一種體外誘導(dǎo)IPS細(xì)胞分化生成人胰島β細(xì)胞的方法與流程
一種體外誘導(dǎo)ips細(xì)胞分化生成人胰島
β
細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域
1.本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種體外誘導(dǎo)ips細(xì)胞分化生成人胰島β細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
2.胰島β細(xì)胞一般指胰島b細(xì)胞，胰島b細(xì)胞屬于胰島細(xì)胞的一種，屬內(nèi)分泌細(xì)胞，約占胰島細(xì)胞總數(shù)的70％，主要位于胰島中央部，能分泌胰島素，起調(diào)節(jié)血糖含量的作用。胰島b細(xì)胞功能受損，胰島素分泌絕對或相對不足，從而引發(fā)糖尿病。通過移植從腦死亡器官捐獻(xiàn)者的胰腺中分離的β細(xì)胞，可以恢復(fù)糖尿病患者的胰島素分泌。然而，這種方法并沒有被廣泛引入，因?yàn)樾枰獊碜灾辽賰蓚€(gè)供體的細(xì)胞來治愈一個(gè)糖尿病患者。
3.長期以來，人們一直在嘗試從干細(xì)胞中產(chǎn)生功能性β細(xì)胞，多潛能干細(xì)胞是一種具有自我復(fù)制能力且在一定條件下可以分化成多種靶向功能細(xì)胞的干細(xì)胞，多潛能干細(xì)胞的使用，已經(jīng)逐漸成為人們尋胰島β細(xì)胞替代物的新資源。然而，盡管多潛能干細(xì)胞能夠解決供體細(xì)胞數(shù)量問題，但是在應(yīng)用前還需要先將其誘導(dǎo)分化為功能性的胰島素分泌細(xì)胞。因此，如何有效的實(shí)現(xiàn)ips細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為胰島β細(xì)胞是重要的研究課題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
4.針對上述情況，為彌補(bǔ)上述現(xiàn)有缺陷，本發(fā)明提供了一種適合ips細(xì)胞定向培養(yǎng)的培養(yǎng)基，從而保證ips細(xì)胞高效定向分化成胰島β細(xì)胞的體外誘導(dǎo)ips細(xì)胞分化生成人胰島β細(xì)胞的方法。
5.本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案：本發(fā)明提出的一種體外誘導(dǎo)ips細(xì)胞分化生成人胰島β細(xì)胞的方法，具體包括下列步驟：
6.(1)準(zhǔn)備ips細(xì)胞、培養(yǎng)基和誘導(dǎo)分化劑，所述培養(yǎng)基包括培養(yǎng)基a、培養(yǎng)基b、培養(yǎng)基c和培養(yǎng)基d，所述誘導(dǎo)分化劑包括誘導(dǎo)分化劑a、誘導(dǎo)分化劑b、誘導(dǎo)分化劑c和誘導(dǎo)分化劑d；
7.(2)向培養(yǎng)基a中加入誘導(dǎo)分化劑a，將ips細(xì)胞置于培養(yǎng)基a中，在體積百分含量為30℃、5％co2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)2天后，棄去未貼壁細(xì)胞，得到細(xì)胞a；
8.(3)向培養(yǎng)基b中加入誘導(dǎo)分化劑b進(jìn)行培養(yǎng)，將細(xì)胞a置于培養(yǎng)基b中，培養(yǎng)3天，得到分化細(xì)胞b；
9.(4)向培養(yǎng)基c中加入誘導(dǎo)分化劑c進(jìn)行培養(yǎng)，將分化細(xì)胞b置于培養(yǎng)基c中，培養(yǎng)6天，得到分化細(xì)胞c；
10.(5)向培養(yǎng)基d中加入誘導(dǎo)分化劑d進(jìn)行培養(yǎng)，將分化細(xì)胞c置于培養(yǎng)基d中，培養(yǎng)21天，得到胰島β細(xì)胞；
11.所述培養(yǎng)基a為dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基b為dmem/f12培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基c為高糖dmem培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基d為df12培養(yǎng)基。
12.進(jìn)一步地，所述誘導(dǎo)分化劑a包括碳酸氫鈉、谷氨酰胺、葡萄糖、糖原合成酶激酶3
抑制劑和白細(xì)胞抑制因子。
13.進(jìn)一步地，所述誘導(dǎo)分化劑b包括碳酸氫鈉、谷氨酰胺、葡萄糖、抗壞血酸、hgf、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、乙醇胺、表皮生長因子和視黃酸。
14.進(jìn)一步地，所述誘導(dǎo)分化劑c包括碳酸氫鈉、谷氨酰胺、葡萄糖、抗壞血酸、hgf、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、乙醇胺、表皮生長因子、視黃酸、活化素a、三碘甲狀腺原氨酸(t3)、alk5iii和硫酸鋅。
15.進(jìn)一步地，所述誘導(dǎo)分化劑d包括β細(xì)胞調(diào)節(jié)素、小檗堿bbr、尼克酰胺、碳酸氫鈉、谷氨酰胺、葡萄糖、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、乙醇胺、活化素a、三碘甲狀腺原氨酸(t3)、alk5iii、硫酸鋅、gsixx、毛喉素、艾塞那肽4、5羥胺和水溶性維生素e。
16.進(jìn)一步地，所述ips細(xì)胞為來源于人體皮膚的ips細(xì)胞。
17.采用上述結(jié)構(gòu)本發(fā)明取得的有益效果如下：本發(fā)明提出的一種體外誘導(dǎo)ips細(xì)胞分化生成人胰島β細(xì)胞的方法，通過誘導(dǎo)分化劑與對應(yīng)的培養(yǎng)基相配合，對ips細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化，提高了ips細(xì)胞向胰島β細(xì)胞的分化效率；且整個(gè)過程沒有用到血清，有效的避免了動物源性病原體帶來的風(fēng)險(xiǎn)，提高了臨床應(yīng)用的安全性。
具體實(shí)施方式
18.下面將結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例；基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
19.一種體外誘導(dǎo)ips細(xì)胞分化生成人胰島β細(xì)胞的方法，具體包括下列步驟：
20.(1)準(zhǔn)備來源于人體皮膚的ips細(xì)胞、培養(yǎng)基和誘導(dǎo)分化劑，所述培養(yǎng)基包括培養(yǎng)基a、培養(yǎng)基b、培養(yǎng)基c和培養(yǎng)基d，所述誘導(dǎo)分化劑包括誘導(dǎo)分化劑a、誘導(dǎo)分化劑b、誘導(dǎo)分化劑c和誘導(dǎo)分化劑d；
21.(2)向培養(yǎng)基a中加入誘導(dǎo)分化劑a，將ips細(xì)胞置于培養(yǎng)基a中，在體積百分含量為30℃、5％co2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)2天后，棄去未貼壁細(xì)胞，得到細(xì)胞a；
22.(3)向培養(yǎng)基b中加入誘導(dǎo)分化劑b進(jìn)行培養(yǎng)，將細(xì)胞a置于培養(yǎng)基b中，培養(yǎng)3天，得到分化細(xì)胞b；
23.(4)向培養(yǎng)基c中加入誘導(dǎo)分化劑c進(jìn)行培養(yǎng)，將分化細(xì)胞b置于培養(yǎng)基c中，培養(yǎng)6天，得到分化細(xì)胞c；
24.(5)向培養(yǎng)基d中加入誘導(dǎo)分化劑d進(jìn)行培養(yǎng)，將分化細(xì)胞c置于培養(yǎng)基d中，培養(yǎng)21天，得到胰島β細(xì)胞。
25.所述培養(yǎng)基a為dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述誘導(dǎo)分化劑a包括碳酸氫鈉、谷氨酰胺、葡萄糖、糖原合成酶激酶3抑制劑和白細(xì)胞抑制因子。
26.所述培養(yǎng)基b為dmem/f12培養(yǎng)基，所述誘導(dǎo)分化劑b包括碳酸氫鈉、谷氨酰胺、葡萄糖、抗壞血酸、hgf、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、乙醇胺、表皮生長因子和視黃酸。
27.所述培養(yǎng)基c為高糖dmem培養(yǎng)基，所述誘導(dǎo)分化劑c包括碳酸氫鈉、谷氨酰胺、葡萄糖、抗壞血酸、hgf、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、乙醇胺、表皮生長因子、視黃酸、活化素a、三碘甲狀腺原氨酸(t3)、alk5iii和硫酸鋅。
28.所述培養(yǎng)基d為df12培養(yǎng)基，所述誘導(dǎo)分化劑d包括β細(xì)胞調(diào)節(jié)素、小檗堿bbr、尼克酰胺、碳酸氫鈉、谷氨酰胺、葡萄糖、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、乙醇胺、活化素a、三碘甲狀腺原氨酸(t3)、alk5iii、硫酸鋅、gsixx、毛喉素、艾塞那肽4、5羥胺和水溶性維生素e。
29.本發(fā)明通過誘導(dǎo)分化劑a、誘導(dǎo)分化劑b、誘導(dǎo)分化劑c和誘導(dǎo)分化劑d輔助對應(yīng)的培養(yǎng)基，能夠顯著提ips的誘導(dǎo)分化效率，促進(jìn)體外分泌胰島素細(xì)胞的成熟，通過該方法能夠獲得大量的、有功能的、成熟的、穩(wěn)定的胰島β細(xì)胞。
30.要說明的是，在本文中，諸如第一和第二等之類的關(guān)系術(shù)語僅僅用來將一個(gè)實(shí)體或者操作與另一個(gè)實(shí)體或操作區(qū)分開來，而不一定要求或者暗示這些實(shí)體或操作之間存在任何這種實(shí)際的關(guān)系或者順序。而且，術(shù)語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物料或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物料或者設(shè)備所固有的要素。
31.盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。
技術(shù)特征：
1.一種體外誘導(dǎo)ips細(xì)胞分化生成人胰島β細(xì)胞的方法，其特征在于，具體包括下列步驟：(1)準(zhǔn)備ips細(xì)胞、培養(yǎng)基和誘導(dǎo)分化劑，所述培養(yǎng)基包括培養(yǎng)基a、培養(yǎng)基b、培養(yǎng)基c和培養(yǎng)基d，所述誘導(dǎo)分化劑包括誘導(dǎo)分化劑a、誘導(dǎo)分化劑b、誘導(dǎo)分化劑c和誘導(dǎo)分化劑d；(2)向培養(yǎng)基a中加入誘導(dǎo)分化劑a，將ips細(xì)胞置于培養(yǎng)基a中，在體積百分含量為30℃、5％co2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)2天后，棄去未貼壁細(xì)胞，得到細(xì)胞a；(3)向培養(yǎng)基b中加入誘導(dǎo)分化劑b進(jìn)行培養(yǎng)，將細(xì)胞a置于培養(yǎng)基b中，培養(yǎng)3天，得到分化細(xì)胞b；(4)向培養(yǎng)基c中加入誘導(dǎo)分化劑c進(jìn)行培養(yǎng)，將分化細(xì)胞b置于培養(yǎng)基c中，培養(yǎng)6天，得到分化細(xì)胞c；(5)向培養(yǎng)基d中加入誘導(dǎo)分化劑d進(jìn)行培養(yǎng)，將分化細(xì)胞c置于培養(yǎng)基d中，培養(yǎng)21天，得到胰島β細(xì)胞；所述培養(yǎng)基a為dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基b為dmem/f12培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基c為高糖dmem培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基d為df12培養(yǎng)基。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外誘導(dǎo)ips細(xì)胞分化生成人胰島β細(xì)胞的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)分化劑a包括碳酸氫鈉、谷氨酰胺、葡萄糖、糖原合成酶激酶3抑制劑和白細(xì)胞抑制因子。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種體外誘導(dǎo)ips細(xì)胞分化生成人胰島β細(xì)胞的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)分化劑b包括碳酸氫鈉、谷氨酰胺、葡萄糖、抗壞血酸、hgf、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、乙醇胺、表皮生長因子和視黃酸。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種體外誘導(dǎo)ips細(xì)胞分化生成人胰島β細(xì)胞的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)分化劑c包括碳酸氫鈉、谷氨酰胺、葡萄糖、抗壞血酸、hgf、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、乙醇胺、表皮生長因子、視黃酸、活化素a、三碘甲狀腺原氨酸(t3)、alk5iii和硫酸鋅。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種體外誘導(dǎo)ips細(xì)胞分化生成人胰島β細(xì)胞的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)分化劑d包括β細(xì)胞調(diào)節(jié)素、小檗堿bbr、尼克酰胺、碳酸氫鈉、谷氨酰胺、葡萄糖、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、乙醇胺、活化素a、三碘甲狀腺原氨酸(t3)、alk5iii、硫酸鋅、gsixx、毛喉素、艾塞那肽4、5羥胺和水溶性維生素。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外誘導(dǎo)ips細(xì)胞分化生成人胰島β細(xì)胞的方法，其特征在于，所述ips細(xì)胞為來源于人體皮膚的ips細(xì)胞。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種體外誘導(dǎo)IPS細(xì)胞分化生成人胰島β細(xì)胞的方法，具體包括下列步驟：(1)準(zhǔn)備IPS細(xì)胞、培養(yǎng)基和誘導(dǎo)分化劑；(2)培養(yǎng)基A和誘導(dǎo)分化劑A誘導(dǎo)分化，得到細(xì)胞A；(3)培養(yǎng)基B和誘導(dǎo)分化劑B誘導(dǎo)分化，得到細(xì)胞B；(4)培養(yǎng)基C和誘導(dǎo)分化劑C誘導(dǎo)分化，得到細(xì)胞C；(5)培養(yǎng)基D和誘導(dǎo)分化劑D誘導(dǎo)分化，得到胰島β細(xì)胞。本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體提供了一種適合IPS細(xì)胞定向培養(yǎng)的培養(yǎng)基，從而保證IPS細(xì)胞高效定向分化成胰島β細(xì)胞的體外誘導(dǎo)IPS細(xì)胞分化生成人胰島β細(xì)胞的方法。IPS細(xì)胞分化生成人胰島β細(xì)胞的方法。
