一種基于磁性COF復合材料的miRA光電化學生物傳感器及其制備方法和應用
一種基于磁性cof復合材料的mirna光電化學生物傳感器及其制備方法和應用
技術領域
1.本發明屬于功能生物材料和生物傳感技術領域，具體涉及一種基于磁性cof復合材料的mirna光電化學生物傳感器及其制備方法和應用。
背景技術：
2.microrna(mirna)是由19-24個核苷酸構成的內源性非編碼rna。mirna在多種疾病的發生和發展階段皆存在異常表達，可以作為非創傷性診斷的標志物。因此，發展靈敏檢測mirna的分析方法對于臨床診斷具有重要意義。然而，由于mirna的序列長度短、濃度低、序列同源性高且易降解，準確地檢測mirna極具挑戰。當前，應用最為廣泛的mirna檢測方法包括印跡法、反轉錄聚合酶鏈反應法以及微陣列法。其中，印記法是檢測mirna的標準方法，但該方法耗時長、靈敏度低且樣品需求量大。反轉錄聚合酶鏈反應法雖然具有靈敏度高和特異性好的優勢，但是所需的引物短，導致該方法檢測準確度不高。此外，該方法中存在的反轉錄步驟使得實驗復雜性增加，同時増加了實驗成本。盡管微陣列分析法可以實現mirna的多重檢測，但其重現性低、交叉雜交及非特異性吸附等問題降低了檢測的準確度。因此，開發一種高特異性、高靈敏度且簡便的mirna檢測方法是十分必要的。
3.光電化學(pec)生物傳感器依靠光敏材料與電極之間的電子和空穴的轉移，能夠將生化指標轉化為可讀取的光電信號，其靈敏度高、背景信號低，比傳統檢測方法更有優勢。另外，該傳感技術由于成本低，操作簡單且易于小型化，目前已被推廣應用于各類生物檢測中。然而，傳統的pec傳感器在檢測過程中是基于光電信號相對于背景信號的增強或減弱進行分析，其缺點在于共存干擾物易于造成假陽性或假陰性信號，導致檢測的特異性和靈敏度降低。針對上述問題，光電流極性翻轉策略是一種理想的選擇。光電流極性翻轉型光電化學生物傳感器的構建可以實現在目標物存在的情況下光電流的極性發生改變，因而具備高靈敏度和高選擇性的優勢。
4.在pec生物傳感器中，光電活性材料的選擇至關重要。一些傳統光電材料，如硫化物、氮化碳、氧化物等，由于光電性能良好而廣泛應用于pec傳感領域。然而，對于多數傳統活性材料構建的pec傳感器，在檢測中都需加入電子供體，如抗壞血酸和過氧化氫等，從而補償電子消耗而獲得穩定的pec信號。同時，光電子在光電活性材料和電子供體間的傳遞是分子間的傳遞過程，這大大降低了電子傳遞的效率和穩定性，因而限制了光電流響應信號強度的提高。電子供體-受體型(d-a)共價有機框架材料(cof)是由供電子基團和吸電子基團構成的新型半導體?；赿-a cof的pec分析無需在檢測液中加入電子供體即可獲得良好的光電信號。另外，d-a cof能實現分子內的電子轉移，具備自增強效應，有望提升pec傳感的性能，在pec傳感領域具有潛在應用前景。因此，基于供體-受體型cof材料優異的光電性質，發展新的光電流極性翻轉體系，構建可用于靈敏檢測mirna的pec生物傳感器具有重要意義。
技術實現要素：
5.本發明的目的是結合催化發卡自組裝(cha)信號放大策略與磁分離技術，發展一種基于磁性cof復合材料的光電流極性翻轉型光電化學生物傳感器用于高靈敏、高特異性地檢測復雜樣品中的mirna。如附圖1所示，首先，發卡結構dna(hp1)修飾的fe3o4@d-a cof(fe3o4@d-a cof-hp1)通過堿基互補配對從復雜樣品中高效富集目標物mirna，并打開hp1的發卡結構。隨后，修飾znse量子點(qds)的發卡結構dna hp2(znse qds-hp2)的引入啟動cha反應，取代mirna。釋放的mirna進而與下一個發卡結構的hp1雜交，引發下一個cha反應，如此循環使得fe3o4@d-a cof表面捕獲大量的znse qds，從而實現信號放大。最后，利用磁性吸附將磁性復合物引入到磁性工作電極表面，在光照下檢測pec信號變化，從而實現對目標物的高靈敏、特異性檢測。其中，znse qds作為一種光敏材料，與d-a cof在能級上相匹配，這不僅有利于光生載流子的轉移，還能誘導磁性cof復合材料(fe3o4@d-a cof)的光電流極性發生改變。所提出的基于znse qds誘導磁性cof復合材料新型光電流極性翻轉體系有利于提升pec生物傳感器的特異性。此外，通過更換相應的hp1和hp2，可實現不同種類mirna的檢測。
6.基于上述目的，本發明所涉及的技術方案如下：
7.(1)fe3o4@d-a cof-hp1的制備
8.a.fe3o4的制備
9.首先，將fecl3·
6h2o(0.24～1.88g)溶解于10～80ml乙二醇中。隨后，依次加入0.40～1.86g乙酸鈉和0.10～1.00g檸檬酸鈉，攪拌10～90min。將混合溶液轉移到具有聚四氟乙烯內襯的不銹鋼反應釜中，并在150～220℃下反應6～20h。冷卻至室溫后，用磁鐵收集產物，用去離子水和乙醇洗滌數次，然后真空干燥。
10.b.fe3o4@d-a cof的制備
11.稱取10～50mg的fe3o4，將其分散在5～50ml的乙腈溶液中，超聲處理10～60min。然后加入1,3,5-三(4-氨苯基)苯(0.1～0.3mmol)，室溫下用搖床緩慢搖晃2～8h。隨后，加入0.1～0.4mmol的2,5-二甲氧基對苯-1,4-二甲醛和1～8ml的冰醋酸(6～12mol/l)，繼續室溫搖晃12～36h后，外加磁場分離產物，用甲醇洗滌3次，最后真空干燥。
12.c.羧基化fe3o4@d-a cof(fe3o4@d-a cof-paa)的制備
13.將0.5～2ml的聚丙烯酸(paa)溶液(5mg/ml)與0.5～2ml含有0.1m edc/nhs(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/n-羥基丁二酰亞胺)的水溶液混合后，在黑暗中搖晃10～40min。然后，加入0.5～2ml的fe3o4@d-a cof溶液(4mg/ml)。將混合溶液搖晃12～36h后，用超純水洗滌3次，并進行磁分離。最后，將產品分散在2ml的超純水中，并在4℃下保存備用。
14.d.fe3o4@d-a cof-hp1的制備
15.將10～200μl羧基化的fe3o4@d-a cof分散液與10～200μl含有0.1m的edc/nhs溶液混合，搖晃10～40min，經磁分離和磷酸鹽緩沖(pbs)溶液(0.1m，ph＝7.4)洗滌后，加入10～200μl含有hp1(100μm)的pbs溶液，然后在25～40℃下反應40～90min，得到fe3o4@d-a cof-hp1。經磁分離和pbs溶液洗滌后用1％牛血清白蛋白(bsa)封閉剩余的活性位點，然后將其重新分散在100μl的pbs溶液中備用。
16.(2)znse qds-hp2的制備
17.a.znse qds的制備
18.在氮氣氣氛下，將28～240mg的nabh4加入1～8ml超純水中，再加入22～220mg的se粉，由此獲得的nahse作為se前驅體。將100～400mg的zn(ch3cooh)2溶解在5～40ml超純水中，在90～110℃下用n2鼓泡攪拌，然后加入200～500μl的巰基丙酸(mpa)。在n2保護下，用0.1～1m naoh將溶液的ph值調節至9～11，將1～5ml的nahse溶液快速注入上述溶液中。反應2～6h后，獲得mpa包覆的znse qds溶液。用乙醇萃取三次后，以8000rpm的速度離心除去未反應的試劑，得到純化的znse qds。加入超純水超聲分散得到1～4mg/ml的znse qds分散液，4℃下避光儲存備用。
19.b.znse qds-hp2的制備
20.將10～200μl的znse qds分散液加到含有0.1m edc/nhs的200μl pbs(0.1m，ph＝7.4)溶液中，反應20～60min。用pbs離心洗滌后，加入50～300μl含150μm hp2的pbs，在37℃下反應1～3h，用pbs離心洗滌3次，得到znse qds-hp2。最后，用1％bsa封閉，并重新分散于200μl pbs溶液中，在4℃儲存備用。
21.(3)光電化學生物傳感器的制備
22.首先，將10～100μl的fe3o4@d-a cof-hp1溶液和10～100μl的znse qds-hp2溶液加到10～100μl不同濃度的mirna樣品中，反應10～60min。由于hp2和hp1之間的結合位點更多，hp2的加入可以引發cha，mirna被置換下來并進入下一個循環。將得到的fe3o4@d-a cof-hp1/znse qds-hp2復合物經磁分離和pbs洗滌后，分散在100μl的pbs溶液中。最后，將分散液(10～30μl)滴在磁性氧化銦錫(ito)電極表面，磁性復合物被電極迅速捕獲，在氙燈照射下的pbs溶液中進行pec測試。其中，飽和甘汞電極和鉑電極分別作為參比電極和對電極，與工作電極共同構成三電極體系。
23.所述的mirna為：mirna-1、mirna-16、mirna-21、mirna-34a、mirna-107、mirna-133a、mirna-138、mirna-141、mirna-146a、mirna-155、mirna-373等。
24.發明原理：本發明中的fe3o4@d-a cof具有優異的光電性能和很強的磁性，并修飾有大量的探針hp1。當有目標物mirna存在時，hp1修飾的fe3o4@d-a cof可以從復雜樣品中高效富集目標物。因此，使用fe3o4@d-a cof，可以簡化實驗操作步驟并可以聚集分析物，從而提高生物傳感器的靈敏度。目標mirna的存在使得fe3o4@d-a cof-hp1的hp1發卡結構打開，但是由于hp2和hp1之間的結合位點更多，因而znse qds-hp2的加入可以引發cha反應，釋放mirna進入下一個循環，從而可以在fe3o4@d-acof表面捕獲更多的znse qds，有利于低濃度目標物的檢測。最后，利用磁性吸附將磁性復合物引入到磁性工作電極表面，在光照下檢測pec信號變化，實現對目標物的高靈敏、高特異性檢測。其優點在于：
25.(1)高靈敏度。本發明使用的d-a cof和znse qds，均是光電性能良好的光電材料，極低濃度目標物的引入就可以引起明顯的光電流信號輸出；另一方面，采用催化發卡自組裝策略，通過循環釋放目標mirna實現信號放大。
26.(2)特異性強，常見其他mirna和電活性/電惰性干擾物對目標mirna檢測均無干擾。原因在于：一方面，本發明是基于目標mirna序列設計的兩條發卡結構dna序列(hp1和hp2)，目標mirna與hp1堿基互補配對結合打開hp1發卡結構，使得hp2能與hp1通過堿基互補配對結合，引發cha反應，其他mirna序列不同，不能引發cha反應；另一方面，僅目標mirna能誘導znse qds-hp2與fe3o4@d-acof-hp1的結合，引發光電流極性翻轉，但其他mirna和電活
性/電惰性干擾物的存在無法誘導znse qds-hp2與fe3o4@d-a cof-hp1結合，不能使光電流極性發生改變。故均對本檢測體系無干擾。
27.(3)檢測方法簡便、快速。將fe3o4@d-acof-hp1、znse qds-hp2、目標mirna放進同一個容器中，實現快速識別并形成光電流極性翻轉體系znse qds//fe3o4@d-a cof，通過磁輔助快速分離并吸附到磁性ito電極上，即可檢測得到即時的光電化學極性翻轉信號，實現目標物高靈敏、高選擇性檢測。
28.(4)此方法具有普適性。只需根據目標mirna序列設計相應的發卡結構dna(hp1和hp2)，即可實現對不同mirna的檢測。
29.綜上所述，本發明基于磁性cof復合材料，將光電流極性翻轉策略、催化發卡自組裝信號放大策略以及磁分離技術有機結合，構建一種mirna光電化學生物傳感器，具有高靈敏度、高特異性、普適性、簡便快速、易于操作等優點，可以實現復雜樣品中低濃度mirna的檢測，具有良好的即時和臨床檢測應用前景。
附圖說明
30.圖1為所述的基于磁性cof復合材料的mirna光電化學生物傳感器的制備流程圖；
31.圖2為所述的光電化學生物傳感器對mirna-138檢測的光電響應圖；
32.圖3為所述的光電化學生物傳感器對mirna-138檢測的標準曲線圖；
33.圖4為所述的光電化學生物傳感器的選擇性實驗數據圖。
具體實施方式
34.下面通過具體實施例，并結合附圖對本發明的技術方案作進一步詳細描述。
35.下述實施例中，所有寡核苷酸均購買自生工生物工程股份有限公司(中國上海)。
36.實施例1fe3o4@d-a cof-hp1和znse qds-hp2的制備
37.(1)fe3o4@d-a cof-hp1的制備
38.a.fe3o4的制備
39.首先，將fecl3·
6h2o(1.36g)溶解于40ml乙二醇中。隨后，依次加入1.44g乙酸鈉和0.40g檸檬酸鈉，攪拌50min。將混合溶液轉移到具有聚四氟乙烯內襯的不銹鋼反應釜中，并在200℃下反應14h。冷卻至室溫后，用磁鐵收集產物，用去離子水和乙醇洗滌數次，然后真空干燥。
40.b.fe3o4@d-a cof的制備
41.稱取30mg的fe3o4，將其分散在30ml的乙腈溶液中，超聲處理30min。然后加入1,3,5-三(4-氨苯基)苯(0.24mmol)，室溫下用搖床緩慢搖晃6h。隨后，加入0.36mmol的2,5-二甲氧基對苯-1,4-二甲醛和6ml的冰醋酸(12mol/l)，繼續室溫搖晃24h后，外加磁場分離產物，用甲醇洗滌3次，最后真空干燥。
42.c.羧基化fe3o4@d-a cof(fe3o4@d-a cof-paa)的制備
43.將1ml的paa溶液(5mg/ml)與1ml含有0.1m edc/nhs的水溶液混合后，在黑暗中搖晃30min。然后，加入1ml的fe3o4@d-a cof溶液(4mg/ml)。將混合溶液搖晃24h后，用超純水洗滌3次，并進行磁分離。最后，將產品分散在2ml的超純水中，并在4℃下保存備用。
44.d.fe3o4@d-a cof-hp1的制備
45.將100μl羧基化的fe3o4@d-a cof分散液與100μl含有0.1m的edc/nhs溶液混合，搖晃30min用pbs溶液洗滌后，加入100μl含有hp1(100μm)的pbs溶液，然后在37℃下反應60min，得到fe3o4@d-acof-hp1，所述的hp1(發卡結構dna)的序列為5
’?
nh
2-(ch2)
6-cggcctgattcacaacaccagctccatgtgtagaagctggtgttgtgaatc-3’。然后用pbs洗滌并用1％bsa封閉后，將其重新分散在100μl的pbs溶液中備用。
46.(2)znse qds-hp2的制備
47.a.znse qds的制備
48.在氮氣氣氛下，將132mg的nabh4加入4ml超純水中，再加入110mg的se粉，由此獲得的nahse作為se前驅體。將229mg的zn(ch3cooh)2溶解在25ml超純水中，在100℃下用n2鼓泡攪拌，然后加入375μl mpa。在n2保護下，用1m naoh將溶液的ph值調節至10，將2.85ml的nahse溶液快速注入上述溶液中。反應5h后，獲得mpa包覆的znse qds溶液。用乙醇萃取三次后，以8000rpm的速度離心除去未反應的試劑，得到純化的znse qds。加入超純水超聲分散得到2mg/ml的znse qds分散液，4℃下避光儲存備用。
49.b.znse qds-hp2的制備
50.將100μl的znse qds加到含有0.1m edc/nhs的200μl pbs(0.1m，ph＝7.4)溶液中，反應30min。用pbs離心洗滌后，加入200μl含150μm hp2的pbs，在37℃下反應2h，用pbs離心洗滌3次，得到znse qds-hp2，所述的hp2(發卡結構dna)的序列為5
’?
nh
2-(ch2)
6-caccagcttctacacatggagctggtgttgtgaatccatgtgtaga-3’。最后，用1％bsa封閉，然后重新分散于200μl pbs溶液中，在4℃儲存備用。
51.實施例2標準樣品和人血清樣品中mirna的檢測
52.基于實施例1制備的fe3o4@d-a cof-hp1和znse qds-hp2，將10μl的fe3o4@d-a cof-hp1溶液和100μl的znse qds-hp2溶液加到100μl含有不同濃度的mirna的標準溶液/人血清溶液中，反應30min。將得到的fe3o4@d-a cof-hp1/znse qds-hp2復合物用pbs洗滌并進行磁分離，分散在100μl的pbs溶液中。最后，將分散液(20μl)滴在磁性ito電極表面，磁性復合物被電極迅速捕獲，氙燈照射下，在pbs溶液中進行pec測試。
53.實施例3mirna-138的檢測
54.基于實施例1和實施例2的過程，以mirna-138為目標物模型進行檢測，所述的mirna-138序列為5
’?
agcugguguugugaaucaggccg-3’，且所制備的fe3o4@d-a cof-hp1和znse qds-hp2中hp1和hp2的序列是根據目標物mirna-138的序列設計的，記錄在加入不同mirna-138標準濃度下的光電流響應曲線。mirna-138標準溶液的濃度從a到j分別為0fm、1fm、5fm、10fm、50fm、100fm、1pm、10pm、30pm、50pm。結果如附圖2，隨著mirna-138濃度的增加，極性翻轉的光電流信號強度隨之增加。并且如附圖3所示，可以觀察到pec光電流信號大小與mirna-138濃度的對數在1fm
–
10pm之間呈現良好的線性關系。線性相關方程為δi(na)＝672.26logc
mirna-138(fm)+1380.66(r2＝0.9924)。δi＝i
–
i0，i和i0是分別在mirna-138存在和不存在情況下的光電流數值。檢測限計算值為0.42fm，表明該傳感器具有極好的分析性能。上述實驗結果說明了我們所提出的分析方法具有靈敏檢測mirna的應用價值。
55.實施例4選擇性和抗干擾實驗
56.在選擇性和抗干擾實驗中，目標物mirna-138濃度為1pm，所用到的其他干擾物名稱及濃度如下：mirna-155(10pm)、mirna-141(10pm)、mirna-21(10pm)與mirna-107(10pm)。
按上述實施例1、實施例2和實施例3的步驟，用其他mirna代替mirna-138用于選擇性檢測，將其他mirna與mirna-138混合用于抗干擾性檢測。結果如附圖4所示，與mirna-138對比，其他mirna的引入并未引起光電流信號極性翻轉，基本接近空白信號，說明本發明方法對目標mirna-138的檢測具有極好的選擇性。此外，其它mirna與mirna-138混合后，并未影響光電流的極性翻轉及翻轉后的信號強度，說明本發明所提出的傳感器對目標mirna的檢測具有極好的抗干擾性能。
57.上述說明是針對本發明可行實施例的詳細說明，但實施例并非用以限定本發明的專利申請范圍，凡本發明所提示的技術精神下所完成的同等變化或修飾變更，均應屬于本發明所涵蓋專利范圍。
