生產硫酸化多糖的方法和生產PAPS的方法與流程
生產硫酸化多糖的方法和生產paps的方法
技術領域
1.本發明涉及一種使用表達atp硫酸化酶和aps激酶(腺苷酰硫酸激酶)的棒狀桿菌屬細菌，從廉價原材料例如葡萄糖和腺嘌呤生產3
’?
磷酸腺苷5
’?
磷酰硫酸(在后文中被稱為paps)的方法，以及一種使用所述棒狀桿菌屬(corynebacterium)細菌和表達各種不同硫酸化酶的屬于原核生物的微生物生產硫酸化多糖的方法。
背景技術：
2.paps是一種廣泛存在于從微生物到高等生物中的輔酶，并在體內起到硫酸基團的供體的作用。在高等生物中，paps為糖胺聚糖例如硫酸軟骨素和硫酸乙酰肝素的生物合成所需。已知硫酸化的體內代謝物具有各種不同的生理功能，并且paps本身有望用作生發劑(ptl 1)、具有保濕效果的皮膚外用制劑(ptl 2)等。
3.作為生產paps的方法，已知的有使用源自于純化酵母的atp硫酸化酶、源自于青霉的aps激酶和源自于大腸埃希氏桿菌(escherichia coli)的焦磷酸酶，并使用atp作為原材料的方法(npl 1)；使用源自于嗜熱細菌的熱穩定性atp硫酸化酶、源自于酵母的aps激酶和焦磷酸酶，并與上述方法中相同使用atp作為原材料的方法(ptl 3)；使用源自于熱穩定細菌的atp硫酸化酶、源自于銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa)的aps激酶和多聚磷酸激酶，并使用腺苷5
’?
單磷酸(在后文中被稱為amp)作為原材料的方法(ptl 4)；等等。
4.同時，已知一種使用產氨棒狀桿菌(corynebacterium ammoniagenes)的突變菌株工業生產atp的方法，其中將該細菌細胞的膜用二甲苯或表面活性劑處理以賦予其通透性，并使用廉價原材料例如葡萄糖和腺嘌呤(npl 2)。
5.paps是一種非常不穩定的化合物。即使在使用粗酶的方法中，也通過制備用大腸埃希氏桿菌作為宿主重組表達的源自于熱穩定細菌的aps激酶和atp硫酸化酶的粗酶，然后在反應前進行熱處理從而抑制源自于大腸埃希氏桿菌的污染酶的活性，來生產paps(ptl 4)。
6.ptl8公開了paps在大腸埃希氏桿菌的粗酶溶液中被降解。大腸埃希氏桿菌具有一些與paps的降解相關的酶，并且可以通過缺失此類酶的基因來抑制paps的降解。
7.作為一種硫酸化多糖的肝素是一種重要的抗凝劑，被用于血栓栓塞和彌散性血管內凝血綜合征，以及在人工透析期間和體外循環中預防凝血等。在工業上，大部分肝素從豬的腸黏膜提取并純化。自2008年因豬源性肝素被雜質污染而造成的致死事故以來，已進行了非動物來源的生產受控/質量受控的肝素的研究和開發。
8.作為一個具體實例，在一種方法中對發酵生產和純化的作為某些革蘭氏陰性微生物的一種莢膜多糖的n-乙酰肝素原(在后文中被稱為肝素原(heparosan))進行化學n-脫乙?；蚽-硫酸化，然后進行酶促差向異構化和硫酸化，以產生具有與源自于豬的肝素相同的結構和抗凝活性的肝素(ptl 5至7，和npl 3和4)。
9.已知硫酸軟骨素是另一種有用的硫酸化多糖，它已被用作關節疼痛的藥物和用于保護角膜表面層的滴眼液。已使用了從各種不同動物組織提取和純化的硫酸軟骨素，
但最近報道了一種利用源自于大腸埃希氏桿菌的莢膜多糖作為原材料，以與肝素相同的方式使用硫酸化酶的方法(npl 5和6)。
10.在利用源自于微生物莢膜的多糖作為原材料，使用純化的酶進行硫酸化的方法中，paps在硫酸化酶的反應中充當硫酸基團的供體并作為輔酶被需要。在上述使用源自于微生物莢膜的莢膜多糖作為原材料生產硫酸化多糖的方法中，通過向底物多糖轉移paps的硫酸基團產生3
’?
磷酸腺苷5
’?
磷酸(在后文中被稱為pap)，對硝基苯基硫酸酯的硫酸基團被酶法轉移到所述pap從而再生paps，并且所述多糖的酶法硫酸化反應繼續進行(ptl 6和npl 3)。
11.[引文表]
[0012]
[專利文獻]
[0013]
[ptl 1]wo2012/057336
[0014]
[ptl 2]jp-a-2012-201665
[0015]
[ptl 3]jp-a-h5-137588
[0016]
[ptl 4]日本專利號4505011
[0017]
[ptl 5]日本專利號5830464
[0018]
[ptl 6]美國專利號8771995
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[ptl 7]wo2018/048973
[0020]
[ptl 8]wo2020/013346
[0021]
[非專利文獻]
[0022]
[npl 1]glycobiology vol.21,no.6,pp.771-780,2011
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[npl 2]biosci.biotechnol.biochem.65(3),644-650,2001
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[npl 3]carbohydrate polymers 122(2015)399-407
[0025]
[npl 4]advanced drug delivery reviews 97(2016)237-249
[0026]
[npl 5]metabolic engineering 27(2015)92-100
[0027]
[npl 6]biotechnology and bioengineering 115(2018)1561-1570
技術實現要素：
[0028]
[技術問題]
[0029]
在npl 1以及ptl 1和2中描述的用于生產paps的常規方法各自使用了相對昂貴的核苷酸例如atp和amp作為原材料，并使用通過培養細菌，然后分離細菌細胞，通過超聲等破碎細菌細胞和離心制備的酶或粗酶。因此，不容易在工業規模上執行那些方法。
[0030]
另一方面，如上所述，為了生產paps，已知一種使用純化的酶或粗酶并利用atp或amp作為原材料的方法，但使用微生物本身生產paps的實例是未知的。此外，如上所述，paps是一種非常不穩定的化合物，并且在現有技術中，在使用粗酶的情況下，要進行復雜的步驟例如通過熱處理抑制污染酶的活性。
[0031]
鑒于上述情況，難以預測可以通過與用于工業生產atp的方法相似的方法，簡單地通過在作為宿主的棒狀桿菌屬細菌中表達atp硫酸化酶和aps激酶來生產paps。這是因為與大腸埃希氏桿菌的情況相同，棒狀桿菌屬也具有一些與paps的降解相關的酶。
[0032]
此外，如上所述，用于酶法硫酸化多糖的常規方法使用了多種硫酸化酶，它們從通
過培養表達硫酸化酶的微生物，然后收集并超聲等而制備的細胞裂解液純化。這些方法不容易在工業規模上實施。此外，需要昂貴的paps和對硝基苯基硫酸酯作為原材料。
[0033]
因此，本發明的一個目的是提供一種通過將利用微生物或其處理物的代謝活性的paps生產/再生系統與表達硫酸化酶的微生物或其處理物或提取物在混合廉價原材料例如硫酸鎂后進行反應來容易地生產硫酸化多糖的方法。本發明的另一個目的是提供一種從廉價原材料生產paps的實用方法。
[0034]
[技術解決方案]
[0035]
本發明的發明人基于下述發現(1)和(2)，完成了本發明。
[0036]
(1)通過培養其中通過使用具有atp生產能力的棒狀桿菌屬細菌作為宿主的重組dna技術增強了atp硫酸化酶和aps激酶活性的菌株，使用表面活性劑等賦予其膜通透性，并添加原材料例如葡萄糖和腺嘌呤，與現有技術的方法相比，可以更容易且廉價地生產paps。
[0037]
(2)通過使用(1)中描述的具有增強的atp硫酸化酶和aps激酶活性的菌株作為負責paps生產/再生反應的微生物細菌細胞，賦予表達差向異構酶和/或硫酸化酶的屬于原核生物的微生物以膜通透性，并執行混合反應，可以在不進行酶純化或paps添加的情況下，使用細菌細胞和廉價原材料例如硫酸鎂來生產硫酸化多糖。
[0038]
也就是說，本發明如下所述。
[0039]
1.一種生產硫酸化多糖的方法，所述方法包括下述步驟(1-1)和(1-2)：
[0040]
(1-1)制備棒狀桿菌屬細菌的轉化體(a)或所述轉化體(a)的處理物，所述轉化體(a)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼atp硫酸化酶的基因和編碼aps激酶的基因；和
[0041]
(1-2)使用含有atp或atp源、硫酸根離子源和所述轉化體(a)或其處理物的反應溶液進行生產paps的反應。
[0042]
2.根據1所述的生產硫酸化多糖的方法，所述方法還包括下述步驟(2-1)和(2-2)：
[0043]
(2-1)制備屬于原核生物的微生物的轉化體(b)或所述轉化體(b)的處理物或提取物，所述轉化體(b)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼c5-差向異構酶的基因；和
[0044]
(2-2)通過在n-磺基肝素原存在下將所述轉化體(b)或其處理物或提取物并入到所述反應溶液中，進行c5-差向異構化。
[0045]
3.根據1或2所述的生產硫酸化多糖的方法，其包括通過包含以可表達的方式引入到其中的編碼磺基轉移酶的基因的轉化體或所述轉化體的處理物或提取物進行硫酸化。
[0046]
4.根據3所述的生產硫酸化多糖的方法，所述方法還包括下述步驟(3-1)和(3-2)：
[0047]
(3-1)制備屬于原核生物的微生物的轉化體(c)或所述轉化體(c)的處理物或提取物，所述轉化體(c)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼2-o-磺基轉移酶的基因；和
[0048]
(3-2)通過在n-磺基肝素原存在下將所述轉化體(c)或其處理物或提取物并入到所述反應溶液中，進行2-o-硫酸化。
[0049]
5.根據3或4所述的生產硫酸化多糖的方法，所述方法還包括下述步驟(3
’?
1)至(3
’?
3)：
[0050]
(3
’?
1)制備屬于原核生物的微生物的轉化體(b)或所述轉化體(b)的處理物或提取物，所述轉化體(b)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼c5-差向異構酶的基因；
[0051]
(3
’?
2)制備屬于原核生物的微生物的轉化體(c)或所述轉化體(c)的處理物或提
取物，所述轉化體(c)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼2-o-磺基轉移酶的基因；和
[0052]
(3
’?
3)通過在n-磺基肝素原存在下將所述轉化體(b)或其處理物或提取物和轉化體(c)或其處理物或提取物并入到所述反應溶液中，進行c5-差向異構化和2-o-硫酸化。
[0053]
6.根據3至5中的任一項所述的生產硫酸化多糖的方法，所述方法還包括下述步驟(4-1)和(4-2)：
[0054]
(4-1)制備屬于原核生物的微生物的轉化體(d)或所述轉化體(d)的處理物或提取物，所述轉化體(d)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼6-o-磺基轉移酶的基因；和
[0055]
(4-2)通過在n-磺基肝素原存在下將所述轉化體(d)或其處理物或提取物并入到所述反應溶液中，進行6-o-硫酸化。
[0056]
7.根據3至6中的任一項所述的生產硫酸化多糖的方法，所述方法還包括下述步驟(5-1)和(5-2)：
[0057]
(5-1)制備屬于原核生物的微生物的轉化體(e)或所述轉化體(e)的處理物或提取物，所述轉化體(e)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼3-o-磺基轉移酶的基因；和
[0058]
(5-2)通過在n-磺基肝素原存在下將所述轉化體(e)或其處理物或提取物并入到所述反應溶液中，進行3-o-硫酸化。
[0059]
8.一種生產硫酸化多糖的方法，所述方法包括通過在atp或atp源、硫酸根離子源和n-磺基肝素原存在下在反應溶液中并入下述物質來產生硫酸化多糖：
[0060]
棒狀桿菌屬細菌的轉化體(a)或所述轉化體(a)的處理物，所述轉化體(a)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼atp硫酸化酶的基因和編碼aps激酶的基因，和
[0061]
選自下述的至少一者：
[0062]
屬于原核生物的微生物的轉化體(b)或所述轉化體(b)的處理物或提取物，所述轉化體(b)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼c5-差向異構酶的基因，
[0063]
屬于原核生物的微生物的轉化體(c)或所述轉化體(c)的處理物或提取物，所述轉化體(c)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼2-o-磺基轉移酶的基因，
[0064]
屬于原核生物的微生物的轉化體(d)或所述轉化體(d)的處理物或提取物，所述轉化體(d)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼6-o-磺基轉移酶的基因，和
[0065]
屬于原核生物的微生物的轉化體(e)或所述轉化體(e)的處理物或提取物，所述轉化體(e)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼3-o-磺基轉移酶的基因。
[0066]
9.根據7所述的生產硫酸化多糖的方法，所述方法還包括通過在所述atp或atp源、硫酸根離子源和n-磺基肝素原存在下，在所述反應溶液中并入所述轉化體(a)或其處理物和所述轉化體(b)至(e)或其處理物或提取物來產生硫酸化多糖。
[0067]
10.根據1至9中的任一項所述的生產硫酸化多糖的方法，其用于生產肝素。
[0068]
11.一種生產paps的方法，所述方法包括下述步驟(i)和(ii)：
[0069]
(i)制備棒狀桿菌屬細菌的轉化體或所述轉化體的處理物，所述轉化體至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼atp硫酸化酶的基因和編碼aps激酶的基因；和
[0070]
(ii)使用含有atp或atp源、硫酸根離子源和在步驟(i)中制備的所述轉化體或其處理物的反應溶液，進行生產paps的反應。
[0071]
[有利效果]
thermoaminogenes)(有效棒狀桿菌(corynebacterium efficiens))和力士棒狀桿菌(corynebacterium herculis)。
[0087]
棒狀桿菌屬菌株的實例包括產氨棒狀桿菌(停滯棒狀桿菌(corynebacterium stationis))atcc 6871和atcc 6872、嗜乙酰乙酸棒狀桿菌atcc 13870、醋谷棒狀桿菌atcc 15806、解烷棒狀桿菌atcc 21511、帚石南棒狀桿菌atcc 15991、鈍齒棒狀桿菌as1.542、谷氨酸棒狀桿菌atcc 13020、atcc 13032、atcc 13060、atcc 13869和ferm bp-734、百合棒狀桿菌atcc 15990、棲糖蜜棒狀桿菌atcc17965、有效棒狀桿菌(熱產氨棒狀桿菌)aj12340(ferm bp-1539)、力士棒狀桿atcc 13868、散枝短桿菌(brevibacterium divaricatum)(谷氨酸棒狀桿菌)atcc 14020、黃短桿菌(brevibacterium flavum)(谷氨酸棒狀桿菌)atcc 13826、atcc 14067和aj12418(ferm bp-2205)以及乳糖發酵短桿菌(brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒狀桿菌)atcc 13869。
[0088]
屬于棒狀桿菌屬的細菌還包括傳統上分類為短桿菌屬，但現在被整合到棒狀桿菌屬中的細菌(int.j.syst.bacteriol.,41,255(1991))。此外，停滯棒狀桿菌也包括傳統上被分類為產氨棒狀桿菌，但現在通過16s rrna核苷酸分析等被重新分類為停滯棒狀桿菌的細菌[int.j syst.evol.microbiol.,60,874-879(2010)]。
[0089]
這些菌株可以從例如美國典型培養物保藏中心(american type culture collection)(地址：12301parklawn drive,rockville,maryland20852,p.o.box 1549,manassas,va 20108,united states of america)獲得。也就是說，每個菌株被提供有登記號，并且可以使用該登記號獲得所述菌株(參見https://www.atcc.org/)。對應于每個菌株的登記號描述在美國典型培養物保藏中心的目錄中。此外，這些菌株可以從例如保藏有每種菌株的保藏庫獲得。所述棒狀桿菌屬細菌可以是野生型菌株、其突變菌株或人工重組體。
[0090]
在本發明中，將編碼atp硫酸化酶的基因和編碼aps激酶的基因以可表達的方式引入到所述棒狀桿菌屬細菌中。
[0091]
atp硫酸化酶通過下述反應式從硫酸根產生腺苷5
’?
磷酰硫酸(aps)。
[0092]
[化學反應式1]
[0093]
atp+so
42-→
aps+ppi
[0094]
(在上式中，atp代表腺苷5
’?
三磷酸)
[0095]
所述atp硫酸化酶的一種情況是met3。對atp硫酸化酶的來源沒有特別限制，其實例包括源自于釀酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、白假絲酵母(candida albicans)、粟酒裂殖酵母(shizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)、粗糙脈孢菌(neurospora crassa)、產黃青霉(penicillium chrysogenum)、乳酸克魯維酵母(kluyveromyces lactis)、藤倉鐮孢菌(fusarium fujikuroi)、米曲霉(aspergillus oryzae)或棉囊阿舒氏酵母(ashbya gossypii)的atp硫酸化酶，其中源自于釀酒酵母的atp硫酸化酶是優選的。
[0096]
編碼atp硫酸化酶的基因的實例包括seq id no：22中示出的核苷酸序列。其實例還包括編碼具有atp硫酸化酶活性的多肽，并包含與seq id no：22中示出的核苷酸序列具有優選地80％或更高、更優選地90％或更高、甚至更優選地95％或更高、特別優選地98％或更高同一性的核苷酸序列的dna；和編碼具有atp硫酸化酶活性的多肽，并包含在嚴緊條件下與seq id no：22中示出的核苷酸序列雜交或與上述核苷酸序列互補的核苷酸序列的
67699]、[miwa,k.等，產谷氨酸細菌中的隱含質粒(cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria)，agric.biol.chem.48:2901-2903(1984)]和[yamaguchi,r.等，乳糖發酵短桿菌質粒pam330的完整核苷酸序列的確定及其遺傳信息的分析(determination of the complete nucleotide sequence of the brevibacterium lactofermentum plasmid pam330 and the analysis of its genetic information)，nucleic acids symp.ser.16:265-267(1985)]；源自于谷氨酸棒狀桿菌atcc 3058的phm1519[miwa,k.等，產谷氨酸細菌中的隱含質粒(cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria)，agric.biol.chem.48:2901-2903(1984)]和pcry30[kurusu,y.等，棒狀桿菌中質粒分配功能的鑒定(identification of plasmid partition function in coryneform bacteria)，appl.environ.microbiol.57:759-764(1991)]；源自于谷氨酸棒狀桿菌t250的pcg4[jp-a-s57-183799]和[katsumata,r.等，產谷氨酸細菌用質粒dna的原生質體轉化(protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid dna)，j.bacteriol.,159:306-311(1984)]、pag1、pag3、pag14和pag50[jp-a-s62-166890]以及pek0、pec5和pekex1[eikmanns,b.j.等，用于克隆、受控基因表達和啟動子探測的谷氨酸棒狀桿菌/大腸埃希氏桿菌穿梭載體家族(a family of corynebacterium glutamicum/escherichia coli shuttle vectors for cloning,controlled gene expression,and promoter probing)，gene,102:93-98(1991)]，等等。
[0108]
啟動子可以是源自于宿主的啟動子或異源啟動子。其實例包括源自于谷氨酸棒狀桿菌r的甘油醛3-磷酸脫氫酶a基因(gapa)的啟動子pgapa、蘋果酸脫氫酶基因(mdh)的啟動子pmdh、乳酸脫氫酶a基因(ldha)的啟動子pldha等。
[0109]
終止子的實例包括大腸埃希氏桿菌rrna操縱子的rrnb t1t2終止子、大腸埃希氏桿菌的trpa終止子、乳糖發酵短桿菌的trp終止子等。
[0110]
作為本發明的一個方面，與paps的降解相關的酶的基因表達未被弱化。所述與paps的降解相關的酶的基因的實例包括cysq基因和cp01850基因。作為所述轉化體(a)的一種情況，選自cysq基因和cp01850基因的至少一個基因的表達未被弱化。
[0111]
《《轉化體(b)：c5-差向異構化》》
[0112]
在根據本發明的生產硫酸化多糖的方法中，n-磺基肝素原的c5-差向異構化使用屬于原核生物的微生物的轉化體(b)或所述轉化體(b)的處理物或提取物來進行，所述轉化體(b)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼c5-差向異構酶的基因。
[0113]
對c5-差向異構酶沒有特別限制，只要它可以催化葡萄糖醛酸(glcua)殘基向艾杜糖醛酸(idoa)殘基的異構化即可。所述c5-差向異構酶可以源自于任何動物、植物、微生物等。例如，可以使用人類c5-差向異構酶作為所述c5-差向異構酶。
[0114]
編碼c5-差向異構酶的基因的實例包括seq id no：24中示出的核苷酸序列。其實例還包括編碼具有c5-差向異構酶活性的多肽，并包含與seq id no：24中示出的核苷酸序列具有優選地80％或更高、更優選地90％或更高、甚至更優選地95％或更高、特別優選地98％或更高同一性的核苷酸序列的dna；和編碼具有c5-差向異構酶活性的多肽，并包含在嚴緊條件下與seq id no：24中示出的核苷酸序列雜交或與上述核苷酸序列互補的核苷酸序列的dna。
[0115]
轉化體中的c5-差向異構酶活性通過所述轉化體的細胞提取液中c5-差向異構酶
活性值的提高來檢查。c5-差向異構酶活性可以通過文獻中描述的方法來測量[babu p.等，使用氫/氘交換質譜法測量硫酸乙酰肝素c-5差向異構酶活性的一種快速、非放射性測定法(a rapid,nonradioactive assay for measuring heparan sulfate c-5epimerase activity using hydrogen/deuterium exchange-mass spectrometry)，methods.mol.biol.1229:209-219(2015)]。
[0116]
在下文中，將描述表達磺基轉移酶的轉化體。在本發明的生產硫酸化多糖的方法中，硫酸化使用包含以可表達的方式引入到其中的編碼磺基轉移酶的基因的轉化體或所述轉化體的處理物或提取物來進行。在本發明中，對磺基轉移酶沒有特別限制，只要它將硫酸基團轉移到多糖以產生硫酸化多糖即可。所述磺基轉移酶的實例包括2-o-磺基轉移酶(2-ost)、6-o-磺基轉移酶(6-ost)和3-o-磺基轉移酶(3-ost)。
[0117]
《《轉化體(c)：2-o-硫酸化》》
[0118]
在本發明的生產硫酸化多糖的方法中，2-o-硫酸化使用屬于原核生物的微生物的轉化體(c)或所述轉化體(c)的處理物或提取物來進行，所述轉化體(c)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼2-o-磺基轉移酶(2-ost)的基因。
[0119]
對所述2-ost沒有特別限制，只要它可以催化idoa殘基在o-2位置處的硫酸化即可。此外，所述2-ost可以源自于任何動物、植物、微生物等。例如，可以使用源自于倉鼠的2-ost作為所述2-ost。
[0120]
編碼2-ost的基因的實例包括seq id no：19中示出的核苷酸序列。其實例還包括編碼具有2-ost活性的多肽，并包含與seq id no：19中示出的核苷酸序列具有優選地80％或更高、更優選地90％或更高、甚至更優選地95％或更高、特別優選地98％或更高同一性的核苷酸序列的dna；和編碼具有2-ost活性的多肽，并包含在嚴緊條件下與seq id no：19中示出的核苷酸序列雜交或與上述核苷酸序列互補的核苷酸序列的dna。
[0121]
轉化體中的2-ost活性通過所述轉化體的細胞提取液中2-ost活性值的提高來檢查。2-ost活性可以通過文獻中描述的方法來檢查[zhang j.等，用于生產生物工程肝素的表達2-o-磺基轉移酶和c5-差向異構酶的重組大腸埃希氏桿菌菌株的高細胞密度培養(high cell density cultivation of recombinant escherichia coli strains expressing2-o-sulfotransferase and c5-epimerase for the production of bioengineered heparin)，appl.biochem.biotechnol.175(6):2986-2995(2015)]。
[0122]
《《轉化體(d)：6-o-硫酸化》》
[0123]
在本發明的生產硫酸化多糖的方法中，6-o-硫酸化使用屬于原核生物的微生物的轉化體(d)或所述轉化體(d)的處理物或提取物來進行，所述轉化體(d)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼6-o-磺基轉移酶(6-ost)的基因。
[0124]
對所述6-ost沒有特別限制，只要它可以催化n-硫酸化葡萄糖胺(glcns)殘基在o-6位置處的硫酸化即可。所述6-ost可以源自于任何動物、植物、微生物等。6-ost的實例包括源自于倉鼠的6-ost-1和源自于小鼠的6-ost-3。
[0125]
編碼6-ost的基因的實例包括seq id no：25中示出的核苷酸序列。其實例還包括編碼具有6-ost活性的多肽，并包含與seq id no：25中示出的核苷酸序列具有優選地80％或更高、更優選地90％或更高、甚至更優選地95％或更高、特別優選地98％或更高同一性的核苷酸序列的dna；和編碼具有6-ost活性的多肽，并包含在嚴緊條件下與seq id no：25中
示出的核苷酸序列雜交或與上述核苷酸序列互補的核苷酸序列的dna。
[0126]
轉化體中的6-ost活性通過所述轉化體的細胞提取液中6-ost活性值的提高來檢查。6-ost活性可以通過文獻中描述的方法來檢查[zhang j.等，用于生產生物工程肝素的表達6-o-磺基轉移酶的重組大腸埃希氏桿菌菌株的高細胞密度培養(high cell density cultivation of a recombinant escherichia coli strain expressing a 6-o-sulfotransferase for the production of bioengineered heparin)，j.appl.microbiol.118(1):92-98(2015)]。
[0127]
《《轉化體(e)：3-o-硫酸化》》
[0128]
在本發明的生產硫酸化多糖的方法中，3-o-硫酸化使用屬于原核生物的微生物的轉化體(e)或所述轉化體(e)的處理物或提取物來進行，所述轉化體(e)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼3-o-磺基轉移酶(3-ost)的基因。
[0129]
對所述3-ost沒有特別限制，只要它可以催化n-硫酸化/6-o-硫酸化葡萄糖胺殘基在o-3位置處的硫酸化即可。所述3-ost可以源自于任何動物、植物、微生物等。例如，可以使用源自于小鼠的3-ost-1作為所述3-ost。
[0130]
編碼3-ost的基因的實例包括seq id no：26中示出的核苷酸序列。其實例還包括編碼具有3-ost活性的多肽，并包含與seq id no：26中示出的核苷酸序列具有優選地80％或更高、更優選地90％或更高、甚至更優選地95％或更高、特別優選地98％或更高同一性的核苷酸序列的dna；和編碼具有3-ost活性的多肽，并包含在嚴緊條件下與seq id no：26中示出的核苷酸序列雜交或與上述核苷酸序列互補的核苷酸序列的dna。
[0131]
轉化體中的3-ost活性通過所述轉化體的細胞提取液中3-ost活性值的提高來檢查。3-ost活性可以通過文獻中描述的方法來檢查[jin w.等，提高大鼠腦的肝素生物合成關鍵酶3-o-磺基轉移酶1的可溶性異源表達(increased soluble heterologous expression of a rat brain3-o-sulfotransferase 1-a key enzyme for heparin biosynthesis)，protein expr.purif.151:23-29(2018)]。
[0132]
《《屬于原核生物的微生物》》
[0133]
對在本發明中用作轉化體的宿主的屬于原核生物的微生物沒有特別限制，只要它可以表達本發明的預定基因即可。其實例包括細菌例如屬于埃希氏桿菌屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、微桿菌屬和假單胞菌屬的微生物，并且優選地使用埃希氏桿菌屬的細菌。
[0134]
對在本發明中使用的屬于埃希氏桿菌屬的細菌沒有特別限制，其實例包括按照微生物學領域專家所知的分類方法分類為埃希氏桿菌屬的細菌。屬于埃希氏桿菌屬的細菌的實例包括在文獻中描述的細菌[backmann,bj 1996，大腸埃希氏桿菌k-12的一些突變衍生菌株的衍生和基因型(derivations and genotypes of some mutant derivatives of escherichia coli k-12)，p.2460-2488，表1，在f.d.neidhardt主編的《大腸埃希氏桿菌和沙門氏菌的細胞和分子生物學》(escherichia coli and salmonella cellular and molecular biology)第二版中，american society for microbiology press,washington,dc]。
[0135]
屬于埃希氏桿菌屬的細菌的實例包括大腸埃希氏桿菌。大腸埃希氏桿菌的實例包括大腸埃希氏桿菌k-12菌株例如w3110菌株(atcc27325)和mg1655菌株(atcc 47076)、大腸
埃希氏桿菌k5菌株(atcc23506)、大腸埃希氏桿菌b菌株例如bl21(de3)菌株、大腸埃希氏桿菌nissle 1917菌株(dsm 6601)及其衍生菌株。
[0136]
這些菌株可以從例如美國典型培養物保藏中心(american type culture collection)(地址：12301parklawn drive,rockville,maryland20852,p.o.box 1549,manassas,va 20108,united states of america)獲得。也就是說，每個菌株被提供有登記號，并且可以使用該登記號獲得所述菌株(參見https://www.atcc.org/)。對應于每個菌株的登記號描述在美國典型培養物保藏中心的目錄中。此外，bl21(de3)菌株可以從例如life technologies(產品號c6000-03)獲得。
[0137]
出于以可表達的方式引入基因的目的，可以使用可以在宿主中自主復制的載體作為用于屬于原核生物的微生物的轉化的載體。所述載體優選為多拷貝載體。此外，為了選擇轉化體，所述載體優選地具有標志物例如抗生素抗性基因或文獻中描述的其他基因[karl friehs，質粒拷貝數和質粒穩定性(plasmid copy number and plasmid stability)，adv biochem engin/biotechnol 86:47-82(2004)]。此外，為了表達插入的基因，所述載體可以具有啟動子或終止子。載體的實例包括源自于細菌質粒的載體、源自于酵母質粒的載體、源自于噬菌體的載體、粘粒、噬菌粒等。
[0138]
能夠在大腸埃希氏桿菌屬的細菌中自主復制的載體的具體實例包括puc19、puc18、phsg299、phsg399、phsg398、pbr322和pstv29(都來自于takara bio inc.)、pacyc184和pmw219(nippon gene)、ptrc99a(pharmacia)、pprok載體(clontech)、pkk233-2(clontech)、pet載體(novagen)、pqe載體(qiagen)和廣宿主范圍載體rsf1010。
[0139]
啟動子可以是源自于宿主的啟動子或異源啟動子。所述啟動子可以是待引入的基因的固有啟動子或其他基因的啟動子。
[0140]
終止子的實例包括t7終止子、t4終止子、fd噬菌體終止子、tet終止子和trpa終止子。
[0141]
在上述轉化體(b)至(e)中，被引入到屬于原核生物的微生物中的兩個或更多個基因可以被引入到一個轉化體中。更具體來說，例如，編碼c5-差向異構酶的基因和編碼2-o-磺基轉移酶的基因可以被引入到一個屬于原核生物的微生物中，以形成一個轉化體。
[0142]
《《轉化體的處理物》》
[0143]
在本發明中，轉化體的處理物是指其中細菌細胞的細胞質膜可通透的物體。在本發明中，當細胞質膜被稱為物質可通透時，意味著各種不同的小(離子等)和大(蛋白質等)分子通過擴散穿過細胞膜，并因此可以自由進入和離開細胞膜。在本發明中，轉化體的處理物優選為由于賦予細胞膜通透性的處理而失去生長能力的靜止細菌細胞。
[0144]
轉化體的處理物的實例包括作為轉化體的細菌細胞的表面活性劑處理物、所述細菌細胞的溶劑處理物、所述細菌細胞的酶處理物、含有活細菌細胞的保留了與作為酶源的所述細菌細胞的培養物相同的功能的處理物例如所述細菌細胞的固定化產物、所述細菌細胞的超聲處理物和所述細菌細胞的機械研磨處理物。
[0145]
使細胞質膜物質可通透的方法的實例包括化學處理和機械處理。在本發明的生產方法中，對使所述轉化體的細胞質膜變得物質可通透的時間沒有特別限制，只要本發明的效果得以表現即可。使每個轉化體的細胞質膜變得物質可通透可以預先進行，或者它可以在通過將反應中使用的轉化體彼此接觸以進行反應時進行。
[0146]
所述化學處理的實例包括使用表面活性劑的方法、使用有機溶劑的方法和使用酶的方法。作為表面活性劑，優選的是非離子型表面活性劑，因為它對蛋白質等的作用更加溫和(當與離子型表面活性劑相比時)。所述表面活性劑的實例包括洋地黃皂苷、皂苷、triton x100、triton x114、吐溫20、吐溫80、n,n-雙(3-d-葡糖酰胺丙基)膽酰胺[bigchap]、n,n-雙(3-d-葡糖酰胺丙基)脫氧膽酰胺[脫氧-bigchap]、nikkolbl-9ex[聚氧乙烯(9)月桂基醚]、辛酰基-n-甲基葡糖酰胺[mega-8]、苯扎氯銨等。
[0147]
所述有機溶劑的實例包括苯、甲苯、二甲苯、其他醇類等。所述酶的實例包括溶菌酶、消肽酶(achromopeptidase)等。
[0148]
使用上述物質的處理的條件例如濃度、溫度、時間等隨著細胞類型而變，并且需要設置適合的條件以進行所需分析，但通常的處理濃度為10至1000微克/ml，更通常為20-200微克/ml，溫度為2℃至37℃，時間為1至30分鐘。
[0149]
所述機械處理的實例包括超聲處理和機械研磨處理。
[0150]
《《轉化體的提取物》》
[0151]
在本發明中，轉化體的提取物的實例包括從作為轉化體的細菌細胞獲得的粗酶提取物、從如上所述(例如化學或機械)處理的細菌細胞獲得的純化的酶、通過培養上述轉化體獲得的培養物或其處理物的濃縮物和所述培養物的干燥產物。轉化體的提取物的實例還包括通過離心或過濾所述培養物獲得的細菌細胞、干燥的細菌細胞和冷凍干燥的細菌細胞。
[0152]
《《轉化方法和培養轉化體的方法》》
[0153]
可以無限制地使用已知的轉化方法。此類已知方法的實例包括氯化鈣/氯化銣法、磷酸鈣法、deae-葡聚糖介導的轉染、電脈沖法等。其中，電脈沖法適合于棒狀桿菌，并且電脈沖法可以通過已知方法進行[kurusu,y.等，通過營養缺陷互補用于棒狀桿菌的電穿孔轉化系統(electroporation-transformation system for coryneform bacteria by auxotrophic complementation)，agric biol.chem.54:443-447(1990)]。
[0154]
優選地，在每個反應之前通過使用常用于培養微生物的培養基培養來生長所述轉化體。作為培養基，通?？梢允褂锰烊慌囵B基或含有碳源、氮源、無機鹽和其他營養物質的合成培養基。
[0155]
所述碳源可以是atp源。所述碳源的實例包括碳水化合物或糖醇例如葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖、麥芽糖、甘露糖醇、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、淀粉、糖蜜、山梨糖醇和甘油；有機酸例如乙酸、檸檬酸、乳酸、富馬酸、馬來酸和葡萄糖酸；以及醇類例如乙醇和丙醇。作為碳源，可以單獨使用一種，也可以混合兩種或更多種。一般來說，這些碳源在培養基中的濃度為約0.1至10(w/v％)就已足夠。
[0156]
所述氮源的實例包括無機或有機銨化合物例如氯化銨、硫酸銨、硝酸銨和乙酸銨、尿素、氨水、硝酸鈉、硝酸鉀等。此外，也可以使用玉米漿、肉提取物、蛋白胨、nz-胺、蛋白質水解物、含氮有機化合物例如氨基酸等。作為氮源，可以單獨使用一種，也可以混合并使用兩種或更多種。培養基中氮源的濃度隨著所使用的氮化合物而變，但通常為約0.1至10(w/v％)。
[0157]
所述無機鹽的實例除了硫酸根離子源例如硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鋅和硫酸鈷之外，還包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硝酸亞鐵、氯化鈉、碳酸鈣等。作為無機鹽，可以單獨使用
一種，也可以混合并使用兩種或更多種。培養基中無機鹽的濃度隨著所使用的無機鹽而變，但通常為約0.01至1(w/v％)。
[0158]
所述營養物質的實例包括肉提取物、蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干酵母、玉米漿、脫脂奶粉、脫脂大豆鹽酸鹽水解物、動植物或微生物細菌細胞的提取物及其分解產物等，并且其濃度通常為約0.1至10(w/v％)。此外，必要時可添加維生素。維生素的實例包括生物素、硫胺素(維生素b1)、吡哆醇(維生素b6)、泛酸、肌醇、煙酸等。培養基的ph優選為約6至8。
[0159]
用于微生物的培養基的優選實例包括a培養基[inui,m.等，在缺氧條件下乳酸和琥珀酸生產過程中谷氨酸棒狀桿菌的代謝分析(metabolic analysis of corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions)，j.mol.microbiol.biotechnol.7:182-196(2004)]、bt培養基[omumasaba,c.a.等，具有相反的atp依賴性調控的谷氨酸棒狀桿菌甘油醛3-磷酸脫氫酶同工型(corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite,atp-dependent regulation)，j.mol.microbiol.biotechnol.8:91-103(2004)]等。作為具體培養條件，例如培養溫度為約15℃至45℃，培養時間為約1至7天。
[0160]
《生產硫酸化多糖的方法》
[0161]
根據本發明的生產硫酸化多糖的方法的一種情況是一種生產硫酸化多糖的方法，所述方法包括通過在atp或atp源、硫酸根離子源和n-磺基肝素原存在下，在反應溶液中并入所述轉化體(a)或其處理物和選自轉化體(b)至(e)或其處理物或提取物中的至少一者，來產生硫酸化多糖。
[0162]
作為根據本發明的生產硫酸化多糖的方法的一種情況，其實例包括一種生產硫酸化多糖的方法，所述方法包括通過在atp或atp源、硫酸根離子源和n-磺基肝素原存在下使用含有所述轉化體(a)或其處理物和所述轉化體(b)至(e)或其處理物或提取物的反應溶液，來產生硫酸化多糖。
[0163]
此外，根據本發明的生產硫酸化多糖的方法的一種情況是一種生產硫酸化多糖的方法，所述方法包括通過在paps和n-磺基肝素原存在下將選自所述轉化體(b)至(e)或其處理物或提取物中的至少一者并入到所述反應溶液中，來產生硫酸化多糖。
[0164]
在本發明的生產方法中，每種轉化體可以在一開始就添加到所述反應溶液，可以順序添加，或者可以在一開始并隨后順序添加。一開始向所述反應溶液添加每種轉化體的情況的具體實例包括下述情況，其中通過在atp或atp源、硫酸根離子源和n-磺基肝素原存在下一開始向所述反應溶液添加所述轉化體(a)或其處理物和所述轉化體(b)至(e)或其處理物或提取物來產生硫酸化多糖。
[0165]
在本發明的使用轉化體(a)或其處理物和轉化體(b)至(e)或其處理物或提取物的生產硫酸化多糖的方法可以進行下述過程：1)使用所述轉化體(a)或其處理物進行paps的供應/再生，2)使用所述轉化體(b)或其處理物或提取物進行c5-差向異構化，3)使用所述轉化體(c)或其處理物或提取物進行2-o-硫酸化，4)使用所述進行轉化體(d)或其處理物或提取物6-o-硫酸化，和5)使用所述轉化體(e)或其處理物或提取物進行3-o-硫酸化。
[0166]
在下文中會分開描述每個步驟，但對2)c5-差向異構化、3)2-o-硫酸化、4)6-o-硫
酸化和5)3-o-硫酸化的順序沒有特別限制，只要可以獲得所需硫酸化多糖即可。
[0167]
此外，在下文中會分開描述1)paps的供應/再生、2)c5-差向異構化、3)2-o-硫酸化、4)6-o-硫酸化和5)3-o-硫酸化的每個反應，但這些反應中的兩者或更多者可以同時進行。例如，這些反應可以使用含有所有所述轉化體(a)或其處理物和轉化體(b)至(e)或其處理物或提取物的反應溶液同時進行。
[0168]
通過本發明的生產硫酸化多糖的方法生產的硫酸化多糖的實例包括肝素。
[0169]
《《paps的供應/再生》》
[0170]
本發明的生產硫酸化多糖的方法的特征在于包括下述步驟(1-1)和(1-2)：
[0171]
(1-1)制備棒狀桿菌屬細菌的轉化體(a)或所述轉化體(a)的處理物，所述轉化體(a)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼atp硫酸化酶的基因和編碼aps激酶的基因；和
[0172]
(1-2)使用含有atp或atp源、硫酸根離子源和所述轉化體(a)或其處理物的反應溶液進行生產paps的反應。
[0173]
由所述轉化體(a)或其處理物表達的atp硫酸化酶和aps激酶與atp或atp源和硫酸根離子源在所述轉化體(a)或其處理物中反應，從而產生paps。所述paps在硫酸化多糖的生產中起到硫酸基團的供體的作用。此外，由所述轉化體(a)或其處理物產生的paps被用于所述生產硫酸化多糖的方法中，從而獲得pap。paps可以通過所述轉化體(a)或其處理物從該pap產生。因此，通過將轉化體(a)或其處理物并入到所述反應溶液中，可以供應/再生paps。
[0174]
《《c5-差向異構化》》
[0175]
本發明的生產硫酸化多糖的方法優選地包括下述步驟(2-1)和(2-2)：
[0176]
(2-1)制備屬于原核生物的微生物的轉化體(b)或所述轉化體(b)的處理物或提取物，所述轉化體(b)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼c5-差向異構酶的基因；和
[0177]
(2-2)通過在n-磺基肝素原存在下將所述轉化體(b)或其處理物或提取物并入到所述反應溶液中，進行c5-差向異構化。
[0178]
在步驟(2-2)中，n-磺基肝素原的c5-差向異構化通過表達c5-差向異構酶的所述轉化體(b)或其處理物或提取物來進行。
[0179]
《《2-o-硫酸化》》
[0180]
本發明的生產硫酸化多糖的方法優選地包括下述步驟(3-1)和(3-2)：
[0181]
(3-1)制備屬于原核生物的微生物的轉化體(c)或所述轉化體(c)的處理物或提取物，所述轉化體(c)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼2-o-磺基轉移酶的基因；和
[0182]
(3-2)通過在n-磺基肝素原存在下將所述轉化體(c)或其處理物或提取物并入到所述反應溶液中，進行2-o-硫酸化。
[0183]
在步驟(3-2)中，n-磺基肝素原的2-o-硫酸化通過表達2-o-磺基轉移酶的所述轉化體(c)或其處理物或提取物，使用由所述轉化體(a)或其處理物產生的paps作為硫酸基團的供體來進行。
[0184]
當所述反應溶液中存在步驟(2-2)中產生的硫酸化多糖時，進行在所述步驟中產生的硫酸化多糖的2-o-硫酸化。例如，當存在具有c5-差向異構化的n-磺基肝素原時，進行所述具有c5-差向異構化的n-磺基肝素原的2-o-硫酸化。
[0185]
上述c5-差向異構化和2-o-硫酸化可以同時進行。也就是說，本發明的生產硫酸化
多糖的方法的一種情況優選地包括下述步驟(3
’?
1)至(3
’?
3)：
[0186]
(3
’?
1)制備屬于原核生物的微生物的轉化體(b)或所述轉化體(b)的處理物或提取物，所述轉化體(b)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼c5-差向異構酶的基因；
[0187]
(3
’?
2)制備屬于原核生物的微生物的轉化體(c)或所述轉化體(c)的處理物或提取物，所述轉化體(c)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼2-o-磺基轉移酶的基因；和
[0188]
(3
’?
3)通過在n-磺基肝素原存在下將所述轉化體(b)或其處理物或提取物和轉化體(c)或其處理物或提取物并入到所述反應溶液中，進行c5-差向異構化和2-o-硫酸化。
[0189]
《《6-o-硫酸化》》
[0190]
本發明的生產硫酸化多糖的方法優選地包括下述步驟(4-1)和(4-2)：
[0191]
(4-1)制備屬于原核生物的微生物的轉化體(d)或所述轉化體(d)的處理物或提取物，所述轉化體(d)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼6-o-磺基轉移酶的基因；和
[0192]
(4-2)通過在n-磺基肝素原存在下將所述轉化體(d)或其處理物或提取物并入到所述反應溶液中，進行6-o-硫酸化。
[0193]
在步驟(4-2)中，n-磺基肝素原的6-o-硫酸化通過表達6-o-磺基轉移酶的所述轉化體(d)或其處理物或提取物，使用由所述轉化體(a)或其處理物產生的paps作為硫酸基團的供體來進行。
[0194]
當在所述反應溶液中存在步驟(2-2)、(3-2)或(3
’?
3)中產生的硫酸化多糖時，進行在所述步驟中產生的硫酸化多糖的6-o-硫酸化。
[0195]
例如，當存在具有c5-差向異構化的n-磺基肝素原時，進行所述具有c5-差向異構化的n-磺基肝素原的6-o-硫酸化。當存在具有2-o-硫酸化的n-磺基肝素原時，進行所述具有2-o-硫酸化的n-磺基肝素原的6-o-硫酸化。
[0196]
當存在具有c5-差向異構化和2-o-硫酸化的n-磺基肝素原時，進行所述具有c5-差向異構化和2-o-硫酸化的n-磺基肝素原的6-o-硫酸化。
[0197]
《《3-o-硫酸化》》
[0198]
本發明的生產硫酸化多糖的方法優選地包括下述步驟(5-1)和(5-2)：
[0199]
(5-1)制備屬于原核生物的微生物的轉化體(e)或所述轉化體(e)的處理物或提取物，所述轉化體(e)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼3-o-磺基轉移酶的基因；和
[0200]
(5-2)通過在n-磺基肝素原存在下將所述轉化體(e)或其處理物或提取物并入到所述反應溶液中，進行3-o-硫酸化。
[0201]
在步驟(5-2)中，n-磺基肝素原的3-o-硫酸化通過表達3-o-磺基轉移酶的所述轉化體(e)或其處理物或提取物，使用由所述轉化體(a)或其處理物產生的paps作為硫酸基團的供體來進行。
[0202]
當所述反應溶液中存在步驟(2-2)、(3-2)、(3
’?
3)或(4-2)中產生的硫酸化多糖時，進行在所述步驟中產生的硫酸化多糖的3-o-硫酸化。
[0203]
例如，當存在具有c5-差向異構化的n-磺基肝素原時，進行所述具有c5-差向異構化的n-磺基肝素原的3-o-硫酸化。當存在具有2-o-硫酸化的n-磺基肝素原時，進行所述具有2-o-硫酸化的n-磺基肝素原的3-o-硫酸化。當存在具有6-o-硫酸化的n-磺基肝素原時，進行所述具有6-o-硫酸化的n-磺基肝素原的3-o-硫酸化。
[0204]
當存在具有c5-差向異構化和2-o-硫酸化的n-磺基肝素原時，進行所述具有c5-差向異構化和2-o-硫酸化的n-磺基肝素原的3-o-硫酸化。當存在具有c5-差向異構化和6-o-硫酸化的n-磺基肝素原時，進行所述具有c5-差向異構化和6-o-硫酸化的n-磺基肝素原的3-o-硫酸化。當存在具有2-o-硫酸化和6-o-硫酸化的n-磺基肝素原時，進行所述具有2-o-硫酸化和6-o-硫酸化的n-磺基肝素原的3-o-硫酸化。
[0205]
當存在具有c5-差向異構化、2-o-硫酸化和6-o-硫酸化的n-磺基肝素原時，進行所述具有c5-差向異構化、2-o-硫酸化和6-o-硫酸化的n-磺基肝素原的3-o-硫酸化。
[0206]
《《反應條件》》
[0207]
下面將描述上述1)paps的供應/再生、2)c5-差向異構化、3)2-o-硫酸化、4)6-o-硫酸化和5)3-o-硫酸化的反應條件。
[0208]
所述反應溶液的ph優選為約6至8。在反應期間，優選地使用氨水溶液、氫氧化鈉水溶液、氫氧化鉀等，使用ph控制器將反應溶液的ph控制到接近中性、特別是約7，來進行所述反應。
[0209]
反應溫度、即反應期間轉化體的存活溫度，優選為20℃至50℃，更優選為25℃至47℃。反應時間優選為約1至7天，更優選為約1至3天。培養可以是分批類型、分批補料類型和連續類型中的任一者。其中，分批類型是優選的。
[0210]
通氣條件反應可以在還原條件或微需氧條件下進行。還原條件由反應溶液的氧化還原電位定義。反應溶液的氧化還原電位優選為約-200mv至-500mv，更優選為-250mv至-500mv。
[0211]
反應溶液的還原狀態可以使用刃天青指示劑容易地估計，并且可以使用氧化還原電位計精確測量。作為制備還原條件下的反應溶液的方法，可以無限制地使用已知方法。
[0212]
具體來說，通過對蒸餾水等進行熱處理或減壓處理以除去溶解的氣體，可以得到用于還原條件下的反應溶液的水性溶液。此外，可以添加適合的還原劑(例如硫代羥基乙酸、抗壞血酸、鹽酸胱氨酸、巰基乙酸、硫代乙酸、谷胱甘肽、硫化鈉等)來制備用于還原條件下的反應溶液的水性溶液。這些方法的適當組合也是制備用于還原條件下的反應溶液的水性溶液的有效方法。
[0213]
在反應期間維持還原條件的情況下，希望盡可能多地阻止來自于反應體系外部的氧氣的混合，并且這種方法的具體實例包括用惰性氣體例如氮氣或二氧化碳氣體封閉反應體系的方法。
[0214]
在反應期間維持微需氧條件的情況下，可以在將通氣速率設定到0.5vvm等的低值或更低的值，并將攪拌速度設定到500rpm等的低值或更低的值的條件下進行反應。在某些情況下，反應可以與下述狀態相組合進行，在所述狀態下在反應開始后的適當時間停止通氣，并在攪拌速度為100rpm或更低的條件下提高厭氧狀態的程度。
[0215]
《《硫酸化多糖的收集》》
[0216]
通過如上所述的培養在反應溶液中產生硫酸化多糖。所述硫酸化多糖可以通過回收所述反應溶液來收集，并且此外，所述硫酸化多糖可以通過已知方法從所述反應溶液分離。此類已知方法的實例包括蒸餾法、膜滲透法、有機溶劑萃取法等。
[0217]
《《n-磺基肝素原的制備》》
[0218]
在本發明的生產硫酸化多糖的方法中使用的n-磺基肝素原通過對肝素原進行脫
乙?；⒔饩酆蚽-硫酸化來獲得。肝素原的生產和從肝素原生產n-磺基肝素原可以通過已知方法來進行(例如wo2018/048973)。
[0219]
生產肝素原的方法的實例包括一種方法，所述方法包括將具有下述(a1)的遺傳修飾并具有肝素原生產能力的屬于原核生物的微生物在培養基中培養以在所述培養基中產生肝素原，和從所述培養基收集肝素原：
[0220]
(a1)提高kpss基因的表達水平的遺傳修飾。
[0221]
除了(a1)之外，所述屬于原核生物的微生物可以進一步具有下述遺傳修飾(a2)和(a3)中的至少一者：
[0222]
(a2)提高選自kfia、kfib、kfic和kfid基因中的至少一個基因的表達水平的遺傳修飾，和
[0223]
(a3)引起yhbj基因的功能喪失的遺傳修飾。
[0224]
所述kpss基因是i區、ii區和iii區的基因中由i區編碼的基因。kpss參與肝素原合成的起始。在肝素原生產中，kpss與kpsc一起在向內膜中的磷脂酰甘油添加多個kdo連接物中發揮作用。
[0225]
作為kpss基因，源自于埃希氏桿菌屬的kpss基因是優選的。其具體實例包括大腸埃希氏桿菌k5菌株的kpss基因。大腸埃希氏桿菌k5菌株的kpss基因的核苷酸序列和由所述基因編碼的蛋白質的氨基酸序列可以從公共數據庫獲得。大腸埃希氏桿菌k5菌株的kpss基因被登記為genbank登記號caa52659.1。
[0226]
kpss基因的實例包括具有seq id no：27中示出的核苷酸序列的dna，或具有當在屬于原核生物的微生物中表達水平提高時提高所述微生物的肝素原生產能力的特性、具有與seq id no：27中示出的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列并具有肝素原生產能力的dna。
[0227]
kfia、kfib、kfic和kfid是i區、ii區和iii區的基因中由ii區編碼的基因。如圖2中所示，kfia、kfib、kfic和kfid參與肝素原的合成，并發揮添加糖并由此合成肝素原的作用。
[0228]
作為kfia、kfib、kfic或kfid基因，源自于埃希氏桿菌屬的kfia、kfib、kfic或kfid基因是優選的。其具體實例包括大腸埃希氏桿菌k5菌株的kfia、kfib、kfic或kfid基因。大腸埃希氏桿菌k5菌株的kfia、kfib、kfic或kfid基因的核苷酸序列和由所述基因編碼的蛋白質的氨基酸序列可以從公共數據庫獲得。所述kfia被登記為genbank登記號caa54711.1；所述kfib被登記為genbank登記號cae55824.1；所述kfic被登記為genbank登記號caa54709.1；并且所述kfid被登記為genbank登記號caa54708.1。
[0229]
kfia基因的實例包括具有seq id no：28中示出的核苷酸序列的dna，或具有當在屬于原核生物的微生物中表達水平提高時提高所述微生物的肝素原生產能力的特性、具有與seq id no：28中示出的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列并具有肝素原生產能力的dna。
[0230]
kfib基因的實例包括具有seq id no：29中示出的核苷酸序列的dna，或具有當在屬于原核生物的微生物中表達水平提高時提高所述微生物的肝素原生產能力的特性、具有與seq id no：29中示出的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列并具有肝素原生產能力的dna。
[0231]
kfic基因的實例包括具有seq id no：30中示出的核苷酸序列的dna，或具有當在屬于原核生物的微生物中表達水平提高時提高所述微生物的肝素原生產能力的特性、具有與seq id no：30中示出的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列并具有肝素原生產能力的dna。
[0232]
kfid基因的實例包括具有seq id no：31中示出的核苷酸序列的dna，或具有當在屬于原核生物的微生物中表達水平提高時提高所述微生物的肝素原生產能力的特性、具有與seq id no：31中示出的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列并具有肝素原生產能力的dna。
[0233]
圖3示出了肝素原生物合成途徑的示意圖。glms是作為肝素原前體的udp-n-乙酰葡萄糖胺的供應途徑中的第一個酶，并且是催化從果糖-6-磷酸到葡萄糖胺-6-磷酸的反應的酶。yhbj是負向控制glms的酶。
[0234]
作為yhbj基因，源自于埃希氏桿菌屬的yhbj基因是優選的。其具體實例包括大腸埃希氏桿菌k-12菌株的yhbj基因。大腸埃希氏桿菌k-12菌株的yhbj基因的核苷酸序列和由所述基因編碼的蛋白質的氨基酸序列可以從公共數據庫獲得。大腸埃希氏桿菌k-12菌株的yhbj基因被登記為genbank登記號bae77249.1。
[0235]
yhbj基因實例包括具有seq id no：32中示出的核苷酸序列的dna，或具有當在屬于原核生物的微生物中表達水平降低時提高所述微生物的肝素原生產能力的特性、具有與seq id no：32中示出的核苷酸序列具有90％或更高同一性的核苷酸序列并具有肝素原生產能力的dna。
[0236]
上述(a1)至(a3)中的各個基因可以從公共數據庫，通過例如使用上述各個基因的核苷酸序列進行blast搜索或fasta搜索容易地獲得。此外，各個基因的同源物可以使用微生物例如細菌的染體作為模板并使用在這些已知基因序列的基礎上產生的寡核苷酸作為引物，通過例如pcr來獲得。
[0237]
上述(a1)至(a3)中的各個基因可以是所述基因的變體，只要由所述基因編碼的蛋白質的原始功能(例如活性或性質)得以維持即可?？梢詸z查由所述基因的變體編碼的蛋白質是否維持其原始功能；具體來說，例如當所述原始功能是提高肝素原生產能力時，通過將所述基因的變體引入到具有肝素原生產能力的屬于原核生物的微生物中。
[0238]
上述(a1)至(a3)中的各個基因的變體可以根據定點突變方法，通過修飾基因的編碼區使得在編碼蛋白質的特定位置處的氨基酸殘基被替換、缺失、插入或添加來獲得。此外，上述(a1)至(a3)中的各個基因的變體也可以通過例如突變處理來獲得。
[0239]
只要它們的原始功能得以維持，上述(a1)至(a3)中的各個基因可以是具有其中一個或幾個位置處的一個或幾個氨基酸被替換、缺失、插入或添加的氨基酸序列的蛋白質的編碼基因。例如，在編碼的蛋白質中，其n-端和/或c-端可以被延長或縮短。短語“一個或幾個”根據蛋白質的三維結構中氨基酸殘基的位置和類型而不同。其具體實例包括1至50個、1至40個、1至30個，并且它優選為1至20個，更優選為1至10個，甚至更優選為1至5個，特別優選為1至3個。
[0240]
如上所述的一個或幾個氨基酸的替換、缺失、插入或添加是維持蛋白質功能正常的保守突變。保守突變的代表是保守替換。保守替換是下述突變：在替換位點是芳香族氨基酸的情況下，發生在phe、trp和tyr之間的替換；在替換位點是疏水氨基酸的情況下，發生在
leu、ile和val之間的替換；在替換位點是極性氨基酸的情況下，發生在gln和asn之間的替換；在替換位點是堿性氨基酸的情況下，發生在lys、arg和his之間的替換；在替換位點是酸性氨基酸的情況下，發生在asp和glu之間的替換；以及在替換位點是具有羥基的氨基酸的情況下，發生在ser和thr之間的替換。被認為是保守替換的替換的具體實例包括用ser或thr替換ala，用gln、his或lys替換arg，用glu、gln、lys、his或asp替換asn，用asn、glu或gln替換asp，用ser或ala替換cys，用asn、glu、lys、his、asp或arg替換gln，用gly、asn、gln、lys或asp替換glu，用pro替換gly，用asn、lys、gln、arg或tyr替換his，用leu、met、val或phe替換ile，用ile、met、val或phe替換leu，用asn、glu、gln、his或arg替換lys，用ile、leu、val或phe替換met，用trp、tyr、met、ile或leu替換phe，用thr或ala替換ser，用ser或ala替換thr，用phe或tyr替換trp，用his、phe或trp替換tyr，以及用met、ile或leu替換val。此外，如上所述的氨基酸替換、缺失、插入、添加及其倒置等，包括由天然存在的突變(突變體或變體)例如基于基因所源自的生物體中的個體差異或種差異的突變所導致的替換、缺失、插入和添加、倒置等。
[0241]
此外，只要它們的原始功能得以維持，上述(a1)至(a3)中的各個基因可以是與所述整個氨基酸序列具有80％或更高、優選地90％或更高、更優選地95％或更高、甚至更優選地97％或更高、特別優選地99％或更高同一性的蛋白質的編碼基因。
[0242]
此外，只要它們的原始功能得以維持，上述(a1)至(a3)中的各個基因可以是在嚴緊條件下與可以從已知基因序列制備的探針、例如與整個或一部分所述核苷酸序列互補的序列雜交的dna。術語“嚴緊條件”是指形成所謂的特異性雜交體并且不形成非特異性雜交體的條件。其實例包括彼此具有較高水平同一性的dna，例如彼此具有80％或更高、優選地90％或更高、更優選地95％或更高、甚至更優選地97％或更高、特別優選地99％或更高同一性的dna彼此雜交，并且彼此具有較低水平同一性的dna彼此不雜交的條件；或在正常southern雜交中用于清洗的條件，其中清洗在對應于60℃、1x ssc和0.1％sds，優選地60℃、0.1x ssc和0.1％sds，更優選地68℃、0.1x ssc和0.1％sds的鹽濃度和溫度下進行一次，優選地兩次到三次。
[0243]
用于上述雜交的探針可以是各個基因的互補序列的一部分。這種探針可以使用基于已知基因序列產生的寡核苷酸作為引物并使用含有上述(a1)至(a3)中的各個基因的dna片段作為模板，通過pcr來產生。例如，具有約300bp的長度的dna片段可以用作探針。在使用具有約300bp的長度的dna片段作為探針的情況下，在雜交中用于清洗的條件的實例包括50℃、2x ssc和0.1％sds的條件。
[0244]
此外，由于密碼子簡并性取決于宿主有所不同，因此上述(a1)至(a3)中的各個基因可以是通過將任何密碼子用等同密碼子替換而獲得的基因，只要它們的原始功能得以維持即可。例如，表1至3中的基因可以被修飾，使得它們根據所使用的宿主的密碼子使用頻率而具有最佳密碼子。
[0245]
突變處理的實例包括：用羥胺等體外處理具有上述(a1)至(a3)中的各個基因的核苷酸序列的dna分子的方法；用x-射線、紫外線或誘變劑例如n-甲基-n
’?
硝基-n-亞硝基胍(ntg)、甲磺酸乙酯(ems)和甲磺酸甲酯(mms)等處理帶有上述(a1)至(a3)中的各個基因的微生物的方法。
[0246]
《《提高基因表達的遺傳修飾》》
[0247]
短語“基因表達的提高”意味著與未修飾的菌株相比基因的表達提高。提高基因表達的一種情況的實例包括其中與未修飾的菌株相比基因的表達優選地提高1.5倍或更多，更優選地提高2倍或更多，甚至更優選地提高3倍或更多的情況。
[0248]
此外，短語“基因表達被提高”不僅意味著在原本表達靶基因的菌株中所述靶基因表達的提高，而且意味著在原本不表達靶基因的菌株中所述靶基因被表達。也就是說，短語“基因表達被提高”包括例如將靶基因引入到不具有所述靶基因的菌株中并在其中表達所述靶基因的情況。此外，短語“基因表達被提高”也指短語“基因表達被增強”和“基因表達被升高”。
[0249]
基因表達的提高可以通過例如增加所述基因的拷貝數來實現。增加基因的拷貝數可以通過將所述基因引入到宿主的染體中來實現。基因在染體中的引入可以使用例如同源重組來進行(miller i,j.h.《分子遺傳學實驗》(experiments in molecular genetics)，1972，cold spring harbor laboratory)?？梢砸牖虻膬H僅一個拷貝，或者可以引入其兩個或更多個拷貝。
[0250]
例如，可以通過靶向在染體上具有多個拷貝的序列進行同源重組，將基因的多個拷貝引入到染體中。在染體上具有多個拷貝的序列的實例包括重復dna序列(重復dna)和存在于轉座子的兩個末端處的反向重復序列。
[0251]
或者，同源重組可以靶向染體上的適合序列例如對靶物質的生產來說非必需的基因來進行。同源重組可以通過例如使用線性dna的方法、使用含有溫度敏感性復制原點的質粒的方法、使用能夠接合轉移的質粒的方法、使用不具有在宿主中起作用的復制原點的自殺質粒的方法或使用噬菌體的轉導方法來進行。此外，也可以使用轉座子或mini-mu將基因隨機引入到染體中(jp-a-h2-109985)。
[0252]
可以通過使用具有與所述基因的全部或一部分互補的序列的探針的southern雜交，使用在所述基因的序列的基礎上產生的引物的pcr等，來檢查靶基因是否已被引入到染體中。
[0253]
此外，也可以通過將含有基因的載體引入到宿主中，來增加所述基因的拷貝數。例如，可以通過將含有靶基因的dna片段連接到在宿主中起作用的載體以構建所述基因的表達載體，并用所述表達載體轉化所述宿主，來增加所述基因的拷貝數。通過例如使用具有靶基因的微生物的基因組dna作為模板的pcr，可以獲得含有所述靶基因的dna片段。轉化方法沒有特別限制，并且可以使用常規已知的方法。
[0254]
作為載體，可以使用可以在宿主細胞中自主復制的載體。所述載體優選為多拷貝載體。此外，所述載體優選地具有標志物例如抗生素抗性基因或文獻中描述的其他基因[karl friehs，“質粒拷貝數和質粒穩定性”(plasmid copy number and plasmid stability)，adv biochem engin/biotechnol 86:47-82(2004)]，以便選擇轉化體。此外，所述載體可以具有啟動子或終止子，以便表達插入的基因。所述載體的實例包括源自于細菌質粒的載體、源自于酵母質粒的載體、源自于噬菌體的載體、粘粒、噬菌粒等。
[0255]
能夠在腸桿菌科細菌例如大腸埃希氏桿菌中自主復制的載體的具體實例包括puc19、puc18、phsg299、phsg399、phsg398、pbr322和pstv29(都來自于takara bio inc.)、pacyc184和pmw219(nippon gene)、ptrc99a(pharmacia)、pprok載體(clontech)、pkk233-2(clontech)、pet載體(novagen)、pqe載體(qiagen)和廣宿主范圍載體rsf1010。
[0256]
在引入基因的情況下，所述基因保留在具有本發明的遺傳修飾的屬于原核生物的微生物中就已足夠。具體來說，所述基因被引入，使得它在本發明的細菌中起作用的啟動子序列的控制下表達就已足夠。啟動子可以是源自于宿主的啟動子或異源啟動子。所述啟動子可以是待引入基因的固有啟動子或其他基因的啟動子。作為啟動子，可以使用例如后文中描述的較強啟動子。
[0257]
用于終止轉錄的終止子可以被配置在基因的下游。對終止子沒有特別限制，只要它在本發明的細菌中起作用即可。所述終止子可以是源自于宿主的終止子或異源終止子。所述終止子可以是特異性針對待引入基因的終止子，或者可以是其他基因的終止子。終止子的具體實例包括t7終止子、t4終止子、fd噬菌體終止子、tet終止子和trpa終止子。
[0258]
可以在各種不同微生物中使用的載體、啟動子和終止子被詳細描述在例如“微生物學、基因工程基礎講義8”(basic lecture 8on microbiology,gene engineering)，kyoritsu shuppan,1987中，并且可以使用它們。
[0259]
此外，在引入兩個或更多個基因的情況下，各個基因以可表達方式保留在本發明的細菌中就已足夠。例如，各個基因可以都保留在單一表達載體上，或者可以全都保留在染體上。此外，各個基因可以分開地保留在多個表達載體上，或者可以分開地保留在單一或多個表達載體上以及染體上。此外，兩個或更多個基因可以形成操縱子并被引入?！捌渲幸雰蓚€或更多個基因的情況”的實例包括引入分別編碼兩種或更多種酶的基因的情況、引入分別編碼形成單個酶的兩個或更多個亞基的基因的情況及其組合。
[0260]
對待引入的基因沒有特別限制，只要它編碼在宿主中起作用的蛋白質即可。所述待引入的基因可以是源自于宿主的基因或異源基因。所述待引入的基因可以例如使用在所述基因的核苷酸序列的基礎上設計的引物并使用具有所述基因的生物體的基因組dna或帶有所述基因的質粒等作為模板，通過pcr來獲得。此外，所述待引入的基因可以例如在所述基因的核苷酸序列的基礎上全合成[gene,60(1),115-127(1987)]。
[0261]
此外，基因表達的提高可以通過提高基因的轉錄效率來實現。提高基因的轉錄效率可以通過例如將染體上的基因啟動子用較強啟動子代替來實現。所述“較強啟動子”是指與天然存在的野生型啟動子相比增強基因轉錄的啟動子。
[0262]
所述“較強啟動子”的實例包括已知的高表達啟動子，例如uspa啟動子、t7啟動子、trp啟動子、lac啟動子、thr啟動子、tac啟動子、trc啟動子、tet啟動子、arabad啟動子、rpoh啟動子、pr啟動子和pl啟動子。
[0263]
此外，作為較強啟動子，可以使用各種不同的報告基因獲得高活性類型的常規啟動子。例如，通過使啟動子區中的-35和-10區更接近于共有序列，可以提高啟動子的活性(wo2000/18935)。
[0264]
高活性類型啟動子的實例包括各種不同的tac樣啟動子(katashkina ji等，俄羅斯聯邦專利申請2006134574)和pnlp8啟動子(國際wo2010/027045)。用于評估啟動子強度的方法和強啟動子的實例被描述在已知文獻中[“生物技術中的原核啟動子”(prokaryotic promoters in biotechnology)，biotechnol.annu.rev.,1,105-128(1995)等]。
[0265]
此外，基因表達水平的提高可以通過提高基因的翻譯效率來實現?；蚍g效率的提高可以通過例如將染體上所述基因的shine-dalgarno(sd)序列(也被稱為核糖體結合位點(rbs))用較強sd序列代替來實現。
[0266]
所述“較強sd序列”是指與天然存在的野生型sd序列相比提高mrna翻譯的sd序列。較強sd序列的實例包括來自于噬菌體t7的基因10的rbs[olins p.o.等，gene,1988,73,227-235]。此外，已知在rbs與起始密碼子之間的間隔區中、特別是緊靠起始密碼子上游的序列(5
’?
utr)中幾個核苷酸的替換、插入或缺失顯著影響mrna的穩定性和翻譯效率，因此可以通過修飾它們來提高基因的翻譯效率。
[0267]
在本發明中，影響基因表達的位點例如啟動子、sd序列和rbs與起始密碼子之間的間隔區，也被合稱為“表達控制區”。表達控制區可以使用基因搜索軟件例如啟動子搜索載體或genetyx來確定。這些表達控制區的修飾可以通過例如使用溫度敏感性載體的方法或red驅動的整合方法(wo2005/010175)來進行。
[0268]
基因翻譯效率的提高也可以通過例如密碼子修飾來實現。具體來說，例如在進行基因的異源表達等的情況下，可以通過將所述基因中存在的稀有密碼子用更頻繁使用的同義密碼子代替，來提高所述基因的翻譯效率。
[0269]
密碼子替換可以通過例如定點突變方法來進行，其中將靶突變引入到dna中的靶位點中。定點突變方法的實例包括使用pcr的方法[higuchi,r.,61，《pcr技術》(pcr technology)，erlich,h.a.主編，stockton press(1989)；carter,p.,meth.in enzymol.,154,382(1987)]和使用噬菌體的方法[kramer,w.和frits,h.j.，meth.in enzymol.,154,350(1987)；kunkel,t.a.等，meth.in enzymol.,154,367(1987)]?；蛘?，可以全合成其中密碼子已被替換的基因片段。各種不同生物體中的密碼子使用頻率被描述在“密碼子使用數據庫”(codon usage database)[http://www.kazusa.or.jp/codon；nakamura,y.等，nucl.acids res.,28,292(2000)]中。
[0270]
此外，基因的表達也可以通過擴增提高基因表達的調控物或通過缺失或弱化降低基因表達的調控物來提高。如上所述的此類用于提高基因表達的技術可以單獨使用，或者可以以任何組合使用。
[0271]
可以例如通過檢查基因轉錄量的提高或通過檢查從所述基因表達的蛋白質的量的提高，來檢查基因表達的提高。此外，可以例如通過檢測從基因表達的蛋白質的活性的提高，來檢查基因表達的提高。
[0272]
檢查基因轉錄量的提高可以通過將從所述基因轉錄的mrna的量與未修飾的菌株例如野生菌株或親本菌株進行比較來進行。用于評估mrna的量的方法的實例包括northern雜交、rt-pcr等[sambrook,j.等，《分子克隆實驗指南》(molecular cloning a laboratory manual)第三版，cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor(usa),2001]。mrna量的提高是指例如與未修飾的菌株相比，mrna的量優選地提高1.5倍或更多，更優選地提高2倍或更多，甚至更優選地提高3倍或更多的情況。
[0273]
蛋白質的量的提高可以通過例如使用抗體的western印跡來檢查。蛋白質的量的提高是指例如與未修飾的菌株相比，蛋白質的量優選地提高1.5倍或更多，更優選地提高2倍或更多，甚至更優選地提高3倍或更多的情況。
[0274]
蛋白質活性的提高可以通過例如測量所述蛋白質的活性來檢查。蛋白質活性的提高是指例如與未修飾的菌株相比，蛋白質的活性優選地提高1.5倍或更多，更優選地提高2倍或更多，甚至更優選地提高3倍或更多的情況。
[0275]
上述用于提高基因表達的技術可用于增強上述基因(a1)和(a2)中的每一者的表
達。
[0276]
提高kpss基因表達的遺傳修飾優選是kpss基因的表達控制區的修飾和增加拷貝數的遺傳修飾中的至少一者。kpsfeducs基因作為生產肝素原的基因存在，但正如后面將在實施例中描述的，本發明的發明人發現，通過提高它們之中僅僅kpss基因的表達，獲得了特別提高肝素原生產的效果。因此，作為提高kpss基因表達的遺傳修飾，用于提高kpss基因的拷貝數的遺傳修飾是特別優選的。
[0277]
提高選自kfia、kfib、kfic和kfid基因的至少一個基因的表達的遺傳修飾，優選是選自kfia、kfib、kfic和kfid基因的至少一個基因的表達控制區的修飾和增加所述基因的拷貝數中的至少一者。如圖1中所示，kfia、kfib、kfic和kfid基因構成操縱子。增強由kfia、kfib、kfic和kfid基因構成的整個操縱子的遺傳修飾是優選的，并且kfia、kfib、kfic和kfid基因的表達控制區的修飾是更加優選的。
[0278]
《《引起基因功能喪失的遺傳修飾》》
[0279]
上述(a3)的引起yhbj基因的功能喪失的遺傳修飾，包括其中通過修飾編碼作為宿主的屬于原核生物的微生物的基因組dna中對應于yhbj的部分的dna，使由所述對應于yhbj的部分編碼的蛋白質的功能降低或完全停止的遺傳修飾。
[0280]
在本發明的方法中，對添加到編碼所述對應于yhbj的部分的dna的修飾的形式沒有特別限制，只要由所述對應于yhbj的部分編碼的蛋白質的功能被降低或完全停止即可，并且可以適合地使用已知的方法。
[0281]
降低或完全停止由所述對應于yhbj的部分編碼的蛋白質的功能的形式的實例包括下述修飾(i)至(iii)中的任一者：
[0282]
(i)除去編碼所述對應于yhbj的部分的dna的全部或一部分，
[0283]
(ii)對編碼所述對應于yhbj的部分的dna做出一個或幾個替換、缺失或添加，和
[0284]
(iii)將編碼所述對應于yhbj的部分的dna用與修飾前的dna序列具有低于80％同一性的dna序列代替。
[0285]
yhbj基因的功能喪失的實例包括其中與未修飾的菌株相比，yhbj基因的活性優選為20％或更低，更優選地10％或更低，甚至更優選地5％或更低的情況。yhbj的活性可以通過用northern印跡法、western印跡法等檢查glms的表達水平來檢查[kalamorz f.等，(2007)，“大腸埃希氏桿菌中葡萄糖胺-6-磷酸合酶glms表達的反饋控制依賴于小rna glmz并涉及新蛋白yhbj”(feedback control of glucosamine-6-phosphate synthase glms expression depends on the small rna glmz and involves the novel protein yhbj in escherichia coli)，mol microbiol.65(6):1518-33]。
[0286]
在本發明的生產硫酸化多糖的方法中，可以將通過已知方法化學修飾肝素原而獲得的n-磺基肝素原用于反應溶液，其中肝素原通過上述生產肝素原的方法獲得。
[0287]
《生產paps的方法》
[0288]
本發明的生產paps的方法的特征在于通過將atp源、硫酸根離子源、上述轉化體(a)或其處理物并入到反應溶液中來進行paps生產反應。也就是說，本發明的生產paps的方法包括下述步驟(i)和(ii)：
[0289]
(i)制備棒狀桿菌屬細菌的轉化體或所述轉化體的處理物，所述轉化體至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼atp硫酸化酶的基因和編碼aps激酶的基因，其中所述轉
化體的細胞質膜是物質可通透的；和
[0290]
(ii)使用含有atp源、硫酸根離子源和在步驟(i)中制備的轉化體或其處理物的反應溶液，進行生產paps的反應。
[0291]
根據本發明的生產paps的方法，可以使用表達atp硫酸化酶和aps激酶的棒狀桿菌屬細菌的轉化體或其處理物，通過細菌細胞反應來生產paps。
[0292]
實施例
[0293]
下面示出了實施例，但本發明不限于下述實施例。
[0294]
[實施例1]
[0295]
產氨棒狀桿菌de3質粒的構建
[0296]
如下所述構建了用于在產氨棒狀桿菌野生菌株atcc 6872的染體上插入在gltd-purta之間含有t7 rna聚合酶基因的λde3的質粒。設計了用于擴增gltd側的兩種引物[gltd-purt_1(seq id no：1)和gltd-purt_2bx(seq id no：2)]和用于擴增purt側的兩種引物[gltd-purt_3bx](seq id no：3)和gltd-purt_4(seq id no：4)]。
[0297]
此時，為了進行用于連接在第一pcr中擴增的gltd側翼片段和purt側翼片段的第二pcr(融合pcr)，將與用于擴增purt側翼片段的5’引物(gltd-purt_4；seq id no：4)的3’側上約25個堿基的序列互補的序列添加到用于擴增gltd側翼片段的3’引物(gltd-purt_2bx；seq id no：2)的5’側上。此外，將用于融合克隆的序列添加到用于擴增gltd側翼片段的5’引物(gltd-purt_1)和用于擴增purt側翼片段的3’引物(gltd-purt_4)的5’側。此外，將bglii和xhoi識別序列添加到gltd側和purt側上的連接部分，以插入λde3。
[0298]
按照saito等人描述的方法[biochim.biophys.acta 72,619(1963)]制備作為產氨棒狀桿菌的野生型菌株的產氨棒狀桿菌atcc 6872菌株(在后文中被稱為atcc 6872)的染體dna。
[0299]
使用所述染體dna作為模板進行用于擴增gltd側翼片段和purt側翼片段的第一pcr，從而獲得gltd側翼上約0.8kb的dna片段和purt側翼上約0.8kb的dna片段。接下來進行第二pcr以連接這些gltd側翼片段和purt側翼片段，從而獲得約1.6kb的dna片段(gltd-bx-purt)。
[0300]
將在具有卡那霉素抗性基因的大腸埃希氏桿菌載體phsg299[gene,61,63,(1987)]的psti切割位點處含有包含枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis)的左旋蔗糖酶基因sacb的2.6kb psti dna片段[mol.microbiol.,6,1195(1992)]的質粒pesb30，用bamhi切割。然后，使用融合克隆試劑盒(takara bio inc.)連接如上獲得的gltd-bx-purt片段。使用所述反應產物，按照常規方法[《分子克隆實驗指南》(molecular cloning:a laboratory manual)，第3版，2001,cold spring harbor laboratory press]轉化大腸埃希氏桿菌dh5α[由toyobo co.,ltd.制造]。
[0301]
將得到的菌株在含有20微克/ml卡那霉素的lb瓊脂培養基[所述培養基在1l水中含有10g細菌胰蛋白胨(由difco制造)、5g酵母提取物(由difco制造)、10g氯化鈉和16g細菌瓊脂(由difco制造)，并將其ph調節到ph 7.0]上培養，并選擇轉化的菌株。在通過菌落pcr選擇靶克隆后，將所述轉化的菌株接種在含有20微克/ml卡那霉素的lb培養基中(除了不含瓊脂之外，所述培養基具有與lb瓊脂培養基相同的組成)并培養過夜，從而使用qiaprep spin miniprep試劑盒(qiagen)從得到的培養液制備質粒。核苷酸序列分析確認了所述質
粒具有其中約1.6kb的gltd-bx-purt片段被插入到pesb30中的結構。
[0302]
隨后，使用從大腸埃希氏桿菌bl21(de3)提取的染體dna作為模板并使用引物de3-for_xho(seq id no：5)和de3-rev_bgl(seq id no：6)，通過pcr擴增4.5kb的λde3片段。將xhoi識別序列添加到de3-for_xho，并將bglii識別序列添加到de3-rev_bgl。將該片段和具有其中約1.6kb的gltd-bx-purt片段被插入到pesb30中的結構的質粒用xhoi和bglii消化，然后用dna連接試劑盒(takara bio inc.)連接。
[0303]
以與上述相同的方式轉化大腸埃希氏桿菌dh5α，將由此獲得的菌株在含有20微克/ml卡那霉素的lb瓊脂培養基上培養，并選擇轉化的菌株。將所述轉化的菌株接種到含有20微克/ml卡那霉素的lb培養基中并培養過夜，從而使用質粒qiaprep spin miniprep試劑盒(qiagen)從得到的培養液制備質粒。核苷酸序列分析確認所述質粒具有其中4.5kb的λde3片段被插入到pesb30上約1.6kb的gltd-purt之間的結構。該質粒被命名為pc-de3。
[0304]
[實施例2]
[0305]
產氨棒狀桿菌的λde3插入菌株的構建
[0306]
按照rest等人的方法[appl.microbiol.biotech.,52,541(1999)]通過電穿孔將pc-de3引入到atcc 6872菌株中，并選擇卡那霉素抗性菌株。當通過southern雜交[《分子克隆實驗指南》(molecular cloning:a laboratory manual)第3版，2001,cold spring harbor laboratory press]檢查從卡那霉素抗性菌株之一獲得的染體的結構時，確認了pc-de3通過campbell型同源重組被整合到染體中。
[0307]
將所述轉化的菌株(單個重組體)施加到suc瓊脂培養基[所述培養基在1l水中含有100g蔗糖、7g肉提取物、10g蛋白胨、3g氯化鈉、5g酵母提取物(由difco制造)和15g細菌瓊脂(由difco制造)，并將其ph調節到ph 7.2]，在30℃培養1天，并選擇生長的克隆。其中存在sacb基因的菌株不能在這種培養基上生長，因為它將蔗糖轉變成自殺性物質[j.bacteriol.,174,5462(1991)]。另一方面，其中sacb基因通過染體上鄰近存在的λde3插入型與野生型之間的第二次同源重組而被缺失的菌株，可以在這種培養基上生長而不產生自殺性物質。在這種同源重組期間，野生型結構或其中λde3片段已被插入到gltd-purt之間的菌株與sacb一起被除去。此時，在野生型結構與sacb一起被除去的菌株中，發生了基因替換為λde3插入型。
[0308]
使用由此獲得的第二重組體，使用引物de3-for_xho和de3-rev_bgl，通過菌落pcr獲得了其中λde3被插入到atcc 6872的gltd-purt之間的菌株。這個菌株被命名為atcc 6872(de3)。
[0309]
[實施例3]
[0310]
具有用于表達met3-met14的dna片段的質粒的構建
[0311]
將質粒pcs299p[appl.microbiol.biotech.,63,592(2004)]用bamhi消化。使用pcet_fw2(seq id no：7)和pcet_rv2(seq id no：8)并使用pet21b作為模板進行pcr，以獲得含有laci-pt7的dna片段。將這些片段通過qiaquick pcr純化試劑盒(qiagen)進行純化，并使用融合克隆試劑盒(takara bio inc.)連接。使用所述反應產物，按照常規方法轉化大腸埃希氏桿菌dh5α(由toyobo co.,ltd.制造)，在含有20微克/ml卡那霉素的lb瓊脂培養基上培養，并選擇轉化的菌株。在通過菌落pcr選擇靶克隆后，將所述轉化的菌株接種在含有20微克/ml卡那霉素的lb培養基中并培養過夜，從而使用qiaprep spin miniprep試劑盒
(qiagen)從得到的培養液制備質粒。核苷酸序列分析確認了所述質粒是具有其中源自于pet21b的約1.9kb的laci-pt7 dna片段被插入到pcs299p中的結構的質粒。該質粒被命名為pcet212。
[0312]
隨后，構建了其中源自于釀酒酵母的met3和met14被插入到pcet212的t7啟動子下游的質粒。設計了用于從釀酒酵母s288c菌株(在后文中被稱為s288c)的染體dna擴增met3的兩種引物(met3_1(seq id no：9)和met3_2(seq id no：10))和用于擴增met14的兩種引物(met14_3(seq id no：11)和met14_4(seq id no：12))。
[0313]
此時，為了進行連接在第一pcr中擴增的met3片段和met14片段的第二pcr(融合pcr)，將與用于擴增met14的5’引物(met14_3；seq id no：11)的5’側上約15個堿基的序列互補的序列添加到用于擴增met3的3’引物(met3_2；seq id no：10)的5’側，并將與met3_3的5’側上約15個堿基的序列互補的序列添加到met14_3的5’側。此外，將用于融合克隆的序列添加到用于擴增met3的5’引物(met3_1)和用于擴增met13的3’引物(met14_4)的5’側。使用s288c菌株的染體dna作為模板進行用于擴增met3和met14的第一pcr，由此獲得約1.5kb的met3的dna片段和約0.6kb的下游區域中的dna片段。接下來，進行第二pcr以連接這些met3片段和met14片段，由此獲得約2.1kb的dna片段(met3-met14)。將該dna片段使用qiaquick pcr純化試劑盒(qiagen)進行純化，然后使用融合克隆試劑盒(takara bio inc.)連接到用ndei和xhoi消化的pcet212。使用所述反應產物，按照常規方法轉化大腸埃希氏桿菌dh5α(由toyobo co.,ltd.制造)。將由此得到的菌株在含有20微克/ml卡那霉素的lb瓊脂培養基上培養，并選擇轉化的菌株。在通過菌落pcr選擇靶克隆后，將所述轉化的菌株接種到含有20微克/ml卡那霉素的lb培養基中并培養過夜，從而使用qiaprep spin miniprep試劑盒(qiagen)從所述得到的培養液制備質粒。核苷酸序列分析確認所述質粒具有其中約2.1kb的met3-met14片段被插入到pcet212中的結構。該質粒被命名為psc-3-13。通過將psc-3-13轉化到atcc6872(de3)中，獲得了產氨棒狀桿菌的產paps的atcc 6872(de3)/psc-3-13菌株。
[0314]
[實施例4]
[0315]
具有用于表達伴侶蛋白的dna片段的質粒的構建
[0316]
使用gro_f(seq id no：13)和gro_r(seq id no：14)并使用大腸埃希氏桿菌bl21(de3)菌株的染體dna作為模板進行pcr，由此獲得含有groes-groel的dna片段。接下來，使用pkd46[datsenko,k.a.,warner,b.l.,proceedings of the national academy of science of the united states of america,vol.97.6640-6645(2000)]作為模板并使用arac_parab_f(seq id no：15)和arac_parab_r(seq id no：16)進行pcr，從而獲得了含有arac_parab的dna片段。使用pcdf-smori-f(seq id no：17)和pcdf-smori-r(seq id no：18)并使用pcdf-duet1(novagen)作為模板進行pcr，從而獲得含有鏈霉素抗性基因和colddf復制原點的dna片段。將這些片段通過qiaquick pcr純化試劑盒(qiagen)進行純化并使用融合克隆試劑盒(takara bio inc.)連接。使用所述反應產物，按照常規方法轉化大腸埃希氏桿菌dh5α(由toyobo co.,ltd.制造)，在含有50微克/ml鏈霉素的lb瓊脂培養基上培養，并選擇轉化的菌株。在通過菌落pcr選擇靶克隆后，將所述轉化的菌株接種在含有50微克/ml鏈霉素的lb培養基中并培養過夜，從而使用qiaprep spin miniprep試劑盒(qiagen)從得到的培養液制備質粒。核苷酸序列分析確認了所述質粒具有其中源自于
pkd46的約1.2kb的arac-parab dna片段和源自于bl21(de3)的約2.0kb的groes-groel dna片段被插入到pcdf-duet1中的結構。所述質粒被命名為pgro(sm)。
[0317]
[實施例5]
[0318]
表達c5-差向異構酶、2ost、6ost-3和3ost-1的大腸埃希氏桿菌的克隆
[0319]
按照文獻中描述的方法[biochemical and biophysical research communications第339卷,第2期,13 2006年1月,597-602頁]，將人類c5-差向異構酶的催化結構域區域(e53-n609)克隆到pmal-c2x載體(new england biolabs)中以構建mbp-c5。將所述mbp-c5與pgro7(takara bio inc.)一起轉化到origami-b(de3)(novagen)中，從而構建了表達c5-差向異構酶的大腸埃希氏桿菌origami-b(de3)/mbp-c5_pgro7菌株。
[0320]
seq id no：19示出了2-o-磺基轉移酶同工型1的催化結構域(r51-n356)的核苷酸序列，其源自于中華倉鼠，并被密碼子優化以在大腸埃希氏桿菌中表達。使用上述人工合成的序列作為模板和seq id no：20和21作為引物進行pcr。通過不依賴連接的克隆方法[methods mol biol.2009；498:105-115]將該pcr片段克隆到pet-his6-mbp-tev-lic(addgene)中，以構建h-mbp-2ost。將h-mbp-2ost與pgro(sm)一起轉化到origami-b(de3)(novagen)中，從而構建了表達2ost的大腸埃希氏桿菌的origami-b(de3)/h-mbp-2ost_pgro(sm)菌株。
[0321]
通過文獻中描述的方法[chemistry&biology第14卷,第9期,212007年9月,986-993頁]，將源自于小鼠的6-o-磺基轉移酶同工型3的催化結構域(p120-l424)克隆到pmal-c2x載體(new england biolabs)中以構建mbp-6ost3。將mbp-6ost3與pgro7(takara bio inc.)一起轉化到origami-b(de3)(novagen)中，從而構建了表達6ost-3的大腸埃希氏桿菌的origami-b(de3)/mbp-6ost3_pgro7菌株。
[0322]
通過文獻中描述的方法[j biol chem.2004年6月11日；279(24):25789-97]將源自于小鼠的3-o-磺基轉移酶的催化結構域(g48-h311)克隆到pet28a載體(novagen)中，以構建his-3ost1。將his-3ost1與pgro(sm)一起轉化到bl21-codonplus(de3)-ril(agilent technologies)中，從而構建了表達3ost1的大腸埃希氏桿菌的ril/his-3ost1_pgro(sm)菌株。
[0323]
[實施例6]
[0324]
n-磺基肝素原和2-o-硫酸化n-磺基肝素原的制備
[0325]
按照專利文獻[wo2018/048973a1]中描述的方法，使用大腸埃希氏桿菌k5菌株或nissle菌株通過發酵生產肝素原。根據所述文獻，將所述得到的肝素原化學去乙?；⒔饩郏缓蠡瘜Wn-硫酸化。隨后，通過乙醇沉淀進行分級以獲得n-磺基肝素原。按照同一文獻，通過酶反應對得到的n-磺基肝素原進行糖醛酸殘基中c5位的差向異構化和2-o位的硫酸化，然后通過乙醇沉淀進行分級，從而獲得2-o-硫酸化的n-磺基肝素原。
[0326]
[實施例7]
[0327]
atcc 6872(de3)/psc-3-13的培養
[0328]
將實施例3中獲得的atcc 6872(de3)/psc-3-13菌株接種在含有50微克/ml卡那霉素的by-葡萄糖瓊脂培養基[所述培養基在1l水中含有10g葡萄糖、20g普通肉湯培養基(由kyokuto pharmaceutical industrial co.,ltd.制造)、5g酵母提取物(由difco制造)和20g細菌瓊脂(由difco制造)]中，并在30℃培養過夜。
[0329]
將兩個平板的細菌細胞接種在2l erlenmeyer搖瓶中的350ml一級種子培養基中[所述培養基含有葡萄糖50g/l、高多聚蛋白胨(nihon pharmaceutical co.,ltd.)10g/l、酵母提取物(asahi)10g/l、kh2po41g/l、k2hpo
4 1g/l、(nh4)2so
4 0.5g/l、尿素0.5g/l、l-胱氨酸0.03g/l、mgso
4-7h2o 1g/l、cacl
2-2h2o 0.1g/l、znso
4-7h2o 0.01g/l、feso
4-7h2o 0.01g/l、mnso
4-5h2o 0.02g/l、d-泛酸鈣0.01g/l、生物素40微克/l、鹽酸硫胺素0.005g/l和煙酸0.005g/l，用氫氧化鈉將其ph調節到ph 7.2，并在使用壓熱釜在122℃滅菌20分鐘后向其分開地添加l-半胱氨酸0.1g/l、硫代硫酸鈉1g/l和卡那霉素0.1g/l]，并以220rpm的攪拌速度在30℃培養24小時。
[0330]
在6l培養罐中的1700ml二級種子培養基中[所述培養基含有葡萄糖100g/l、果糖4g/l、酵母提取物(由asahi制造)10g/l、kh2po41.25g/l、k2hpo
4 1g/l、單水谷氨酸鈉2.1g/l、l-胱氨酸0.02g/l、mgso
4-7h2o 1.25g/l、cacl
2-2h2o 0.1g/l、cuso
4-5h2o 0.002g/l、znso
4-7h2o 0.01g/l、feso
4-7h2o 0.02g/l、mnso
4-5h2o 0.02g/l、d-泛酸鈣0.015g/l、生物素40微克/l、煙酸0.005g/l和adeka nol lg-109(由adeka制造)1ml/l，用氫氧化鈉將其ph調整到7.2，在單獨添加尿素至3.2g/l后將其在壓熱釜中在122℃滅菌20分鐘，并向其分開地添加鹽酸硫胺素0.1g/l、l-半胱氨酸0.3g/l、硫代硫酸鈉2.5g/l和卡那霉素0.2g/l]，接種300ml上述培養溶液，并在30℃、650rpm的攪拌速度和2l/min的通氣速率的培養條件下培養24小時，同時用18％氨水將其ph調節到6.8。
[0331]
在6l培養罐中的1700ml主培養基中[所述培養基含有kh2po410g/l、k2hpo
4 10g/l、單水谷氨酸鈉1g/l、l-胱氨酸0.02g/l、cacl
2-2h2o 0.1g/l、cuso
4-5h2o 0.005g/l、znso
4-7h2o 0.01g/l、feso
4-7h2o 0.02g/l、生物素150微克/l、煙酸0.005g/l、尿素2g/l和adeka nol lg-109(由adeka制造)1ml/l，并在壓熱釜中122℃滅菌20分鐘后分開地向其添加葡萄糖125g/l、果糖25g/l、mgso
4-7h2o10g/l、mnso
4-5h2o 0.02g/l、d-泛酸鈣0.015g/l、鹽酸硫胺素0.005g/l、l-半胱氨酸0.15g/l、硫代硫酸鈉2.5g/l和卡那霉素0.2g/l]，接種300ml上述培養溶液，并在30℃和2l/min的通氣速率的培養條件下培養25小時，同時在650rpm至900rpm之間調節攪拌速度以使溶解氧的量不下降到低于1ppm，同時用18％氨水將其ph調節到6.8。
[0332]
在此期間添加iptg，使得在從培養開始起6小時后終濃度變為1mm，并在從培養開始起10小時后進一步添加生物素100微克/l、煙酸0.015g/l、d-泛酸鈣0.015g/l和鹽酸硫胺素0.005g/l。在培養完成后，通過離心機將培養溶液分離成細菌細胞和培養上清液，由此獲得沉淀物作為濕細菌細胞，并在-80℃下冷凍。
[0333]
[實施例8]
[0334]
origami-b(de3)/mbp-c5_pgro7、origami-b(de3)/h-mbp-2ost_pgro(sm)、origami-b(de3)/mbp-6ost3_pgro7和ril/his-3ost1_pgro(sm)的培養
[0335]
將在實施例5中獲得的origami-b(de3)/mbp-c5_pgro7菌株接種在含有5ml tb培養基并含有50微克/ml氨芐青霉素、20微克/ml氯霉素、15微克/ml四環素和15微克/ml卡那霉素的大試管中，并在30℃培養16小時。將1.2％培養溶液接種在含有500ml tb培養基并含有50微克/ml氨芐青霉素、20微克/ml氯霉素、15微克/ml四環素和15微克/ml卡那霉素的帶擋板erlenmeyer搖瓶中，并在37℃振搖培養6小時。隨后向其添加終濃度為1mm的iptg和終濃度為4mm的阿拉伯糖，并將培養在28℃進行20小時。隨后，將所述培養溶液離心，由此獲得
沉淀物作為濕細菌細胞，并在-80℃下冷凍。
[0336]
將在實施例5中獲得的origami-b(de3)/h-mbp-2ost_pgro(sm)菌株接種在含有5ml tb培養基并含有50微克/ml氨芐青霉素、50微克/ml鏈霉素、15微克/ml四環素和15微克/ml卡那霉素的大試管中，并在30℃培養16小時。將1.2％培養溶液接種在含有500ml tb培養基并含有50微克/ml氨芐青霉素、50微克/ml鏈霉素、15微克/ml四環素和15微克/ml卡那霉素的帶擋板erlenmeyer搖瓶中，并在30℃振搖培養12小時。隨后向其添加終濃度為1mm的iptg和終濃度為4mm的阿拉伯糖，并將培養在28℃進行20小時。隨后，將所述培養溶液離心，由此獲得沉淀物作為濕細菌細胞，并在-80℃下冷凍。
[0337]
將在實施例5中獲得的origami-b(de3)/mbp-6ost3_pgro7菌株接種在含有5ml tb培養基并含有50微克/ml氨芐青霉素、20微克/ml氯霉素、15微克/ml四環素和15微克/ml卡那霉素的大試管中，并在30℃培養16小時。將1.2％培養溶液接種在含有500ml tb培養基并含有50微克/ml氨芐青霉素、20微克/ml氯霉素、15微克/ml四環素和15微克/ml卡那霉素的帶擋板erlenmeyer搖瓶中，并在37℃振搖培養4小時。隨后向其添加終濃度為1mm的iptg和終濃度為4mm的阿拉伯糖，并將培養在28℃進行20小時。隨后，將所述培養溶液離心，由此獲得沉淀物作為濕細菌細胞，并在-80℃下冷凍。
[0338]
將在實施例5中獲得的ril/his-3ost1_pgro(sm)菌株接種在含有5ml tb培養基并含有50微克/ml鏈霉素、15微克/ml卡那霉素的大試管中，并在30℃培養16小時。將1.2％培養溶液接種在含有500ml tb培養基并含有50微克/ml鏈霉素和15微克/ml卡那霉素的帶擋板erlenmeyer搖瓶中，并在37℃振搖培養4小時。隨后向其添加終濃度為1mm的iptg和終濃度為4mm的阿拉伯糖，并將培養在28℃進行20小時。隨后，將所述培養溶液離心，由此獲得沉淀物作為濕細菌細胞，并在-80℃下冷凍。
[0339]
[實施例9]
[0340]
使用atcc 6872(de3)/psc-3-13、origami-b(de3)/mbp-c5_pgro7和origami-b(de3)/h-mbp-2ost_pgro(sm)在n-磺基肝素原的2-o位處的硫酸化反應的測試
[0341]
將在實施例7和8中獲得的atcc 6872(de3)/psc-3-13、origami-b(de3)/mbp-c5_pgro7和origami-b(de3)/h-mbp-2ost_pgro(sm)中的每一者的冷凍的細菌細胞懸浮在蒸餾水中使得所述冷凍細菌細胞的重量為333g/l，以制備細菌細胞懸液。將由此獲得的30ml atcc 6872(de3)/psc-3-13細菌細胞懸液、6ml origami-b(de3)/mbp-c5_pgro7細菌細胞懸液和6ml origami-b(de3)/h-mbp-2ost_pgro(sm)細菌細胞懸液添加到250ml生物反應器中的18ml反應溶液[含有葡萄糖60g/l、kh2po
4 8.75g/l、k2hpo
4 15g/l、mgso
4-7h2o 20g/l、d-泛酸鈣0.3g/l、煙酸0.2g/l、腺嘌呤4.05g/l、苯扎氯銨1.25g/l、adeka nol lg-109(由adeka制造)1ml/l和n-磺基肝素原1g/l(在實施例6中生產)的水性溶液]，并在37℃、500rpm的攪拌速度和0.75ml/min的通氣速率的培養條件下反應22小時，同時用2.8％氨水溶液將其ph調節到6.5。在此期間，在反應開始后6小時進一步添加葡萄糖60g/l、mgso
4-7h2o 5.0g/l和腺嘌呤2.7g/l。
[0342]
在反應期間適當時候進行取樣，以獲得反應溶液。將得到的反應溶液適當稀釋，然后離心，使用由shimadzu corporation制造的hplc，通過用uv檢測器測量在254nm處的吸收值來檢測并定量paps。結果示出在圖4中。此外，按照專利文獻[wo2018/048973a1]通過酶消化進行不飽和二糖的產生并通過hplc進行分析。
[0343]
也就是說，將得到的反應溶液離心，并將得到的上清液加熱并在80℃維持10分鐘以變性蛋白質。將所述蛋白質變性后的溶液離心，使用3k分子量過濾裝置(由merck制造)通過超濾對得到的上清液進行脫鹽。將脫鹽后的溶液提供到含有0.5u/ml的每種肝素酶i、ii和iii(由sigma制造，但也可以使用其他肝素酶)的肝素酶反應溶液[由50mm乙酸銨和2mm氯化鈣構成]，并在35℃進行2小時的酶消化。在酶消化后，通過將所述溶液在95℃維持15分鐘，將肝素酶滅活。
[0344]
通過使用shimadzu hplc和強陰離子交換柱(spherisorb-sax層析柱，4.0x 250mm，5微米，由waters制造)對肝素酶滅活后的溶液進行流動相a[含有1.8mm磷酸二氫鈉的水性溶液，用磷酸將其ph調節到ph 3.0]和流動相b[含有1.8mm磷酸二氫鈉和1m高氯酸鈉的水性溶液，使用磷酸將其ph調節到ph 3.0]的梯度洗脫模式分析，來進行不飽和二糖分析。
[0345]
不飽和二糖通過使用uv檢測器在232nm處測量吸光度來檢測。通過與不飽和二糖標準試劑(由iduron制造)進行比較來檢查δ-ua-glcns和δ-ua,2s-glcns的保留時間。通過獲得δ-ua,2s-glcns相對于檢測到的δ-ua-glcns和δ-ua,2s-glcns的總面積的面積比，來檢查2-o-硫酸化。結果示出在圖5中。
[0346]
[實施例10]
[0347]
使用atcc 6872(de3)/psc-3-13和origami-b(de3)/mbp-6ost3_pgro7在2-o-硫酸化n-磺基肝素原的6-o位處的硫酸化反應的測試
[0348]
將在實施例7和8中獲得的atcc 6872(de3)/psc-3-13和origami-b(de3)/mbp-6ost3_pgro7中的每一者的冷凍的細菌細胞懸浮在蒸餾水中使得所述冷凍細菌細胞的重量為333g/l，以制備細菌細胞懸液。將由此獲得的30ml atcc 6872(de3)/psc-3-13細菌細胞懸液和6ml origami-b(de3)/mbp-6ost3_pgro7細菌細胞懸液以及6ml蒸餾水添加到250ml生物反應器中的18ml反應溶液[含有葡萄糖60g/l、kh2po
4 8.75g/l、k2hpo
4 15g/l、mgso
4-7h2o 20g/l、d-泛酸鈣0.3g/l、煙酸0.2g/l、腺嘌呤4.05g/l、苯扎氯銨1.25g/l、adeka nol lg-109(由adeka制造)1ml/l和2-o-硫酸化n-磺基肝素原0.5g/l(在實施例6中生產)的水性溶液]，并在32℃、500rpm的攪拌速度和0.75ml/min的通氣速率的培養條件下反應22小時，同時用2n氫氧化鉀水溶液將其ph調節到7.4。
[0349]
在此期間，在反應開始后6小時進一步添加葡萄糖60g/l、mgso
4-7h2o 5.0g/l和腺嘌呤2.7g/l。在反應期間適當時候進行取樣，以獲得反應溶液。使用與實施例9中相同的方法進行paps的檢測和定量。結果示出在圖6中。
[0350]
此外，通過與實施例9中相同的方法分析反應后糖鏈中包含的硫酸化組成。通過與不飽和二糖標準試劑(由iduron制造)進行比較來檢查δ-ua,2s-glcns和δ-ua,2s-glcn,6s的保留時間。通過獲得δ-ua,2s-glcn,6s相對于檢測到的δ-ua,2s-glcns和δ-ua,2s-glcn,6s的總面積的面積比，來檢查6-o-硫酸化。結果示出在圖7中。
[0351]
[實施例11]
[0352]
使用atcc 6872(de3)/psc-3-13、origami-b(de3)/mbp-6ost3_pgro7和ril/his-3ost1_pgro(sm)在2-o-硫酸化n-磺基肝素原的6-o位和3-o位處的硫酸化反應的測試
[0353]
反應在實施例10中描述的條件下進行22小時。在此期間，在反應開始后3小時，將在實施例8中獲得的il/his-3ost1_pgro(sm)的冷凍細菌細胞懸浮在蒸餾水中，使得所述冷
凍細菌細胞的重量變為333g/l，并添加6ml所述制備的細菌細胞懸液。在反應期間適當時候進行取樣，以獲得反應溶液。使用與實施例9中相同的方法進行paps的檢測和定量。結果示出在圖8中。
[0354]
在所述反應完成后，將反應溶液離心，將得到的上清液適當稀釋，然后使用biophen(商標)anti-iia測量試劑盒(由hyphen biomed制造)測量anti-iia活性，以檢查3-o-硫酸化。此外，也測量在實施例10的反應后溶液的anti-iia活性，作為未添加ril/his-3ost1_pgro(sm)的陰性對照。使用biophen(商標)ufh校準品(由hyphen biomed制造)制作校準曲線。結果示出在表1中。
[0355]
[表1]
[0356]
表1.anti-iia活性的測量結果
[0357]
ril/his-3ost1_pgro(sm)的添加anti-iia活性(iu/ml-上清液)添加375未添加-36
[0358]
[實施例12]
[0359]
將在實施例7中獲得的atcc 6872(de3)/psc-3-13的冷凍細菌細胞懸浮在蒸餾水中，使得所述冷凍細菌細胞的重量變成333g/l，以制備細菌細胞懸液。將由此獲得的30ml細菌細胞懸液添加到250ml生物反應器中的30ml反應溶液[含有葡萄糖60g/l、kh2po
4 8.75g/l、k2hpo
4 15g/l、mgso
4-7h2o 20g/l、d-泛酸鈣0.3g/l、煙酸0.2g/l、腺嘌呤4.05g/l、苯扎氯銨0.625g/l、adeka nol lg-109(由adeka制造)1ml/l的水性溶液]，并在32℃、500rpm的攪拌速度和0.75ml/min的通氣速率的培養條件下反應22小時，同時用2n氫氧化鉀水溶液將其ph調節到7.4。
[0360]
在此期間，在反應開始后6小時進一步添加葡萄糖60g/l、kh2po
4 2.19g/l、k2hpo
4 3.75g/l、mgso
4-7h2o 5.0g/l和腺嘌呤2.7g/l。在反應期間適當時候進行取樣，以獲得反應溶液。
[0361]
將得到的反應溶液適當稀釋，然后離心，使用由shimadzu corporation制造的hplc，通過用uv檢測器測量在254nm處的吸收值來檢測并定量paps。結果示出在圖9中。
[0362]
如上所述，將能夠產生和再生paps的棒狀桿菌屬細菌和表達硫酸化酶的屬于原核生物的微生物添加到原材料例如葡萄糖、腺嘌呤和硫酸鎂并與其反應，從而從多糖高效地產生硫酸化多糖。
[0363]
盡管本發明已參考其具體實施方式進行了詳細描述，但對于本領域技術人員來說，顯然可以在其中做出各種不同的改變和修改而不背離其精神和范圍。本文中引用的所有參考文獻整體并入本文。本技術是基于2020年4月3日提交的國際申請號pct/jp2020/015388，其全部內容通過參考并入本文。
技術特征：
1.一種生產硫酸化多糖的方法，所述方法包括下述步驟(1-1)和(1-2)：(1-1)制備棒狀桿菌屬(corynebacterium)細菌的轉化體(a)或所述轉化體(a)的處理物，所述轉化體(a)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼atp硫酸化酶的基因和編碼aps激酶的基因；和(1-2)使用含有atp或atp源、硫酸根離子源和所述轉化體(a)或其處理物的反應溶液進行生產paps的反應。2.根據權利要求1所述的生產硫酸化多糖的方法，所述方法還包括下述步驟(2-1)和(2-2)：(2-1)制備屬于原核生物的微生物的轉化體(b)或所述轉化體(b)的處理物或提取物，所述轉化體(b)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼c5-差向異構酶的基因；和(2-2)通過在n-磺基肝素原存在下將所述轉化體(b)或其處理物或提取物并入到所述反應溶液中，進行c5-差向異構化。3.根據權利要求1或2所述的生產硫酸化多糖的方法，所述方法包括通過包含以可表達的方式引入到其中的編碼磺基轉移酶的基因的轉化體或所述轉化體的處理物或提取物進行硫酸化。4.根據權利要求3所述的生產硫酸化多糖的方法，所述方法還包括下述步驟(3-1)和(3-2)：(3-1)制備屬于原核生物的微生物的轉化體(c)或所述轉化體(c)的處理物或提取物，所述轉化體(c)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼2-o-磺基轉移酶的基因；和(3-2)通過在n-磺基肝素原存在下將所述轉化體(c)或其處理物或提取物并入到所述反應溶液中，進行2-o-硫酸化。5.根據權利要求3或4所述的生產硫酸化多糖的方法，所述方法還包括下述步驟(3
’?
1)至(3
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3)：(3
’?
1)制備屬于原核生物的微生物的轉化體(b)或所述轉化體(b)的處理物或提取物，所述轉化體(b)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼c5-差向異構酶的基因；(3
’?
2)制備屬于原核生物的微生物的轉化體(c)或所述轉化體(c)的處理物或提取物，所述轉化體(c)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼2-o-磺基轉移酶的基因；和(3
’?
3)通過在n-磺基肝素原存在下將所述轉化體(b)或其處理物或提取物和轉化體(c)或其處理物或提取物并入到所述反應溶液中，進行c5-差向異構化和2-o-硫酸化。6.根據權利要求3至5中的任一項所述的生產硫酸化多糖的方法，所述方法還包括下述步驟(4-1)和(4-2)：(4-1)制備屬于原核生物的微生物的轉化體(d)或所述轉化體(d)的處理物或提取物，所述轉化體(d)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼6-o-磺基轉移酶的基因；和(4-2)通過在n-磺基肝素原存在下將所述轉化體(d)或其處理物或提取物并入到所述反應溶液中，進行6-o-硫酸化。7.根據權利要求3至6中的任一項所述的生產硫酸化多糖的方法，所述方法還包括下述步驟(5-1)和(5-2)：(5-1)制備屬于原核生物的微生物的轉化體(e)或所述轉化體(e)的處理物或提取物，所述轉化體(e)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼3-o-磺基轉移酶的基因；和
(5-2)通過在n-磺基肝素原存在下將所述轉化體(e)或其處理物或提取物并入到所述反應溶液中，進行3-o-硫酸化。8.一種生產硫酸化多糖的方法，所述方法包括通過在atp或atp源、硫酸根離子源和n-磺基肝素原存在下在反應溶液中并入下述物質來產生硫酸化多糖：棒狀桿菌屬細菌的轉化體(a)或所述轉化體(a)的處理物，所述轉化體(a)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼atp硫酸化酶的基因和編碼aps激酶的基因，和選自下述的至少一者：屬于原核生物的微生物的轉化體(b)或所述轉化體(b)的處理物或提取物，所述轉化體(b)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼c5-差向異構酶的基因，屬于原核生物的微生物的轉化體(c)或所述轉化體(c)的處理物或提取物，所述轉化體(c)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼2-o-磺基轉移酶的基因，屬于原核生物的微生物的轉化體(d)或所述轉化體(d)的處理物或提取物，所述轉化體(d)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼6-o-磺基轉移酶的基因，和屬于原核生物的微生物的轉化體(e)或所述轉化體(e)的處理物或提取物，所述轉化體(e)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼3-o-磺基轉移酶的基因。9.根據權利要求8所述的生產硫酸化多糖的方法，所述方法還包括通過在所述atp或atp源、硫酸根離子源和n-磺基肝素原存在下，在所述反應溶液中并入所述轉化體(a)或其處理物和所述轉化體(b)至(e)或其處理物或提取物來產生硫酸化多糖。10.根據權利要求1至9中的任一項所述的生產硫酸化多糖的方法，其用于生產肝素。11.一種生產paps的方法，所述方法包括下述步驟(i)和(ii)：(i)制備棒狀桿菌屬細菌的轉化體或所述轉化體的處理物，所述轉化體至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼atp硫酸化酶的基因和編碼aps激酶的基因；和(ii)使用含有atp或atp源、硫酸根離子源和在步驟(i)中制備的所述轉化體或其處理物的反應溶液，進行生產paps的反應。
技術總結
本發明的目的是提供一種通過將利用微生物或其處理物的代謝活性的PAPS生產/再生系統與表達硫酸化酶的微生物或其處理物或提取物在混合廉價原材料例如硫酸鎂后進行反應來容易地生產硫酸化多糖的方法。本發明的另一個目的是提供一種從廉價原材料生產PAPS的實用方法。本發明涉及一種生產硫酸化多糖的方法和一種生產PAPS的方法，所述方法包括制備棒狀桿菌屬(Corynebacterium)細菌的轉化體(a)或所述轉化體(a)的處理物的步驟，所述轉化體(a)至少包含以可表達的方式引入到其中的編碼ATP硫酸化酶的基因和編碼APS激酶的基因，并且其中所述轉化體(a)的細胞質膜是物質可通透的；以及使用含有ATP或ATP源、硫酸根離子源和所述轉化體(a)或其處理物的反應溶液進行生產PAPS的反應的步驟。應的步驟。
