一種硒代部花菁類化合物及其應用
cancer therapy.chem.sci.2017, 8,7689-7695；ebaston,t.m.；nakonechny,f.；talalai,e.；gellerman,g.；patsenker,l.,iodinatedxanthene-cyanine nir dyes as potential photosensitizers for antimicrobial photodynamic therapy. dyes and pigments,2021,184,108854；santra,m.；owens,m.；birch,g.；bradley,m., near-infrared-emitting hemicyanines and their photodynamic killing of cancer cells.acs appl.biomater.2021,4,8503-8508；xu,f.；li,h.d.；yao,q.c.；ge,h.y.；fan,j.l.；sun,w.；wang,j.y.； peng,x.j.,hypoxia-activated nir photosensitizer anchoring in the mitochondria forphotodynamic therapy.chem.sci.2019,10,10586-10594)然而，在原有的部花菁結構上添加重 原子無疑增加了合成難度，并且重原子的引入增加了細胞暗毒性以及有限的吸收發射波長嚴 重阻礙了腫瘤的光療效果的可行性。此外，在從激發態返回基態的過程中，熒光成像方式和 光療策略pdt/ptt分別與能量輻射和非輻射過程相關，幾乎相互對立，始終具有競爭性， 因此很難在單個發團中同時增強兩者，同時，在拓展部花菁染料的成像窗口和提高其 效果的同時避免不可預見的光降解和漂白仍然存在很大挑戰。。
技術實現要素：
4.針對現有技術的不足，本發明提供了一種新型硒代部花菁類化合物及其應用。
5.本發明具體技術方案如下：
6.一種硒代部花菁類化合物，具有如下結構：
7.其中r代表-oh，-nh2或n,n-二乙胺基；
8.x-代表陰離子，如cl-、br-、i-、no
3-或pf
4-。
9.本發明進一步公開了一種聚乙二醇修飾的硒代部花菁類化合物，其特征在于具有如下結構：
10.其中r代表-oh，-nh2或n,n-二乙胺基；
11.x-代表陰離子，如cl-、br-、i-、no
3-或pf
4-；n＝3～200的整數。本發明一個具體的示
例，r 代表n,n-二乙胺基，聚乙二醇為peg5000(n＝79)。
12.經聚乙二醇修飾的 本發明所述的硒代部花菁類化合物以及聚乙二醇修飾的硒代部花菁類化合物吸收和發射波長 均位于近紅外區域(700-900納米)。本發明另一目的在于保護上述化合物在制備熒光染料或 腫瘤光療藥物中的應用。進一步的，所述熒光染料為細胞和活體成像熒光探針。
13.本發明另一目的在于提供所述的硒代部花菁類化合物以及聚乙二醇修飾的硒代部花菁類 化合物的合成方法。根據硒酚的強親核性，選擇3-二乙胺基苯硒酚和川菁染料ir780一步反 應得到硒代部花菁類化合物cyse-net2。將cyse-alkynyl和n
3-mpeg-methoxy通過銅(i)催 化的炔烴-疊氮化物點擊反應(click reaction)獲得聚乙二醇修飾的硒代部花菁類化合物。本發明 合成方法簡易，合成條件溫和，提純較為簡易。
14.有益效果
15.(1)本發明所述的硒代部花菁類化合物相比較于氧/硫代部花菁染料(yuan,l.；lin,w.y.； zhao,s.；gao,w.s.；chen,b.；he,l.w.；zhu,s.s.,a unique approach to development ofnear-infrared fluorescent sensors for in vivo imaging.j.am.chem.soc.,2012,134, 13510-13523)，吸收波長紅移至776nm,發射波長紅移至818nm，其單線態氧產率提高 至14.8％，光熱轉換效率增強至42.2％。該染料靶向細胞線粒體，在光照下產生更多的 活性氧ros物種，以殺傷細胞，并具有明顯的光毒性，其半致死濃度ic50值達到0.26 μm，是一種潛在的有效光敏劑。
16.(2)本發明在硒代部花菁類化合物的結構基礎上進行了聚乙二醇修飾獲得cyse-mpeg
5k
， 并對其進行了研究。結果顯示cyse-mpeg
5k
不僅繼承了cyse-net2的光熱轉換能力， 單線態氧產率為14.8％，光熱轉換效率為14.2％，更值得注意地是，相較于cyse-net2的較差光穩定性，具有高的光熱轉換能力和穩定性。cyse-mpeg
5k
可以有效的在腫瘤區 域富集，實現了光聲模式下腫瘤區域的成像造影，為腫瘤臨床提供更精確的時空信 息。在生物學、醫學中具有廣闊的應用前景。
附圖說明
17.圖1.為不同氧族部花菁類化合物cyx-net2(x＝o,s或se)的歸一化吸收光譜(1a)和熒光光譜 (1b)。
18.圖2.為cyx-net2的單線態氧產率及光熱效應測試圖。光照條件下吸收光譜的變化，間隔時 間為5秒。(2a-c)dpbf與cyx-net2在甲醇溶液中激光光照后的光譜變化情況，激發波長為 750nm，照射功率為20mw/cm2；(d)光照吲哚菁綠icg和cyx-net2引起dpbf在410nm 處吸收值變化隨時間變化情況。(e)在750nm激光照射下，cyx-net2(50μm)和pbs(ph＝7.4) 的溫度變化隨時間的變化，當溫度到達最大值時，停止光照，紅外熱成像儀記錄溫度變化曲 線；(f)cyse-net2的熱-冷曲線，共5個循環，激光波長為750nm，光功率密度為500mw/cm2。
19.圖3.為cyx-net2的4t1細胞熒光共聚焦成像假圖。(a)cyo-net2；(b)cys-net2；(c) cyse-net2共定位成像圖。染料cyx-net2通道，670nm激發，680nm-800nm通道收集；線 粒體染料mitotracker green和溶酶體染料lysotracker green通道，488nm激發，492nm-630 nm通道收集；細胞核染料dapi通道，405nm激發,420nm-450nm通道收集。bar值：25μm。
20.圖4.為cyx-net2的4t1細胞光療效果。(a)細胞內ros檢測實驗，cyx-net2(4μm)孵育
細 胞后經避光或光照處理，dcfh-da(1μm)為細胞內活性氧檢測指示劑。綠熒光通道，488 nm激發，500nm-550nm通道收集，bar值：20μm；(b)a圖中對應細胞內平均熒光強度柱狀 圖，n＝3；(c)孵育不同濃度(0-4μm)cyx-net2的4t1細胞經避光或光照處理后在24小時 后的存活率，激光波長為750nm，光功率密度為500mw/cm2；(d)cyx-net2(4μm)與4t1 細胞孵育光照后活死細胞染圖，活細胞染劑鈣黃綠素(calcein am)，死細胞染劑碘化丙 啶(propidium iodide，pi),綠通道，488nm激發，500nm-550nm通道收集；紅通道，543 nm激發,560nm-650nm通道收集。bar值：25μm。
21.圖5.為本發明所述聚乙二醇修飾的硒代部花菁類化合物cyse-mpeg
5k
的光熱效應。(a)在 750nm激光照射下，cyse-mpeg
5k
(50μm)的pbs(ph＝7.4)溶液的溫度變化隨時間的變化， 當溫度到達最大值時，停止光照，紅外熱成像儀記錄溫度變化曲線；(b)cyse-mpeg
5k
的熱
??
冷曲線，共5個循環，激光波長為750nm，光功率密度為500mw/cm2；(c)在750nm激光， 500mw/cm2光功率密度照射下，不同濃度(20μm，40μm和60μm)的cyse-mpeg
5k
紅外 溫度變化曲線；(d)cyse-mpeg
5k
濃度為60μm，在不同功率(200mw/cm2，300mw/cm2和 500mw/cm2)下紅外溫度變化曲線。
22.圖6.為本發明所述聚乙二醇修飾的硒代部花菁類化合物cyse-mpeg
5k
的細胞光療效果。(a) 孵育不同濃度(0-64μm)cyx-net2和cyse-mpeg
5k
的4t1細胞經避光處理后在24小時后的 存活率；(b)孵育不同濃度(0-4μm)cyse-mpeg
5k
的4t1細胞經光照處理后在24小時后的 存活率，激光波長為750nm，光功率密度為500mw/cm2。
23.圖7.為本發明所述聚乙二醇修飾的硒代部花菁類化合物cyse-mpeg
5k
的腫瘤靶向熒光/光聲 成像。(a)尾靜脈給藥，cyse-net2和cyse-mpeg
5k
(50μm)在荷4t1瘤小鼠中的熒光造影圖 像；(b)給藥1小時,2小時和3小時后腫瘤組織與正常組織的熒光造影圖，激發波長780nm, 收集波段845
±
20nm；(c)a圖中腫瘤區域的熒光強度；(d)b圖中cyse-net2在各時間段腫瘤 組織與正常組織的熒光強度；(e)b圖中cyse-mpeg
5k
在各時間段腫瘤組織與正常組織的熒光 強度；(f)cyse-net2和cyse-mpeg
5k
在腫瘤區域每隔1小時的光聲造影圖像；(g)f圖中腫瘤 區域的光聲信號pa
780
強度值，標尺：3mm。
24.圖8.為本發明所述聚乙二醇修飾的硒代部花菁類化合物cyse-mpeg
5k
的腫瘤光熱成像。(a) pbs+780nm光照組，cyse-net2+780nm光照組與cyse-mpeg
5k
+780nm光照組小鼠熱成像 圖片；(b)a圖中腫瘤部位溫度上升曲線。
25.圖9.為本發明所述聚乙二醇修飾的硒代部花菁類化合物cyse-mpeg
5k
的腫瘤光療評估。(a) 不同實驗組荷瘤小鼠在過程中的體重變化曲線；(b)不同實驗組小鼠腫瘤體積增長曲線； (c)實驗結束后，不同實驗組荷瘤小鼠體型和腫瘤部位照片；(d)經過兩周結束后，不同 實驗組離體腫瘤照片；(e)不同實驗組小鼠的主要器官組織蘇木精-伊紅染切片，標尺:100 μm。
具體實施方式
26.下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出 了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實例。
27.實施例1：不同氧族部花菁類化合物cyx-net2(x＝o,s或se)的制備
28.1.cyo-net2的制備
[0029][0030]
化合物cyo-net2的合成:將cycho-net2(280mg,1.0mmol)，ch3coona(164mg,2.0 mmol)和吲哚鹽(395g,1.2mmol)溶解在無水ac2o(25ml)中，在25℃攪拌18小時。將所 得深綠溶液減壓濃縮并將所得殘余物溶解在二氯甲烷中，然后用水洗滌3次，有機層用無 水硫酸鈉干燥。旋蒸脫溶劑，硅膠譜柱提純，洗脫劑：ch2cl2：ch3oh＝100:3，得到深 綠固體0.38g，產率約65％。1h nmr(400mhz,cd2cl2,δppm):8.54(d,j＝14.2hz,1h), 7.53-7.40(m,4h),7.30(td,j＝7.5,0.7hz,1h),7.21(d,j＝7.9hz,1h),6.84(dd,j＝9.0,2.4hz, 1h),6.55(d,j＝2.0hz,1h),6.08(d,j＝14.2hz,1h),4.07(t,j＝7.5hz,2h),3.55(q,j＝7.1hz, 4h),2.78(t,j＝6.1hz,2h),2.69(t,j＝6.1hz,2h),1.99-1.86(m,4h),1.77(s,6h),1.29(t,j＝ 7.1hz,6h),1.09(t,j＝7.4hz,3h)ppm.
13
c nmr(400mhz,cd2cl2):δ174.69,165.12,157.78, 153.62,143.64,143.45,142.16,139.94,130.94,130.06,126.67,124.63,123.67,116.38,114.51, 113.79,112.22,100.72,97.02,55.21,50.78,47.49,46.58,30.04,29.63,25.81,22.03,13.59,12.71 ppm.hr-ms(esi,positive mode,m/z):calcd.467.30569,found 467.30423for[m-i]
+
。
[0031]
2.cys-net2的制備
[0032][0033]
化合物cys-net2的合成:在n2氛圍和0℃下，化合物cys-nh2(200mg,0.361mmol)溶解 在ch3cn(30ml)溶液中，加入碘乙烷(281mg,1.8mmol)和k2co3(200mg,1.44mmol)，在 85℃下回流18h。減壓除去反應溶劑，用二氯甲烷稀釋，然后用水洗滌3次，有機層用無水 硫酸鈉干燥。旋蒸脫溶劑，硅膠譜柱提純，洗脫劑：ch2cl2：ch3oh＝50:1，得到藍綠 固體產率約15％。1h nmr(400mhz,cd2cl2,δppm):8.24(d,j＝13.6hz,1h),7.51(dd,j＝ 14.8,8.1hz,2h),7.43(dd,j＝16.9,9.2hz,2h),7.32(t,j＝7.4hz,1h),7.21(d,j＝7.9hz,1h), 6.92(d,j＝10.5hz,2h),6.17(d,j＝13.7hz,1h),4.06(t,j＝7.3hz,2h),3.53(dd,j＝13.9,6.9 hz,4h),2.79(t,j＝5.8hz,2h),2.67(t,j＝5.8hz,2h),2.06-1.87(m,4h),1.79(s,6h),1.28(t,j ＝6.9hz,6h),1.07(t,j＝7.3hz,3h)ppm.
13
c nmr(400mhz,cd2cl2):δ174.67,159.09, 151.10,143.29,142.46,141.96,140.66,134.71,131.68,130.12,126.90,126.58,123.78,120.75, 115.91,112.34,106.16,101.97,97.33,50.91,47.50,46.45,
33.66,29.94,28.03,22.10,22.04,13.68, 12.70ppm.hr-ms(esi,positive mode,m/z):calcd.483.28284,found 483.28107for[m-i]
+
。
[0034]
3.本發明所述cyse-net2的制備
[0035][0036]
化合物cyse-net2的合成:在n2氛圍和0℃下，將nabh4(23mg,0.6mmol)分批加入到 2arse-net2(91mg,0.2mmol)的etoh(2ml)溶液中。反應15分鐘后，加入固體檸檬酸(192mg， 1.0mmol)，并將反應混合物在0℃繼續攪拌5分鐘。然后將反應液用et2o(5ml)稀釋并加入 去離子水(3ml)。萃取完分離各層，有機層用飽和nh4cl水溶液(2ml)和鹽水(2ml)洗滌，經 na2so4干燥，過濾并真空濃縮，得到arseh-net2，無需進一步純化。1h nmr(400mhz, cd2cl2,δppm):7.09(t,j＝7.9hz,1h),6.97-6.88(m,2h),6.54(d,j＝7.5hz,1h),3.30(q,j＝ 7.0hz,4h),1.12(t,j＝7.1hz,6h)ppm。
[0037]
化合物arseh-net2(361mg,1.58mmol)和k2co3(218mg,1.58mmol)溶于乙腈溶液中 (20ml),50℃加熱下ar氛圍中攪拌10min。ir780(700mg,1.05mmol)溶于乙腈(50ml)， 用注射器緩慢滴加進上述溶液，室溫下避光反應24h，tcl跟蹤反應。旋蒸脫溶劑，硅膠 譜柱提純，展開劑：ch2cl2:ch3oh＝94:4，得到藍固體，產率約20％。1h nmr(400mhz, cd2cl2,δppm):8.08(d,j＝13.7hz,1h),7.53(d,j＝8.6hz,2h),7.46(t,j＝7.6hz,1h),7.36(t, j＝7.4hz,1h),7.30-7.24(m,2h),7.04(d,j＝1.9hz,1h),6.85(d,j＝9.0hz,1h),6.30(d,j＝ 13.7hz,1h),4.12(t,j＝7.4hz,2h),3.51(q,j＝7.0hz,4h),2.81(t,j＝6.0hz,2h)),2.66(t,j ＝6.0hz,2h),2.03-1.84(m,4h),1.79(s,6h),1.27(t,j＝7.0hz,6h),1.07(t,j＝7.3hz,3h) ppm.
13
c nmr(400mhz,cd2cl2):δ174.36,161.53,149.46,144.40,142.03,141.59,141.36, 139.08,134.76,130.56,128.92,128.75,126.09,122.57,120.03,113.91,111.47,107.59,102.26, 49.95,46.52,45.07,33.43,28.51,27.56,21.03,20.91,12.37,11.37ppm.hr-ms(esi,positivemode,m/z):calcd.531.22730,found 531.22687for[m-i]
+
。
[0038]
cyx-net2在純甲醇溶劑中的歸一化吸收(a圖)和熒光發射(b圖)光譜如圖1所示。 cyo-net2的最大吸收波長大約在716nm附近，對應的最大摩爾消光系數為1.37
×
105m-1
cm-1
， 最大熒光發射波長為746nm，熒光量子產率為0.23。化合物cys-net2最大吸收與發射波長 分別在760nm和800nm，熒光量子效率為0.18，摩爾消光系數為1.17
×
105m-1
cm-1
。化合 物cyse-net2最大吸收與發射波長分別在776nm和818nm，熒光量子效率為0.11，摩爾消 光系
小時以除去多余的鹽，n
3-mpeg-methoxy和dmso，并冷凍干燥得到cyse-mpeg
5k
，產率為 95％。1h nmr(400mhz,meod,δppm):8.18(d,j＝13.3hz,1h),7.69-7.61(m,3h),7.57-7.48 (m,2h),7.45-7.39(m,2h),7.26(s,1h),6.99(d,j＝7.8hz,1h),6.49(d,j＝13.7hz,1h),4.62(s, 2h),4.38(s,2h),4.15(s,2h),4.06-3.54(m,mpeg),3.50(dd,j＝9.3,4.5hz,4h),3.40(s,3h), 3.27(d,j＝5.0hz,2h),2.87(s,2h),2.70(s,2h),2.33(s,2h),2.01(s,2h),1.82(s,6h),1.30(t,j ＝6.9hz,6h)ppm。modi-tof-ms,m/z:found 5000～6000。
[0043]
實施例3：不同氧族部花菁類化合物cyx-net2(x＝o,s或se)的光動力及光熱效應
[0044]
對熒光染料cyx-net2的單線態氧產生能力進行了考察。選用1,3-二苯基異苯并呋喃 (dpbf)作為單線態氧的捕獲劑。dpbf自身在415nm處有吸收峰，當存在單線態氧時，dpbf 與單線態氧發生反應，破壞其共軛結構，使得410nm處的紫外吸收峰下降，其反應歷程如下 所示：
[0045][0046]
選用波長匹配的吲哚菁綠(icg,indocyanine green)作為標準單線態氧參照物，dpbf作為 單線態氧捕獲劑，用紫外分光光度法測試，結果如圖2所示。由圖2a-d可以看出，在甲醇溶 劑中，用波長為750nm，功率為5mw/cm2的激光照射1分鐘，熒光染料cyse-net2在光照 后迅速產生單線態氧，表現為410nm處的dpbf吸收峰快速下降，而cys-net2溶液中的dpbf 吸收峰些微下降，cyo-net2幾乎無變化。根據如下公式可以算出化合物cyo-net2、cys-net2和cyse-net2的單線態氧產率分別為0.9％、2.5％和14.8％。結果顯示cyse-net2相對于 cyo-net2、cys-net2更適用于光動力。
[0047][0048]
φ
δ
表示單線態氧產率；上標sample和icg分別表示材料和對照品；s表示dpbf在410 nm處吸收值的變化隨時間作圖的斜率；f＝1-10-od
，od值是750nm處材料和icg的吸光度。
[0049]
光熱效應：選用750nm激發光源(0.5w
·
cm-2
)對50μm的cyx-net2的pbs緩沖液進 行光照150秒，再關閉激光器，使其冷卻至初始溫度，每秒記錄一次溫度。由圖2e可以看出， 當溶液起始溫度為25℃時，經激光照射后，溶液溫度分別可以升到41℃(cyo-net2)，53℃ (cys-net2)和63℃(cyse-net2)，而純pbs緩沖液的溫度無明顯變化。通過計算得知其熱轉 換效率依次為27.5％(cyo-net2)，38.5％(cys-net2)，42.2％(cyse-net2)，說明cyse-net2在 腫瘤光熱方面更具優勢。
[0050]
光熱穩定性測試，即在一定光功率密度下，重復測量升溫/冷卻過程，通過相同條件下， 每次升溫的變化量來確定材料的光熱穩定性。如圖2f所示，結果顯示cyse-net2在經歷5個 循環后溫度無法繼續上升，這可能是部花菁共軛結構被熱效應和單線態氧破壞所致。
[0051]
實施例4：不同氧族部花菁類化合物cyx-net2(x＝o,s或se)的共定位實驗
[0052]
造影實驗中所用4t1細胞在含有10％胚胎小牛血清(fbs,invitrogen)，青霉素(100units/ml) 和鏈霉素(100mg/ml)的dulbecco’s modified eagle medium(dmem,invitrogen)，37℃，5％ co2的空氣中培養。
[0053]
選用4t1細胞用2μm cyx-net2在37℃下孵育30分鐘后用pbs(20mm,ph 7.4)洗滌三 次。再用150nm共染試劑(包括mito-tracker green，lyso-tracker green和dapi)孵化30分 鐘，然后再用pbs(20mm,ph 7.4)洗滌三次成像。紅通道激發波長：670nm；發射波長范 圍：680-800nm。綠通道激發波長：488nm；發射波長范圍，492-630nm。藍通道激發 波長：405nm；發射波長范圍，420-450nm。共定位實驗在leica tcs sp8激光共聚焦熒光顯 微鏡上使用63倍油鏡拍照。共染試劑購買自賽默飛公司，并按說明書操作進行實驗。由圖3 可以看出，線粒體商業染料mito-tracker green和cyx-net2共孵育30分鐘后發現兩者的熒光 可以很好的重疊，紅綠熒光疊加后呈現出黃，其pearson’s共定位系數分別為0.89 (cyo-net2)，0.89(cys-net2)和0.91(cyse-net2)，而lyso-tracker green和dapi與之共孵育 后的pearson’s共定位系數均小于0.7，說明cyx-net2染料靶向線粒體。上述結果可能是由 于線粒體膜電位呈負性，帶正電荷的部花菁結構利于靶向線粒體。
[0054]
實施例5：不同氧族部花菁類化合物cyx-net2(x＝o,s或se)的細胞光療效果
[0055]
細胞內ros檢測實驗：選用商用活性氧檢測試劑盒dcfh-da(2
′
,7
′?
二氯熒光黃雙乙酸鹽) 作為細胞內活性氧檢測的指示劑，4t1細胞為考察對象。dcfh-da本身并不發射熒光，當被 4t1細胞攝取后細胞內的酯酶可將其水解為dcfh，dcfh不能穿透細胞膜因此探針容易被 標記在細胞內。當細胞內存在活性氧時，dcfh會被氧化成熒光物質dcf，在488nm光激發 下，dcf在525nm處會有熒光發射，其熒光強度和活性氧濃度成正比。將濃度為cyx-net2溶液或者pbs(ph＝7.4)分別與4t1細胞在37℃，含有5％co2的空氣中孵育2h后，用pbs 緩沖液洗滌去多余材料。加入dcfh-da，30分鐘后，用750nm激光器照射5分鐘，然后將 其用于成像試驗。由圖4a可以看出cyo-net2和cys-net2組的細胞呈現弱的綠熒光，而 cyse-net2組的細胞呈現強的綠熒光，結合熒光強度圖4b，表明相較于其他組細胞， cyse-net2組細胞內產生了大量的單線態氧。
[0056]
mtt實驗：利用mtt檢測方法研究了化合物cyx-net2對4t1細胞的暗毒性和光毒性。 將4t1細胞接種到96孔板上，接種密度約為每孔1
×
105個細胞。接種完后在培養箱中繼續 培養24小時待細胞貼壁后吸去孔內的培養液加入不同濃度的4t1細胞，繼續培養6小時后用 20mw/cm2能量的750nm激光器光照5分鐘。光照結束后繼續培養24小時。然后每個孔加 入40μl濃度為2.5mg/ml的mtt溶液。孵育4小時后吸去孔內溶液，加入150μl二甲亞 砜(dmso)來溶解甲臜晶體，使用酶標儀(thermo scientific,varioskan flash)測得490nm處各 孔吸光度od值。以不加藥對照組細胞生長存活率為100％，計算公式：細胞存活率％＝加藥 組od/對照組od
×
100％。
[0057]
測試結果表明，如圖4c，在避光情況下，化合物cyx-net2(x＝o,s,se)分別與細胞共 孵育24小時，細胞的半抑制濃度ic
50
為12.08μm,8.02μm和5.33μm，而在光照條件下， 細胞存活率顯著降低，細胞的半抑制濃度ic
50
分別為》4μm,2.17μm和0.26μm，對應的 pi值(ic
50(light)
/ic
50(dark)
)分別為《3.02,3.70和20.50，證明相較于cyo-net2和cys-net2，化 合物cyse-net2產生了明顯的光毒性，具有更好的光動力效果。
[0058]
活死細胞染實驗：將cyse-net2溶液與4t1細胞在37℃下孵育4h后，用pbs緩沖液 洗滌去多余材料，然后加入活細胞和死細胞的染劑鈣黃綠素(calcein am)和碘化丙啶 (propidium iodide，pi),用750nm激光器照射5分鐘后，用于成像。由圖4d可以看出，不光 照時，細胞呈現綠熒光，而經過光照后，細胞呈現紅熒光，并且細胞形態發生了明顯變 化，再次證明cyse-net2具有良好的光療效果。
[0059]
實施例6：聚乙二醇修飾的硒代部花菁類化合物cyse-mpeg
5k
的光熱效應
[0060]
參照實施例3方法，考察cyse-mpeg
5k
的光熱效應，結果如圖5a和5b所示。計算得cyse-mpeg
5k
的熱轉換效率為40.5％，說明cyse-mpeg
5k
繼承了cyse-net2的光熱轉換能力， 更值得注意地是，相較于cyse-net2的較差光穩定性，cyse-mpeg
5k
在730nm的激光照射條 件下，在經歷五個升溫、降溫循環過程中，cyse-mpeg
5k
的光熱轉換能力幾乎沒有改變，表 明cyse-mpeg
5k
具有高的光熱轉換能力和穩定性，其優于cyse-net2。
[0061]
濃度/光功率密度依賴性光熱轉換測試：如圖5c所示，固定cyse-mpeg
5k
的濃度為50μm， cyse-mpeg
5k
在pbs中的溫度變化與光功率密度表現出正相關的變化趨勢。例如，當激光功 率密度為200mw/cm2,300mw/cm2和500mw/cm2時，相應的溫度上升至33℃，40℃和60℃。 如圖5d所示，固定激光功率密度為500mw/cm2時，隨著cyse-mpeg
5k
濃度的增加， cyse-mpeg
5k
在pbs中的溫度變化也相應的增加。當濃度分別為20μm，40μm和60μm時， 相應的溫度上升至32℃，42℃和60℃。其中60℃足可以對癌細胞產生不可逆的殺傷作用(如 果溫度超過43℃，腫瘤細胞會發生病變，細胞內蛋白錯誤折疊，如果長時暴露在此溫度下會 造成腫瘤細胞不可逆的損傷,如果溫度超過60℃，那么腫瘤細胞中的蛋白質會發生凝固，腫 瘤細胞被熱消融)。
[0062]
實施例7：聚乙二醇修飾的硒代部花菁類化合物cyse-mpeg
5k
的細胞光療效果
[0063]
參照實施例5的mtt實驗方法，考察cyse-mpeg
5k
的細胞光療效果。結果如圖6a,6b所示。 在避光情況下，即使64μm的cyse-mpeg
5k
與細胞共孵育24小時，細胞的存活率依舊高達 87％，證明cyse-mpeg
5k
的暗毒性小。然而小分子cyx-net2系列染料的暗毒性比較大，其 ic
50
值分別為12.08μm,8.02μm和5.33μm，這在活體生物中會給正常組織帶來不可避免的 暗毒性傷害。值得注意地是，在用500mw/cm2的750nm激光照射5分鐘后，與cyse-mpeg
5k
孵育的細胞存活率顯著降低，ic
50
低至0.85μm，說明相較于小分子cyx-net2系列染料， cyse-mpeg
5k
的光穩定性、生物安全性和光療效應更適用于活體腫瘤。
[0064]
實施例8：聚乙二醇修飾的硒代部花菁類化合物cyse-mpeg
5k
的腫瘤靶向熒光/光聲成像
[0065]
實驗方案：6-8周大的雌性荷4t1細胞瘤小鼠用于熒光活體成像，用異氟烷進行氣體麻 醉，使用perkinelmer ivis lumina k series iii成像系統進行活體成像。成像實驗激發光:780 nm，收集845nm通道的發射光。
[0066]
為了研究cyse-mpeg
5k
是否可以用于活體腫瘤造影，通過尾靜脈注射的方式將對照小分 子cyse-net2(100μm,100μl)和cyse-mpeg
5k
(100μm,100μl)注射到荷4t1腫瘤的 balb/c小鼠中然后進行熒光和光聲信號采集。結果如圖7所示。活體熒光成像能力探究結果 如圖7a所示，可以看出，在注射之前小鼠的腫瘤部位沒有熒光，分別給藥后，對照組的熒光 信號主要集中在肝臟區域，并未在腫瘤部位進行富集。而注射cyse-mpeg
5k
組小鼠可以在腫 瘤部位快速檢測到熒光信號，這表明cyse-mpeg
5k
納米粒子可以通過腫瘤epr效應富集到 腫瘤區
域，腫瘤區域的熒光信號在0.5小時左右達到最大值，然后降低(圖7a,7c)。實驗組給 藥1小時，2小時和3小時后分別對小鼠進行解剖取腫瘤組織和其它正常組織進行熒光拍照， 結果顯示，腫瘤部位的熒光信號最強，在肝、脾、肺、腎也能觀察到熒光信號，而在肝和腎 部位熒光信號較強，可能與cyse-mpeg
5k
的代謝途徑相關(圖7b)。實驗表明cyse-mpeg
5k
可以靶向腫瘤組織且其熒光可以穿透活體組織用于腫瘤組織熒光造影。
[0067]
在熒光成像模式下確定cyse-mpeg
5k
具有很好的腫瘤靶向和造影能力后，進一步對 cyse-mpeg
5k
在光聲造影模式下的造影能力進行考察，使用光聲/超聲(pa/us vevo lazr-xfujifilm visualsonics)活體成像系統進行。與熒光成像類似，首先采集腫瘤區域在780nm激 光器下的光聲信號pa780，如圖7f,7g所示,相比于0小時腫瘤區域的光聲信號，給藥1小時 后，腫瘤區域光聲信號pa780明顯變強，并能持續幾個小時都可觀測到，然而注射小分子 cyse-net2對照組小鼠的腫瘤的光聲信號卻沒明顯變化，以上結果與熒光成像相符。這表明 cyse-mpeg
5k
可以有效的在腫瘤區域富集，實現了光聲模式下腫瘤區域的成像造影，可以為 腫瘤臨床提供更精確的時空信息。
[0068]
實施例9：聚乙二醇修飾的硒代部花菁類化合物cyse-mpeg
5k
的腫瘤光熱成像
[0069]
實驗方案：6-8周大的雌性荷4t1細胞瘤小鼠用于活體光熱成像，使用美國flie紅外熱 成像儀進行熱成像。尾靜脈注射pbs溶液(組一)和cyse-mpeg
5k
(100μm,100μl,組二)至 荷瘤小鼠體內，1小時后使用0.5w/cm2的780nm激光器對腫瘤區域進行光照，記錄腫瘤區 域的溫度。
[0070]
鑒于材料溶液具有優越的光熱效果，且cyse-mpeg
5k
具有良好的腫瘤富集能力，猜測其 可以用于腫瘤組織的光熱，而近紅外光在生物組織中具有較好的穿透性，可以殺死較深 處的腫瘤組織。材料的活體光熱效果在荷4t1小鼠上進行評估。對小鼠注射pbs，cyse-net2和cyse-mpeg
5k 1小時后，用750nm(0.5w/cm2)激光對腫瘤部位進行照射，用熱成像儀對 腫瘤部位的溫度進行跟蹤記錄。如圖8所示，注射cyse-mpeg
5k
的小鼠腫瘤部位溫度在兩分 鐘內快速升高至53℃左右，并維持這個溫度不變。在該溫度下，對腫瘤細胞造成不可逆的殺 傷。相比之下，注射pbs溶液和cyse-net2并光照后的腫瘤溫度只升高至34℃和41℃，溫 度未超過腫瘤細胞損傷閾值(43℃)，并未對腫瘤區域造成破壞。實驗結果表明，cyse-mpeg
5k
材料可以用于小鼠腫瘤光熱。
[0071]
實施例10：聚乙二醇修飾的硒代部花菁類化合物cyse-mpeg
5k
的腫瘤光療評估
[0072]
實驗方案：6-8周大荷4t1細胞瘤小鼠用于光動力效果評估。將荷瘤小鼠隨機分成3 個實驗組。尾靜脈注射pbs溶液(組一),cyse-net2(200μm,100μl,組二)和cyse-mpeg
5k (200μm,100μl,組三)進行黑暗處理或者各1小時后用0.5w/cm2的750nm激光器光照腫 瘤區域10分鐘；小鼠每兩天進行一次，兩周后停止給藥和光照，記錄腫瘤體積和小鼠體 重。用游標卡尺測量腫瘤體積，腫瘤體積＝瘤長
×
瘤寬2
×
0.5，測量小鼠的體重。
[0073]
腫瘤及器官組織切片的h&e染實驗：h&e染又稱蘇木精-伊紅染，蘇木精為堿性， 可將細胞核中核酸染成紫藍；伊紅染料為酸性主要將細胞株和細胞外基質的成為著成紅。 對荷瘤小鼠進行后，按照章程處死小鼠，取每組小鼠的腫瘤、心、肝、脾、肺、腎等主 要器官，浸泡在福爾馬林中，石蠟切片后進行h&e染，研究腫瘤和主要器官的病理情況。
[0074]
實驗結果如圖9b，對照組一和二中小鼠的瘤體積增加，其生長速度相似，說明
750nm 光照與注射pbs溶液/cyse-net2避光條件下對小鼠腫瘤發展影響不大。而注射cyse-mpeg
5k
后再使用750nm激光光照則小鼠腫瘤完全消失，在腫瘤位置上留下黑的結痂，結痂脫落后 長出新的皮膚(圖9c)。如圖9a,d，瘤體積和小鼠體重數據表明cyse-mpeg
5k
具有很好的光熱 腫瘤能力且生物相容性較好、生物毒性小，在過程中小鼠體重沒有明顯減輕。
[0075]
cyse-mpeg
5k
作為一種潛在的腫瘤光熱材料，對其生物毒性研究是非常必要的。本 發明通過組織學分析實驗研究cyse-mpeg
5k
是否會導致其它器官炎癥或者損傷。取對照組和 組的小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟進行h&e染。染結果如圖9e，注射 cyse-net2(組一)小鼠避光和光照組的肝臟細胞出現炎癥侵染，空泡化現象，可能是由于 cyse-net2的暗毒性較大，富集和停滯在肝臟所致。其他對照組和組小鼠心肌細胞結構正 常，無明顯水腫。肝臟細胞無明顯炎癥侵染，肺泡和肺支氣管結構清晰，肺泡壁血管無充血 現象，無明顯纖維化及炎癥癥狀，其它組織也未見明顯損傷，同時只有注射cyse-mpeg
5k
的 光照組小鼠腫瘤出現細胞壞死和凋亡情況。因此cyse-mpeg
5k
具有較好的生物相容性和低毒 性，在實驗所用的劑量下對小鼠無明顯毒性，可用于活體腫瘤光熱。
技術特征：
1.一種硒代部花菁類化合物，其特征在于具有如下結構：其中r代表-oh，-nh2或n,n-二乙胺基；x-代表陰離子。2.如權利要求1所述的硒代部花菁類化合物，其特征在于所述x-選自cl-、br-、i-、no
3-或pf
4-。3.一種聚乙二醇修飾的硒代部花菁類化合物，其特征在于具有如下結構：其中r代表-oh，-nh2或n,n-二乙胺基；x-代表陰離子，n＝3～200的整數。4.如權利要求3所述的聚乙二醇修飾的硒代部花菁類化合物，其特征在于r代表n,n-二乙胺基，n＝79。5.如權利要求4所述的聚乙二醇修飾的硒代部花菁類化合物，其特征在于所述x-選自cl-、br-、i-、no
3-或pf
4-。6.權利要求1或2所述的硒代部花菁類化合物或者權利要求3或4所述的聚乙二醇修飾的硒代部花菁類化合物在制備熒光染料或者腫瘤光療藥物中的應用。7.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述熒光染料為細胞和活體成像熒光探針。
技術總結
本發明公開了一類硒代部花菁類化合物，具有如下結構：或其中R代表-OH，-H2或,-二乙胺基；X-代表陰離子。本發明所述硒代部花菁類化合物吸收和發射波長均位于近紅外區域(700nm-900nm)。有效靶向線粒體，可作為熒光染料用于細胞和活體成像以及腫瘤靶向的光動力/光熱聯合。的光動力/光熱聯合。
