖瓶，60ml。
[0168]
5)接毒時細胞密度：4
×
106cells/ml。
[0169]
6)培養條件：37℃，5％co2，120
±
5rpm(搖床軌道直徑25mm)。
[0170]
7)接毒方式：直接接毒
[0171]
(2)實驗方法
[0172]
按照批次培養工藝培養hek293懸浮細胞，細胞密度達到4.0
×
106cells/ml時，按照5moi進行接毒，接毒體積50ml，根據表5實驗設計添加補料培養基，接毒，接毒后放置于37℃，5％co2，120
±
5rpm(搖床軌道直徑25mm)培養條件下培養。過程中不再補加任何其他試劑，包括葡萄糖。接毒后48h及72h收獲病毒液進行病毒滴度檢測。
[0173]
補料培養基添加策略設置如下：
[0174]
表7
[0175]
條件表1配方1表2對照配方1對比例//配方1接毒前補加10％/對照配方1 接毒前補加10％
[0176]
(3)實施例與對比例實驗結果
[0177]
實驗結果見圖4、圖5、表8和表9。
[0178]
圖4為實施例和對比例添加補料培養基后的腺病毒表達滴度隨著培養天數的變化圖。
[0179]
圖5為實施例和對比例添加補料培養基后的腺相關病毒(aav)表達滴度隨著培養天數的變化圖。
[0180]
表7為實施例和對比例添加補料培養基后的腺病毒表達細胞密度和活率變化情況。
[0181]
表8為實施例和對比例添加補料培養基后的腺相關病毒(aav)表達細胞密度和活率變化情況。
[0182]
表7
[0183][0184][0185]
表8
[0186][0187]
根據圖4和圖5，在同一接毒條件下，優選補料培養基配方與對比例相比，可獲得更
高的腺病毒表達滴度，但對于腺相關病毒(aav)的表達，優選補料培養基配方與對比例相比優點并不突出。
[0188]
以上所述實施方式和實施例的各技術特征可以進行任意合適方式的組合，為使描述簡潔，未對上述實施方式和實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存在矛盾，都應當認為在本說明書記載的范圍中。
[0189]
以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，便于具體和詳細地理解本發明的技術方案，但并不能因此而理解為對發明專利保護范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，得到的等價形式同樣落于本技術的保護范圍。還應當理解，本領域技術人員在本發明提供的技術方案的基礎上，通過合乎邏輯的分析、推理或者有限的試驗得到的技術方案，均在本發明所附權利要求的保護范圍內。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求的內容為準，說明書及附圖可以用于解釋權利要求的內容。
技術特征：
400mg/l l-纈氨酸、30mg/l-40mg/l氯化膽堿、30mg/l-40mg/l泛酸鈣、5mg/l-6mg/l葉酸、30mg/l-40mg/l煙酰胺、7mg/l-8mg/l鹽酸吡哆醇、20mg/l-30mg/l核黃素、5mg/l-6mg/l鹽酸硫胺素、60mg/l-70mg/l肌醇、4mg/l-5mg/l維生素b12、0.2mg/l-1mg/l九水硝酸鐵、750mg/l-850mg/l七水氯化鎂、800mg/l-1200mg/l氯化鉀、500mg/l-600mg/l磷酸二氫鈉、0.005mg/l-0.05mg/l硫酸銅、3mg/l-4mg/l硫酸鋅、100mg/l-200mg/l亞硒酸鈉、5500mg/l-6500mg/l葡萄糖、125mg/l-175mg/l丙酮酸鈉、15mg/l-20mg/l次黃嘌呤、2.5mg/l-3.5mg/l胸腺嘧啶核苷和水；(2)所述293細胞補料培養基的ph值為6.8-7.4。4.權利要求1至3任一項所述的293細胞補料培養基的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟：混合所述的氨基酸、維生素、無機鹽、葡萄糖、丙酮酸鈉、次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷和水，制備所述293細胞補料培養基。5.根據權利要求4所述的293細胞補料培養基的制備方法，其特征在于，所述制備方法還包括將混合所得混合物的ph值調節至6.8-7.4的步驟。6.一種293細胞的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括如下步驟：將293細胞接種于生長培養基中培養，培養的過程中添加權利要求1至6任一項所述的293細胞補料培養基，制備293細胞。7.根據權利要求6所述的293細胞的制備方法，其特征在于，添加的次數為1次-10次，每次添加的所述293細胞補料培養基的體積占所述生長培養基的體積的0.5％-10％。8.根據權利要求6或者7所述的293細胞的制備方法，其特征在于，所述制備方法具有如下技術特征中的一個或者多個：(1)所述生長培養基為293無血清懸浮培養基；(2)所述293細胞的類型為懸浮型；(3)培養的時間為8d-16d。9.一種腺病毒的生產方法，其特征在于，所述生產方法包括如下步驟：將293細胞接種于生長培養基中進行第一階段培養，補加如權利要求1至3任一項所述的293細補料培養基，腺病毒接毒，進行第二階段培養。10.根據權利要求9所述的腺病毒的生產方法，其特征在于，所述生產方法具有如下技術特征中的一個或者多個：(1)所述生長培養基為293無血清懸浮培養基；(2)所述293細胞的類型為懸浮型；(3)補加的所述293細補料培養基的體積是所述生長培養基的體積的8％-12％；(4)第一階段培養所得培養產物中的細胞密度為(3-4)
×
106cells/ml，補加所述293細補料培養基；(5)第一階段培養的時間為48h-72h。
技術總結
本發明涉及一種293細胞補料培養基及其制備和應用，所述293細胞補料培養基包含氨基酸、維生素無機鹽、葡萄糖、丙酮酸鈉、次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷和水。相對于傳統技術，本發明具備如下有益效果：本發明通過氨基酸、維生素和無機鹽種類的選擇，并搭配葡萄糖、丙酮酸鈉、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷，形成特定配方的培養基配方，在采用生長培養基培養293細胞的過程中補加該培養基配方，能夠很好地維持細胞密度增長并保持較高的細胞活率，同時維持細胞蛋白抗體濃度持續升高，同時該補料對于病毒的表達滴度亦有幫助作用。亦有幫助作用。亦有幫助作用。
