COL24A1突變在預測肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感性中的應用的制作方法
col24a1突變在預測肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感性中的應用
技術領域
1.本技術涉及分子診斷領域，具體涉及col24a1突變在預測肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感性中的應用。
背景技術：
2.基于pd-1/pd-l1、ctla-4等新興的免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors,icis)的方案在多種實體瘤得到了廣泛的研究，并已進入肺腺癌(nsclc)一線。盡管免疫檢查點抑制劑效果不錯，但整體客觀緩解率(orr)依然只有20％左右，因此開發合適的生物標志物，精確篩選更多免疫獲益人，是未來腫瘤免疫發展亟待解決的關鍵問題。基于免疫組織化學染檢測腫瘤pd-l1表達是目前免疫應用最為廣泛的生物標志物。在某些腫瘤類型，如肺腺癌，pd-l1的表達可以作為抗pd-1/pd-l1反應的預測標志物。但是，多個臨床試驗結果顯示pd-l1表達對免疫療效的預測能力并不一致，部分pd-l1陰性患者依然能從免疫獲益，雖然pd-l1陰性患者整體有效率更低，但持續緩解時間不遜于pd-l1陽性的患者。并且，pd-l1的檢測標準依然存在諸多爭議，而且pd-l1在腫瘤的不同的解剖以及隨著的進展都會發生改變。
3.腫瘤突變負荷(tmb)已證明與多種腫瘤類型包括黑素瘤，肺腺癌和膀胱癌的免疫檢查點抑制劑的療效相關。不過tmb作為預測因子的應用仍面臨一些問題，比如高tmb患者能從免疫中獲益，但有研究表明無論tmb的高或低，帕博利珠單抗聯合化療在鱗狀和非鱗狀nsclc患者的一線中均顯示出生存獲益；其次，國內不同檢測機構因檢測產品不同及算法各異，tmb的檢測尚沒有標準的方法。此外，tmb閾值問題仍然是區分有效或者無效患者的難點。
4.研究表明對腫瘤微環境中免疫細胞，特別是cd8+t細胞的浸潤程度，能夠預測腫瘤對免疫反應的可能性，但目前缺少簡便、有效的分子標志物來反映肺腺癌的免疫特征。另外，近期研究表明，dna錯配修復(ddr)通路基因突變，導致癌細胞中dna損傷的增加和dna修復能力的降低，這能提高免疫的有效性。然而，ddr通路涉及基因眾多，目前缺少簡便的檢測方式。
5.越來越多的二代測序腫瘤精準中研究發現，特定基因的體細胞突變可能影響腫瘤免疫功能或對免疫的響應，即提示特定體細胞突變可能是潛在的免疫預測因子。因此現有技術中仍然需要更高效、準確地鑒定適用于免疫檢查點抑制劑肺癌患者的方法和工具，有鑒于此，特提出本技術。
技術實現要素：
6.為了實現本技術的上述目的，特采用以下技術方案：
7.本技術首先提供一種獲取樣本中col24a1突變水平的檢測劑或組件在制備用于預測肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感性的產品中的應用。
8.本技術還提供一種col24a1突變在預測肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感性中的應用。
9.進一步的，所述col24a1突變的存在是所述肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感的指征。
10.本技術還提供了一種獲取樣本中col24a1突變水平的檢測劑或組件在制備用于預測肺腺癌患者腫瘤突變負荷程度的產品中的應用；
11.本技術還提供一種col24a1在預測肺腺癌患者腫瘤突變負荷程度中的應用。
12.進一步的，所述col24a1點突變的存在是高腫瘤突變負荷的指征。
13.本技術還提供了一種獲取樣本中col24a1突變水平的檢測劑或組件在制備用于預測肺腺癌患者ddr通路基因突變頻率的產品中的應用；
14.本技術還提供一種col24a1在預測肺腺癌患者ddr通路基因突變頻率的應用；
15.進一步的，所述col24a1突變的存在是所述肺腺癌患者ddr通路基因突變頻率高的指征。
16.本技術還提供了一種獲取樣本中col24a1突變水平的檢測劑或組件在制備用于預測肺腺癌患者腫瘤內免疫細胞浸潤水平的產品中的應用；
17.本技術還提供一種col24a1在預測肺腺癌患者腫瘤內免疫細胞浸潤程度的應用；
18.進一步的，所述產品為試劑盒類產品。
19.進一步的，所述col24a1突變的存在是所述肺腺癌患者腫瘤內免疫細胞浸潤程度高的指征。
20.進一步的，上述免疫檢查點抑制劑為pd1抑制劑和/或pd-l1抑制劑。
21.進一步的，所述突變為點突變；優選的，所述點突變包括但不限于單核苷酸多態性，堿基取代/插入/缺失，或沉默突變。
22.本技術還提供一種col24a1在預測肺腺癌患者腫瘤突變負荷程度中的應用。
23.進一步的，所述檢測劑于核酸水平進行檢測；
24.優選的，所述檢測劑用于執行以下任一種方法：聚合酶鏈反應、變性梯度凝膠電泳、核酸測序法、核酸分型芯片檢測、變性高效液相譜法、原位雜交、生物質譜法以及hrm法。
25.進一步的，所述檢測劑于蛋白水平進行檢測；
26.優先的，所述檢測劑用于執行以下任一種方法：生物質譜法、氨基酸測序法、電泳法以及用特異性針對突變位點所設計的抗體進行檢測。
27.進一步的，所述試劑盒中還包括檢測其他基因突變的試劑；
28.優選的，所述其他基因包括但不限于：fgfr4、pole、pold1、arid1a、arid1b、fgfr4、muc16或notch1-4之一或多個；
29.進一步的，所述試劑盒還包括樣品的處理試劑，所述樣品的處理試劑包括樣品裂解試劑、樣品純化試劑以及樣品核酸提取試劑中的至少一種。
30.進一步的，所述樣品選自所述肺腺癌患者的血液、血清、血漿、腦脊髓液、組織或組織裂解液、細胞培養上清、精液以及唾液樣品中的至少一種。
31.本技術還提供一種用于預測、評估或篩查肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感性試劑盒，所述試劑盒中包含用于col24a1基因突變檢測的試劑；
32.優選的，還包括其他基因突變檢測的試劑，所述其他基因包括但不限于：fgfr4、pole、pold1、arid1a、arid1b、fgfr4、muc16或notch1-4之一或多個。
33.本技術還提供一種用于預測、評估或篩查肺腺癌患者腫瘤突變負荷程度的試劑盒，所述試劑盒中包含用于col24a1其他基因突變檢測的試劑；
34.優選的，還包括其它基因突變檢測的試劑，所述基因包括但不限于：fgfr4、pole、pold1、arid1a、arid1b、fgfr4、muc16或notch1-4之一或多個。
35.本技術還提供一種預測肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感性的方法，所述方法包括檢測患者col24a1基因突變情況進行預測，或利用上述試劑盒進行預測。
36.本技術還提供一種預測、評估或篩查肺腺癌患者腫瘤突變負荷程度的方法，所述方法包括檢測患者col24a1基因突變情況進行預測，或利用上述試劑盒進行預測。
37.本技術還提供一種預測、評估或篩查肺腺癌患者ddr通路基因突變頻率的方法，所述方法包括檢測患者col24a1基因突變情況進行預測，或利用上述試劑盒進行預測。
38.本技術還提供一種預測、評估或篩查肺腺癌患者腫瘤內免疫細胞浸潤程度的方法，所述方法包括檢測患者col24a1基因突變情況進行預測，或利用上述試劑盒進行預測。
附圖說明
39.為了更清楚地說明本技術具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本技術的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
40.圖1ici-luad隊列中col24a1突變組orr顯著高于野生型組；
41.圖2ici-luad隊列中col24a1突變與野生型患者pfs具有顯著差異；
42.圖3ici-luad隊列中col24a1是pfs的獨立預測因子；
43.圖4tcga-luad隊列中col24a1突變組tmb顯著高于野生型組；
44.圖5tcga-luad隊列中col24a1基因突變與ddr通路基因的高突變頻率有關；
45.圖6tcga-luad隊列中col24a1突變組cd8+t細胞、漿細胞浸潤程度顯著高于野生型組。
具體實施方式
46.下面將結合實施例對本技術的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本技術，而不應視為限制本技術的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。
47.以下基本術語或定義僅僅是為了幫助理解本技術而提供。這些定義不應被理解為具有小于本領域技術人員所理解的范圍。除非在下文中另有定義，本技術具體實施方式中所用的所有技術術語和科學術語的含義意圖與本領域技術人員通常所理解的相同。雖然相信以下術語對于本領域技術人員很好理解，但仍然闡述以下定義以更好地解釋本技術。
48.如本技術中所使用，術語“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”為包含性的(inclusive)或開放式的，且不排除其它未列舉的元素或方法步驟。術語“由
…
組成”被認為是術語“包含”的優選實施方案。如果在下文中某一組被定義為包含至少一定數目的實施方
案，這也應被理解為揭示了一個優選地僅由這些實施方案組成的組。
49.在提及單數形式名詞時使用的不定冠詞或定冠詞例如“一個”或“一種”，“所述”，包括該名詞的復數形式。
50.本技術中的術語“大約”、“大體”表示本領域技術人員能夠理解的仍可保證論及特征的技術效果的準確度區間。該術語通常表示偏離指示數值的
±
10％，優選
±
5％。
51.此外，說明書和權利要求書中的術語第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及諸如此類，是用于區分相似的元素，不是描述順序或時間次序必須的。應理解，如此應用的術語在適當的環境下可互換，并且本技術描述的實施方案能以不同于本技術描述或舉例說明的其它順序實施。
52.本技術中的術語“核酸”或“核酸序列”指包含核糖核酸、脫氧核糖核酸或其類似物單元的任何分子、優選聚合分子。所述核酸可為單鏈的或雙鏈的。單鏈核酸可為變性雙鏈dna的一條鏈的核酸。或者，單鏈核酸可為不來源于任何雙鏈dna的單鏈核酸。
53.本文所使用的術語“互補”涉及核苷酸堿基g、a、t、c和u之間的氫鍵堿基配對，以使得當兩種給定的多核苷酸或多核苷酸序列彼此退火時，在dna中a與t配對、g與c配對，在rna中g與c配對、a與u配對。
54.現將詳細地提供本技術實施方式的參考，其一個或多個實例描述于下文。提供每一實例作為解釋而非限制本技術。對本領域技術人員而言，顯而易見的是，可以對本技術進行多種修改和變化而不背離本技術的范圍或精神。例如，作為一個實施方式的部分而說明或描述的特征可以用于另一實施方式中，來產生更進一步的實施方式。因此，旨在本技術覆蓋落入所附權利要求的范圍及其等同范圍中的此類修改和變化。本技術的其它對象、特征和方面公開于以下詳細描述中或從中是顯而易見的。本領域普通技術人員應理解本討論僅是示例性實施方式的描述，而非意在限制本技術更廣闊的方面。
55.本技術涉及col24a1基因突變的檢測劑在制備用于預測或篩查肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感性的試劑盒中的應用，優選的，col24a1基因突變的存在是所述肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感的指征。
56.本技術還涉及col24a1突變水平的檢測劑或組件在制備用于預測或篩查肺腺癌患者腫瘤突變負荷程度、ddr通路基因突變頻率、腫瘤內免疫細胞浸潤程度的產品中的應用，其中col24a1基因突變的存在是高腫瘤突變負荷的指征，或ddr通路基因突變頻率高的指征，或腫瘤內免疫細胞浸潤程度高的指征。
57.術語“產品”是指將用于檢測col24a1突變水平的流程配置成相應產品形式，用于預測或篩查肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感性的診斷或預測，或用于預測或篩查肺腺癌患者腫瘤突變負荷程度、ddr通路基因突變頻率、腫瘤內免疫細胞浸潤程度。該產品包括了檢測col24a1突變水平的試劑或組件。可以理解，此類產品形式是多樣的，包括但不限于試劑盒形式、系統裝置、計算機可讀介質或計算機系統形式。
58.本技術的col24a1為24型膠原蛋白α1鏈，col24a1基因種屬可以為哺乳動物；優選的，為靈長類動物。
59.可以理解的是，本技術提供一種預測肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感性的新標記物：col24a1基因突變。經過臨床研究證實，其在肺腺癌患者中有基因突變與無基因突變患者tmb的程度發生統計學差異。且col24a1突變的患者接受免疫后預后明顯好
于col24a1野生型患者。
60.如本文所用，術語“免疫檢查點”是指免疫系統中存在的一些抑制性信號通路。機體在正常情況下，免疫檢查點可以通過調節自身免疫反應的強度來維持免疫耐受，然而機體在受到腫瘤侵襲時，免疫檢查點的激活會抑制自身免疫，有利于腫瘤細胞的生長和逃逸。通過使用免疫檢查點抑制劑，可以恢復機體正常的抗腫瘤免疫反應，從而控制和清除腫瘤。
61.本技術所述“免疫檢查點”包括但不限于程序性死亡受體1(pd-1)、pd-l1、細胞毒性t免疫細胞相關抗原4(ctla-4)；也包括一些新發現的免疫檢查點例如免疫細胞活化基因3(lag3)、t-細胞免疫球蛋白和itim結構域(tigit)、t細胞免疫球蛋白和粘蛋白-3(tim-3)、t細胞活化的v結構域免疫球蛋白抑制劑(vista)、腺苷a2a受體(a2ar)唾液酸結合性免疫球蛋白樣凝集素7/9等。在一些實施方式中，本技術的免疫檢查點抑制劑優選為pd-1抑制劑和/或pd-l1抑制劑。所述pd-1抑制劑進一步可以選擇為nivolumab(opdivo；bms-936558)、pembrolizumab(keytruda；mk-3475)、lambrolizumab(mk-3475)、pidilizumab(ct-011)、特瑞普利單抗(js001)、信迪利單抗(ibi308)、卡瑞利珠單抗(艾瑞卡)以及替雷利珠單抗(百澤安)中的一種或多種。所述pd-l1抑制劑進一步可以選擇為atezolizumab(tecentriq；mpdl3280a)、js003、durvalumab(imfinzi)、avelumab(bavencio)、bms-936559、medi4736以及msb0010718c中的一種或多種。
62.術語“突變負荷”、“突變負荷(mutation burden)”和“突變負荷(mutational burden)”在本文中可互換使用。在腫瘤的背景下，突變負荷在本文中又稱為“腫瘤突變負荷”、“腫瘤突變負荷”或“tmb”。
63.在本技術中，“ddr通路基因突變頻率”是指dna錯配修復(dna damage response)通路中基因突變頻率。ddr通路包括堿基切除修復(ber)，同源重組(hr)、錯配修復(mmr)、核苷酸切除修復(fa)、非同源端連接(nhej)、dna損傷修復(ddr)、dna雙鏈斷裂(dsb)和單鏈斷裂(ssbs)8個通路，各通路包含的基因列表來自broad institute msigdb數據庫(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/)。基因突變頻率指這8個通路中任一基因發生突變的樣本數占總樣本數的比例。
64.在本技術中，“腫瘤浸潤免疫細胞”是指包括離開血流并遷移到腫瘤中的免疫細胞。這些免疫細胞包括t細胞和b細胞，以及自然殺傷細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞等，它們可以以不同的比例存在于腫瘤中。“腫瘤內免疫細胞浸潤水平”是指腫瘤浸潤免疫細胞的相對含量多少。本技術的腫瘤浸潤免疫細胞由腫瘤浸潤性淋巴細胞(til)組成，并且更優選地，由cd8
+
腫瘤浸潤性t細胞組成。
65.在本技術中，點突變可以是單核苷酸多態性(snp)、堿基取代，堿基插入或堿基缺失，或沉默突變(例如，同義突變)。
66.評估col24a1基因突變包括確定其編碼區是否存在突變，例如移碼突變。
67.在一些實施方案中，所述突變位于col24a1基因的編碼區。在一些優選實施方式中，評估col24a1基因突變包括確定其編碼區是否存在使col24a1蛋白截短的突變。
68.在一些實施方式中，在確定col24a1基因編碼區存在使col24a1蛋白截短的突變后，評估col24a1基因表達，例如col24a1基因的蛋白表達水平。
69.在一些實施方式中，所述肺腺癌患者的病理類型包括肺腺癌及肺鱗癌。
70.在一些實施方式中，所述試劑盒還包括其它基因突變的檢測劑；優選的，所述基因
包括但不限于：fgfr4、pole、pold1、arid1a、arid1b、fgfr4、muc16或notch1-4之一或多個。
71.鑒于col24a1基因為一種能夠編碼蛋白質的基因，因而其基因的突變通常也會表現在轉錄水平和反應水平上，本領域技術人員可以從rna和蛋白水平對其突變進行檢測以間接反映其是否發生基因突變，這些都可以應用于本技術。
72.在一些實施方式中，所述檢測劑于核酸水平進行檢測。
73.核酸水平(dna或rna水平)的檢測劑可選用本領域技術人員所公知的試劑，例如能夠與該dna或rna雜交，且標記有熒光標記的核酸(通常為探針或引物)等。并且本領域技術人員也容易想到將mrna反轉錄成cdna后對cdna進行檢測，這些技術手段的常規置換不超出本技術的保護范圍。
74.在一些實施方式中，所述檢測劑用于執行以下任一種方法：
75.聚合酶鏈反應、變性梯度凝膠電泳、核酸測序法、核酸分型芯片檢測、變性高效液相譜法、原位雜交、生物質譜法以及hrm法。在一些實施方式中，所述聚合酶鏈反應選自限制性片段長度多態性法、單鏈構象多態性法、taqman探針法、競爭性等位基因特異性pcr和等位基因特異性pcr。
76.在一些實施方式中，所述生物質譜法選自飛行質譜儀檢測，例如massarray檢測。
77.在一些實施方式中，所述核酸測序法選自snapshot法。
78.在本技術的一些實施方式中，所述核酸測序法可以為轉錄組測序或基因組測序。在本技術另外一些實施方案中，所述核酸測序法是高通量測序，也稱作二代測序(“ngs”)。ngs區別于“sanger測序”(一代測序)，后者是基于單個測序反應中的鏈終止產物的電泳分離。ngs是對傳統sanger測序技術革命性的變革，可以一次對幾十萬到幾百萬條核酸分子進行序列測定。可用本技術的ngs的測序平臺是商用可得的，包括但不限于roche/454flx、illumina/solexa genomeanalyzer和applied biosystems solid system等。轉錄組測序也可以通過二代測序平臺快速、全面地獲得某一物種特定細胞或組織在某一狀態下的幾乎所有的轉錄本及基因序列，可以用于研究基因表達量、基因功能、結構、可變剪接和新轉錄本預測等。在本技術另外一些實施方案中，所述核酸測序法可以為單分子實時測序，單分子dna測序技術是近10年發展起來的新一代測序技術,也稱為第三代測序技術,包括單分子實時測序、真正單分子測序、單分子納米孔測序等技術。
79.在一些實施方式中，所述檢測劑于蛋白水平進行檢測。
80.在一些實施方式中，所述檢測劑用于執行以下任一種方法：生物質譜法、氨基酸測序法、電泳法以及用特異性針對突變位點所設計的抗體進行檢測。用特異性針對突變位點所設計的抗體進行檢測的方法進一步可以為免疫沉淀、免疫共沉淀、免疫組化、elisa以及western blot等。
81.在一些實施方式中，所述試劑盒還包括樣品的處理試劑；進一步地，所述樣品的處理試劑包括樣品裂解試劑、樣品純化試劑以及樣品核酸提取試劑中的至少一種。
82.在一些實施方式中，所述樣品選自所述肺腺癌患者的血液、血清、血漿、胸水、腦脊髓液、組織或組織裂解液、細胞培養上清、精液以及唾液樣品中的至少一種。
83.在一些實施方式中，所述組織為肺腺癌癌組織或癌旁組織。其中，優選的檢測樣品為血液、血清、血漿；更優選的，來自外周血。
84.根據本技術的再一方面，本技術還提供了一種用于預測或篩查肺腺癌患者對免疫
檢查點抑制劑療法敏感性的方法，所述方法包括：使用如上所述的檢測劑檢測col24a1基因突變的存在與否。在一些實施方式中，所述方法用于肺腺癌患者在進行免疫檢查點抑制劑療法后的預后評估。
85.根據本技術的再一方面，本技術還提供了一種用于預測、評估或篩查肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感性試劑盒，所述試劑盒中包含用于col24a1基因突變檢測的試劑；在一些優選的實施方式中，還包括其他基因突變檢測的試劑，所述基因包括但不限于：fgfr4、pole、pold1、arid1a、arid1b、fgfr4、muc16或notch1-4之一或多個。
86.根據本技術的再一方面，本技術還提供了一種用于預測、評估或篩查肺腺癌患者腫瘤突變負荷程度的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包含用于col24a1基因突變檢測的試劑；在一些優選的實施方式中，還包括其它基因突變檢測的試劑，所述基因包括但不限于：fgfr4、pole、pold1、arid1a、arid1b、fgfr4、muc16或notch1-4之一或多個。
87.下面結合實施例對本技術的實施方案進行詳細描述(實施方案與申請人早期專利類似，比如cn113403399a)。
88.實施例
89.1.數據集
90.本技術共使用2個獨立隊列的數據集進行分析(表1)。(1)ici-luad隊列，共包含128例肺腺癌患者，其中75例來自hellmann等人的研究，患者接受抗pd-1和ctla-4聯合；53例來自miao等人的研究，患者接受抗ctla-4和(或)抗pd-l1或pd-l1。對腫瘤組織和匹配的正常組織進行外顯子組測序以檢測患者體細胞突變。(2)tcga-luad隊列，患者未接受免疫，包含567例肺腺癌患者的全外顯子組測序數據和509例患者的rna-seq數據。數據集在腫瘤基因組學數據庫cbioportal網站(http://www.cbioportal.org/)進行下載，包括患者臨床基線資料、免疫檢查點抑制劑療效評估數據以及患者體細胞突變和基因表達數據。
91.表1、本技術使用的數據集
92.數據集名稱ici-luadtcga-luad方式免疫非免疫癌癥類型肺腺癌肺腺癌樣本數128567臨床指標orr，pfspfs，osdna測序全外顯子組測序，128樣本全外顯子組測序，567樣本rna測序-rna-seq，509樣本
93.2.臨床指標
94.本技術涉及的臨床指標包括客觀緩解率(orr)和無進展生存率(pfs)。orr依據recistv.1.1定義為確認有完全反應(cr)或部分反應(pr)的患者的百分比。pfs被定義為從免疫開始到疾病進展或死亡日期的時間。對于ici-luad隊列，從開始日期開始計算pfs。對tcga-luad隊列，從第一次診斷之日起計算pfs。
95.3.col24a1突變型患者與野生型患者的預后比較
96.本技術根據col24a1是否突變將患者分成兩組，即col24a1突變組(col24a1-mut)和col24a1野生型組(col24a1-wt)，通過kaplan-meier(km)分析col24a1-mut和col24a1-wt
兩組患者ici的pfs，采用對數秩檢驗(log-rank test)對兩組患者的pfs進行比較。分別統計col24a1-mut和col24a1-wt兩組的orr，并采用fisher精確檢驗的方法對兩組的orr進行比較。
97.4.col24a1突變與tmb、腫瘤內免疫細胞浸潤程度、ddr通路基因突變頻率相關性分析
98.腫瘤突變負荷(tmb)定義為每個患者每百萬堿基(mb)基因組發生突變(snv或插入缺失)的數量。通過mann-whitney u test對col24a1-mut和col24a1-wt兩組患者tmb進行比較。
99.使用cibersort軟件來分析tcga-luad和tcga-lusc隊列中col24a1-wt和col24a1-mut亞之間22種腫瘤浸潤免疫細胞(tils)的豐度。通過mann-whitney u test對col24a1-mut和col24a1-wt兩組患者各種免疫細胞浸潤程度進行比較。
100.與ddr通路相關的基因集來自broad institute msigdb數據庫(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/)。通過mann-whitney u test對col24a1-mut和col24a1-wt兩組患者中ddr通路基因突變數目進行比較。
101.5.統計分析
102.通過mann-whitney u test比較連續變量，通過fisher精確檢驗比較分類變量。生存分析由kaplan meier曲線進行估計，采用對數秩檢驗計算p值。p≤0.05為顯著，所有統計分析采用r v.4.0.3軟件進行。
103.實施例1在免疫隊列中分析col24a1基因突變與免疫療效的關系
104.本技術首先分析col24a1基因突變與orr的關系。col24a1突變組tmb顯著高于野生型組，col24a1突變組的orr為58.82％(10/17)，而在col24a1野生型的患者中，這一比例僅為27.93％(31/111)(fisher精確檢驗，p＝0.021，圖1)。
105.進一步地，本技術分析col24a1與pfs相關性。在ici-luad隊列中，col24a1突變患者有17例(13.28％)，col24a1突變的患者接受免疫后的中位pfs較col24a1野生型患者長(中位pfs:22.14vs.7.56個月；log-rank test，p＝0.018)結果如圖2，col24a1突變與野生型患者pfs具有顯著差異。
106.進一步地，本技術利用cox多因素回歸分析方法，在同時考慮年齡、性別、吸煙史因素影響的情況下，對col24a1對肺腺癌免疫預后的預測效能進行分析。結果表明，col24a1突變可作為肺腺癌免疫預后的獨立預測因子(hr值＝0.2554,95％ci：0.08849-0.7373，p＝0.012)，即當col24a1發生突變時病人疾病進展的風險為未發生突變的25.54％(見圖3)。
107.因此，本實施例通過對肺腺癌免疫臨床隊列ici-luad的分析，說明col24a1基因突變可作為肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感性的預測因素，且col24a1突變的存在是所述肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感的指征。
108.為進一步驗證和確認col24a1基因突變可用于肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感性的預測，本技術進一步評價col24a1與現有免疫預后評價的其他指標的相關性，包括tmb、ddr通路、免疫細胞浸潤程度等。
109.實施例2col24a1基因突變與免疫生物標志物tmb的相關性
110.tmb是廣泛使用的免疫療效預測標記物，本技術探究了col24a1基因突變與
tmb的關系。在tcga-luad隊列中，col24a1突變患者的tmb顯著高于col24a1野生型患者(見圖4)。
111.因此，本實施例說明col24a1突變可作為高tmb的指征，并進一步提示col24a1突變可預測肺腺癌免疫療效。
112.實施例3col24a1基因突變與免疫生物標志物ddr通路基因突變的相關性
113.已有研究報道ddr通路基因的突變與腫瘤中對免疫的反應相關，因此本技術進一步檢查了col24a1突變狀態和ddr基因突變的相關性。本技術觀察到col24a1突變組中ddr基因突變頻率高的趨勢。在tcga-luad隊列中,ddr相關的6種通路，即堿基切除修復(ber)，同源重組(hr)、錯配修復(mmr)、核苷酸切除修復(fa)、非同源端連接(nhej)和核酸切除修復(ner)均在col24a1突變患者中富集更多突變(見圖5)。
114.該結果說明col24a1突變可作為高ddr通路突變頻率的指征，并進一步提示col24a1突變可預測肺腺癌免疫療效。
115.實施例4col24a1基因突變與腫瘤內免疫細胞浸潤程度之間的相關性
116.在tgca-luad隊列中，同時進行了患者腫瘤組織突變和基因表達的檢測。因此本技術在這個隊列中分析col24a1突變與腫瘤內免疫細胞浸潤水平之間的相關性。在tcga-luad隊列中中，本技術發現在免疫過程中發揮主要作用的cd8
+
t細胞,以及被報道與較好的免疫效果相關的漿細胞(plasma cells)在col24a1突變患者腫瘤組織中的浸潤程度顯著高于col24a1野生型患者(圖6)。
117.本實施例在tcga-luad隊列中驗證col24a1突變與腫瘤內免疫細胞浸潤程度的關系，說明col24a1突變可作為腫瘤內免疫細胞浸潤程度高的指征，特別地，col24a1基因突變與免疫效應細胞cd8+t細胞的浸潤程度高相關，進一步提示col24a1突變可預測肺腺癌免疫療效。
118.最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本技術的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本技術進行了詳細的說明，但本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本技術各實施例技術方案的范圍。
技術特征：
1.獲取樣本中col24a1突變水平的檢測劑或組件在制備用于預測肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感性的產品中的應用；所述col24a1突變的存在是所述肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感的指征。2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述產品為試劑盒。3.根據權利要求1-2任一項所述的應用，其特征在于，所述免疫檢查點抑制劑為pd1抑制劑和/或pd-l1抑制劑。4.根據權利要求1-3任一項所述的應用，其特征在于，所述突變為點突變；優選的，所述點突變包括但不限于單核苷酸多態性，堿基取代/插入/缺失。5.根據權利要求1-3任一項所述的應用，其特征在于，所述檢測劑于核酸水平進行檢測；優選的，所述檢測劑用于執行以下任一種方法：聚合酶鏈反應、變性梯度凝膠電泳、核酸測序法、核酸分型芯片檢測、變性高效液相譜法、原位雜交、生物質譜法以及hrm法。6.根據權利要求1-5任一項所述的應用，其特征在于，所述檢測劑于蛋白水平進行檢測，優先的，所述檢測劑用于執行以下任一種方法：生物質譜法、氨基酸測序法、電泳法以及用特異性針對突變位點所設計的抗體進行檢測。7.根據權利要求2-6任一項所述的應用，其特征在于，所述試劑盒中還包括檢測其他基因突變的試劑，所述其他基因包括但不限于fgfr4、pole、pold1、arid1a、arid1b、fgfr4、muc16或notch1-4之一或多個；優選的，所述試劑盒還包括樣品的處理試劑，所述樣品的處理試劑包括樣品裂解試劑、樣品純化試劑以及樣品核酸提取試劑中的至少一種。8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述樣品選自所述肺腺癌患者的血清、血漿、腦脊髓液、組織或組織裂解液、細胞培養上清、精液以及唾液樣品中的至少一種。9.一種用于預測、評估或篩查肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感性的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包含用于col24a1基因突變水平檢測的試劑；優選的，還包括其他基因突變水平檢測的試劑，所述其他基因包括但不限于：fgfr4、pole、pold1、arid1a、arid1b、fgfr4、muc16或notch1-4之一或多個。10.一種預測肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感性的方法，其特征在于，所述方法包括檢測樣本中col24a1基因突變水平。
技術總結
本申請涉及COL24A1基因突變在預測肺腺癌患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感性中的應用。患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感性中的應用。患者對免疫檢查點抑制劑療法敏感性中的應用。
