含吡唑多環類衍生物的自由堿晶型及其制備方法和應用與流程
1.本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種含吡唑多環類衍生物的自由堿晶型及其制備方法和應用。
背景技術：
2.p2x受體(p2x receptors)或稱為p2x嘌呤受體(p2x purinoreceptor)是一個陽離子滲透型atp配體門控離子通道家族，能同細胞外的atp結合。p2x受體具有七個亞基，以同源三聚體i或異源三聚體的形式存在，主要表達于神經系統的神經末梢(突觸前和突觸后)，調節突觸傳遞。p2x3受體是p2x家族成員之一，是感受上呼吸道刺激和觸發咳嗽反射的關鍵感覺受體，被認為在特定感覺神經的致敏(sensitisation)中發揮了關鍵作用，參與疼痛和咳嗽，并參與骨癌痛的感知，阻斷p2x3可以抑制咳嗽的信號刺激。
3.咳嗽是機體的防御性神經反射，有利于清除呼吸道分泌物和有害因子，但頻繁劇烈的咳嗽會對患者等工作、生活和社會活動造成嚴重影響。咳嗽分為急性、亞急性、慢性咳嗽。慢性咳嗽(chronic cough)為咳嗽時間》8周，以咳嗽為主要或唯一癥狀者，胸部影像學檢查肺內無明顯病變。慢性咳嗽一直被認為是各種疾病的后果，如哮喘/嗜酸性支氣管炎、鼻炎和胃食管反酸病。然而，最近的證據表明，慢性咳嗽是一種臨床癥狀，具有獨特的內在病理生理學特征的神經過敏。不明原因慢性咳嗽或特發性咳嗽，此類以慢性刺激性干咳為主要表現，對外界刺激較敏感，普遍存在咳嗽高敏感性，咳嗽高敏感性是其生理病理機制。咳嗽相關傳入神經異常可能是難治性或原因不明的慢性咳嗽的原因。慢性咳嗽可引起心血管、消化、神經、泌尿、肌肉骨骼等多個系統的并發癥，如尿失禁、暈厥、失眠、焦慮等。
4.基于咳嗽高敏綜合癥的病理生理學特征，應以降低咳嗽敏感性為目的。目前選擇有限，包括藥物手段和非藥物手段。臨床研究結果顯示神經調節因子類藥物加巴噴丁有效，其他藥物如阿米替林，巴氯芬、卡馬西平、普瑞巴林等亦可選用。嚴重咳嗽可適當給予鎮咳，鎮咳藥物主要分為中樞性鎮咳藥和外周性鎮咳藥。中樞性鎮咳藥物分為依賴性鎮咳藥(類生物堿及其衍生物)和非依賴性鎮咳藥(人工合成的右美沙芬和噴托維林)，前者具有成癮性和麻醉性等副作用，后者臨床應用十分廣泛。外周性鎮咳藥也稱為末梢鎮咳藥，通過抑制咳嗽反射弧中的某一環節而起到鎮咳作用，包括局部麻醉藥(那可丁、苯佐那酯)和黏膜防護劑(苯丙哌林和莫吉司坦)。
5.目前，市場上尚未有已批準上市的p2x3受體拮抗劑小分子藥物。現在處在臨床階段的p2x3受體拮抗劑藥物有默克(merck&co)的mk-7264，其用于慢性咳嗽、疼痛和肺纖維化等疾病，其對p2x3/p2x2/3選擇性低，安全性好但具有味覺喪失等副作用，目前適應癥慢性咳嗽已經入臨床iii期研究。貝勒斯健康(bellus health)的blu5937，具有較高的選擇性，且在i期臨床試驗中未出現味覺等副作用，2020年7月6日，貝勒斯健康公布了blu-5937的2期relief試驗在難治性慢性咳嗽患者中的主要研究結果：在ii期臨床研究中，relief試驗在任何劑量下均未達到安慰劑調整后咳嗽頻率降低的主要終點的統計學意義。另外，拜耳(bayer)的bay-1817080和bay-1902607，shionogi公司的s-600918，適應癥慢性咳嗽目前
處在臨床i/ii期。因此，迫切需要開發安全性好、非成癮麻醉性、具有高選擇性的p2x3受體抑制劑藥物用于慢性咳嗽等疾病，以滿足巨大的市場需求。
6.江蘇豪森藥業集團有限公司的專利申請(申請號：pct/cn2020/134264)中公開了一系列含吡唑多環類衍生物抑制劑的結構，在后續的研發中，為了使產物易于處理、過濾、干燥，便于儲存、產品長期穩定、生物利用度高等，本發明對上述物質的晶型進行了全面的研究，致力于得到最適合的晶型。
技術實現要素：
7.專利申請pct/cn2020/134264所涉及的所有內容均以引證的方式添加到本發明中。
8.本發明的目的在于提供一種通式(i)所示化合物或其立體異構體的晶型，
[0009][0010]
其中：
[0011]
r1選自氫、氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、硝基、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
烷氧基、鹵代c
1-6
烷氧基、c
1-6
羥烷基、c
3-12
環烷基、-(ch2)nc(o)ra、3-12元雜環基、c
6-14
芳基或5-14元雜芳基，所述的氨基、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
烷氧基、鹵代c
1-6
烷氧基、c
1-6
羥烷基、c
3-12
環烷基、-(ch2)nc(o)ra、3-12元雜環基、c
6-14
芳基和5-14元雜芳基，任選地被氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、硝基、氧代基、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
鹵代烷氧基、c
1-6
羥烷基、氰基取代的c
1-6
烷基、c
3-12
環烷基、3-12元雜環基、c
6-12
芳基和5-12元雜芳基中的一個或多個取代基所取代；
[0012]
ra選自氫、氘、鹵素、氨基、硝基、羥基、氰基、c
1-6
烷基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
羥烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
鹵代烷氧基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基或5-10元雜芳基，所述的氨基、c
1-6
烷基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
羥烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
鹵代烷氧基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基和5-10元雜芳基，任選地被氘、鹵素、氨基、硝基、羥基、氰基、羧基、氧代基、硫代基、c
1-6
烷基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
羥烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
鹵代烷氧基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基和5-10元雜芳基中的一個或多個取代基所取代；
[0013]
r2選自氫、氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、硝基、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
烷氧基、鹵代c
1-6
烷氧基、c
1-6
羥烷基、c
3-12
環烷基、3-12元雜環基、c
6-14
芳基或5-14元雜芳基，所述的氨基、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
烷氧基、鹵代c
1-6
烷氧基、c
1-6
羥烷基、c
3-12
環烷基、3-12元雜環基、c
6-14
芳基和5-14
元雜芳基，任選地被氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、硝基、氧代基、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
鹵代烷氧基、c
1-6
羥烷基、氰基取代的c
1-6
烷基、c
3-12
環烷基、3-12元雜環基、c
6-12
芳基和5-12元雜芳基中的一個或多個取代基所取代；
[0014]
r3選自氫、氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、氧代基、硫代基、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
羥烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
鹵代烷氧基、c
3-8
環烷基、3-12元雜環基、c
6-14
芳基或5-14元雜芳基；且
[0015]
x為0～3的整數，優選0、1或2，更優選0或1；
[0016]
n為0～3的整數，優選0、1或2，更優選0或1。
[0017]
在本發明的優選方案中，通式(i)進一步進一步如通式(ii)所示：
[0018][0019]
在本發明的優選方案中，所述r1選自氫、氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、硝基、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
烷氧基、鹵代c
1-6
烷氧基、c
1-6
羥烷基、c
3-8
環烷基、-(ch2)nc(o)ra、3-8元雜環基、c
6-10
芳基或5-10元雜芳基，所述的氨基、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
烷氧基、鹵代c
1-6
烷氧基、c
1-6
羥烷基、c
3-8
環烷基、-(ch2)
n1
c(o)ra、3-8元雜環基、c
6-10
芳基和5-10元雜芳基，任選地被氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、硝基、氧代基、c
1-3
烷基、c
2-3
烯基、c
2-3
炔基、c
1-3
氘代烷基、c
1-3
鹵代烷基、c
1-3
烷氧基、c
1-3
鹵代烷氧基、c
1-3
羥烷基、氰基取代的c
1-3
烷基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基和5-10元雜芳基中的一個或多個取代基所取代；
[0020]
ra選自氫、氘、鹵素、氨基、硝基、羥基、氰基、c
1-3
烷基、c
1-3
氘代烷基、c
1-3
鹵代烷基、c
1-3
羥烷基、c
1-3
烷氧基、c
1-3
鹵代烷氧基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基或5-10元雜芳基，所述的氨基、c
1-3
烷基、c
1-3
氘代烷基、c
1-3
鹵代烷基、c
1-3
羥烷基、c
1-3
烷氧基、c
1-3
鹵代烷氧基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基和5-10元雜芳基，任選地被氘、鹵素、氨基、硝基、羥基、氰基、羧基、氧代基、硫代基、c
1-3
烷基、c
1-3
氘代烷基、c
1-3
鹵代烷基、c
1-3
羥烷基、c
1-3
烷氧基、c
1-3
鹵代烷氧基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基和5-10元雜芳基中的一個或多個取代基所取代；
[0021]
優選地，r1選自氫、鹵素、氨基、氰基、c
1-3
烷基、c
2-6
烯基、、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
烷氧基、鹵代c
1-6
烷氧基、c
1-6
羥烷基、c
3-8
環烷基、-(ch2)nc(o)ra、含1-3個選自氮、氧或硫原子的3-8元雜環基、c
6-10
芳基或含1-3個選自氮、氧或硫原子5-10元雜芳基，所述的氨基、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
烷氧基、鹵代c
1-6
烷氧基、c
1-6
羥烷基、c
3-8
環烷基、-(ch2)
n1
c(o)ra、含1-3個選自氮、氧或硫原子的3-8元雜環基、c
6-10
芳基或含1-3個選自氮、氧或硫原子5-10元雜芳基，任選地被氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、硝基、氧代基、c
1-3
烷基、c
1-3
氘代烷基、c1-3
鹵代烷基、c
1-3
烷氧基、c
1-3
鹵代烷氧基、c
1-3
羥烷基、氰基取代的c
1-3
烷基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基和5-10元雜芳基中的一個或多個取代基所取代；
[0022]
ra選自氫、氘、鹵素、氨基、氰基、c
1-3
烷基、c
1-3
氘代烷基、c
1-3
鹵代烷基、c
1-3
羥烷基、c
1-3
烷氧基、c
1-3
鹵代烷氧基、c
3-6
環烷基或含1-2個選自n或o的4-6元雜環基，所述的氨基c
1-3
烷基、c
1-3
氘代烷基、c
1-3
鹵代烷基、c
1-3
羥烷基、c
1-3
烷氧基、c
1-3
鹵代烷氧基、c
3-6
環烷基或含1-2個選自n或o的4-6元雜環基，任選地被氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、硝基、氧代基、c
1-3
烷基、c
1-3
氘代烷基、c
1-3
鹵代烷基、c
1-3
烷氧基、c
1-3
鹵代烷氧基、c
1-3
羥烷基、氰基取代的c
1-3
烷基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基和5-10元雜芳基中的一個或多個取代基所取代；
[0023]
更優選地，r1選自以下基團：
[0024]-h、-nh2、-f、-cl、-br、-cn、-ch3、-ch2ch3、-cf3、、
[0025]
r2選自氫、氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、硝基、c
1-3
烷基、c
2-3
烯基、c
2-3
炔基、c
1-3
氘代烷基、c
1-3
鹵代烷基、c
1-3
烷氧基、鹵代c
1-3
烷氧基、c
1-3
羥烷基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基或5-10元雜芳基，優選氫、氨基、氰基、氟、氯、溴、甲基、異丙基、三氟甲基、甲氧基、環丙基或嗎啉基；
[0026]
r3選自氫、氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、氧代基、硫代基、c
1-3
烷基、c
2-3
烯基、c
2-3
炔基、c
1-3
氘代烷基、c
1-3
鹵代烷基、c
1-3
羥烷基、c
1-3
烷氧基、c
1-3
鹵代烷氧基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基或5-1.元雜芳基，優選氫或氰基。
[0027]
在本發明的優選方案中，所述化合物的具體結構如下：
[0028]
[0029][0030]
在本發明優選的方案中，所述晶型為化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶型。
[0031]
在本發明的優選方案中，提供化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶型i～vii。
[0032]
在本發明的優選方案中，化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶型i的x-射線粉末衍射圖譜在18.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在20.8
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在11.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在24.2
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在24.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在21.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在15.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在26.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在32.0
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在26.3
±
0.2
°
處具有衍射峰；優選包含上述衍射峰中的任意2-5處，或者3-5處，或者3-6處，或者3-8處，或者5-8處，或者6-8處，更優選包含其中任意6處、7處或8處；
[0033]
優選地，晶型i的x-射線粉末衍射圖譜至少包含位于2θ為18.1
±
0.2
°
、20.8
±
0.2
°
、11.7
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選包含其中兩條，更優選包含三條；任選的，進一步還可以包含位于2θ為24.2
±
0.2
°
、24.7
±
0.2
°
、21.1
±
0.2
°
、15.7
±
0.2
°
、26.7
±
0.2
°
中的至少一條，優選至少包含其中2條、3條、4條或5條；
[0034]
更優選地，所述晶型i的x-射線粉末衍射圖譜任選還包含位于2θ為32.0
±
0.2
°
、26.3
±
0.2
°
、28.4
±
0.2
°
、17.6
±
0.2
°
、30.1
±
0.2
°
、35.9
±
0.2
°
、27.3
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰；優選至少包含其中任意2-3處，或者4-5處，或者6-7處；進一步優選，至少包含其中任意2處、3處、4處、5處、6處、7處；
[0035]
進一步優選地，所述晶型i的x-射線粉末衍射圖譜包含位于2θ為18.1
±
0.2
°
、20.8
±
0.2
°
、11.7
±
0.2
°
、24.2
±
0.2
°
、24.7
±
0.2
°
、21.1
±
0.2
°
、15.7
±
0.2
°
、26.7
±
0.2
°
、32.0
±
0.2
°
、26.3
±
0.2
°
、28.4
±
0.2
°
、17.6
±
0.2
°
、30.1
±
0.2
°
、35.9
±
0.2
°
、27.3
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選的，至少包含其中任選的4處、5處、6處、8處或10處有衍射峰；
[0036]
最優選的，在本發明進一步優選的實施方式中，化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶型i，使用cu-kα輻射，以2θ角和晶面間距d值表示的x-射線特征衍射峰如表1所示。
[0037]
表1
[0038][0039]
本發明實施例17化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶型i，其x-射線粉末衍射圖譜基本如圖1所示；其dsc圖譜基本如圖2所示。
[0040]
在本發明的優選方案中，化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶型ii的x-射線粉末衍射圖譜在27.3
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在20.2
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在27.6
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在22.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在30.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在28.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在10.4
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在19.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在22.0
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在13.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；優選包含上述衍射峰中的任意2-5處，或者3-5處，或者3-6處，或者3-8處，或者5-8處，或者6-8處，更優選包含其中任意6處、7處或8處；
[0041]
優選地，晶型ii的x-射線粉末衍射圖譜至少包含位于2θ為27.3
±
0.2
°
、20.2
±
0.2
°
、27.6
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選包含其中兩條，更優選包含三條；任選的，進一步還可以包含位于2θ為22.5
±
0.2
°
、30.1
±
0.2
°
、28.5
±
0.2
°
、10.4
±
0.2
°
、19.5
±
0.2
°
中的至少一條，優選至少包含其中2條、3條、4條或5條；
[0042]
更優選地，晶型ii的x-射線粉末衍射圖譜任選還包含位于2θ為22.0
±
0.2
°
、13.7
±
0.2
°
、20.9
±
0.2
°
、22.3
±
0.2
°
、30.4
±
0.2
°
、19.8
±
0.2
°
、21.5
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰；優選至少包含其中任意2-3處，或者4-5處，或者6-7處；進一步優選，至少包含其中任意2處、3處、4處、5處、6處、7處；
[0043]
進一步優選地，晶型ii的x-射線粉末衍射圖譜包含位于2θ為27.3
±
0.2
°
、20.2
±
0.2
°
、27.6
±
0.2
°
、22.5
±
0.2
°
、30.1
±
0.2
°
、28.5
±
0.2
°
、10.4
±
0.2
°
、19.5
±
0.2
°
、22.0
±
0.2
°
、13.7
±
0.2
°
、20.9
±
0.2
°
、22.3
±
0.2
°
、30.4
±
0.2
°
、19.8
±
0.2
°
、21.5
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選的，至少包含其中任選的4處、5處、6處、8處或10處有衍射峰；
[0044]
在本發明進一步優選地實施方式中，化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的自由堿晶型ii，使用cu-kα輻射，以2θ角和晶面間距d值表示的x-射線特征衍射峰如表2所示。
[0045]
表2
[0046][0047][0048]
本發明化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧
啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶型ii，其x-射線粉末衍射圖譜基本如圖3所示；其dsc圖譜基本如圖4所示。
[0049]
在本發明的優選方案中，化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶型iii的x-射線粉末衍射圖譜在12.2
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在5.9
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在24.4
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在17.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在17.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在8.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在20.2
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者11.8
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在24.8
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在8.8
±
0.2
°
處具有衍射峰；優選包含上述衍射峰中的任意2-5處，或者3-5處，或者3-6處，或者3-8處，或者5-8處，或者6-8處，更優選包含其中任意6處、7處或8處；
[0050]
優選地，晶型iii的x-射線粉末衍射圖譜至少包含位于2θ為12.2
±
0.2
°
、5.9
±
0.2
°
、24.4
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選包含其中兩條，更優選包含三條；任選的，進一步還可以包含位于2θ為17.1
±
0.2
°
、17.7
±
0.2
°
、8.5
±
0.2
°
、20.2
±
0.2
°
、11.8
±
0.2
°
中的至少一條，優選至少包含其中2條、3條、4條或5條；更優選地，晶型iii的x-射線粉末衍射圖譜任選還包含位于2θ為24.8
±
0.2
°
、8.8
±
0.2
°
、22.6
±
0.2
°
、27.4
±
0.2
°
、23.6
±
0.2
°
、20.8
±
0.2
°
、23.4
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰；優選至少包含其中任意2-3處，或者4-5處，或者6-7處；進一步優選，至少包含其中任意2處、3處、4處、5處、6處、7處；
[0051]
進一步優選地，晶型iii的x-射線粉末衍射圖譜包含位于2θ為12.2
±
0.2
°
、5.9
±
0.2
°
、24.4
±
0.2
°
、17.1
±
0.2
°
、17.7
±
0.2
°
、8.5
±
0.2
°
、20.2
±
0.2
°
、11.8
±
0.2
°
、24.8
±
0.2
°
、8.8
±
0.2
°
、22.6
±
0.2
°
、27.4
±
0.2
°
、23.6
±
0.2
°
、20.8
±
0.2
°
、23.4
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選的，至少包含其中任選的4處、5處、6處、8處或10處有衍射峰；
[0052]
在本發明進一步優選地實施方式中，化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的自由堿晶型iii，使用cu-kα輻射，以2θ角和晶面間距d值表示的x-射線特征衍射峰如表3所示。
[0053]
表3
[0054][0055]
本發明化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶型iii，其x-射線粉末衍射圖譜基本如圖5所示；其dsc圖譜基本如圖6所示。
[0056]
在本發明的優選方案中，化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶型iv的x-射線粉末衍射圖譜在10.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在7.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在15.2
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在17.4
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在24.8
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在19.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在10.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在22.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在26.9
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在24.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；優選包含上述衍射峰中的任意2-5處，或者3-5處，或者3-6處，或者3-8處，或者5-8處，或者6-8處，更優選包含其中任意6處、7處或8處；
[0057]
優選地，晶型iv的x-射線粉末衍射圖譜至少包含位于2θ為10.5
±
0.2
°
、7.5
±
0.2
°
、15.2
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選包含其中兩條，更優選包含三條；任選的，進一步還可以包含位于2θ為17.4
±
0.2
°
、24.8
±
0.2
°
、19.5
±
0.2
°
、10.1
±
0.2
°
、22.5
±
0.2
°
中的至少一條，優選至少包含其中2條、3條、4條或5條；
[0058]
更優選地，晶型iv的x-射線粉末衍射圖譜任選還包含位于2θ為26.9
±
0.2
°
、24.1
±
0.2
°
、14.4
±
0.2
°
、11.3
±
0.2
°
、24.5
±
0.2
°
、16.8
±
0.2
°
、20.4
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰；優選至少包含其中任意2-3處，或者4-5處，或者6-7處；進一步優選，至少包含其中任意2處、3處、4處、5處、6處、7處；
[0059]
進一步優選地，晶型iv的x-射線粉末衍射圖譜包含位于2θ為10.5
±
0.2
°
、7.5
±
0.2
°
、15.2
±
0.2
°
、17.4
±
0.2
°
、24.8
±
0.2
°
、19.5
±
0.2
°
、10.1
±
0.2
°
、22.5
±
0.2
°
、26.9
±
0.2
°
、24.1
±
0.2
°
、14.4
±
0.2
°
、11.3
±
0.2
°
、24.5
±
0.2
°
、16.8
±
0.2
°
、20.4
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選的，至少包含其中任選的4處、5處、6處、8處或10處有衍射峰；
[0060]
在本發明進一步優選地實施方式中，化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的自由堿晶型iv，使用cu-kα輻射，以2θ角和晶面間距d值表示的x-射線特征衍射峰如表4所示。
[0061]
表4
[0062][0063][0064]
本發明化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧
啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶型iv，其x-射線粉末衍射圖譜基本如圖7所示；其dsc圖譜基本如圖8所示。
[0065]
在本發明的優選方案中，化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶型v的x-射線粉末衍射圖譜在13.9
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在18.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在24.0
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在19.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在25.9
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在12.9
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在14.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在21.0
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在30.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在22.6
±
0.2
°
處具有衍射峰；優選包含上述衍射峰中的任意2-5處，或者3-5處，或者3-6處，或者3-8處，或者5-8處，或者6-8處，更優選包含其中任意6處、7處或8處；
[0066]
優選地，晶型v的x-射線粉末衍射圖譜至少包含位于2θ為13.9
±
0.2
°
、18.1
±
0.2
°
、24.0
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選包含其中兩條，更優選包含三條；任選的，進一步還可以包含位于2θ為19.7
±
0.2
°
、25.9
±
0.2
°
、12.9
±
0.2
°
、14.7
±
0.2
°
、21.0
±
0.2
°
中的至少一條，優選至少包含其中2條、3條、4條或5條；
[0067]
更優選地，晶型v的x-射線粉末衍射圖譜任選還包含位于2θ為30.7
±
0.2
°
、22.6
±
0.2
°
、15.8
±
0.2
°
、31.8
±
0.2
°
、29.5
±
0.2
°
、29.8
±
0.2
°
、22.2
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰；優選至少包含其中任意2-3處，或者4-5處，或者6-7處；進一步優選，至少包含其中任意2處、3處、4處、5處、6處、7處；
[0068]
進一步優選地，晶型v的x-射線粉末衍射圖譜包含位于2θ為13.9
±
0.2
°
、18.1
±
0.2
°
、24.0
±
0.2
°
、19.7
±
0.2
°
、25.9
±
0.2
°
、12.9
±
0.2
°
、14.7
±
0.2
°
、21.0
±
0.2
°
、30.7
±
0.2
°
、22.6
±
0.2
°
、15.8
±
0.2
°
、31.8
±
0.2
°
、29.5
±
0.2
°
、29.8
±
0.2
°
、22.2
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選的，至少包含其中任選的4處、5處、6處、8處或10處有衍射峰；
[0069]
在本發明進一步優選地實施方式中，化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的自由堿晶型v，使用cu-kα輻射，以2θ角和晶面間距d值表示的x-射線特征衍射峰如表5所示。
[0070]
表5
[0071]
[0072][0073]
本發明化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶型v，其x-射線粉末衍射圖譜基本如圖9所示；其dsc圖譜基本如圖10所示。
[0074]
在本發明的優選方案中，化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶型vi的x-射線粉末衍射圖譜在10.3
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在14.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在17.2
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在24.6
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在7.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在19.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在26.9
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在10.8
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在24.9
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在22.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；優選包含上述衍射峰中的任意2-5處，或者3-5處，或者3-6處，或者3-8處，或者5-8處，或者6-8處，更優選包含其中任意6處、7處或8處；
[0075]
優選地，，晶型vi的x-射線粉末衍射圖譜至少包含位于2θ為10.3
±
0.2
°
、14.7
±
0.2
°
、17.2
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選包含其中兩條，更優選包含三條；任選的，進一步還可以包含位于2θ為24.6
±
0.2
°
、7.5
±
0.2
°
、19.7
±
0.2
°
、26.9
±
0.2
°
、10.8
±
0.2
°
中的至少一條，優選至少包含其中2條、3條、4條或5條；
[0076]
更優選地，晶型vi的x-射線粉末衍射圖譜任選還包含位于2θ為24.9
±
0.2
°
、22.5
±
0.2
°
、30.2
±
0.2
°
、28.7
±
0.2
°
、21.0
±
0.2
°
、5.4
±
0.2
°
、24.0
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰；優選至少包含其中任意2-3處，或者4-5處，或者6-7處；進一步優選，至少包含其中任意2處、3處、4處、5處、6處、7處；
[0077]
進一步優選地，晶型vi的x-射線粉末衍射圖譜包含位于2θ為10.3
±
0.2
°
、14.7
±
0.2
°
、17.2
±
0.2
°
、24.6
±
0.2
°
、7.5
±
0.2
°
、19.7
±
0.2
°
、26.9
±
0.2
°
、10.8
±
0.2
°
、24.9
±
0.2
°
、22.5
±
0.2
°
、30.2
±
0.2
°
、28.7
±
0.2
°
、21.0
±
0.2
°
、5.4
±
0.2
°
、24.0
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選的，至少包含其中任選的4處、5處、6處、8處或10處有衍射峰；
[0078]
在本發明進一步優選地實施方式中，化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的自由堿晶型vi，使用cu-kα輻射，以2θ角和晶面間距d值表示的x-射線特征衍射峰如表6所示。
[0079]
表6
[0080][0081]
本發明化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶型vi，其x-射線粉末衍射圖譜基本如圖11所示；其dsc圖譜基本如圖12所示。
[0082]
在本發明的優選方案中，化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶型vii的x-射線粉末衍射圖譜在10.6
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在15.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在17.7
±
0.2
°
處具
有衍射峰；或者在25.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在11.0
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在20.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在7.6
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在25.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在5.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在21.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；優選包含上述衍射峰中的任意2-5處，或者3-5處，或者3-6處，或者3-8處，或者5-8處，或者6-8處，更優選包含其中任意6處、7處或8處；
[0083]
優選地，晶型vii的x-射線粉末衍射圖譜至少包含位于2θ為10.6
±
0.2
°
、15.1
±
0.2
°
、17.7
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選包含其中兩條，更優選包含三條；任選的，進一步還可以包含位于2θ為25.1
±
0.2
°
、11.0
±
0.2
°
、20.1
±
0.2
°
、7.6
±
0.2
°
、25.5
±
0.2
°
中的至少一條，優選至少包含其中2條、3條、4條或5條；
[0084]
更優選地，晶型vii的x-射線粉末衍射圖譜任選還包含位于2θ為5.5
±
0.2
°
、21.1
±
0.2
°
、27.3
±
0.2
°
、30.7
±
0.2
°
、30.3
±
0.2
°
、23.9
±
0.2
°
、15.9
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰；優選至少包含其中任意2-3處，或者4-5處，或者6-7處；進一步優選，至少包含其中任意2處、3處、4處、5處、6處、7處；
[0085]
進一步優選地，晶型vii的x-射線粉末衍射圖譜包含位于2θ為10.6
±
0.2
°
、15.1
±
0.2
°
、17.7
±
0.2
°
、25.1
±
0.2
°
、11.0
±
0.2
°
、20.1
±
0.2
°
、7.6
±
0.2
°
、25.5
±
0.2
°
、5.5
±
0.2
°
、21.1
±
0.2
°
、27.3
±
0.2
°
、30.7
±
0.2
°
、30.3
±
0.2
°
、23.9
±
0.2
°
、15.9
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選的，至少包含其中任選的4處、5處、6處、8處或10處有衍射峰；
[0086]
在本發明進一步優選地實施方式中，化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的自由堿晶型vii，使用cu-kα輻射，以2θ角和晶面間距d值表示的x-射線特征衍射峰如表7所示。
[0087]
表7
[0088]
[0089][0090]
本發明化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶型vii，其x-射線粉末衍射圖譜基本如圖13所示。
[0091]
在本發明進一步優選的方案中，化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶型i、晶型ii、晶型iii、晶型iv、晶型v、晶型vi和晶型vii的x-射線粉末衍射圖譜中相對峰強度為前十強的衍射峰位置分別與圖1、圖3、圖5、圖7、圖9、圖11和圖13對應位置衍射峰的2θ誤差為
±
0.2
°
～
±
0.5
°
，優選
±
0.2
°
～
±
0.3
°
，最優選
±
0.2
°
。
[0092]
在本發明進一步優選的方案中，所述晶型為無水物。
[0093]
在本發明另一優選的方案中，所述晶型為水合物，水的個數為0-3，優選0、0.2、0.5、1、1.5、2、2.5或3，更優選0、0.5、1、2或3。
[0094]
在本發明進一步優選的方案中，上述化合物晶型的制備方法，具體包括如下步驟：
[0095]
1)稱取適量的自由堿，用不良溶劑混懸；
[0096]
2)以上所得混懸液在0～50℃溫度下振搖1～15天；
[0097]
3)將以上混懸液快速離心，去除上清液，干燥得到目標產物；
[0098]
其中：
[0099]
所述的不良性溶劑選自甲醇、丙酮、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙腈、乙醇、丙酮、2-甲基-四氫呋喃、二氯甲烷、二氧六環、甲基叔丁基醚、正庚烷、苯、甲苯、氯苯、氯仿、異丙醇、正丁醇、異丁醇、甲苯、n，n-二甲基甲酰胺、n，n-二甲基乙酰胺、二甲基亞砜、正丙醇、甲酸乙酯、醋酸異丙酯、叔丁醇、2-丁酮和3-戊酮中的一種或多種；優選甲醇、乙醇、二氯甲烷、四氫呋喃、丙酮、甲苯、二氧六環、乙酸乙酯、甲苯、甲酸乙酯和醋酸異丙酯中的一種或多種。
[0100]
本發明還提供了一種優選方案，還涉及一種藥物組合物，其含有有效量的上述任一化合物的晶型，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0101]
本發明進一步還涉及任一上述的化合物晶型或上述藥物組合物在制備p2x3抑制
劑藥物中的應用。
[0102]
本發明還提供任一上述化合物的晶型或組合物在制備神經源性疾病藥物中的用途；優選地所述神經源性疾病選自婦科疾病、泌尿道疾病狀態、呼吸障礙疾病或疼痛相關疾病或病癥，更優選子宮內膜異位癥、膀胱過度活動癥、肺纖維化或慢性咳嗽。
[0103]
在本發明進一步優選的實施方式中，所述疼痛相關疾病或病癥選自神經性疼痛或子宮肌瘤相關的疼痛或不適。
[0104]
發明的詳細說明
[0105]
除非有相反陳述，在說明書和權利要求書中使用的術語具有下述含義。
[0106]
術語“烷基”指飽和脂肪族烴基團，其為包含1至20個碳原子的直鏈或支鏈基團，優選含有1至8個碳原子的烷基，更優選1至6個碳原子的烷基，最優選1至3個碳原子的烷基。非限制性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各種支鏈異構體等。烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，所述取代基優選為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、氧代基、羧基或羧酸酯基，本發明優選甲基、乙基、異丙基、叔丁基、鹵代烷基、氘代烷基、烷氧基取代的烷基和羥基取代的烷基。
[0107]
術語“環烷基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，環烷基環包含3至20個碳原子，優選包含3至12個碳原子，更優選包含3至6個碳原子。單環環烷基的非限制性實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環己二烯基、環庚基、環庚三烯基、環辛基等；多環環烷基包括螺環、稠環和橋環的環烷基，優選環丙基、環丁基、環己基、環戊基和環庚基。
[0108]
所述環烷基環可以稠合于芳基、雜芳基或雜環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為環烷基，非限制性實例包括茚滿基、四氫萘基、苯并環庚烷基等。環烷基可以是任選取代的或非取代的，當被取代時，取代基優選為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、氧代基、羧基或羧酸酯基。
[0109]
術語“雜環基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，其包含3至20個環原子，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或s(o)m(其中m是整數0至2)的雜原子，但不包括-o-o-、-o-s-或-s-s-的環部分，其余環原子為碳。優選包含3至12個環原子，其中1～4個是雜原子；更優選包含3至8個環原子；最優選包含3至8個環原子；進一步優選包含1-3氮原
子的3-8元雜環基，任選地，被1-2個氧原子、硫原子、氧代基取代，包括含氮單環雜環基、含氮螺雜環基或含氮稠雜環基。
[0110]
所述雜環基環可以稠合于芳基、雜芳基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜環基，其非限制性實例包括：
[0111]
等。
[0112]
雜環基可以是任選取代的或非取代的，當被取代時，取代基優選為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、氧代基、羧基或羧酸酯基。
[0113]
術語“芳基”指具有共軛的π電子體系的6至14元全碳單環或稠合多環(也就是共享毗鄰碳原子對的環)基團，優選為6至12元，例如苯基和萘基。更優選苯基。所述芳基環可以稠合于雜芳基、雜環基或環烷基環上，包括苯并5-10元雜芳基、苯并3-8元環烷基和苯并3-8元雜烷基，優選苯并5-6元雜芳基、苯并3-6元環烷基和苯并3-6元雜烷基，其中雜環基為含1-3氮原子、氧原子、硫原子的雜環基；或者還包含含苯環的三元含氮稠環。
[0114]
其中與母體結構連接在一起的環為芳基環，其非限制性實例包括：
[0115][0115]
等。
[0116]
芳基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基優選為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、羧基或羧酸酯基。
[0117]
術語“雜芳基”指包含1至4個雜原子、5至14個環原子的雜芳族體系，其中雜原子選自氧、硫和氮。雜芳基優選為5至12元，更優選為5元或6元，例如咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡唑基、噁唑基、吡咯基、三唑基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、噻二唑、噠嗪基、吡嗪基等，優選吡啶基、噁二唑基、三唑基、噻吩基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、噠嗪基、吡嗪基或噻唑基；更優選吡啶基、呋喃基、噻吩基、嘧啶基、噁唑基、噁二唑基、吡唑基、吡咯基、噻唑基、噠嗪基、吡嗪基和噁唑基。所述雜芳基環可以稠合于芳基、雜環基或環
烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜芳基環，其非限制性實例包括：
[0118][0118]
等。
[0119]
雜芳基可以是任選取代的或非取代的，當被取代時，取代基優選為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、羧基或羧酸酯基。
[0120]
術語“烷氧基”指-o-(烷基)和-o-(非取代的環烷基)，其中烷基的定義如上所述。烷氧基的非限制性實例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基，烷氧基可以是任選取代的或非取代的，當被取代時，取代基優選為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、羧基或羧酸酯基。
[0121]
術語“烷硫基”指-s-(烷基)和-s-(非取代的環烷基)，其中烷基的定義如上所述。烷硫基的非限制性實例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基，烷硫基可以是任選取代的或非取代的，當被取代時，取代基優選為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、羧基或羧酸酯基。
[0122]“鹵代烷基”指被一個或多個鹵素取代的烷基，其中烷基如上所定義。
[0123]“鹵代烷氧基”指被一個或多個鹵素取代的烷氧基，其中烷氧基如上所定義。
[0124]“羥烷基”指被羥基取代的烷基，其中烷基如上所定義。
[0125]“烯基”指鏈烯基，又稱烯烴基，其中所述的烯基可以進一步被其他相關基團取代，例如：烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、羧基或羧酸酯基。
[0126]“炔基”指(ch≡c-)，其中所述的炔基可以進一步被其他相關基團取代，例如：烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、羧基或羧酸酯基。
[0127]“鹵素”指氟、氯、溴或碘。
[0128]“x選自a、b、或c”、“x選自a、b和c”、“x為a、b或c”、“x為a、b和c”等不同用語均表達了相同的意義，即表示x可以是a、b、c中的任意一種或幾種。
[0129]
本發明所述的氫原子均可被其同位素氘所取代，本發明涉及的實施例化合物中的任一氫原子也均可被氘原子取代。
[0130]“任選”或“任選地”意味著隨后所描述的事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“任選被烷基取代的雜環基團”意味著烷基可以
基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺自由堿晶型v的xrpd圖示。
[0144]
圖10為2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺自由堿晶型iv的dsc圖示。
[0145]
圖11為2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺自由堿晶型vi的xrpd圖示。
[0146]
圖12為2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺自由堿晶型vi的dsc圖示。
[0147]
圖13為2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺自由堿晶型vii的xrpd圖示。
具體實施方式
[0148]
以下結合實施例進一步描述本發明，但這些實施例并非限制著本發明的范圍。
[0149]
實施例
[0150]
本發明的化合物結構是通過核磁共振(nmr)或/和液質聯用譜(lc-ms)來確定的。nmr化學位移(δ)以百萬分之一(ppm)的單位給出。nmr的測定是用bruker avance-400核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞砜(dmso-d6)，氘代甲醇(cd3od)和氘代氯仿(cdcl3)，內標為四甲基硅烷(tms)。
[0151]
液質聯用譜lc-ms的測定用agilent 1200infinity series質譜儀。hplc的測定使用安捷倫1200dad高壓液相譜儀(sunfire c18 150
×
4.6mm譜柱)和waters 2695-2996高壓液相譜儀(gimini c
18 150
×
4.6mm譜柱)。
[0152]
薄層層析硅膠板使用煙臺黃海hsgf254或青島gf254硅膠板，tlc采用的規格是0.15mm～0.20mm，薄層層析分離純化產品采用的規格是0.4mm～0.5mm。柱層析一般使用煙臺黃海硅膠200～300目硅膠為載體。
[0153]
本發明實施例中的起始原料是已知的并且可以在市場上買到，或者可以采用或按照本領域已知的方法來合成。
[0154]
在無特殊說明的情況下，本發明的所有反應均在連續的磁力攪拌下，在干燥氮氣或氬氣氛下進行，溶劑為干燥溶劑，反應溫度單位為攝氏度。
[0155]
實施例1
[0156]
2-(2-(叔丁基)-5-氧吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺
[0157][0158]
第一步：n-(3-(叔丁基)-1h-吡唑-5-基)-2-氯煙酰胺的制備
[0159][0160]
冰浴條件下向2-氯煙酸(1.57g，9.96mmol)的dmf(30ml)溶液中依次加入3-(叔丁基)-1h-吡唑-5-胺(2.77g,19.93mmol)，dipea(6.2g,49.8mmol)和hatu(5.4g,0.144mmol)，撤去冰浴后攪拌1h。混合物經制備得到實施例1-1(2.5g,90％)。
[0161]
ms m/z(esi):279.7[m+h]
+
.
[0162]
第二步：2-(叔丁基)吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-5(4h)-酮的制備
[0163][0164]
向實施例1-1(2.5g,8.97mmol)的dmf(50ml)溶液中加入碳酸鉀(1.61g,11.66mmol)and 1,4-二氮雜二環[2.2.2]辛烷(dabco)(150.9mg,1.35mmol)，反應液在室溫下攪拌16小時。混合物經制備得到實施例1-2(2.1g,97％)。
[0165]
ms m/z(esi):279.7[m+h]
+
.
[0166]
第三步：2-(2-(叔丁基)-5-氧吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的制備
[0167][0168]
室溫下向實施例1-2(1.5g，6.19mmol)的dmf(30ml)的溶液中加入碳酸鉀(4.28g，30.96mmol)和實施例1-3(4.33g,18.57mmol)。將混合物加至熱80℃，攪拌反應2h。冷卻后，加入水，將沉淀過濾并用乙酸乙酯洗滌，純化得到實施例1(656mg，收率：27％)。
[0169]
ms m/z(esi):395.4[m+h]
+
.
[0170]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.01(s,1h),8.80
–
8.78(m,1h),8.47(d,j＝7.6hz,1h),8.30(d,j＝2.8hz,1h),8.01
–
7.94(m,1h),7.73
–
7.66(m,1h),7.49(dd,j＝8.0,4.8hz,1h),6.34(s,1h),4.87(s,2h),1.26(s,9h).
[0171]
實施例2
[0172]
2-(2-溴-5-氧吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺
[0173][0174]
實施例2的合成參照實施例1的方法,以3-溴-1h-吡唑-5-胺替代3-(叔丁基)-1h-吡唑-5-胺,得到目標化合物(500mg,68％收率)。
[0175]
ms m/z(esi):418.2[m+h]
+
.
[0176]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.32(s,1h),9.85(d,j＝7.6hz,1h),8.74(d,j＝6.4hz,1h),8.40(d,j＝2.8hz,1h),8.05-8.00(m,1h),7.78-7.73(m,1h),7.23-7.17(m,1h),6.31(s,1h),5.52(s,2h).
[0177]
實施例3
[0178]
n-(5-氟吡啶-2-基)-2-(2-甲基-5-氧代吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)基)乙酰胺
[0179][0180]
實施例3的合成參照實施例1的方法,以3-甲基-1h-吡唑-5-胺替代3-(叔丁基)-1h-吡唑-5-胺,得到目標化合物(20mg,26％收率)。
[0181]
ms m/z(esi):353.3[m+h]
+
.
[0182]
實施例4
[0183]
n-(5-氟吡啶-2-基)-2-(2-乙基-5-氧代吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)基)乙酰胺
[0184][0185]
實施例4的合成參照實施例1的方法,以3-乙基-1h-吡唑-5-胺替代3-(叔丁基)-1h-吡唑-5-胺,得到目標化合物(15mg,36％收率)。
[0186]
ms m/z(esi):367.4[m+h]
+
.
[0187]
實施例5
[0188]
n-(5-氟吡啶-2-基)-2-(2-異丙基-5-氧代吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)基)乙酰胺
[0189][0190]
實施例5的合成參照實施例1的方法,以3-異丙基-1h-吡唑-5-胺替代3-(叔丁基)-1h-吡唑-5-胺,得到目標化合物(15mg,36％收率)。
[0191]
ms m/z(esi):381.4[m+h]
+
.
[0192]
實施例6
[0193]
n-(5-氟吡啶-2-基)-2-(2-異丙烯基-5-氧代吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)基)乙酰胺
[0194][0195]
實施例2(100mg,0.24mmol)，異丙烯基硼酸(41.2mg,0.48mmol)，[1,1'-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀二氯甲烷絡合物(19.2mg,0.024mmol)和碳酸銫(232.8mg,0.72mmol)在二氧六環(4ml)和水(1ml)中100℃微波攪拌1小時。旋干反應液，制備液相純化得到實施例6(54mg,產率60％)。
[0196]
ms m/z(esi):379.4[m+h]
+
.
[0197]
實施例7
[0198]
n-(5-氟吡啶-2-基)-2-(5-氧代-2-(三氟甲基)吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)乙酰胺
[0199][0200]
實施例7的合成參照實施例1的方法,以3-三氟甲基-1h-吡唑-5-胺替代3-(叔丁
基)-1h-吡唑-5-胺,得到目標化合物(15mg,36％收率)。
[0201]
ms m/z(esi):407.3[m+h]
+
.
[0202]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.08(s,1h),8.96(dd,j＝8.0,1.6hz,1h),8.65(dd,j＝8.0,1.6hz,1h),8.37(d,j＝3.2hz,1h),8.07-8.02(m,1h),7.78-7.73(m,2h),7.05(s,1h),5.02(s,2h).
[0203]
實施例8
[0204]
2-(2-氨基-5-氧吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺
[0205][0206]
第一步：5-氧代-4,5-二氫吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-2-羧酸甲基的制備
[0207][0208]
實施例8-1的合成方法，參考實施例1-2的合成方法，以5-氨基-1h-吡唑-3-羧酸甲酯代替3-(叔丁基)-1h-吡唑-5-胺，得到實施例8-1(500mg，73％)。
[0209]
ms：m/z(esi):245.2[m+h]
+
.
[0210]
第二步：4-(2-((5-氟吡啶-2-基)氨基)-2-氧乙基)-5-氧代-4,5-二氫吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-2-羧酸甲酯的制備
[0211][0212]
實施例8-2的合成方法，參考實施例1的合成方法，以實施例8-1為原料，得到標題化合物實施例8-2(500mg，51％)。
[0213]
ms m/z(esi):397.3[m+h]
+
.
[0214]
第三步：4-(2-((5-氟吡啶-2-基)氨基)-2-氧乙基)-5-氧代-4,5-二氫吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-2-羧酸的制備
[0215][0216]
室溫下向實施例8-2(490mg，1.24mmol)的四氫呋喃(10ml)的溶液中加入lioh(519mg，12.36mmol)的水(2ml)溶液。混合物室溫攪拌反應3h，然后用1m hcl調節ph至3左右，濃縮至干得到實施例8-3(470mg，99％)。
[0217]
ms m/z(esi):383.3[m+h]
+
.
[0218]
第四步：2-(2-氨基-5-氧吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的制備
[0219][0220]
向實施例8-3(450mg，1.2mmol)在1,4-二氧六環(10ml)、et3n(33μl，0.24mmol)和bop試劑(598mg，1.35mmol)中的溶液中加入胺，并在室溫下攪拌20min。添加疊氮化鈉(160mg，2.46mmol)和四丁基溴化銨(786mg，2.46mmol)，并繼續攪拌1小時。然后用1,4-二氧六環(12ml)稀釋反應，加入2m h2so4(4ml)水溶液，并在100℃下加熱2h。蒸發溶劑，將殘渣稀釋水，用乙酸乙酯萃取。用鹽水清洗有機層，無水硫酸鈉上干燥，并蒸發溶劑。柱層析純化得到實施例8(360mg，86％)。
[0221]
ms m/z(esi):354.3[m+h]
+
.
[0222]
實施例9
[0223]
2-(2-環丙基-5-氧吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺
[0224][0225]
實施例9的合成方法，參考實施例6的合成方法，以環丙基硼酸代替乙丙烯硼酸，得到標題化合物實施例9(8mg，51％)。
[0226]
ms m/z(esi):378.4[m+h]
+
.
[0227]
實施例10
[0228]
2-(2-(叔丁基)-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺
[0229][0230]
實施例10的合成方法，參考實施例1的合成方法，以2-氯-6-三氟甲基煙酸為原料，得到標題化合物實施例10(25mg，46％)。
[0231]
ms m/z(esi):463.1[m+h]
+
.
[0232]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.09(s,1h),7.78(d,j＝8.0hz,1h),8.38(d,j＝2.8hz,1h),8.09-8.04(m,1h),8.00(d,j＝8.0hz,1h),7.79-7.74(m,1h),6.52(s,1h),4.95(s,2h),1.34(s,9h).
[0233]
實施例11
[0234]
n-(5-氟吡啶-2-基)-2-(2-甲基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑啉[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)乙酰胺
[0235]
[0236]
實施例11的合成方法，參考實施例2的合成方法，得到標題化合物實施例11(18mg，30％)。
[0237]
ms m/z(esi):421.1[m+h]
+
.
[0238]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.06(s,1h),8.80(d,j＝8.0hz,1h),8.37(s,1h),8.07-8.03(m,1h),8.00(d,j＝8.0hz,1h),7.79-7.73(m,1h),6.28(s,1h),4.95(s,2h),2.33(s,3h).
[0239]
實施例12
[0240]
2-(2-乙基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺
[0241][0242]
第一步：5-氨基-3-乙基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯的制備
[0243][0244]
將3-乙基-1h-吡唑-5-胺(2.0g，18.0mmol)溶解在無水二氯甲烷(50ml)中，加入三乙胺(2.2g，21.6mmol)和二碳酸二叔丁酯(4.7g，21.6mmol)，室溫反應16小時。反應液依次用水(50ml*2)、飽和氯化鈉溶液(50ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮，所得粗產品柱層析(乙酸乙酯/二氯甲烷＝0～20％)，得到標題產物實施例12-1(3.4g)，產率：89.5％。
[0245]
ms:m/z(esi):212.1[m+h]
+
.
[0246]
第二步：5-氨基-3-乙基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯的制備
[0247][0248]
將實施例12-1(3.4g，16.1mmol)溶解在無水二氯甲烷(60ml)中，加入三乙胺(5.4g,53.1mmol)，氮氣保護下在0℃滴加現制備的2-氯-6-三氟甲基煙酸酰氯(4.3g，17.7mmol)的二氯甲烷溶液(50ml)，加完室溫反應30分鐘。反應液依次用水(200ml*2)、飽和氯化鈉溶液(200ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮，所得粗產品硅膠柱層析
(乙酸乙酯/石油醚＝0～20％)，得到實施例12-2(2.6g)，產率：38.2％。
[0249]
ms:m/z(esi):319.1[m-boc+h]
+
.
[0250]
第三步：n-(3-乙基-1h-吡唑-5-基)-2-氯-6-(三氟甲基)煙酰胺的制備
[0251][0252]
將實施例12-2(2.6g,6.2mmol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，加入鹽酸二氧六環溶液(4m,20ml)，室溫反應4小時。反應液直接旋干，得到實施例12-3(1.9g)，產率：96.0％。
[0253]
ms:m/z(esi):319.0[m+h]
+
.
[0254]
第四步：2-乙基-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-5(4h)-酮
[0255][0256]
將實施例12-3(1.9g，6.0mmol)溶解在n,n-二甲基甲酰胺(20ml)中，加入碳酸鉀(2.5g，18.0mmol)，加熱至120℃反應2小時。反應液冷卻至室溫，直接用于下步反應。
[0257]
ms:m/z(esi):283.1[m+h]
+
.
[0258]
第五步：2-(2-乙基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺
[0259][0260]
在實施例12-4(1.0g，3.5mmol)的n，n-二甲基甲酰胺(20ml)反應液中，加入碳酸鉀(1.5g，10.6mmol)和2-溴-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺(0.99g，4.2mmol)，40℃反應2小時。反應液冷卻至室溫，倒入300ml水中，乙酸乙酯萃取(200ml*3)。合并有機相，依次用水(200ml*2)、飽和氯化鈉溶液(200ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮，粗產品乙酸乙酯重結晶，得到實施例12。
[0261]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.06(s,1h),8.79(d,j＝7.6hz,1h),8.37(s,1h),8.07
–
8.03(m,1h),8.00(d,j＝8.0hz,1h),7.79
–
7.72(m,1h),6.36(s,1h),4.96(s,2h),2.70(q,j＝7.6hz,2h),1.25(t,j＝7.6hz,3h).
[0262]
ms m/z(esi):435.1[m+h]
+
.
[0263]
實施例13
[0264]
2-(2-環丙基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺
[0265][0266]
實施例13的合成方法，參考實施例1的合成方法，得到標題化合物實施例13(17mg，28％)。
[0267]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.05(s,1h),8.78(d,j＝8.0hz,1h),8.37(s,1h),8.08
–
8.02(m,1h),7.98(d,j＝8.4hz,1h),7.79-7.73(m,1h),6.23(s,1h),4.91(s,2h),2.11
–
2.04(m,1h),1.04-0.98(m,2h),0.82
–
0.78(m,2h).
[0268]
ms m/z(esi):447.1[m+h]
+
.
[0269]
實施例14
[0270]
n-(5-氟吡啶-2-基)-2-(2-異丙基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)乙酰胺
[0271][0272]
實施例14的合成方法，參考實施例4的合成方法，得到標題化合物實施例31(10mg，22％)。
[0273]
ms m/z(esi):449.1[m+h]
+
.
[0274]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.06(s,1h),8.79(d,j＝8.0hz,1h),8.37(s,1h),8.09-8.03(m,1h),8.00(d,j＝8.0hz,1h),7.79-7.74(m,1h),6.42(s,1h),4.96(s,2h),3.08-3.01(m,1h),1.29(s,3h),1.27(s,3h).
[0275]
實施例15
[0276]
2-(2-溴-5-氧-8-(三氟甲基)吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的制備
[0277]
第一步：5-氨基-3-溴-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯的制備
[0278][0279]
將3-溴-1h-吡唑-5-胺(10.0g，61.7mmol)溶解在無水二氯甲烷(100ml)中，加入三乙胺(7.48g，74.1mmol)和二碳酸二叔丁酯(16.0g，74.1mmol)，室溫反應16小時。反應液依次用水(50ml*2)、飽和氯化鈉溶液(50ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮，所得粗產品柱層析(乙酸乙酯/二氯甲烷＝0～20％)，得到標題產物5-氨基-3-溴-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯實施例15-1(14.5g)，產率：89.5％。
[0280]
ms:m/z(esi):262.0[m+h]
+
[0281]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ6.62(s,2h),5.41(s,1h),1.56(s,9h).
[0282]
第二步：5-氨基-3-溴-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯的制備
[0283][0284]
將5-氨基-3-溴-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯實施例15-1(14.5g，55.3mmol)溶解在無水二氯甲烷(200ml)中，加入三乙胺(18.5g,183mmol)，氮氣保護下在0℃滴加現制備的2-氯-6-三氟甲基煙酸酰氯(13.0g，61.0mmol)的二氯甲烷溶液(50ml)，加完室溫反應30分鐘。反應液依次用水(200ml*2)、飽和氯化鈉溶液(200ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮，所得粗產品硅膠柱層析(乙酸乙酯/石油醚＝0～20％)，得到5-氨基-3-溴-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯實施例15-2(9.5g)，產率：38.2％。
[0285]
ms:m/z(esi):371.0[m-boc+h]
+
[0286]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.08(s,1h),8.40(d,j＝7.6hz,1h),8.14(d,j＝7.6hz,1h),6.96(s,1h),1.58(s,9h).
[0287]
第三步：n-(3-溴-1h-吡唑-5-基)-2-氯-6-(三氟甲基)煙酰胺的制備
[0288][0289]
將5-氨基-3-溴-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯實施例51-2(8.0g,17.1mmol)溶解在無水二氯甲烷(20ml)中，加入鹽酸二氧六環溶液(4m,40ml)，室溫反應4小時。反應液直接旋干，得到n-(3-溴-1h-吡唑-5-基)-2-氯-6-(三氟甲基)煙酰胺實施例15-3(6.2g)，產率：98.4％。
[0290]
ms:m/z(esi):368.9[m+h]
+
[0291]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.50(s,1h),8.39(d,j＝7.6hz,1h),8.10(d,j＝7.6hz,1h),6.53(s,1h).
[0292]
第四步：2-溴-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-5(4h)-酮的制備
[0293][0294]
將n-(3-溴-1h-吡唑-5-基)-2-氯-6-(三氟甲基)煙酰胺實施例15-3(6.2g，16.8mmol)溶解在n,n-二甲基甲酰胺(80ml)中，加入碳酸鉀(6.96g，50.4mmol)，加熱至120℃反應2小時。反應液冷卻至室溫，直接用于下步反應。
[0295]
ms:m/z(esi):333.0[m+h]
+
[0296]
第五步：2-(2-溴-5-氧-8-(三氟甲基)吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的制備
[0297][0298]
在2-溴-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-5(4h)-酮實施例51-4(na，16.8mmol)的n，n-二甲基甲酰胺(80ml)反應液中，加入碳酸鉀(6.96g，50.4mmol)和2-溴-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺(4.7g，20.2mmol)，40℃反應2小時。反應液冷卻至室溫，倒入300ml水中，乙酸乙酯萃取(200ml*3)。合并有機相，依次用水(200ml*2)、飽和氯化鈉溶液(200ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮，粗產品乙酸乙酯重結晶，得到標題產物2-(2-溴-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺實施例15。
[0299]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.05(s,1h),8.84(d,j＝8.0hz,1h),8.37(s,1h),8.09(d,j＝8.0hz,1h),8.07
–
8.02(m,1h)，7.80
–
7.73(m,1h),6.78(s,1h),4.96(s,2h).
[0300]
ms m/z(esi):486.2[m+h]
+
.
[0301]
實施例16
[0302]
n-(5-氟吡啶-2-基)-2-(5-氧-2,8-雙(三氟甲基)吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)乙酰胺
[0303][0304]
實施例16的合成方法，參考實施例1的合成方法，得到標題化合物實施例16(10mg，33％)。
[0305]
ms m/z(esi):475.3[m+h]
+
.
[0306]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.07(s,1h),8.91(d,j＝8.0hz,1h),8.37(d,j＝3.1hz,1h),8.19(d,j＝8.1hz,1h),8.14
–
7.98(m,1h),7.76(t,j＝8.8hz,1h),7.13(s,1h),5.04(s,2h).
[0307]
實施例17
[0308]
2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺
[0309][0310]
第一步：2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的制備
[0311][0312]
在室溫下將實施例15(300mg，0.619mmol)和zn(cn)2(300mg，2.56mmol)，pd2(dba)3(20mg，0.022mmol)，pd(dppf)cl2(30mg，0.036mmol)和zn粉(10mg，0.154mmol)溶在dma(10ml)中，向里鼓氮氣2分鐘。然后微波加熱140度反應8小時。冷卻至室溫，并用乙酸乙酯(50ml)萃取，有機相用飽和食鹽水洗兩遍。將有機相干燥(na2so4)，減壓濃縮，送p-hplc(fa)得到100mg(38％收率)的標題化合物。
[0313]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.07(s,1h),8.92(d,j＝8.2hz,1h),8.37(d,j＝
3.1hz,1h),8.22(d,j＝7.9hz,1h),8.05(s,1h),7.77(t,j＝8.6hz,1h),7.24(s,1h),5.01(s,2h).
[0314]
ms m/z(esi):432.3[m+h]
+
.
[0315]
實施例18
[0316]
n-(5-氟吡啶-2-基)-2-(5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)乙酰胺
[0317][0318]
第一步：n-(1h-吡唑-5-基)-2-氯煙酰胺的制備
[0319][0320]
冰浴條件下向2-氯煙酸(1.57g，9.96mmol)的dmf(30ml)溶液中依次加入1h-吡唑-5-胺(1.66g,19.93mmol)，dipea(6.2g,49.8mmol)和hatu(5.4g,0.144mmol)，撤去冰浴后攪拌1h。混合物經制備得到實施例18-1(2.0g,90％)。
[0321]
ms m/z(esi):291.0[m+h]
+
.
[0322]
第二步：吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-5(4h)-酮的制備
[0323][0324]
向實施例18-1(2.0g,8.97mmol)的dmf(50ml)溶液中加入碳酸鉀(1.61g,11.66mmol)and 1,4-二氮雜二環[2.2.2]辛烷(dabco)(150.9mg,1.35mmol)，反應液在室溫下攪拌16小時。混合物經制備得到實施例18-2(1.6g,97％)。
[0325]
ms m/z(esi):255.0[m+h]
+
.
[0326]
第三步：2-(2-(叔丁基)-5-氧吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的制備
[0327][0328]
室溫下向實施例18-2(1.5g，8.06mmol)的dmf(30ml)的溶液中加入碳酸鉀(2.23g，16.11mmol)和實施例1-3(2.25g,9.67mmol)。將混合物加至熱80℃，攪拌反應2h。冷卻后，加入水，將沉淀過濾并用乙酸乙酯洗滌，純化得到實施例18(2.1g，收率：78％)。
[0329]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.06(s,1h),8.83(d,j＝8.0hz,1h),8.37(d,j＝3.2hz,1h),8.06(d,j＝8.0hz,1h),8.05
–
8.02(m,1h),7.98(d,j＝2.0hz,1h),7.78
–
7.73(m,1h),6.46(s,1h),5.00(s,2h).
[0330]
ms m/z(esi):407.3[m+h]
+
.
[0331]
實施例19
[0332]
2-(2-氯-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺
[0333][0334]
實施例19的合成參照實施例1的方法，以3-氯-1h-吡唑-5-胺替代3-(叔丁基)-1h-吡唑-5-胺，得到目標化合物(31mg,26％收率)。
[0335]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.05(s,1h),8.84(d,j＝8.1hz,1h),8.36(s,1h),8.15
–
7.99(m,2h),7.76(t,j＝9.0hz,1h),6.73(s,1h),4.96(s,2h).
[0336]
ms m/z(esi):441.7[m+h]
+
.
[0337]
實施例20
[0338]
2-(3-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺
[0339][0340]
實施例20的合成參照實施例1的方法，以4-氰基-1h-吡唑-5-胺替代3-(叔丁基)-1h-吡唑-5-胺，得到目標化合物。
[0341]
第一步：5-氨基-4-氰基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯的制備
[0342][0343]
將5-氨基-1h-吡唑-4-甲腈(2.0g，18.5mmol)溶解在無水二氯甲烷(40ml)中，加入三乙胺(3.74g，37.0mmol)和二碳酸二叔丁酯(4.44g，20.4mmol)，室溫反應16小時。反應液減壓濃縮，石油醚(50ml)打漿，得到標題產物5-氨基-4-氰基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯實施例20-1(3.5g)，產率：90.9％。
[0344]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ7.77(s,1h),7.63(s,2h),1.56(s,9h).
[0345]
第二步：5-(2-氯-6-(三氟甲基)煙酰胺)-4-氰基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯的制備
[0346][0347]
將5-氨基-4-氰基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯實施例20-1(3.5g，16.8mmol)溶解在無水二氯甲烷(50ml)中，加入三乙胺(5.35g,7.37mmol)，氮氣保護下在0℃滴加現制備的2-氯-6-三氟甲基煙酸酰氯(4.3g，17.6mmol)的二氯甲烷溶液(50ml)，加完室溫反應1小時。反應液依次用水(50ml*2)、飽和氯化鈉溶液(50ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮，所得粗產品硅膠柱層析(乙酸乙酯/石油醚＝0～40％)，得到5-(2-氯-6-(三氟甲基)煙酰胺)-4-氰基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯實施例20-2(2.8g)，產率：38.2％。
[0348]
ms:m/z(esi):432.8[m+nh4]
+
[0349]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.87(s,1h),9.23(s,1h),8.43(d,j＝7.6hz,1h),8.13(d,j＝7.6hz,1h),1.59(s,9h).
[0350]
第三步：2-氯-n-(4-氰基-1h-吡唑-5-基)-6-(三氟甲基)煙酰胺的制備
[0351][0352]
將5-(2-氯-6-(三氟甲基)煙酰胺)-4-氰基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯實施例20-2(2.8g,6.73mmol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，加入鹽酸二氧六環溶液(4m,30ml)，室溫反應5小時。反應液直接旋干，得到2-氯-n-(4-氰基-1h-吡唑-5-基)-6-(三氟甲基)煙酰胺實施例20-3(2.1g)，產率：98.8％。
[0353]
ms:m/z(esi):315.8[m+h]
+
[0354]
第四步：5-氧代-8-(三氟甲基)-4,5-二氫吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-3-甲腈的制備
[0355][0356]
將2-氯-n-(4-氰基-1h-吡唑-5-基)-6-(三氟甲基)煙酰胺實施例20-3(2.1g，6.65mmol)溶解在n,n-二甲基甲酰胺(40ml)中，加入碳酸鉀(1.84g，13.3mmol)，加熱至120℃反應2小時。反應液冷卻至室溫，1m的稀鹽酸調ph至6，乙酸乙酯萃取(100ml*2)。合并有機相，依次用水(100ml*2)、飽和氯化鈉溶液(100ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮，乙酸乙酯(15ml)打漿，得到5-氧代-8-(三氟甲基)-4,5-二氫吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-3-甲腈實施例20-4(1.3g)，產率：69.9％。
[0357]
ms:m/z(esi):279.8[m+h]
+
[0358]
第四步：2-(3-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的制備
[0359][0360]
將5-氧代-8-(三氟甲基)-4,5-二氫吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-3-甲腈實施例20-4(500mg，1.79mmol)溶解在n，n-二甲基甲酰胺(20ml)中，加入碳酸鉀(371mg，2.69mmol)和2-溴-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺(501mg，2.15mmol)，40℃反應2小時。反應液冷卻至室溫，倒入100ml水中，乙酸乙酯萃取(50ml*2)。合并有機相，依次用水(50ml*2)、飽
和氯化鈉溶液(50ml)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮，粗產品乙酸乙酯打漿，所得母液減壓濃縮后反向hplc制備，得到標題產物2-(3-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺實施例20。ms m/z(esi):432.3[m+h]
+
.
[0361]1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.2(s,1h),8.93(d,j＝8.0hz,1h),8.58(s,1h),8.38(d,j＝3.2hz,1h),8.20(d,j＝8.0hz,1h),8.07-8.04(m,1h),7.81-7.75(m,1h),5.19(s,2h).
[0362]
實施例21
[0363]
n-(5-氟吡啶-2-基)-2-(2-(羥甲基)-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)乙酰胺
[0364][0365]
第一步：n-(5-氟吡啶-2-基)-2-(2-(羥甲基)-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)乙酰胺的制備
[0366][0367]
0℃下，向實施例21-1(100mg，0.22mmol)(實施例21-1的合成方法參照實施例8-2)的thf(2ml)中的溶液中加入二異丁基氫化鋁(1m的甲苯溶液，0.66ml，0.66mmol)，將混合物在室溫攪拌過夜。加入rochelle's鹽溶液(1.0m，5ml)；然后加入乙酸乙酯(5ml)，將得到的懸浮液在室溫攪拌直至實現透明相分離，分離有機相，并用etoac(3
×
40ml)萃取水相。合并的有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液(50ml)和飽和食鹽水(50ml)洗滌，經無水硫酸鈉干燥，并濃縮純化得到目標化合物(32mg，34％收率)。
[0368]
ms m/z(esi):437.1[m+h]
+
.
[0369]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.06(s,1h),8.82(d,j＝7.9hz,1h),8.37(s,1h),8.02(m,2h),7.76(s,1h),6.40(s,1h),5.44(s,1h),5.00(s,2h),4.56(s,2h).
[0370]
生物學測試評價
[0371]
以下結合測試例進一步描述解釋本發明，但這些實施例并非意味著限制本發明的范圍。
[0372]
測試例1、本發明化合物在穩定表達1321n1-hp2x3受體細胞中對鈣離子流動能力影響的測定
[0373]
實驗目的：
[0374]
測定化合物對1321n1-hp2x3受體的抑制活性。
[0375]
實驗儀器：
[0376]
384孔-細胞板(corning；3712)；
[0377]
384孔-化合物板(corning；3657)；
[0378]
384孔-試驗板(labcyte；p-05525)；
[0379]
flipr(molecular devices)。
[0380]
實驗試劑：
[0381]
dmem(gibco；11965)；
[0382]
fbs(gibco；10099-141)；
[0383]
潮霉素b(invitrogen，10687010)；
[0384]
matrix(thermo；5416)；
[0385]
dmso(sigma；d2650)；
[0386]
hbss(invitrogen；14025)；
[0387]
hepes(invitrogen；15630080)；
[0388]
probenecid(sigma；p8761)；
[0389]
versene(gibco；15040066)；
[0390]
g418(sigma；g5013)；
[0391]
calcium 4assay kit(molecular devices；r8141)；
[0392]
α，β-meatp(sigma；m6517)；
[0393]
atp hydrolytic enzyme(sigma；a7646)；
[0394]
穩轉細胞株：1321n1-hp2x3(由上海睿智化學研究有限公司提供)。
[0395]
實驗方法：
[0396]
1.試劑配制：
[0397]
assay buffer：1*hbss+20mm hepes；
[0398]
細胞培養基：dmem+10％fbs+75μg/ml潮霉素b+300μg/ml g418；
[0399]
鋪板培養基：dmem+10％dpbs；
[0400]
0.5*dye：10*dye stock+1.25probenecid+1*assay buffer+0.5u/ml atp hydrolytic enzyme；
[0401]
2.細胞株培養于細胞培養基中，37℃，5％co2至70％～90％融合度，棄培養基，取出細胞，加2ml versene，置37℃培養箱2-5min，加10ml鋪板培養基收集細胞，細胞計數，每孔加50μl(1
×
104個細胞/well的密度)播種到384孔-試驗板孵育16-24小時(至少過夜)。
[0402]
3.丟棄培養液，加入30μl 1x染料，37℃避光孵育60min。
[0403]
4.用dmso將化合物粉末溶解成20mm儲備液，準備檢測需要濃度的180x化合物并梯度稀釋10個濃度點。
[0404]
5.準備化合物板：用echo轉移500nl 180x化合物到化合物板(flipr用的source板)中，每孔加入30μl assay buffer，輕微振搖20-40分鐘。
[0405]
6.上機檢測：每孔取15μl 3x化合物加入細胞板，flipr儀器加樣，檢測鈣信號，15分鐘后，每孔加22.5μl 3x激動劑(ec
80
濃度)，檢測鈣信號。
[0406]
實驗數據處理方法：
[0407]
通過flipr讀取鈣信號值。實驗中每個采樣時間點的計算后的輸出結果是340/510nm與380/510nm波長信號的比值。最大值減去最小值的計算來源自比值信號曲線。
[0408]
使用graphpad prism擬合百分比抑制率和十點濃度數據至參數非線性邏輯公式計算出化合物的ic
50
值。
[0409]
實驗結果：
[0410]
本發明實施例化合物在1321n1-hp2x3受體細胞功能鈣流試驗中的結果如表8所示：
[0411]
表8
[0412][0413][0414]
實驗結論：
[0415]
以上數據顯示，本發明所示的化合物在1321n1-hp2x3受體細胞功能鈣流試驗中顯示出良好的抑制作用。
[0416]
測試例2、本發明化合物在穩定表達1321n1-hp2x2/3受體細胞中對鈣離子流動能力影響的測定
[0417]
實驗目的：
[0418]
測定化合物對1321n1-hp2x2/3受體的抑制活性。
[0419]
實驗儀器：
[0420]
384孔-細胞板(corning；3712)；
[0421]
384孔-化合物板(corning；3657)；
[0422]
384孔-試驗板(labcyte；p-05525)；
[0423]
flipr(molecular devices)。
[0424]
實驗試劑：
[0425]
dmem(gibco；11965)；
[0426]
fbs(gibco；10099-141)；
[0427]
潮霉素b(invitrogen，10687010)；
[0428]
matrix(thermo；5416)；
[0429]
dmso(sigma；d2650)；
[0430]
hbss(invitrogen；14025)；
[0431]
hepes(invitrogen；15630080)；
[0432]
probenecid(sigma；p8761)；
[0433]
versene(gibco；15040066)；
[0434]
g418(sigma；g5013)；
[0435]
calcium 4assay kit(molecular devices；r8141)；
[0436]
α，β-meatp(sigma；m6517)；
[0437]
atp hydrolytic enzyme(sigma；a7646)；
[0438]
穩轉細胞株：1321n1-hp2x2/3(由上海睿智化學研究有限公司提供)。
[0439]
實驗方法：
[0440]
1.試劑配制：
[0441]
assay buffer：1*hbss+20mm hepes；
[0442]
細胞培養基：dmem+10％fbs+75μg/ml潮霉素b+150μg/ml g418；
[0443]
鋪板培養基：dmem+10％dpbs；
[0444]
0.5*dye：10*dye stock+1.25probenecid+1*assay buffer+0.5u/ml atp hydrolytic enzyme；
[0445]
2.細胞株培養于細胞培養基中，37℃，5％co2至70％～90％融合度，棄培養基，取出細胞，加2ml versene，置37℃培養箱2-5min，加10ml鋪板培養基收集細胞，細胞計數，每孔加50μl(1
×
104個細胞/well的密度)播種到384孔-試驗板孵育16-24小時(至少過夜)。
[0446]
3.丟棄培養液，加入30μl 1x染料，37℃避光孵育60min。
[0447]
4.用dmso將化合物粉末溶解成20mm儲備液，準備檢測需要濃度的180x化合物并梯度稀釋10個濃度點。
[0448]
5.準備化合物板：用echo轉移500nl 180x化合物到化合物板(flipr用的source板)中，每孔加入30μl assay buffer，輕微振搖20-40分鐘。
[0449]
6.上機檢測：每孔取15μl 3x化合物加入細胞板，flipr儀器加樣，檢測鈣信號，15分鐘后，每孔加22.5μl 3x激動劑(ec
80
濃度)，檢測鈣信號。
[0450]
實驗數據處理方法：
[0451]
通過flipr讀取鈣信號值。實驗中每個采樣時間點的計算后的輸出結果是340/510nm與380/510nm波長信號的比值。最大值減去最小值的計算來源自比值信號曲線。
[0452]
使用graphpad prism擬合百分比抑制率和十點濃度數據至參數非線性邏輯公式計算出化合物的ic
50
值。
[0453]
實驗結果：
[0454]
本發明實施例化合物對1321n1-hp2x2/3受體細胞功能鈣流的試驗，結果如表9所示：
[0455]
表9
[0456][0457]
實驗結論：
[0458]
以上數據顯示，本發明所示的化合物在1321n1-h2x2/3受體細胞功能鈣流試驗中顯示出較小的抑制作用。
[0459]
測試例3、balb/c小鼠藥代動力學測定
[0460]
1.研究目的：
[0461]
以balb/c小鼠為受試動物，研究以下化合物實施例，在5mg/kg劑量下口服給藥在小鼠體內血漿的藥代動力學行為。
[0462]
2.試驗方案
[0463]
2.1試驗藥品：
[0464]
本發明實施例，自制。
[0465]
2.2試驗動物：
[0466]
balb/c mouse 6只/實施例，雄性，上海杰思捷實驗動物有限公司，動物生產許可證號(scxk(滬)2013-0006n0.311620400001794)。
[0467]
2.3藥物配制：
[0468]
稱取5g羥乙基纖維素(hec，cmc-na，粘度：800-1200cps)，溶于1000ml純凈水，加入10g tween80。混合均勻成澄清溶液。
[0469]
2.4給藥：
[0470]
balb/c小鼠，雄性；禁食一夜后分別p.o.，劑量為5mg/kg，給藥體積10ml/kg。
[0471]
2.5樣品采集：
[0472]
小鼠給藥前和給藥后，在0、0.5、1、2、4、6、8和24小時，采用眼眶采血0.04ml，置于edta-k2試管中，4℃ 6000rpm離心6min分離血漿，于-80℃保存。
[0473]
2.6樣品處理：
[0474]
1)血漿樣品20ul加入160ul乙腈沉淀，混合后3500
×
g離心5～20分鐘。
[0475]
2)取處理后上清溶液100ul進行lc/ms/ms分析待測化合物的濃度。
[0476]
2.7液相分析
[0477]
·
液相條件：shimadzu lc-20ad泵
[0478]
·
質譜條件:ab sciex api 4000質譜儀
[0479]
·
譜柱：phenomenex gemiu 5um c18 50
×
4.6mm
[0480]
·
移動相：a液為0.1％甲酸水溶液，b液為乙腈
[0481]
·
流速：0.8ml/min
[0482]
·
洗脫時間：0-4.0分鐘，洗脫液如下：
[0483]
表10
[0484][0485][0486]
3.試驗結果與分析
[0487]
藥代動力學主要參數用winnonlin 8.2計算得到，小鼠藥代實驗結果見下表11：
[0488]
表11小鼠藥代實驗結果
[0489][0490]
注：0.5％cmc-na(1％吐溫80)
[0491]
實驗結論：
[0492]
從表中小鼠藥代實驗結果可以看出，本發明實施例化合物表現出良好的代謝性質，暴露量auc和最大血藥濃度c
max
都表現良好。
[0493]
測試例4、大鼠藥代動力學測定
[0494]
1.研究目的：
[0495]
以sd大鼠為受試動物，研究以下化合物實施例，在5mg/kg劑量下口服給藥在大鼠體內血漿的藥代動力學行為。
[0496]
2.試驗方案
[0497]
2.1試驗藥品：
[0498]
本發明實施例，自制。
[0499]
2.2試驗動物：
[0500]
sd大鼠每組3只，雄性。上海杰思捷實驗動物有限公司，動物生產許可證號(scxk(滬)2013-0006n0.311620400001794)。
[0501]
2.3藥物配制：
[0502]
稱取5g羥乙基纖維素(hec，cmc-na，粘度：800-1200cps)，溶于1000ml純凈水，加入10g tween80。混合均勻成澄清溶液。
[0503]
2.4給藥：
[0504]
sd大鼠每組3只，雄性，禁食一夜后分別po，劑量為5mg/kg，給藥體積10ml/kg。
[0505]
2.5樣品采集：
[0506]
大鼠給藥前和給藥后，在0、0.5、1、2、4、6、8和24小時，采用頸靜脈采血0.2ml，置于edta-k2試管中，4℃ 6000rpm離心6min分離血漿，于-80℃保存。
[0507]
2.6樣品處理：
[0508]
1)血漿樣品40ul加入160ul乙腈沉淀，混合后3500
×
g離心5～20分鐘。
[0509]
2)取處理后上清溶液100ul進行lc/ms/ms分析待測化合物的濃度。
[0510]
2.7液相分析
[0511]
·
液相條件：shimadzu lc-20ad泵
[0512]
·
質譜條件:ab sciex api 4000質譜儀
[0513]
·
譜柱：phenomenex gemiu 5um c18 50
×
4.6mm
[0514]
·
移動相：a液為0.1％甲酸水溶液，b液為乙腈
[0515]
·
流速：0.8ml/min
[0516]
·
洗脫時間：0-4.0分鐘，洗脫液如下：
[0517]
表12
[0518][0519]
3.試驗結果與分析
[0520]
藥代動力學主要參數用winnonlin 8.2計算得到，大鼠藥代實驗結果見下表13：
[0521]
表13大鼠藥代實驗結果
[0522]
[0523]
注：0.5％cmc-na(1％吐溫80)
[0524]
4.實驗結論：
[0525]
從表中大鼠藥代實驗結果可以看出，5mg/kg劑量下，本發明實施例化合物表現出良好的代謝性質，暴露量auc和最大血藥濃度c
max
都表現良好。
[0526]
測試例5、肝微粒體代謝穩定性試驗
[0527]
1.實驗目的：
[0528]
本實驗的目的是檢測實施例化合物在小鼠、大鼠、犬和人肝微粒體中的穩定性情況。
[0529]
2.實驗步驟：
[0530]
2.1配制化合物工作液
[0531]
化合物的工作液配制：將化合物儲備溶液加入磷酸緩沖液，終濃度為20μm。
[0532]
2.2配制肝微粒體工作液
[0533]
用100mm磷酸緩沖液稀釋至終濃度為0.625mg/ml。
[0534]
2.3準備nadph和udpga
[0535]
稱取nadph(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)和udpga(尿苷二磷酸葡萄糖醛酸)，加入100mm磷酸緩沖液，終濃度均為20mm。
[0536]
2.4準備打孔劑
[0537]
稱取1mg alamethicin(丙甲菌素)加入200μl dmso，配制成5mg/ml的溶液。再用磷酸緩沖液稀釋至終濃度為50μg/ml。
[0538]
2.5配制反應終止液
[0539]
終止液：含有100ng/ml的鹽酸拉貝洛爾和400ng/ml甲苯磺丁脲為內標的冷乙腈。
[0540]
2.6孵育流程
[0541]
在96孔板中依次加入400μl配制好的肝微粒體、25μl化合物工作液和25μl alamethicin，于37℃預孵育10min。隨后加入50μl配制好的nadph/udpga啟動反應，37℃孵育，反應體系的總體積為500μl，各成分最終含量如下：
[0542]
表14
[0543]
成分含量肝微粒體0.5mg/ml化合物1μmnadph2mmudpga2mmalamethicin2.5μg/ml
[0544]
2.7樣品分析
[0545]
2.7.1譜條件：
[0546]
儀器：島津lc-30ad；
[0547]
譜柱：c18(50*4.6mm，5μm粒徑)；
[0548]
流動相：a：0.1％甲酸溶液，b：甲醇
[0549]
沖洗梯度：0.2～1.6min 5％a到95％a，3.0～3.1min 95％a到5％a
[0550]
運行時間：4.0min。
[0551]
2.7.2質譜條件：
[0552]
儀器：api5500型液相譜質譜聯用儀，ab sciex公司；
[0553]
離子源：電噴霧離子化源(esi)；
[0554]
干燥氣體：n2，溫度500℃；
[0555]
電噴霧電壓：5000v；
[0556]
檢測方式：正離子檢測；
[0557]
掃描方式：反應監測(mrm)方式。
[0558]
3.實驗結果：
[0559]
表15實施例化合物肝微粒體代謝穩定性結果
[0560][0561]
4.實驗結論：
[0562]
以上數據顯示，本發明實施例化合物在小鼠、大鼠、犬和人的肝微粒體中代謝穩定性良好。
[0563]
測試例6、血漿蛋白結合率實驗
[0564]
1.實驗目的：
[0565]
本實驗方法的目的是檢測實施例化合物在血漿中的血漿蛋白結合情況。
[0566]
2.實驗儀器及材料：
[0567]
液相質譜聯用儀、離心機、渦旋儀、移液、連續加液器、96孔板、組織勻漿機(組織樣品分析時使用)、50％的甲醇水溶液，加入內標的乙腈溶液、空白基質(血漿、尿液或組織勻漿液等)
[0568]
3.實驗步驟：
[0569]
3.1待測物儲備液的配制a
[0570]
用dmso將實施例化合物配制成1mm溶液a；
[0571]
3.2血漿溶液的配制b
[0572]
取溶液a加入到血漿溶液中，配制成5um溶液b；
[0573]
3.3處理流程
[0574]
1)在膜內加入200ul溶液b；
[0575]
2)在膜外加入350ulpbs；
[0576]
3)在37℃水浴鍋內孵育6h；
[0577]
4)樣品進行處理稀釋并進質譜檢測。
[0578]
4.譜條件：
[0579]
儀器：島津lc-20ad；
[0580]
譜柱：phenomenexc18(50*4.6mm，5μm粒徑)；
[0581]
流動相：a：乙腈，b:0.1％甲酸溶液0～0.5min：5％a
→
90％a，2.0～2.1min：90％a
→
5％a；流速：0.8ml/min；運行時間：5.0min；進樣體積：5μl。
[0582]
5.質譜條件：
[0583]
儀器：api4000型液相譜質譜聯用儀，美國ab公司；
[0584]
離子源為電噴霧離子化源(esi)；
[0585]
干燥氣體(n2)溫度500℃；
[0586]
電噴霧電壓為5500v；
[0587]
檢測方式為正離子檢測；
[0588]
掃描方式為選擇反應監測(mrm)方式；掃描時間為0.1s。
[0589]
6.實驗結果：
[0590]
表16：實施例化合物血漿蛋白結合率結果
[0591][0592]
7.實驗結論：
[0593]
以上數據顯示，本發明實施例化合物顯示出高血漿蛋白結合率，種屬差異小。
[0594]
測試例7、cyp酶單點抑制試驗
[0595]
1.實驗目的
[0596]
采用人肝微粒體孵育體系，利用單點法快速預測化合物對cyp450酶亞型的抑制情況。
[0597]
2.實驗步驟
[0598]
2.1溶液配制
[0599]
2.5mm nadph，稱重4.165mg nadph(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)加100mm磷酸緩沖液至2ml。0.25mg/ml微粒體，50μl 20mg/ml微粒體，加4ml 100mm磷酸緩沖液，混勻。
[0600]
待測化合物反應液的配制
[0601]
稱取待測實施例化合物，用dmso稀釋至10mm,再用100mm磷酸緩沖液稀釋至100μm。
[0602]
2.2實驗流程：
[0603]
1.在96孔板中，加入40μl肝微粒體、10μl底物、10μl待測化合物，預孵育3min。
[0604]
2.加入nadph 40μl。
[0605]
3.在20min時加入300μl含有內標的乙腈終止液。
[0606]
4.離心進樣。
[0607]
3.實驗結果：
[0608]
表17實施例化合物cyp酶單點抑制結果
[0609][0610]
注：強抑制：ic
50
《1μm；中等抑制：1μm《ic
50
《10μm；弱抑制：ic
50
》10μm
[0611]
4.實驗結論：
[0612]
以上數據顯示，本發明實施例化合物對各cyp酶亞型沒有強抑制，ddi風險小。
[0613]
測試例8、herg鉀離子通道抑制活性測試
[0614]
1.細胞準備
[0615]
7.1.1cho-herg細胞培養于175cm2培養瓶中，待細胞密度生長到60～80％，移走培養液，用7ml pbs洗一遍，然后加入3ml detachin消化。
[0616]
7.1.2待消化完全后加入7ml培養液中和，然后離心，吸走上清液，再加入5ml培養液重懸，以確保細胞密度為2～5
×
106/ml。
[0617]
2.溶液配制
[0618]
表18細胞內液和外液的組成成分
[0619][0620]
3.電生理記錄過程
[0621]
單細胞高阻抗封接和全細胞模式形成過程全部由qpatch儀器自動完成，在獲得全細胞記錄模式后，細胞鉗制在-80毫伏，在給予一個5秒的+40毫伏去極化刺激前，先給予一個50毫秒的-50毫伏前置電壓，然后復極化到-50毫伏維持5秒，再回到-80毫伏。每15秒施加此電壓刺激，記錄2分鐘后給予細胞外液記錄5分鐘，然后開始給藥過程，化合物濃度從最低測試濃度開始，每個測試濃度給予2.5分鐘，每個濃度至少測試3個細胞(n≥3)。
[0622]
4.化合物準備
[0623]
4.1將20mm的化合物母液用細胞外液進行稀釋，取5μl 20mm的化合物母液加入
2495μl細胞外液，500倍稀釋至40μm，然后在含0.2％dmso的細胞外液中依次進行3倍連續稀釋得到需要測試的最終濃度。
[0624]
4.2最高測試濃度為40μm，依次分別為40，13.33，4.44，1.48，0.49，0.16μm共6個濃度。
[0625]
4.3最終測試濃度中的dmso含量不超過0.2％，此濃度的dmso對herg鉀通道沒有影響。
[0626]
5.數據分析
[0627]
實驗數據由xlfit軟件進行分析。
[0628]
6.質量控制
[0629]
環境：濕度20～50％，溫度22～25℃
[0630]
試劑：所用實驗試劑購買于sigma公司，純度》98％
[0631]
報告中的實驗數據必須滿足以下標準：
[0632]
全細胞封接阻抗》100mω
[0633]
尾電流幅度》400pa
[0634]
藥理學參數：
[0635]
多濃度cisapride對herg通道的抑制效應設為陽性對照。
[0636]
7.實驗結果：
[0637]
表19：實施例化合物在多濃度對herg電流的抑制結果herg結果
[0638][0639]
8.實驗結論：
[0640]
藥物對于心臟herg鉀離子通道的抑制是藥物導致qt延長綜合癥的主要原因。從實驗結果可以看出，本發明實施例化合物對于心臟herg鉀離子通道沒有明顯抑制作用，可以避免高劑量時的心臟毒副作用。
[0641]
測試例9、balb/c小鼠味覺敏感性試驗
[0642]
1.實驗目的：
[0643]
本實驗通過奎寧苦水實驗篩選出對動物味覺毒副作用較小的化合物。
[0644]
2.實驗主要儀器和材料
[0645]
2.1儀器：
[0646]
1、超凈工作臺(cj-2f，蘇州馮氏實驗動物設備有限公司)；
[0647]
2、電子天平(cpa2202d，賽多利斯)；
[0648]
3、電子天平(bsa2202s-cw，賽多利斯)；
[0649]
4、純水儀(pacific tii，thermo)。
[0650]
2.2試劑：
[0651]
奎寧單鹽酸鹽二水合物(6119-47-7，adamas)。
[0652]
2.3動物：
[0653]
balb/c小鼠，6-8周，
♂
，購自上海西普爾－必凱實驗動物有限公司。
[0654]
3.實驗步驟：
[0655]
3.1動物篩選
[0656]
實驗前1天，所有balb/c小鼠稱重，剔除體重過高或過低的動物。
[0657]
3.2分組及禁水
[0658]
根據體重將balb/c小鼠按照要求進行隨機分組，并于給藥前12-16小時禁水、不禁食。
[0659]
3.3奎寧水溶液的制備
[0660]
稱取適量的奎寧單鹽酸鹽二水合物，用超純水配置成濃度為3mmol/l的奎寧鹽酸水溶液，待用。
[0661]
3.4待測化合物配制
[0662]
稱取適量的待測化合物，用對應的溶媒根據實驗設計配制成目標濃度，待用。
[0663]
3.5給藥及動物奎寧飲水量測試
[0664]
給藥及禁食：實驗當天，動物稱重、禁食、更換墊料，按實驗設計進行給藥。
[0665]
奎寧飲水量測試：
[0666]
1、分別用超純水和配制好的3mmol/l的奎寧鹽酸水溶液潤洗對應的干凈的小鼠飲水瓶2-3次，之后裝滿稱重并記錄重量為wi0。
[0667]
2、按照實驗設計，給藥一定時長后，將裝滿的水瓶輕柔地放置于對應的小鼠籠架上，開始計時，30min后，輕柔地取出水瓶，稱重并記錄重量為wi
30
。
[0668]
3、每組動物飲水量計算：δww(g)＝wi
30-wi0；單只小鼠飲水量計算：δpww(g)＝δww/n，n為各組動物只數。
[0669]
4、味覺障礙比率＝(飲用水為奎寧鹽酸水溶液同時給與受試藥組δpww－飲用水為奎寧鹽酸水溶液同時給與溶劑對照組δpww)/(飲用水為超純水同時給與溶劑對照組δpww－飲用水為奎寧鹽酸水溶液同時給與溶劑對照組δpww)
×
100％。用excel等軟件進行數據處理。
[0670]
5、實驗結束后安樂死動物。
[0671]
4.試驗結果：
[0672]
表20實施例化合物味覺結果
[0673]
[0674]
5.實驗結論：
[0675]
從上述結果中可以看出，本專利的化合物對小鼠味覺毒副作用較小。
[0676]
測試例10、對檸檬酸誘導的豚鼠急性咳嗽的藥效研究
[0677]
1.實驗目的
[0678]
本試驗目的是評價化合物在檸檬酸誘導的豚鼠急性咳嗽模型中的藥效。
[0679]
2.實驗儀器與試劑
[0680]
2.1關鍵儀器
[0681]
表21
[0682][0683][0684]
2.2關鍵試劑
[0685]
表22
[0686]
試劑名稱廠家貨號羧甲基纖維素鈉sigmac5678吐溫80sigmap4780atpsigmaa2383檸檬酸sigmac2404
[0687]
3.實驗操作及數據處理：
[0688]
3.1動物
[0689]
豚鼠(hartley guinea pig)，雄性，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。
[0690]
3.2實驗流程
[0691]
動物經適應性飼養，體重達標(300-400g)后，進行流水編號并根據體重進行隨機分組。
[0692]
引咳方法：先將豚鼠放入全身體積掃描箱適應3-5min后，進行2min atp霧化，間隔3min，再給予5min的檸檬酸霧化。從檸檬酸霧化開始，記錄10min內動物的咳嗽次數和咳嗽潛伏期。
[0693]
3.3給藥方案及咳嗽指標監測
[0694]
受試化合物在檸檬酸霧化前2小時進行豚鼠單次灌胃給藥處理，在預定時間放入dsi buxco全身體積描記檢測系統(wbp)的呼吸體積描記腔中進行檸檬酸霧化引咳。從檸檬酸霧化開始，wbp系統記錄10分鐘內豚鼠的咳嗽總次數(ccnt)和咳嗽潛伏期(cip)。
[0695]
3.4數據處理
[0696]
所有的數據被錄入到excel文檔中，并以平均值
±
標準誤的方式表示。實驗數據統計采用單因素方差分析方法(one-way anova)將各組數據進行分析比較。統計分析結果p《0.05認為有顯著差異。兩兩比較采用t-test方法比較差異性。
[0697]
結果顯示，本發明實施例化合物在檸檬酸誘導的豚鼠急性咳嗽模型中能有效改善咳嗽癥狀，咳嗽總次數下降率達59％以上。
[0698]
三、化合物的晶型研究
[0699]
本領域普通技術人員所熟知的是，上述實施例化合物被證明在1321n1-hp2x3受體細胞功能鈣流試驗中顯示出良好的抑制作用時，其晶型往往會具有同樣的藥理藥效活性。在此基礎上，發明人進一步研究了相應化合物晶型的理化性質，但下述具體晶型的制備與表征并不代表對本發明保護范圍范圍的限定，本領域普通技術人員可以以本發明為基礎，獲得本發明化合物更多的晶體，這些晶體均為本發明所保護的方案。具體如下：
[0700]
1.實驗儀器
[0701]
1.1物理化學檢測儀器的一些參數
[0702]
表23
[0703][0704]
1.2儀器與液相分析條件
[0705]
1.2.1儀器與設備
[0706]
表24
[0707]
儀器名稱型號分析天平mettler toledo xa105純水機milli-q plus，millipore高效液相譜儀agilent1260泵agilent g1311b進樣器g1329b柱溫箱g1316a檢測器g1315d
[0708]
1.2.2譜條件
[0709]
譜柱：zorbax bonus rp(3.5μm，4.6*75mm)
[0710]
流速：1.0ml/min
[0711]
柱溫：30℃
[0712]
檢測波長：262nm
[0713]
進樣體積：5.0μl
[0714]
運行時間：15min
[0715]
稀釋劑：dmso
[0716]
流動相：a：水(0.05％三氟乙酸)；b：乙腈(0.05％三氟乙酸)
[0717]
表25
[0718]
t(min)a(％)b(％)0.00604012.00257512.01604015.006040
[0719]
2.化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的的自由堿晶型i～vii的制備
[0720]
2.1自由堿晶型i的制備
[0721]
稱取化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的游離堿6g，用dcm/丙酮＝3:1(250ml)溶解，加入活性炭(0.5g)以及無水硫酸鈉(15g)，40℃攪拌30分鐘。過濾，濾液減壓濃縮至干，用50ml丙酮帶一次，蒸干。加入100ml丙酮，加熱到65℃回流，仍未溶清，滴加200ml正庚烷，加熱攪拌1小時，關閉加熱，自然冷卻到室溫，繼續攪拌1小時。過濾，得類白固體，真空干燥至恒重，得到自由堿晶型i，經檢測分析，其有如圖1所示的xrpd圖、如圖2所示的dsc圖。
[0722]
2.2自由堿晶型ii的制備
[0723]
稱量10mg的化合物(晶型i)到2ml的玻璃瓶中，加入200μl的乙醇溶劑，得到混懸液；將混懸液置于磁力攪拌器上40℃打漿3天，離心，去除上清液，固體進一步在真空干燥箱中干燥過夜(50℃減壓真空干燥)，得到自由堿晶型ii，經檢測分析，其有如下如圖3所示的xrpd圖、如圖4所示的dsc圖。
[0724]
2.3自由堿晶型iii的制備
[0725]
稱量10mg的化合物(晶型i)到2ml的玻璃瓶中，加入200μl的丙酮溶劑，得到混懸液；將混懸液置于磁力攪拌器上40℃打漿3天，離心，去除上清液，固體進一步在真空干燥箱中干燥過夜(50℃減壓真空干燥)，得到自由堿晶型iii，經檢測分析，其有如下如圖5所示的xrpd圖、如圖6所示的dsc圖。
[0726]
2.4自由堿晶型iv的制備
[0727]
稱量10mg的化合物(晶型i)到2ml的玻璃瓶中，加入200μl的二氧六環溶劑，得到混懸液；將混懸液置于磁力攪拌器上40℃打漿3天，離心，去除上清液，固體進一步在真空干燥箱中干燥過夜(50℃減壓真空干燥)，得到自由堿晶型iv，經檢測分析，其有如下如圖7所示的xrpd圖、如圖8所示的dsc圖。
[0728]
2.5自由堿晶型v的制備
[0729]
稱量10mg的化合物(晶型i)到2ml的玻璃瓶中，加入200μl的二氯甲烷溶劑，得到混懸液；將混懸液置于磁力攪拌器上40℃打漿3天，離心，去除上清液，固體進一步在真空干燥箱中干燥過夜(50℃減壓真空干燥)，得到自由堿晶型v，經檢測分析，其有如下如圖9所示的xrpd圖、如圖10所示的dsc圖。
[0730]
2.6自由堿晶型vi的制備
[0731]
稱量10mg的化合物(晶型i)到2ml的玻璃瓶中，加入200μl的醋酸異丙酯溶劑，得到混懸液；將混懸液置于磁力攪拌器上40℃打漿3天，離心，去除上清液，固體進一步在真空干燥箱中干燥過夜(50℃減壓真空干燥)，得到自由堿晶型vi，經檢測分析，其有如下如圖11所示的xrpd圖、如圖12所示的dsc圖。
[0732]
2.7自由堿晶型vii的制備
[0733]
稱量10mg的化合物(晶型i)到2ml的玻璃瓶中，加入200μl的甲苯溶劑，得到混懸液；將混懸液置于磁力攪拌器上40℃打漿3天，離心，去除上清液，固體進一步在真空干燥箱中干燥過夜(50℃減壓真空干燥)，得到晶型自由堿vii，經檢測分析，其有如下如圖13所示的xrpd圖。
[0734]
3.固體穩定性實驗
[0735]
3.1實驗目的：
[0736]
考察化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶型ii在光照5000lx、高溫60℃、高濕92.5％rh、高溫高濕50℃/75％rh條件下，化合物的物理化學穩定性，為化合物貯存提供依據。
[0737]
3.2儀器與液相分析條件
[0738]
表26
[0739][0740][0741]
3.3實驗方案：
[0742]
取晶型ii約1mg，于光照5000lx、高溫60℃、高濕92.5％rh、高溫高濕50℃/75％rh條件下，考察14天，用hplc，外標法測定含量，并采用譜峰面積歸一化法計算有關物質的
變化。
[0743]
3.4實驗結果
[0744]
表27
[0745][0746]
自由堿晶型ii固體穩定性結果：4個條件下14天穩定性都沒有單雜增加超過0.1％，且總雜增加也不超過0.1％。以上數據表明，2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的自由堿晶型ii在高溫、高濕、光照和高溫高濕條件均比較穩定。
[0747]
4、引濕性實驗
[0748]
4.1實驗目的
[0749]
考察化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的自由堿晶型i在不同相對濕度條件下的引濕性，為化合物貯存提供依據。
[0750]
4.2實驗方案：
[0751]
將化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的自由堿晶型i置于同相對濕度的飽和水蒸氣中，使化合物與水蒸氣達到動態平衡，并計算平衡后化合物吸濕增重的百分數。
[0752]
表28動態水分吸附儀(dvs)儀器參數
[0753]
儀器型號sms intrinsic實驗溫度25℃干燥時間0％rh 120min平衡dm/dt0.02％/min(最小10min，最大180min)rh(％)測量步長10％測量梯度0-95-0％循環次數2
[0754]
4.3實驗結果：
[0755]
表29
[0756][0757]
2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的自由堿晶型i在rh80％條件下吸濕增重不到0.3％，略有引濕性。經0-95％相對濕度條件下吸濕與解吸濕循環2次，自由堿晶型i的xrpd譜圖并未發生改變，即晶型未轉變。
[0758]
5.不同介質中溶解度實驗
[0759]
5.1化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶型在不同介質中溶解度實驗
[0760]
5.1.1實驗目的：
[0761]
考察自由堿晶型i和晶型ii在ph1-8 usp緩沖液、人工模擬禁食胃液(fassgf)、禁食人工模擬腸液(fassif)、非禁食人工模擬腸液(fessif)以及純水等媒介中溶解度大小，為可成藥性評估提供依據。
[0762]
5.1.2實驗方案：
[0763]
分別稱量1～2mg的化合物自由堿晶型i、自由堿晶型ii到1.5ml的液相小瓶中，然后分別加入1ml的不同ph緩沖液、人工模擬胃液(fassgf)、禁食人工模擬腸液(fassif)、非禁食人工模擬腸液(fessif)和純水，置于旋轉混勻儀上過夜，溫度為室溫，24小時后將樣品溶液用0.45μm混合水纖濾膜過濾后取續濾液，用hplc測試其含量。
[0764]
表30
[0765][0766]
5.1.3實驗結果：如圖所示：
[0767]
表31
[0768][0769][0770]
化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的自由堿的溶解度不存在ph依賴性，且溶解度都很低，不超過0.02mg/ml，相比晶型ii，晶型i(亞穩晶型)在相應介質中的溶解度提高3倍以上。
技術特征：
1.通式(i)所示化合物或其立體異構體的晶型，其中：r1選自氫、氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、硝基、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
烷氧基、鹵代c
1-6
烷氧基、c
1-6
羥烷基、c
3-12
環烷基、-(ch2)
n
c(o)r
a
、3-12元雜環基、c
6-14
芳基或5-14元雜芳基，所述的氨基、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
烷氧基、鹵代c
1-6
烷氧基、c
1-6
羥烷基、c
3-12
環烷基、-(ch2)
n
c(o)r
a
、3-12元雜環基、c
6-14
芳基和5-14元雜芳基，任選地被氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、硝基、氧代基、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
鹵代烷氧基、c
1-6
羥烷基、氰基取代的c
1-6
烷基、c
3-12
環烷基、3-12元雜環基、c
6-12
芳基和5-12元雜芳基中的一個或多個取代基所取代；r
a
選自氫、氘、鹵素、氨基、硝基、羥基、氰基、c
1-6
烷基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
羥烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
鹵代烷氧基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基或5-10元雜芳基，所述的氨基、c
1-6
烷基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
羥烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
鹵代烷氧基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基和5-10元雜芳基，任選地被氘、鹵素、氨基、硝基、羥基、氰基、羧基、氧代基、硫代基、c
1-6
烷基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
羥烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
鹵代烷氧基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基和5-10元雜芳基中的一個或多個取代基所取代；r2選自氫、氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、硝基、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
烷氧基、鹵代c
1-6
烷氧基、c
1-6
羥烷基、c
3-12
環烷基、3-12元雜環基、c
6-14
芳基或5-14元雜芳基，所述的氨基、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
烷氧基、鹵代c
1-6
烷氧基、c
1-6
羥烷基、c
3-12
環烷基、3-12元雜環基、c
6-14
芳基和5-14元雜芳基，任選地被氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、硝基、氧代基、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
鹵代烷氧基、c
1-6
羥烷基、氰基取代的c
1-6
烷基、c
3-12
環烷基、3-12元雜環基、c
6-12
芳基和5-12元雜芳基中的一個或多個取代基所取代；r3選自氫、氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、氧代基、硫代基、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
羥烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
鹵代烷氧基、c
3-8
環烷基、3-12元雜環基、c
6-14
芳基或5-14元雜芳基；且x為0～3的整數，優選0、1或2，更優選0或1；n為0～3的整數，優選0、1或2，更優選0或1。2.根據權利要求1所述的晶型，其特征在于，
r1選自氫、氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、硝基、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
烷氧基、鹵代c
1-6
烷氧基、c
1-6
羥烷基、c
3-8
環烷基、-(ch2)
n
c(o)r
a
、3-8元雜環基、c
6-10
芳基或5-10元雜芳基，所述的氨基、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
1-6
氘代烷基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
烷氧基、鹵代c
1-6
烷氧基、c
1-6
羥烷基、c
3-8
環烷基、-(ch2)
n
c(o)r
a
、3-8元雜環基、c
6-10
芳基和5-10元雜芳基，任選地被氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、硝基、氧代基、c
1-3
烷基、c
2-3
烯基、c
2-3
炔基、c
1-3
氘代烷基、c
1-3
鹵代烷基、c
1-3
烷氧基、c
1-3
鹵代烷氧基、c
1-3
羥烷基、氰基取代的c
1-3
烷基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基和5-10元雜芳基中的一個或多個取代基所取代；r
a
選自氫、氘、鹵素、氨基、硝基、羥基、氰基、c
1-3
烷基、c
1-3
氘代烷基、c
1-3
鹵代烷基、c
1-3
羥烷基、c
1-3
烷氧基、c
1-3
鹵代烷氧基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基或5-10元雜芳基，所述的氨基、c
1-3
烷基、c
1-3
氘代烷基、c
1-3
鹵代烷基、c
1-3
羥烷基、c
1-3
烷氧基、c
1-3
鹵代烷氧基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基和5-10元雜芳基，任選地被氘、鹵素、氨基、硝基、羥基、氰基、羧基、氧代基、硫代基、c
1-3
烷基、c
1-3
氘代烷基、c
1-3
鹵代烷基、c
1-3
羥烷基、c
1-3
烷氧基、c
1-3
鹵代烷氧基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基和5-10元雜芳基中的一個或多個取代基所取代；優選地，r1選自氫、鹵素、氨基、氰基、c
1-3
烷基、c
2-6
烯基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
烷氧基、鹵代c
1-6
烷氧基、c
1-6
羥烷基、c
3-8
環烷基、-(ch2)
n1
c(o)r
a
、含1-3個選自氮、氧或硫原子的3-8元雜環基、c
6-10
芳基或含1-3個選自氮、氧或硫原子5-10元雜芳基，所述的氨基、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
1-6
鹵代烷基、c
1-6
烷氧基、鹵代c
1-6
烷氧基、c
1-6
羥烷基、c
3-8
環烷基、-(ch2)
n1
c(o)r
a
、含1-3個選自氮、氧或硫原子的3-8元雜環基、c
6-10
芳基或含1-3個選自氮、氧或硫原子5-10元雜芳基，任選地被氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、硝基、氧代基、c
1-3
烷基、c
1-3
氘代烷基、c
1-3
鹵代烷基、c
1-3
烷氧基、c
1-3
鹵代烷氧基、c
1-3
羥烷基、氰基取代的c
1-3
烷基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基和5-10元雜芳基中的一個或多個取代基所取代；r
a
選自氫、氘、鹵素、氨基、氰基、c
1-3
烷基、c
1-3
氘代烷基、c
1-3
鹵代烷基、c
1-3
羥烷基、c
1-3
烷氧基、c
1-3
鹵代烷氧基、c
3-6
環烷基或含1-2個選自n或o的4-6元雜環基，所述的氨基c
1-3
烷基、c
1-3
氘代烷基、c
1-3
鹵代烷基、c
1-3
羥烷基、c
1-3
烷氧基、c
1-3
鹵代烷氧基、c
3-6
環烷基或含1-2個選自n或o的4-6元雜環基，任選地被氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、硝基、氧代基、c
1-3
烷基、c
1-3
氘代烷基、c
1-3
鹵代烷基、c
1-3
烷氧基、c
1-3
鹵代烷氧基、c
1-3
羥烷基、氰基取代的c
1-3
烷基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基和5-10元雜芳基中的一個或多個取代基所取代；更優選地，r1選自以下基團：-h、-nh2、-f、-cl、-br、-cn、-ch3、-ch2ch3、-cf3、
r2選自氫、氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、硝基、c
1-3
烷基、c
2-3
烯基、c
2-3
炔基、c
1-3
氘代烷基、c
1-3
鹵代烷基、c
1-3
烷氧基、鹵代c
1-3
烷氧基、c
1-3
羥烷基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基或5-10元雜芳基，優選氫、氨基、氰基、氟、氯、溴、甲基、異丙基、三氟甲基、甲氧基、環丙基或嗎啉基；r3選自氫、氘、鹵素、氨基、羥基、氰基、氧代基、硫代基、c
1-3
烷基、c
2-3
烯基、c
2-3
炔基、c
1-3
氘代烷基、c
1-3
鹵代烷基、c
1-3
羥烷基、c
1-3
烷氧基、c
1-3
鹵代烷氧基、c
3-8
環烷基、3-8元雜環基、c
6-10
芳基或5-1.元雜芳基，優選氫或氰基。3.根據權利要求1所述的晶型，其特征在于，化合物的具體結構如下：
4.根據權利要求1所述的晶型，其特征在于，所述晶型為化合物2-(2-氰基-5-氧代-8-(三氟甲基)吡唑并[1,5-a]吡啶[3,2-e]嘧啶-4(5h)-基)-n-(5-氟吡啶-2-基)乙酰胺的晶
型；晶型為晶型i，其x-射線粉末衍射圖譜在18.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在20.8
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在11.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在24.2
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在24.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在21.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在15.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在26.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在32.0
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在26.3
±
0.2
°
處具有衍射峰；優選包含上述衍射峰中的任意2-5處，或者3-5處，或者3-6處，或者3-8處，或者5-8處，或者6-8處，更優選包含其中任意6處、7處或8處；優選地，晶型i的x-射線粉末衍射圖譜至少包含位于2θ為18.1
±
0.2
°
、20.8
±
0.2
°
、11.7
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選包含其中兩條，更優選包含三條；任選的，進一步還可以包含位于2θ為24.2
±
0.2
°
、24.7
±
0.2
°
、21.1
±
0.2
°
、15.7
±
0.2
°
、26.7
±
0.2
°
中的至少一條，優選至少包含其中2條、3條、4條或5條；更優選地，晶型i的x-射線粉末衍射圖譜任選還包含位于2θ為32.0
±
0.2
°
、26.3
±
0.2
°
、28.4
±
0.2
°
、17.6
±
0.2
°
、30.1
±
0.2
°
、35.9
±
0.2
°
、27.3
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰；優選至少包含其中任意2-3處，或者4-5處，或者6-7處；進一步優選，至少包含其中任意2處、3處、4處、5處、6處、7處；進一步優選地，晶型i的x-射線粉末衍射圖譜包含位于2θ為18.1
±
0.2
°
、20.8
±
0.2
°
、11.7
±
0.2
°
、24.2
±
0.2
°
、24.7
±
0.2
°
、21.1
±
0.2
°
、15.7
±
0.2
°
、26.7
±
0.2
°
、32.0
±
0.2
°
、26.3
±
0.2
°
、28.4
±
0.2
°
、17.6
±
0.2
°
、30.1
±
0.2
°
、35.9
±
0.2
°
、27.3
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選的，至少包含其中任選的4處、5處、6處、8處或10處有衍射峰；更進一步優選地，晶型i的x-射線粉末衍射圖譜如圖1所示，或其dsc圖譜基本如圖2所示；或，為晶型ii，其x-射線粉末衍射圖譜在27.3
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在20.2
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在27.6
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在22.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在30.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在28.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在10.4
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在19.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在22.0
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在13.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；優選包含上述衍射峰中的任意2-5處，或者3-5處，或者3-6處，或者3-8處，或者5-8處，或者6-8處，更優選包含其中任意6處、7處或8處；優選地，晶型ii的x-射線粉末衍射圖譜至少包含位于2θ為27.3
±
0.2
°
、20.2
±
0.2
°
、27.6
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選包含其中兩條，更優選包含三條；任選的，進一步還可以包含位于2θ為22.5
±
0.2
°
、30.1
±
0.2
°
、28.5
±
0.2
°
、10.4
±
0.2
°
、19.5
±
0.2
°
中的至少一條，優選至少包含其中2條、3條、4條或5條；更優選地，晶型ii的x-射線粉末衍射圖譜任選還包含位于2θ為22.0
±
0.2
°
、13.7
±
0.2
°
、20.9
±
0.2
°
、22.3
±
0.2
°
、30.4
±
0.2
°
、19.8
±
0.2
°
、21.5
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰；優選至少包含其中任意2-3處，或者4-5處，或者6-7處；進一步優選，至少包含其中任意2處、3處、4處、5處、6處、7處；進一步優選地，晶型ii的x-射線粉末衍射圖譜包含位于2θ為27.3
±
0.2
°
、20.2
±
0.2
°
、27.6
±
0.2
°
、22.5
±
0.2
°
、30.1
±
0.2
°
、28.5
±
0.2
°
、10.4
±
0.2
°
、19.5
±
0.2
°
、22.0
±
0.2
°
、13.7
±
0.2
°
、20.9
±
0.2
°
、22.3
±
0.2
°
、30.4
±
0.2
°
、19.8
±
0.2
°
、21.5
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選的，至少包含其中任選的4處、5處、6處、8處或10處有衍射峰；
更進一步優選地，晶型ii的x-射線粉末衍射圖譜如圖3所示，或其dsc圖譜基本如圖4所示；或，為晶型iii，其x-射線粉末衍射圖譜在12.2
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在5.9
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在24.4
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在17.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在17.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在8.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在20.2
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者11.8
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在24.8
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在8.8
±
0.2
°
處具有衍射峰；優選包含上述衍射峰中的任意2-5處，或者3-5處，或者3-6處，或者3-8處，或者5-8處，或者6-8處，更優選包含其中任意6處、7處或8處；優選地，晶型iii的x-射線粉末衍射圖譜至少包含位于2θ為12.2
±
0.2
°
、5.9
±
0.2
°
、24.4
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選包含其中兩條，更優選包含三條；任選的，進一步還可以包含位于2θ為17.1
±
0.2
°
、17.7
±
0.2
°
、8.5
±
0.2
°
、20.2
±
0.2
°
、11.8
±
0.2
°
中的至少一條，優選至少包含其中2條、3條、4條或5條；更優選地，晶型iii的x-射線粉末衍射圖譜任選還包含位于2θ為24.8
±
0.2
°
、8.8
±
0.2
°
、22.6
±
0.2
°
、27.4
±
0.2
°
、23.6
±
0.2
°
、20.8
±
0.2
°
、23.4
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰；優選至少包含其中任意2-3處，或者4-5處，或者6-7處；進一步優選，至少包含其中任意2處、3處、4處、5處、6處、7處；進一步優選地，晶型iii的x-射線粉末衍射圖譜包含位于2θ為12.2
±
0.2
°
、5.9
±
0.2
°
、24.4
±
0.2
°
、17.1
±
0.2
°
、17.7
±
0.2
°
、8.5
±
0.2
°
、20.2
±
0.2
°
、11.8
±
0.2
°
、24.8
±
0.2
°
、8.8
±
0.2
°
、22.6
±
0.2
°
、27.4
±
0.2
°
、23.6
±
0.2
°
、20.8
±
0.2
°
、23.4
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選的，至少包含其中任選的4處、5處、6處、8處或10處有衍射峰；更進一步優選地，晶型iii的x-射線粉末衍射圖譜如圖5所示，或其dsc圖譜基本如圖6所示；或，為晶型iv，其x-射線粉末衍射圖譜在10.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在7.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在15.2
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在17.4
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在24.8
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在19.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在10.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在22.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在26.9
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在24.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；優選包含上述衍射峰中的任意2-5處，或者3-5處，或者3-6處，或者3-8處，或者5-8處，或者6-8處，更優選包含其中任意6處、7處或8處；優選地，晶型iv的x-射線粉末衍射圖譜至少包含位于2θ為10.5
±
0.2
°
、7.5
±
0.2
°
、15.2
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選包含其中兩條，更優選包含三條；任選的，進一步還可以包含位于2θ為17.4
±
0.2
°
、24.8
±
0.2
°
、19.5
±
0.2
°
、10.1
±
0.2
°
、22.5
±
0.2
°
中的至少一條，優選至少包含其中2條、3條、4條或5條；更優選地，晶型iv的x-射線粉末衍射圖譜任選還包含位于2θ為26.9
±
0.2
°
、24.1
±
0.2
°
、14.4
±
0.2
°
、11.3
±
0.2
°
、24.5
±
0.2
°
、16.8
±
0.2
°
、20.4
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰；優選至少包含其中任意2-3處，或者4-5處，或者6-7處；進一步優選，至少包含其中任意2處、3處、4處、5處、6處、7處；進一步優選地，晶型iv的x-射線粉末衍射圖譜包含位于2θ為10.5
±
0.2
°
、7.5
±
0.2
°
、15.2
±
0.2
°
、17.4
±
0.2
°
、24.8
±
0.2
°
、19.5
±
0.2
°
、10.1
±
0.2
°
、22.5
±
0.2
°
、26.9
±
0.2
°
、24.1
±
0.2
°
、14.4
±
0.2
°
、11.3
±
0.2
°
、24.5
±
0.2
°
、16.8
±
0.2
°
、20.4
±
0.2
°
中的一處或多
處衍射峰，優選的，至少包含其中任選的4處、5處、6處、8處或10處有衍射峰；更進一步優選地，晶型iv的x-射線粉末衍射圖譜如圖7所示，或其dsc圖譜基本如圖8所示；或，為晶型v，其x-射線粉末衍射圖譜在13.9
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在18.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在24.0
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在19.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在25.9
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在12.9
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在14.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在21.0
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在30.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在22.6
±
0.2
°
處具有衍射峰；優選包含上述衍射峰中的任意2-5處，或者3-5處，或者3-6處，或者3-8處，或者5-8處，或者6-8處，更優選包含其中任意6處、7處或8處；優選地，晶型v的x-射線粉末衍射圖譜至少包含位于2θ為13.9
±
0.2
°
、18.1
±
0.2
°
、24.0
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選包含其中兩條，更優選包含三條；任選的，進一步還可以包含位于2θ為19.7
±
0.2
°
、25.9
±
0.2
°
、12.9
±
0.2
°
、14.7
±
0.2
°
、21.0
±
0.2
°
中的至少一條，優選至少包含其中2條、3條、4條或5條；更優選地，晶型v的x-射線粉末衍射圖譜任選還包含位于2θ為30.7
±
0.2
°
、22.6
±
0.2
°
、15.8
±
0.2
°
、31.8
±
0.2
°
、29.5
±
0.2
°
、29.8
±
0.2
°
、22.2
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰；優選至少包含其中任意2-3處，或者4-5處，或者6-7處；進一步優選，至少包含其中任意2處、3處、4處、5處、6處、7處；進一步優選地，晶型v的x-射線粉末衍射圖譜包含位于2θ為13.9
±
0.2
°
、18.1
±
0.2
°
、24.0
±
0.2
°
、19.7
±
0.2
°
、25.9
±
0.2
°
、12.9
±
0.2
°
、14.7
±
0.2
°
、21.0
±
0.2
°
、30.7
±
0.2
°
、22.6
±
0.2
°
、15.8
±
0.2
°
、31.8
±
0.2
°
、29.5
±
0.2
°
、29.8
±
0.2
°
、22.2
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選的，至少包含其中任選的4處、5處、6處、8處或10處有衍射峰；更進一步優選地，晶型v的x-射線粉末衍射圖譜如圖9所示，或其dsc圖譜基本如圖10所示；或，為晶型vi，其x-射線粉末衍射圖譜在10.3
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在14.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在17.2
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在24.6
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在7.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在19.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在26.9
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在10.8
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在24.9
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在22.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；優選包含上述衍射峰中的任意2-5處，或者3-5處，或者3-6處，或者3-8處，或者5-8處，或者6-8處，更優選包含其中任意6處、7處或8處；優選地，晶型vi的x-射線粉末衍射圖譜至少包含位于2θ為10.3
±
0.2
°
、14.7
±
0.2
°
、17.2
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選包含其中兩條，更優選包含三條；任選的，進一步還可以包含位于2θ為24.6
±
0.2
°
、7.5
±
0.2
°
、19.7
±
0.2
°
、26.9
±
0.2
°
、10.8
±
0.2
°
中的至少一條，優選至少包含其中2條、3條、4條或5條；更優選地，晶型vi的x-射線粉末衍射圖譜任選還包含位于2θ為24.9
±
0.2
°
、22.5
±
0.2
°
、30.2
±
0.2
°
、28.7
±
0.2
°
、21.0
±
0.2
°
、5.4
±
0.2
°
、24.0
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰；優選至少包含其中任意2-3處，或者4-5處，或者6-7處；進一步優選，至少包含其中任意2處、3處、4處、5處、6處、7處；進一步優選地，晶型vi的x-射線粉末衍射圖譜包含位于2θ為10.3
±
0.2
°
、14.7
±
0.2
°
、17.2
±
0.2
°
、24.6
±
0.2
°
、7.5
±
0.2
°
、19.7
±
0.2
°
、26.9
±
0.2
°
、10.8
±
0.2
°
、24.9
±
0.2
°
、
22.5
±
0.2
°
、30.2
±
0.2
°
、28.7
±
0.2
°
、21.0
±
0.2
°
、5.4
±
0.2
°
、24.0
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選的，至少包含其中任選的4處、5處、6處、8處或10處有衍射峰；更進一步優選地，晶型vi的x-射線粉末衍射圖譜如圖11所示，或其dsc圖譜基本如圖12所示；或，為晶型vii，其x-射線粉末衍射圖譜在10.6
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在15.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在17.7
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在25.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在11.0
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在20.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在7.6
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在25.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在5.5
±
0.2
°
處具有衍射峰；或者在21.1
±
0.2
°
處具有衍射峰；優選包含上述衍射峰中的任意2-5處，或者3-5處，或者3-6處，或者3-8處，或者5-8處，或者6-8處，更優選包含其中任意6處、7處或8處；優選地，晶型vii的x-射線粉末衍射圖譜至少包含位于2θ為10.6
±
0.2
°
、15.1
±
0.2
°
、17.7
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選包含其中兩條，更優選包含三條；任選的，進一步還可以包含位于2θ為25.1
±
0.2
°
、11.0
±
0.2
°
、20.1
±
0.2
°
、7.6
±
0.2
°
、25.5
±
0.2
°
中的至少一條，優選至少包含其中2條、3條、4條或5條；更優選地，晶型vii的x-射線粉末衍射圖譜任選還包含位于2θ為5.5
±
0.2
°
、21.1
±
0.2
°
、27.3
±
0.2
°
、30.7
±
0.2
°
、30.3
±
0.2
°
、23.9
±
0.2
°
、15.9
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰；優選至少包含其中任意2-3處，或者4-5處，或者6-7處；進一步優選，至少包含其中任意2處、3處、4處、5處、6處、7處；進一步優選地，晶型vii的x-射線粉末衍射圖譜包含位于2θ為10.6
±
0.2
°
、15.1
±
0.2
°
、17.7
±
0.2
°
、25.1
±
0.2
°
、11.0
±
0.2
°
、20.1
±
0.2
°
、7.6
±
0.2
°
、25.5
±
0.2
°
、5.5
±
0.2
°
、21.1
±
0.2
°
、27.3
±
0.2
°
、30.7
±
0.2
°
、30.3
±
0.2
°
、23.9
±
0.2
°
、15.9
±
0.2
°
中的一處或多處衍射峰，優選的，至少包含其中任選的4處、5處、6處、8處或10處有衍射峰；更進一步優選地，晶型vii的x-射線粉末衍射圖譜如圖13所示。5.根據權利要求4中所述的晶型，其特征在于，晶型i、晶型ii、晶型iii、晶型iv、晶型v、晶型vi和晶型vii的x-射線粉末衍射圖譜中相對峰強度為前十強的衍射峰位置分別與圖1、圖3、圖5、圖7、圖9、圖11和圖13對應位置衍射峰的2θ誤差為
±
0.2
°
～
±
0.5
°
，優選
±
0.2
°
～
±
0.3
°
，最優選
±
0.2
°
。6.根據權利要求1-5任意一項所述的晶型，其特征在于，晶型為無水物或水合物，當晶型為水合物時，水的個數為0-3，優選0、0.2、0.5、1、1.5、2、2.5或3，更優選0、0.5、1、2或3。7.制備權利要求1-6任一項所述晶型的方法，具體包括如下步驟：1)稱取適量的自由堿，用不良溶劑混懸振搖；2)將以上混懸液快速離心，去除上清液，干燥得到目標產物；所述的不良性溶劑選自甲醇、丙酮、乙酸乙酯、四氫呋喃、乙腈、乙醇、丙酮、2-甲基-四氫呋喃、二氯甲烷、二氧六環、甲基叔丁基醚、正庚烷、苯、甲苯、氯苯、氯仿、異丙醇、正丁醇、異丁醇、甲苯、n，n-二甲基甲酰胺、n，n-二甲基乙酰胺、二甲基亞砜、正丙醇、甲酸乙酯、醋酸異丙酯、叔丁醇、2-丁酮和3-戊酮中的一種或多種；優選甲醇、乙醇、二氯甲烷、四氫呋喃、丙酮、甲苯、二氧六環、乙酸乙酯、甲苯、甲酸乙酯和醋酸異丙酯中的一種或多種。8.一種藥物組合物，其含有有效量的權利要求1-6任一項所述的晶型以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
9.根據權利要求1-6中任一項所述的晶型，或權利要求8所述的藥物組合物在制備p2x3抑制劑藥物中的應用。10.根據權利要求1-6中任一項所述的晶型，或權利要求8所述的藥物組合物在制備神經源性疾病藥物中的用途；優選地，所述神經源性疾病選自婦科疾病、泌尿道疾病狀態、呼吸障礙疾病或疼痛相關疾病或病癥；更優選地，所述神經源性疾病選自子宮內膜異位癥、膀胱過度活動癥、肺纖維化或慢性咳嗽；所述疼痛相關疾病或病癥選自神經性疼痛或子宮肌瘤相關的疼痛或不適。
技術總結
本發明涉及含吡唑多環類衍生物的自由堿晶型及其制備方法和應用。特別地，本發明涉及通式(I)化合物自由堿晶型、制備方法和含有有效量的該晶型的藥物組合物，及其作為P2X3抑制劑，在制備神經源性疾病藥物中的用途，其中通式(I)中的各取代基與說明書中的定義相同。義相同。義相同。義相同。
