一種新的螺甾皂苷化合物及其制備方法
1.本發(fā)明涉及一種從蒺藜葉中分得的新的螺甾皂苷化合物單體及其制備方法，屬于天然藥物化學(xué)研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2.蒺藜葉是蒺藜科(zygophylaceae)蒺藜屬(tribulus)植物蒺藜(tribulus terrestris l.)的葉。蒺藜在我國具有非常悠久的藥用歷史，其全株、果實(shí)、花、莖、葉及根均可入藥，被譽(yù)為“草中名藥”，具有平肝解郁，活血祛風(fēng)，明目，止癢等功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蒺藜中的甾體皂苷具有心血管疾病、增強(qiáng)性功能、抗衰老等作用。國外已開發(fā)了增強(qiáng)性功能的“tribustan”和“vitanone”及具有軟化血管功能的“tribusaponin”等制劑。我國研制開發(fā)的以蒺藜葉總皂苷為主成分的制劑“心腦舒通”已在臨床上用于心、腦血管疾病的，具有擴(kuò)冠、改善冠脈循環(huán)作用，對緩解心絞痛、改善心肌缺血有較好療效。
3.蒺藜主要含有甾體皂苷類、黃酮類、生物堿類、多糖類等化合物，其中甾體皂苷是蒺藜的主要有效成分。甾體皂苷是一類螺甾烷類化合物衍生的寡聚糖，按其母核類型分為螺甾型皂苷和呋甾型皂苷兩大類，具有直鏈和支鏈糖苷單元，所連接糖類以d-葡萄糖、d-半乳糖、d-木糖、l-阿拉伯糖、l-鼠李糖為主。迄今為止，已有120余種甾體皂苷類化合物從蒺藜中被分離鑒定，且包括新骨架在內(nèi)的新化合物仍在被發(fā)現(xiàn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
4.本發(fā)明致力于蒺藜從中提取、分離、鑒定甾體皂苷類化合物，經(jīng)過不斷努力，從蒺藜葉中提取分離得到了一種新的甾體皂苷類化合物，并到了其制備方法。
5.本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，涉及一種新的甾體皂苷化合物，具體包括其提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定及其制備方法。
6.為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案。
7.以蒺藜葉為原料用有機(jī)溶劑的水溶液進(jìn)行提取、提取液減壓回收溶劑，濃縮液用水稀釋后過大孔吸附樹脂吸附，用有機(jī)溶劑的水溶液洗脫，tlc跟蹤檢測，收集含甾體皂苷流分，洗脫液減壓回收溶劑，干燥，得到蒺藜葉總皂苷。取蒺藜葉總皂苷進(jìn)行硅膠柱層析、ods柱層析、制備型高效液相譜分離純化，最終得到(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷單體。
8.所述蒺藜葉的提取方法為取干燥的蒺藜葉粉碎，用有機(jī)溶劑的水溶液回流提取三次，合并三次提取液。提取用有機(jī)溶劑的水溶液為丙酮水或甲醇水或者乙醇水溶液，優(yōu)選70％～90％的丙酮水、甲醇水或者乙醇水溶液。
9.所述的大孔吸附樹脂選自d-101、hp20、ab-8及d4020的一種或它們的兩種或兩種以上的混合樹脂。
10.所述的大孔吸附樹脂洗脫用有機(jī)溶劑選自乙醇、甲醇、丙酮的一種或它們的兩種
或兩種以上混合溶劑。
11.洗脫用有機(jī)溶劑的水溶液是體積百分比濃度為40％～90％的有機(jī)溶劑的水溶液。
12.(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷單體的制備方法如下。首先取蒺藜葉總皂苷進(jìn)行硅膠柱層析，流動相為乙酸乙酯-乙酯-水的混合溶液，優(yōu)選體積比為7.5:1.0:0.4的乙酸乙酯-乙酯-水為流動相，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷的組分a；將組分a以二氯甲烷-甲醇-水為流動相再次進(jìn)行硅膠柱層析分離，優(yōu)選流動相體積比為13.0:4.5:0.8，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷的組分b；將組分b以丙酮-水為流動相進(jìn)行ods柱層析分離，優(yōu)選流動相體積比為1.0:2.6，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷的組分c；將組分c以丙酮-水為流動相再次進(jìn)行ods柱層析分離，優(yōu)選流動相體積比為1.0:2.2，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷的組分d；最后將組分d用乙腈-水為流動相，利用制備型高效液相譜進(jìn)行分離純化，優(yōu)選流動相體積比為87:13，得到(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷單體(簡稱化合物a)。本發(fā)明制備方法得到的(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷單體純度可以達(dá)到99％以上。
13.本發(fā)明獲得的(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷單體可用于中藥材蒺藜或保健食品原料蒺藜的質(zhì)量控制以及制備藥物組合物及其他產(chǎn)品。
14.本發(fā)明利用nmr和ms等手段鑒定了分得的化合物a的化學(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)鑒定過程及數(shù)據(jù)如下：
15.化合物a為白粉末，anisaldehyde試劑顯黃，ehrlich試劑不顯。推測該化合物可能是螺甾型皂苷類化合物。質(zhì)譜(esi-ms)給出分子離子峰為1095.5071[m+h]
+
，提示化合物a的分子量為1094.5071，分子式為c
51h82o25
。
[0016]
13
c nmr(c5d5n，150mhz)譜共給出51個碳信號，初步推測其中27個信號為皂苷元碳信號，其余24個信號為糖基碳信號。結(jié)合dept 90
°
和dept 135
°
譜可將皂苷元的碳信號歸屬為4個伯碳信號δc 16.18，δc 11.81，δc 13.86，δc 13.56；9個仲碳信號δc 36.71，δc 29.85，δc 34.74，δc 28.67，δc 31.75，δc 38.03，δc 31.42，δc 41.00，δc 65.31，其中δc 65.31為連氧碳信號；10個叔碳信號δc 77.15，δc 44.54，δc 34.35，δc 55.55，δc 55.92，δc 80.18，δc 53.94，δc 42.86,δc 81.64,δc 38.27，其中δc 81.64，δc 80.18,δc 77.15為連氧碳信號；4個季碳信號δc 36.36，δc 212.77，δc 55.38，δc 111.76，其中δc 212.77為羰基碳信號。高場端c-18(δc 16.18)的化學(xué)位移比c-19(δc 11.81)的化學(xué)位移處于低場，提示化合物中存在5-α-h。低場區(qū)δc 102.46，δc 105.34，δc 107.09，δc 106.66為糖的端基碳信號，提示化合物中存在四分子糖。
[0017]
在1h nmr(c5d5n，600mhz)譜中，低場區(qū)δh 4.76(1h,d,j＝7.2hz)，δh 4.81(1h,d,j＝7.8hz)，δh 5.03(1h,d,j＝7.8hz)，δh 5.12(1h,d,j＝7.8hz)可歸屬為糖的端基質(zhì)子信號，進(jìn)一步確定化合物中有四分子糖的存在，由j值可知四個糖均為β-d構(gòu)型。高場區(qū)出現(xiàn)四個甲基質(zhì)子信號，分別為δh 0.53(s)，δh 0.86(s)，δh 1.02(d)，δh 1.15(d)，進(jìn)一步確定了化合物中有四個甲基存在。
[0018]
將化合物a的
13
c nmr數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的化合物(24s,25s)-24-[(β-d-glucopyranosyl)oxy]-3β-[β-d-glucopyranosyl-(1
→
2)-[β-d-xylopyranosyl-(1
→
3)]-β-d-glucopyranosyl-(1
→
4)-β-d-galactopyranosyl)oxy]-5α-spirostan-12-one對照，發(fā)現(xiàn)化合物a苷元部分的
13
c nmr數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的化合物基本一致。將化合物a糖部分的
13
c nmr數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的化合物hecogenin3-o-β-d-glucopyranosyl-(1
→
2)-o-β-d-glucopyranosyl-(1
→
4)-β-d-galactopyranoside對照，發(fā)現(xiàn)兩者基本一致。
[0019]
分析化合物a的1h-1
hcosy、hsqc、hmbc的圖譜，發(fā)現(xiàn)有一個葡萄糖的端基氫δh 4.81(1h,d,j＝7.8hz)與c-24(δc 81.64)存在c-h遠(yuǎn)程相關(guān)，證明c-24位連接一分子葡萄糖。半乳糖的端基氫δh 4.76(1h,d,j＝7.2hz)與c-3(δc 77.15)存在c-h遠(yuǎn)程相關(guān)，提示c-3位上連接的是半乳糖，另外2個葡萄糖中的一個葡萄糖的端基氫δh 5.03(1h,d,j＝7.8hz)與半乳糖4位的碳信號δc 81.19存在c-h遠(yuǎn)程相關(guān)，提示該葡萄糖和半乳糖的連接方式為1
→
4連接，即半乳糖的4位連有一分子葡萄糖；該葡萄糖2位的碳信號δc 86.30與剩余一個葡萄糖的端基氫δh 5.12(1h,d,j＝7.8hz)存在c-h遠(yuǎn)程相關(guān)，提示該葡萄糖和剩余的一個葡萄糖的連接方式為1
→
2連接，即該葡萄糖的2位連有一分子葡萄糖。
[0020]
綜上分析，確定化合物a為(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷。(25s)-24-o-β-d-glucopyranosyl-5α-spirost-12-one-3β,24-diol-3-o-β-d-glucopyranosyl-(1
→
2)-o-β-d-glucopyranosyl-(1
→
4)-β-d-galactopyranoside。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，該化合物未見報道，因此確認(rèn)化合物a為新化合物。
[0021][0022]
化合物a的結(jié)構(gòu)式
[0023]
化合物a的
13
cnmr(150mhz)和1hnmr數(shù)據(jù)(600mhz)pyridine-d5
[0024][0025][0026]
檢測化合物a純度的hplc-elsd譜條件如下：
[0027]
譜柱-agilenteclipse xamide(4.6
×
250mm，5μm)
[0028]
流動相-乙腈-水(83:17)；流速-1l/min；柱溫-30℃；進(jìn)樣量-15μl。
[0029]
elsd檢測器漂移管溫度80℃；撞擊狀態(tài)-關(guān)閉。
[0030]
載氣壓力-0.45mpa；霧化器流速-2.1l/min；放大倍數(shù)-1.0倍。
附圖說明
[0031]
圖1.化合物a的質(zhì)譜圖
[0032]
圖2.化合物a的1h-nmr圖
[0033]
圖3.化合物a的
13
c-nmr圖
[0034]
圖4.化合物a的dept90
°
,135
°
圖
[0035]
圖5.化合物a的1h-1
h cosy圖
[0036]
圖6.化合物a的hmbc圖
[0037]
圖7.化合物a的hmqc圖
具體實(shí)施方式
[0038]
以下對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0039]
實(shí)施例1
[0040]
取干燥蒺藜葉13kg，粉碎，用85％乙醇加熱回流提取三次，乙醇水溶液用量分別為10、8、6倍(w/v)，回流時間依次為2h、1.5h、1.0h，合并三次提取液，減壓濃縮至無醇味。濃縮液加5倍蒸餾水稀釋，稀釋液過d-101型大孔樹脂吸附，去離子水洗至無，用8倍柱體積的85％乙醇洗脫，將洗脫液減壓濃縮后用氯仿-甲醇-水(13.0:8.0:1.2)為展開劑進(jìn)行薄層層析檢驗，分別用a試劑(50ml醋酸將0.5ml茴香醛溶解，加硫酸1ml)和e試劑(1％對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液:濃鹽酸(4:1))顯，將甾體皂苷洗脫完全后減壓回收溶劑，干燥，獲得蒺藜葉總皂苷。
[0041]
取蒺藜葉總皂苷100g，以乙酸乙酯-乙酯-水＝7.5:1.0:0.4(體積比)為流動相進(jìn)行硅膠柱層析，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷的組分a 32.5g；將組分a以二氯甲烷-甲醇-水＝13.0:4.5:0.8(體積比)為流動相進(jìn)行硅膠柱層析，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷的組分b12.5g；將組分b以丙酮-水＝1.0:2.6(體積比)為流動相進(jìn)行ods柱層析，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷的組分c 3.5g；將組分c以丙酮-水＝1.0:2.2(體積比)為流動相再次進(jìn)行ods柱層析，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷的組分d 335mg；最后將組分d用乙腈-水＝87:13(體積比)為流動相，利用制備型高效液相譜進(jìn)行分離純化，得到(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷單體34mg。
[0042]
得到的(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷單體經(jīng)hplc-elsd檢測其純度為99.5％。
[0043]
實(shí)施例2
[0044]
取干燥蒺藜葉10kg，粉碎，用80％甲醇加熱回流提取三次，甲醇水溶液用量分別為
10、8、6倍(w/v)，回流時間依次為2h、1.5h、1.0h，合并三次提取液，減壓濃縮至無醇味。濃縮液加5倍蒸餾水稀釋，稀釋液過hp20型大孔樹脂吸附，去離子水洗至無，用8倍柱體積的75％甲醇洗脫，將洗脫液減壓濃縮后用氯仿-甲醇-水(13.0:8.0:1.2)為展開劑進(jìn)行薄層層析檢驗，分別用a試劑(50ml醋酸將0.5ml茴香醛溶解，加硫酸1ml)和e試劑(1％對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液:濃鹽酸(4:1))顯，將甾體皂苷洗脫完全后減壓回收溶劑，干燥，獲得蒺藜葉總皂苷。
[0045]
取蒺藜葉總皂苷100g，以乙酸乙酯-乙酯-水＝7.5:1.0:0.4(體積比)為流動相進(jìn)行硅膠柱層析，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷的組分a 30.0g；將組分a以二氯甲烷-甲醇-水＝13.0:4.5:0.8(體積比)為流動相進(jìn)行硅膠柱層析，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷的組分b 9.5g；將組分b以丙酮-水＝1.0:2.6(體積比)為流動相進(jìn)行ods柱層析，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷的組分c 2.9g；將組分c以丙酮-水＝1.0:2.2(體積比)為流動相再次進(jìn)行ods柱層析分離，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷的組分d 275mg；最后將組分d用乙腈-水＝87:13(體積比)為流動相，利用制備型高效液相譜進(jìn)行分離，得到(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷單體28mg。
[0046]
純化得到的(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷單體經(jīng)hplc-elsd檢測其純度為97.7％。
[0047]
實(shí)施例3
[0048]
取蒺藜干燥葉12kg，粉碎，用90％丙酮加熱回流提取三次，丙酮水溶液用量分別為10、8、6倍(w/v)，回流時間依次為2h、1.5h、1.0h，合并三次提取液，減壓濃縮至無丙酮味。濃縮液加5倍蒸餾水稀釋，稀釋液過ab-8型大孔樹脂吸附，去離子水洗至無，用8倍柱體積的90％丙酮洗脫，將洗脫液減壓濃縮后用氯仿-甲醇-水(13.0:8.0:1.2)為展開劑進(jìn)行薄層層析檢驗，分別用a試劑(50ml醋酸將0.5ml茴香醛溶解，加硫酸1ml)和e試劑(1％對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液:濃鹽酸(4:1))顯，將甾體皂苷洗脫完全后減壓回收溶劑，干燥，獲得蒺藜葉總皂苷。
[0049]
取蒺藜葉總皂苷100g，以乙酸乙酯-乙酯-水＝7.5:1.0:0.4(體積比)為流動相進(jìn)行硅膠柱層析，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷的組分a28.5g；將組分a以二氯甲烷-甲醇-水＝13.0:4.5:0.8(體積比)為流動相進(jìn)行硅膠柱層析，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷的組分b 8.0g；將組分b以丙酮-水＝1.0:2.6(體積比)為流動相進(jìn)行ods柱層析，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半
乳糖苷的組分c 2.5g；將組分c以丙酮-水＝1.0:2.2(體積比)為流動相再次進(jìn)行ods柱層析分離，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷的組分d 230mg；最后將組分d用乙腈-水＝87:13(體積比)為流動相，利用制備型高效液相譜進(jìn)行分離純化，得到(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷單體20mg。
[0050]
經(jīng)hplc-elsd檢測其純度為98.6％。
[0051]
實(shí)施例4
[0052]
取干燥蒺藜葉13kg，粉碎，用85％乙醇加熱回流提取三次，乙醇水溶液用量分別為10、8、6倍(w/v)，回流時間依次為2h、1.5h、1.0h，合并三次提取液，減壓濃縮至無醇味。濃縮液加5倍蒸餾水稀釋，稀釋液過d4020型大孔樹脂吸附，去離子水洗至無，用8倍柱體積的70％丙酮洗脫，將洗脫液減壓濃縮后用氯仿-甲醇-水(13.0:8.0:1.2)為展開劑進(jìn)行薄層層析檢驗，分別用a試劑(50ml醋酸將0.5ml茴香醛溶解，加硫酸1ml)和e試劑(1％對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液:濃鹽酸(4:1))顯，將甾體皂苷洗脫完全后減壓回收溶劑，干燥，獲得蒺藜葉總皂苷。
[0053]
取蒺藜葉總皂苷100g，以乙酸乙酯-乙酯-水＝7.5:1.0:0.4(體積比)為流動相進(jìn)行硅膠柱層析，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷的組分a28.9g；將組分a以二氯甲烷-甲醇-水＝13.0:4.5:0.8(體積比)為流動相進(jìn)行硅膠柱層析，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷的組分b11.3g；將組分b以丙酮-水＝1.0:2.6(體積比)為流動相進(jìn)行ods柱層析，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷的組分c 3.0g；將組分c以丙酮-水＝1.0:2.2(體積比)為流動相再次進(jìn)行ods柱層析，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷的組分d 321mg；最后將組分d用乙腈-水＝87:13(體積比)為流動相，利用制備型高效液相譜進(jìn)行分離純化，得到(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷單體38mg。
[0054]
得到的(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷單體經(jīng)hplc-elsd檢測其純度為94.6％。
[0055]
上述實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管前述實(shí)驗例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改、等同替換、改進(jìn)等，這些均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
技術(shù)特征：
1.一種新的螺甾皂苷化合物，即(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷。2.一種新的螺甾皂苷化合物的制備方法，其特征在于以蒺藜干燥葉為原料經(jīng)有機(jī)溶劑提取、濃縮，濃縮液用水稀釋后過大孔吸附樹脂吸附，有機(jī)溶劑的水溶液進(jìn)行洗脫，洗脫液減壓回收溶劑，干燥，得到含有(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷單體的蒺藜葉總皂苷，取蒺藜葉總皂苷反復(fù)進(jìn)行硅膠柱層析、ods柱層析分離后再利用制備型高效液相譜進(jìn)行純化，得到(25s)-24-o-β-d-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-o-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
2)-β-d-吡喃葡萄糖基-(1
→
4)-β-d-吡喃半乳糖苷單體。3.權(quán)利要求書2所述的制備方法，其特征在于所述的提取用有機(jī)溶劑為乙醇或甲醇，洗脫用有機(jī)溶劑選自乙醇、甲醇、丙酮的一種或它們的兩種或兩種以上的混合溶劑。4.權(quán)利要求書2所述的制備方法，其特征在于所述的大孔吸附樹脂選自d-101、hp20、ab-8的一種或它們的兩種或兩種以上的混合樹脂。5.權(quán)利要求書2所述的制備方法，其特征在于所述的洗脫用有機(jī)溶劑水溶液是體積百分比在70％～90％之間的乙醇、甲醇、丙酮或它們的兩種或兩種以上的混合水溶液。6.權(quán)利要求書2所述的制備方法，其特征在于所述的硅膠柱層析洗脫劑為乙酸乙酯-乙醇-水混合溶劑，優(yōu)選體積比為7.5:1.0:0.4或二氯甲烷-甲醇-水混合溶劑，優(yōu)選體積比為13.0:4.5:0.8。7.權(quán)利要求書2所述的制備方法，其特征在于所述的ods柱層析洗脫劑為丙酮-水混合溶劑，優(yōu)選體積比為1.0:2.6或1.0:2.2。8.權(quán)利要求書2所述的制備方法，其特征在于所述的制備型高效液相譜流動相是乙腈-水混合溶劑，優(yōu)選體積比為87:13。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種新的螺甾皂苷化合物及其制備方法。本發(fā)明所述的新的螺甾皂苷化合物為(25S)-24-O-β-D-葡萄糖基-5α-螺甾-12-酮-3β,24-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1
