一種銀杏DPP-Ⅳ抑制肽的制備方法
一種銀杏dpp
?ⅳ
抑制肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
1.本發(fā)明涉及一種銀杏dpp
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抑制肽的制備方法，屬于食品與生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2.我國銀杏資源豐富，產(chǎn)量較大，銀杏干制品中蛋白含量豐富，銀杏蛋白氨基酸組成合理，為優(yōu)質(zhì)植物蛋白，球蛋白和清蛋白為銀杏蛋白的主要組分。目前，銀杏大多作為干果銷售，價(jià)格低廉，深加工產(chǎn)品較少，銀杏市場(chǎng)需求未能有效拓展，導(dǎo)致產(chǎn)量過剩，供大于求，直接制約了我國銀杏產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步持續(xù)健康發(fā)展。因此，迫切需要研發(fā)銀杏深加工產(chǎn)品，提高銀杏的附加值。
3.食源性生物活性肽被認(rèn)為是新一代的生物活性調(diào)節(jié)劑，主要來源于動(dòng)物蛋白和植物蛋白，具有抗氧化、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫、降血壓、降血脂和降血糖等廣泛的生理功能。糖尿病及其并發(fā)癥是嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病，預(yù)計(jì)到2045年，全球糖尿病患者將達(dá)到約7億。二肽基肽酶-iv(dipeptidyl peptidase-iv，dpp-iv)是細(xì)胞表面的一種絲氨酸蛋白酶，抑制dpp-iv活性有利于控制血糖水平。目前臨床上使用的西格列汀、利格列汀和沙格列汀等降血糖藥物的作用機(jī)制都是靶向抑制dpp-iv活性，但這些藥物往往伴隨著一定副作用。食源性dpp
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抑制肽由于其無毒副作用、安全性高，且對(duì)血糖正常者無降血糖作用，極具開發(fā)利用潛力。
4.迄今為止，已鑒定的dpp-iv食品蛋白衍生肽抑制劑尚未顯示出與合成藥物抑制劑同等的效力，因此需要進(jìn)一步篩選新型dpp
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抑制肽。銀杏肽為銀杏蛋白經(jīng)過單酶或復(fù)酶水解后分離所得的低聚肽，已被證實(shí)具有抗氧化、降血脂、降血壓、降血糖和肝保護(hù)等作用。評(píng)估了銀杏球蛋白作為dpp
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抑制肽來源的潛力，分析結(jié)果表明銀杏球蛋白中含有大量的dpp
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抑制肽片段，提示銀杏球蛋白是dpp
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抑制肽的優(yōu)質(zhì)蛋白來源。目前，有關(guān)銀杏蛋白源dpp
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抑制肽的制備未見報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
5.本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有食源性dpp
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抑制肽未顯示出與合成藥物抑制劑同等效力的問題，提供一種新型的銀杏球蛋白源的dpp
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抑制肽的制備方法，該方法制備的銀杏肽具有較高的dpp
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抑制活性，且制備工藝高效、快速，過程易于控制。
6.本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
7.一種銀杏dpp
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抑制肽的制備方法，包括如下步驟：
8.(1)將銀杏脫殼、去皮后烘干，然后粉碎，過60目篩，得到銀杏粉，將銀杏粉加入到石油醚中浸泡脫脂，結(jié)束后抽濾，干燥，得到脫脂銀杏粉；
9.(2)將脫脂銀杏粉加入到氯化鈉溶液中進(jìn)行提取，結(jié)束后離心收集上清液，往上清液中分批加入硫酸銨至其飽和度達(dá)70％～80％，靜置過夜后離心，將所得沉淀透析、濃縮、冷凍干燥，得到銀杏球蛋白；
10.(3)將銀杏球蛋白加入到去離子水中，混合均勻后得到懸浮液，加入蛋白酶進(jìn)行酶
解，結(jié)束后沸水浴滅酶，將得到的產(chǎn)物通過截留分子量為1000da的超濾膜過濾，收集濾液并冷凍干燥，得到銀杏dpp
?ⅳ
抑制肽；
11.步驟(3)中，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶或木瓜蛋白酶中的任意一種。
12.進(jìn)一步，步驟(2)中，氯化鈉溶液的質(zhì)量濃度為8～12％，脫脂銀杏粉和氯化鈉溶液的質(zhì)量體積比為1:15～1:20。
13.進(jìn)一步，步驟(2)中，所述提取溫度為55～60℃，提取時(shí)間為2～4h。
14.進(jìn)一步，步驟(2)中，所述透析采用的是截留分子量為3500da的透析膜，時(shí)間為48～72h。
15.進(jìn)一步，步驟(3)中，銀杏球蛋白和去離子水的質(zhì)量體積比為1:15～1:20。
16.進(jìn)一步，步驟(3)中，當(dāng)?shù)鞍酌笧槲傅鞍酌笗r(shí)，酶解條件為：酶與底物質(zhì)量比1:50～1:100，酶解溫度37℃，酶解ph3.0～3.5，酶解時(shí)間2.5～3.5h。
17.進(jìn)一步，步驟(3)中，當(dāng)?shù)鞍酌笧椴ぬ}蛋白酶時(shí)，酶解條件為：酶與底物質(zhì)量比1:50～1:100，酶解溫度50～55℃，酶解ph6.5～7.0，酶解時(shí)間3～4h。
18.進(jìn)一步，步驟(3)中，當(dāng)?shù)鞍酌笧槟竟系鞍酌笗r(shí)，酶解條件為：酶與底物質(zhì)量比1:50～1:100，酶解溫度50～55℃，酶解ph7.5～8.0，酶解時(shí)間3～4h。
19.本發(fā)明的有益效果：
20.本發(fā)明公開了一種銀杏dpp
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抑制肽的制備方法，該方法高效、快速，過程易于控制，制備的銀杏肽dpp
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抑制活性高(ic
50
值≤0.3mg/ml)、無毒副作用，相對(duì)分子質(zhì)量較小(150～1000da)，易被人體吸收。
具體實(shí)施方式
21.下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作清楚、詳細(xì)的描述。
22.下述實(shí)施例中，涉及的檢測(cè)方法有：
23.①
dpp
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抑制活性：
24.采用熒光法，以gly-pro-amc為底物，測(cè)定銀杏肽dpp
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抑制活性。依次將50μl20mmol/l tris-hcl緩沖液(ph8.0)、10μl dpp-iv、10μl抑制劑加入到酶標(biāo)板，混勻，37℃孵育5min，加入30μl 10mmol/l熒光底物gly-pro-mca溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，37℃繼續(xù)孵育30min，利用酶標(biāo)儀測(cè)定其熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長380nm，發(fā)射波長450nm。
25.dpp-iv抑制率(％)＝(f1－f2)/f1×
100。
26.式中：f1和f2分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度。
27.ic
50
值為dpp
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抑制率為50％時(shí)的銀杏肽質(zhì)量濃度。將銀杏肽稀釋成7個(gè)濃度梯度，測(cè)定各濃度梯度的dpp
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抑制率，計(jì)算出銀杏肽對(duì)dpp
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抑制活性的ic
50
值。
28.②
相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定：采用高效液相譜儀測(cè)定銀杏肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布。譜條件：譜柱tsk-gel g2000 sw，7.5
×
300mm；流動(dòng)相乙腈/水/三氟乙酸(10/90/0.1，v/v)；檢測(cè)波長220nm；流速0.5ml/min；進(jìn)樣量20μl。
29.實(shí)施例1
30.一種銀杏dpp
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抑制肽的制備方法，包括如下步驟：
31.(1)將銀杏脫殼、去皮后45℃干燥36h，然后粉碎，過60目篩，得到銀杏粉，將銀杏粉加入到石油醚中浸泡脫脂6h，每20min攪拌一次，結(jié)束后抽濾，干燥，得到脫脂銀杏粉；
32.(2)以1:15的質(zhì)量體積比將脫脂銀杏粉加入到質(zhì)量濃度為10％的氯化鈉溶液中，60℃水浴提取2h，結(jié)束后3000r/min離心20min，收集上清液，往上清液中分批加入硫酸銨至其飽和度達(dá)70％，靜置過夜后5000r/min離心20min，將所得沉淀采用截留分子量為3500da的透析膜透析72h，濃縮、冷凍干燥，得到銀杏球蛋白；考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得銀杏蛋白純度為86.42％。
33.(3)以1:15的質(zhì)量體積比將銀杏球蛋白加入到去離子水中，混合均勻后得到懸浮液，加入胃蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解條件：酶與底物質(zhì)量比1:50，酶解溫度37℃，酶解ph3.0，酶解時(shí)間3h；結(jié)束后沸水浴滅酶5min，將得到的產(chǎn)物通過截留分子量為1000da的超濾膜過濾，收集濾液并冷凍干燥，得到銀杏dpp
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抑制肽。
34.測(cè)得制備的銀杏dpp
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抑制肽對(duì)dpp
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抑制活性的ic
50
值分別為73.12μmol/l；銀杏dpp
?ⅳ
抑制肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍為150～1000da。
35.實(shí)施例2
36.步驟(3)中，酶解采用的是菠蘿蛋白酶，酶解條件為：酶與底物質(zhì)量比1:50，酶解溫度50℃、酶解ph 6.5，酶解時(shí)間4h。其余與實(shí)施例1相同。
37.測(cè)得制備的銀杏dpp
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抑制肽對(duì)dpp
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抑制活性的ic
50
值分別為75.15μmol/l；銀杏dpp
?ⅳ
抑制肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍為150～1000da。
38.實(shí)施例3
39.步驟(3)中，酶解采用的是木瓜蛋白酶，酶解條件為：酶與底物質(zhì)量比1:50，酶解溫度50℃，酶解ph 7.5，酶解時(shí)間4h。其余與實(shí)施例1相同。
40.測(cè)得制備的銀杏dpp
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抑制肽對(duì)dpp
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抑制活性的ic
50
值分別為78.17μmol/l；銀杏dpp
?ⅳ
抑制肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍為150～1000da。
41.實(shí)施例4
42.一種銀杏dpp
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抑制肽的制備方法，包括如下步驟：
43.(1)將銀杏脫殼、去皮后45℃干燥36h，然后粉碎，過60目篩，得到銀杏粉，將銀杏粉加入到石油醚中浸泡脫脂6h，每20min攪拌一次，結(jié)束后抽濾，干燥，得到脫脂銀杏粉；
44.(2)以1:20的質(zhì)量體積比將脫脂銀杏粉加入到質(zhì)量濃度為10％的氯化鈉溶液中，55℃水浴提取3h，結(jié)束后3500r/min離心15min，收集上清液，往上清液中分批加入硫酸銨至其飽和度達(dá)80％，靜置過夜后5000r/min離心15min，將所得沉淀采用截留分子量為3500da的透析膜透析72h，濃縮、冷凍干燥，得到銀杏球蛋白；考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得銀杏蛋白純度為87.34％。
45.(3)以1:20的質(zhì)量體積比將銀杏球蛋白加入到去離子水中，混合均勻后得到懸浮液，加入胃蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解條件：酶與底物質(zhì)量比1:100，酶解溫度37℃，酶解ph3.5，酶解時(shí)間3.5h；結(jié)束后沸水浴滅酶8min，將得到的產(chǎn)物通過截留分子量為1000da的超濾膜過濾，收集濾液并冷凍干燥，得到銀杏dpp
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抑制肽。
46.測(cè)得制備的銀杏dpp
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抑制肽對(duì)dpp
?ⅳ
抑制活性的ic
50
值分別為67.36μmol/l；銀杏dpp
?ⅳ
抑制肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍為150～1000da。
47.實(shí)施例5
48.步驟(3)中，酶解采用的是菠蘿蛋白酶，酶解條件為：酶與底物質(zhì)量比1:100，酶解溫度55℃、酶解ph7.0，酶解時(shí)間4h。其余與實(shí)施例4相同。
49.測(cè)得制備的銀杏dpp
?ⅳ
抑制肽對(duì)dpp
?ⅳ
抑制活性的ic
50
值分別為74.31μmol/l；銀杏dpp
?ⅳ
抑制肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍為150～1000da。
50.實(shí)施例6
51.步驟(3)中，酶解采用的是木瓜蛋白酶，酶解條件為：酶與底物質(zhì)量比1:100，酶解溫度55℃，酶解ph8.0，酶解時(shí)間3.5h。其余與實(shí)施例1相同。
52.測(cè)得制備的銀杏dpp
?ⅳ
抑制肽對(duì)dpp
?ⅳ
抑制活性的ic
50
值分別為76.34μmol/l；銀杏dpp
?ⅳ
抑制肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍為150～1000da。
53.以上所述實(shí)施例只是本發(fā)明的較佳實(shí)例，而沒有限制本發(fā)明的實(shí)施范圍。因此，凡是根據(jù)本發(fā)明內(nèi)容的實(shí)質(zhì)所作出的等效修改，都應(yīng)屬于在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
技術(shù)特征：
1.一種銀杏dpp
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抑制肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)將銀杏脫殼、去皮后烘干，然后粉碎，過60目篩，得到銀杏粉，將銀杏粉加入到石油醚中浸泡脫脂，結(jié)束后抽濾，干燥，得到脫脂銀杏粉；(2)將脫脂銀杏粉加入到氯化鈉溶液中進(jìn)行提取，結(jié)束后離心收集上清液，往上清液中分批加入硫酸銨至其飽和度達(dá)70％～80％，靜置過夜后離心，將所得沉淀透析、濃縮、冷凍干燥，得到銀杏球蛋白；(3)將銀杏球蛋白加入到去離子水中，混合均勻后得到懸浮液，加入蛋白酶進(jìn)行酶解，結(jié)束后沸水浴滅酶，將得到的產(chǎn)物通過截留分子量為1000da的超濾膜過濾，收集濾液并冷凍干燥，得到銀杏dpp
?ⅳ
抑制肽；步驟(3)中，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶或木瓜蛋白酶中的任意一種。2.如權(quán)利要求1所述銀杏dpp
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抑制肽的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，氯化鈉溶液的質(zhì)量濃度為8～12％，脫脂銀杏粉和氯化鈉溶液的質(zhì)量體積比為1:15～1:20。3.如權(quán)利要求1所述銀杏dpp
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抑制肽的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述提取溫度為55～60℃，提取時(shí)間為2～4h。4.如權(quán)利要求1所述銀杏dpp
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抑制肽的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述透析采用的是截留分子量為3500da的透析膜，時(shí)間為48～72h。5.如權(quán)利要求1所述銀杏dpp
?ⅳ
抑制肽的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，銀杏球蛋白和去離子水的質(zhì)量體積比為1:15～1:20。6.如權(quán)利要求1所述銀杏dpp
?ⅳ
抑制肽的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，當(dāng)?shù)鞍酌笧槲傅鞍酌笗r(shí)，酶解條件為：酶與底物質(zhì)量比1:50～1:100，酶解溫度37℃，酶解ph3.0～3.5，酶解時(shí)間2.5～3.5h。7.如權(quán)利要求1所述銀杏dpp
?ⅳ
抑制肽的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，當(dāng)?shù)鞍酌笧椴ぬ}蛋白酶時(shí)，酶解條件為：酶與底物質(zhì)量比1:50～1:100，酶解溫度50～55℃，酶解ph 6.5～7.0，酶解時(shí)間3～4h。8.如權(quán)利要求1所述銀杏dpp
?ⅳ
抑制肽的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，當(dāng)?shù)鞍酌笧槟竟系鞍酌笗r(shí)，酶解條件為：酶與底物質(zhì)量比1:50～1:100，酶解溫度50～55℃，酶解ph 7.5～8.0，酶解時(shí)間3～4h。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種銀杏DPP
