一種培養人嗅黏膜間充質干細胞的試劑盒及培養方法與流程
1.本發明屬于細胞培養技術領域，具體涉及一種培養人嗅黏膜間充質干細胞的試劑盒及培養方法。
背景技術：
2.1998年huard等人從人嗅黏膜中分離培養出一種可以向神經元與非神經細胞分化的細胞，后續被認為是嗅黏膜間充質干細胞(om-mscs)。om-mscs廣泛存在于鼻中隔或側壁的上、中、下鼻甲的鼻黏膜的固有層內。多項研究證實，該細胞不僅具有其他類型間充質干細胞的基本特性，并且相比于其他類型的間充質干細胞，om-mscs具有取材方便，來源穩定，更容易向神經元及其他神經細胞分化的優勢。om-mscs在組織工程，再生醫學和細胞免疫領域具有廣闊的應用前景。然而，目前培養om-mscs的方法多用自體血清及胎牛血清作為營養來源，若將培養的細胞應用于人體，其風險極大，如：朊病毒感染、人體抗牛血清蛋白抗體的產生等。因此，迫切需要一種全程無血清的培養om-mscs的方法減少疾病傳播的風險，并能保持干細胞純度，增殖及分化能力。
技術實現要素：
3.有鑒于此，本發明的目的在于提供一種培養人嗅黏膜間充質干細胞的試劑盒及培養方法，全程無血清培養條件下處理的om-mscs仍能維持干細胞的增殖和分化能力。
4.為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
5.本發明提供了一種培養人嗅黏膜間充質干細胞的試劑盒，包括獨立包裝的無血清培養基、無血清胰酶終止液和無血清凍存液；
6.所述無血清培養基以dmem/f12為基礎培養基，還包括谷氨酰胺600μg/ml、hepes 2nm、丙酮酸鈉60μg/ml、層粘蛋白50μg/ml、氫化可的松1μg/ml、人重組白蛋白1mg/ml、重組人胰島素20μg/ml、重組人轉鐵蛋白0.5ng/ml、β-甘油磷酸4mg/ml、膽固醇5μg/ml、生物素20μg/ml、肝素鈉4iu/ml、維生素b1210μg/ml、維生素e10μg/ml、維生素c 50μg/ml、干細胞營養液(v/v)5％、成纖維細胞生長因子20ng/ml、gm-csf 10ng/ml、egf 20ng/ml和β-fgf 20ng/ml；
7.所述無血清胰酶終止液包括pbs緩沖液和抑肽酶溶液20μg/ml；
8.所述無血清凍存液包括以下體積百分含量的組分：dmso 10％、白蛋白溶液30％、右旋糖酐40葡萄糖注射液20％、復方電解質注射液20％和葡萄糖氯化鈉注射液20％。
9.本發明提供了一種人嗅黏膜充間質干細胞的培養方法，包括以下步驟：將采集的人嗅黏膜樣本清洗后剪碎，與上述試劑盒中的無血清培養基混合培養，純化出人嗅黏膜充間質干細胞，得p0代細胞；
10.將p0代細胞培養至70～80％融合度時，用胰酶消化，利用上述試劑盒中的無血清胰酶終止液終止，離心后用所述無血清培養基重懸沉淀，得p1代細胞；利用所述p1代細胞進行與p1代相同的操作，進行代數擴增；
11.將獲得的p0代至p4代的細胞在所述離心后，利用上述試劑盒中的無血清凍存液進行重懸，而后進行凍存。
12.優選的，所述人嗅黏膜樣本采集自上鼻甲及中鼻甲靠上部外側黏膜組織。
13.優選的，所述清洗包括將采集的嗅黏膜樣本用青霉素和生理鹽水的混合溶液清洗3遍；所述青霉素和生理鹽水的體積比為1:1。
14.優選的，采用組織塊反復重新貼壁的方法純化出人嗅黏膜充間質干細胞；
15.在純化出所述人嗅黏膜充間質干細胞后，還包括每3天更換一次所述無血清培養基。
16.優選的，所述凍存包括，依次經4℃冷藏1h，-20℃冷凍4h，轉移至液氮上層，8～12h后轉移至液氮下層。
17.優選的，對經所述凍存后的人嗅黏膜充間質干細胞進行復蘇，包括：采用37℃水浴復溫，融化的細胞懸液與所述無血清培養基混合，離心收集沉淀，用無血清凍存液重懸。
18.優選的，所述離心的轉速為1000rpm，時間為5min。
19.本發明還提供了利用上述培養方法培養得到的人嗅黏膜充間質干細胞在獲得成骨、成脂或成軟骨細胞中的應用。
20.有益效果：本發明提供了一種培養人嗅黏膜間充質干細胞的試劑盒，包括獨立包裝的無血清培養基、無血清胰酶終止液和無血清凍存液，使得om-mscs在分離純化、培養擴增、儲存與復蘇全程無血清。利用本發明所述試劑盒，在om-mscs的分離純化、培養擴增、儲存與復蘇全過程中，優化操作步驟，簡化培養流程，可獲得純度更高的om-mscs。本發明自獲取鼻黏膜后全程不涉及自體血清或胎牛血清，使用了化學成分明確的無血清培養基，避免了疾病的傳播。應用該無血清培養基與10％fbs培養基在形態上相似，均呈梭形，螺旋狀生長，并具有間充質干細胞的增殖能力。流式細胞儀對om-msc的表面標志物檢測顯示與10％fbs培養一致。無血清培養的細胞高表達間充質干細胞標志物(cd73，cd90，cd105)以及om-mscs的特殊標志物，不表達造血干細胞標志物(cd34，cd45)。并且無血清培養om-mscs在成脂和成骨能力上與10％fbs培養的om-mscs相近。綜上可見，無血清培養的細胞符合om-msc鑒定標準，與10％fbs培養的om-msc在形態，生長方式，細胞表型，分化能力等方面一致，全程無血清培養方法可用于om-msc培養，實現om-mscs的體外大量擴增，對未來的臨床應用意義重大。
附圖說明
21.圖1為10％血清與無血清培養p4代om-msc形態對比；
22.圖2為10％血清與無血清培養p4代om-msc流式表型對比；
23.圖3為10％血清與無血清培養p4代om-msc的誘導分化結果對比。
具體實施方式
24.本發明提供了一種培養人嗅黏膜間充質干細胞的試劑盒，包括獨立包裝的無血清培養基、無血清胰酶終止液和無血清凍存液；
25.所述無血清培養基以dmem/f12為基礎培養基，還包括谷氨酰胺600μg/ml、hepes 2nm、丙酮酸鈉60μg/ml、層粘蛋白50μg/ml、氫化可的松1μg/ml、人重組白蛋白1mg/ml、重組
人胰島素20μg/ml、重組人轉鐵蛋白0.5ng/ml、β-甘油磷酸4mg/ml、膽固醇5μg/ml、生物素20μg/ml、肝素鈉4iu/ml、維生素b12 10μg/ml、維生素e 10μg/ml、維生素c 50μg/ml、干細胞營養液(v/v)5％、成纖維細胞生長因子20ng/ml、gm-csf 10ng/ml、egf 20ng/ml和β-fgf 20ng/ml；
26.所述無血清胰酶終止液包括pbs緩沖液、抑肽酶溶液20μg/ml；
27.所述無血清凍存液包括以下體積百分含量的成分：dmso 10％、白蛋白溶液30％、右旋糖酐40葡萄糖注射液20％、復方電解質注射液20％和葡萄糖氯化鈉注射液20％。
28.本發明所述成纖維細胞生長因子、gm-csf、egf和β-fgf促進om-mscs生長與增殖。
29.本發明提供了一種人嗅黏膜充間質干細胞的培養方法，包括以下步驟：將采集的人嗅黏膜樣本清洗后剪碎，與上述試劑盒中的無血清培養基混合培養，純化出人嗅黏膜充間質干細胞，得p0代細胞；
30.將p0代細胞培養至70-80％融合度時，用胰酶消化，利用上述試劑盒中的無血清胰酶終止液終止，離心后用所述無血清培養基重懸沉淀，得p1代細胞；利用所述p1代細胞進行與p1代相同的操作，直至得p4代細胞；
31.將獲得的p0代至p4代的細胞在所述離心后，利用上述試劑盒中的無血清凍存液進行重懸，而后進行凍存。
32.本發明所述人嗅黏膜樣本，優選采集自上鼻甲及中鼻甲靠上部外側黏膜組織，且在采集前，優選還包括排除hiv、梅毒及呼吸道病毒等傳染病。本發明所述采集優選包括在局部麻醉后，使用篩竇咬鉗取鼻腔特殊部位組織，將夾取的嗅黏膜放入專用嗅黏膜保存液中，充分混勻后送入實驗室培養。本發明所述專用嗅黏膜保存液優選為上述無血清培養基。
33.本發明對采集的人嗅黏膜樣本進行清洗，所述清洗優選包括將采集的嗅黏膜樣本用青霉素和生理鹽水的混合溶液清洗3遍，直至血跡洗凈；所述青霉素和生理鹽水的體積比為1:1。本發明優選將清洗后的人嗅黏膜樣本，用無菌眼科剪剪成約1mm3大小的組織塊，并將剪碎的組織塊與配置的無血清培養基充分混合種植于細胞培養瓶，置于37℃，5％co2的培養箱中培養。在本發明所述培養方式下，7天后組織塊周圍可見細胞爬出，利用專用純化方法將om-mscs純化，純化出后優選每3天更換一次無血清培養基。本發明所述專用純化方法優選包括組織塊反復重新貼壁的方法，具體為：嗅黏膜組織塊貼壁后首先可見表皮細胞，成纖維細胞，om-mscs等細胞同時爬出，細胞成分復雜；當細胞覆蓋范圍接近瓶底40％時，將組織塊取出，重新用無血清培養基貼壁到新培養瓶，反復操作2-3次，可見純度較高的om-mscs爬出。
34.本發明將純化出的細胞記作p0代細胞，將所述p0代細胞培養融合為70-80％時，用胰酶消化后充分，予以無血清胰酶終止液終止，1000rpm，5min離心后收集沉淀，用無血清培養基重懸在新的培養瓶，記作p1代細胞。重復上述操作，培養至p4代待用。
35.在本發明中，獲得的p0-p4代的細胞均可以采用胰酶消化充分后，予以無血清胰酶終止液終止，1000rpm離心后收集沉淀重懸在無血清凍存液中，細胞濃度為1
×
106/ml。經過4℃冷藏1h，-20℃冷凍4h后，轉移至液氮上層，過夜(8～12h)后轉移至液氮下層以儲存人嗅黏膜間充質干細胞。
36.本發明還包括對經所述凍存后的人嗅黏膜充間質干細胞進行復蘇，優選包括：采用37℃水浴復溫，融化的細胞懸液與所述無血清培養基混合，離心收集沉淀，用無血清凍存
液重懸。本發明所述離心的轉速優選為1000rpm，時間為5min。
37.本發明優選還包括對獲取的人嗅黏膜間充質干細胞進行鑒定，更優選包括利用流式細胞儀檢測人嗅黏膜間充質干細胞表型，包括cd34、cd45、cd73、cd90、cd105和間充質干細胞特殊標志物。
38.利用本發明所述方法培養得到的人嗅黏膜間充質干細胞，在成骨、成脂及成軟骨誘導分化培養基中，可完成細胞分化，從而得到對應的分化細胞。
39.本發明還提供了利用上述培養方法培養得到的人嗅黏膜充間質干細胞在獲得成骨、成脂或成軟骨細胞中的應用。
40.本發明對所述成骨、成脂或成軟骨細胞的分化誘導方法并沒有特殊限定，利用本領域的常規方法進行分化誘導即可。
41.下面結合實施例對本發明提供的一種培養人嗅黏膜間充質干細胞的試劑盒及培養方法進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發明保護范圍的限定。
42.實施例1
43.1.專用無血清培養基、無血清胰酶終止液、無血清凍存液的配置；
44.a.專用無血清培養基：dmem/f12+谷氨酰胺600μg/ml+hepes 2nm+丙酮酸鈉60μg/ml+層粘蛋白50μg/ml+氫化可的松1μg/ml+人重組白蛋白1mg/ml+重組人胰島素20μg/ml+重組人轉鐵蛋白0.5ng/ml+β-甘油磷酸4mg/ml+膽固醇5μg/ml+生物素20μg/ml+肝素鈉4iu/ml+維生素b12 10μg/ml+維生素e 10μg/ml+維生素c 50μg/ml+干細胞營養液(v/v)5％+成纖維細胞生長因子20ng/ml+gm-csf 10ng/ml+egf 20ng/ml+β-fgf 20ng/ml；
45.b.無血清胰酶終止液：pbs緩沖液+抑肽酶溶液20μg/ml；
46.c.無血清凍存液(v/v)：dmso 10％+白蛋白溶液30％+右旋糖酐40葡萄糖注射液20％+復方電解質注射液20％+葡萄糖氯化鈉注射液20％。
47.2.人嗅黏膜樣本采集，具體采集步驟為:
48.a.樣本來源為鼻黏膜正常的健康成人，年齡為20至60歲，采集鼻黏膜前患者應排除hiv、梅毒及呼吸道病毒等傳染病。取鼻黏膜前三天，修剪鼻毛并用氯霉素滴鼻進行鼻腔準備。
49.b.鼻腔準備三天后，對患者鼻腔全面清洗并消毒，用丁卡因與生理鹽水的比值1.2％-1.5％的棉片用狀鑷塞入病員鼻腔中進行局部麻醉，麻醉2次，每次5-8min。
50.c.麻醉完全后使用篩竇咬鉗取鼻腔特殊部位組織，將夾取的嗅黏膜放入專用嗅黏膜保存液中，充分混勻后送入實驗室培養。
51.3.人嗅黏膜間充質干細胞的分離純化，具體步驟為：
52.a.將鼻黏膜從試管放置于培養皿上，用青霉素與生理鹽水配比1比1清洗3遍，直至血跡清洗干凈。
53.b.用無菌眼科剪將洗凈的鼻黏膜剪成約1mm3大小的組織塊，并將剪碎的組織塊與配置的無血清培養基充分混合種植于細胞培養瓶，置于37℃，5％co2的培養箱中培養。
54.c.7天后組織塊周圍可見雜細胞爬出，組織塊反復重新貼壁直至om-mscs爬出，每3天更換一次無血清培養基。待細胞融合達到70％時，予以傳代培養，記作p1。
55.4.人嗅黏膜間充質干細胞的培養與擴增，具體步驟為：培養的細胞融合度為80％時，去除上清，添加胰酶消化充分，按照1∶2的體積比添加無血清胰酶終止液充分混勻，收集
細胞懸液，以1000rpmin，5min離心，收集沉淀，用無血清凍存液重懸在新的培養瓶上，記相應代數。重復上述操作，培養至p4待用。
56.5.人嗅黏膜間充質干細胞的儲存與復蘇，具體步驟為：
57.a.獲得的p0-p4代的細胞均可以去除上清，添加胰酶消化充分，按照1∶2的比例添加無血清胰酶終止液充分混勻，收集細胞懸液，以rpm離心，收集沉淀，重懸在無血清凍存液中，細胞濃度為1
×
106/ml。經過4℃冷藏1h，-20℃冷凍4h后，轉移至液氮上層，過夜后轉移至液氮下層，以儲存人嗅黏膜間充質干細胞。
58.b.液氮凍存的人嗅黏膜間充質干細胞，采用37℃水浴快速復溫，融化的細胞懸液添加至10ml無血清培養基中，離心1000轉/min離心后收集沉淀，用無血清培養基重懸到新的培養皿中，以復蘇人嗅黏膜間充質干細胞。
59.6.人嗅黏膜間充質干細胞的鑒定，具體步驟為：
60.a.采用上述相同步驟，將其中無血清培養基替換為dmem/f12培養基加10％胎牛血清后，獲取p4代人嗅黏膜間充質干細胞(10％fbs培養om-mscs)，并與采用上述發明獲得的p4代全程無血清培養的人嗅黏膜間充質干細胞(全程無血清培養om-mscs)進行對比。如圖1所示，兩種培養基培養的人om-mscs在光鏡下均為梭型，呈螺旋狀生長。
61.b.利用流式細胞儀鑒定om-msc細胞表型，包括：普通間充質干細胞標志物：cd34，cd45，cd73，cd90，cd105，om-msc特殊標志物。如圖2所示，兩種培養基培養的人om-mscs均表達cd73，cd90，cd105及om-msc特殊標志物，低表達cd34，cd45。并且全程無血清培養的p4代om-mscs表達cd73、cd90明顯高于血清培養om-mscs。
62.c.取p4代細胞，加入成脂、成骨及成軟骨分化誘導劑后，培養足夠天數后分別進行油紅o，茜素紅及阿爾辛藍染。如圖3所示兩種培養基培養的人om-mscs均能向脂肪、骨及軟骨分化。
63.以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
技術特征：
1.一種培養人嗅黏膜間充質干細胞的試劑盒，其特征在于，包括獨立包裝的無血清培養基、無血清胰酶終止液和無血清凍存液；所述無血清培養基以dmem/f12為基礎培養基，還包括谷氨酰胺600μg/ml、hepes 2nm、丙酮酸鈉60μg/ml、層粘蛋白50μg/ml、氫化可的松1μg/ml、人重組白蛋白1mg/ml、重組人胰島素20μg/ml、重組人轉鐵蛋白0.5ng/ml、β-甘油磷酸4mg/ml、膽固醇5μg/ml、生物素20μg/ml、肝素鈉4iu/ml、維生素b1210μg/ml、維生素e10μg/ml、維生素c 50μg/ml、體積百分含量為5％的干細胞營養液、成纖維細胞生長因子20ng/ml、gm-csf 10ng/ml、egf 20ng/ml和β-fgf 20ng/ml；所述無血清胰酶終止液包括pbs緩沖液和抑肽酶溶液20μg/ml；所述無血清凍存液包括以下體積百分含量的成分：dmso 10％、白蛋白溶液30％、右旋糖酐40葡萄糖注射液20％、復方電解質注射液20％和葡萄糖氯化鈉注射液20％。2.一種人嗅黏膜充間質干細胞的培養方法，其特征在于，包括以下步驟：將采集的人嗅黏膜樣本清洗后剪碎，與權利要求1所述試劑盒中的無血清培養基混合培養，純化出人嗅黏膜充間質干細胞，得p0代細胞；將p0代細胞培養至70～80％融合度時，用胰酶消化，利用權利要求1所述試劑盒中的無血清胰酶終止液終止，離心后用所述無血清培養基重懸沉淀，得p1代細胞；利用所述p1代細胞進行與p1代相同的操作，進行代數擴增；將獲得的細胞在所述離心后，利用權利要求1所述試劑盒中的無血清凍存液進行重懸，而后進行凍存。3.根據權利要求2所述培養方法，其特征在于，所述人嗅黏膜樣本采集自上鼻甲及中鼻甲靠上部外側黏膜組織。4.根據權利要求2所述培養方法，其特征在于，所述清洗包括將采集的嗅黏膜樣本用青霉素和生理鹽水的混合溶液清洗3遍；所述青霉素和生理鹽水的體積比為1:1。5.根據權利要求2所述培養方法，其特征在于，采用組織塊反復重新貼壁的方法純化出人嗅黏膜充間質干細胞；在純化出所述人嗅黏膜充間質干細胞后，還包括每3天更換一次所述無血清培養基。6.根據權利要求2所述培養方法，其特征在于，所述凍存包括，依次經4℃冷藏1h，-20℃冷凍4h，轉移至液氮上層，8～12h后轉移至液氮下層。7.根據權利要求2或6所述培養方法，其特征在于，對經所述凍存后的人嗅黏膜充間質干細胞進行復蘇，包括：采用37℃水浴復溫，融化的細胞懸液與所述無血清培養基混合，離心收集沉淀，用無血清凍存液重懸。8.根據權利要求7所述培養方法，其特征在于，所述離心的轉速為1000rpm，時間為5min。9.利用權利要求2～8任一項所述培養方法培養得到的人嗅黏膜充間質干細胞在獲得成骨、成脂或成軟骨細胞中的應用。
技術總結
本發明提供了一種培養人嗅黏膜間充質干細胞的試劑盒及培養方法，涉及細胞培養技術領域。本發明所述試劑盒提供了全套無血清的試劑，可保證人嗅黏膜間充質干細胞全程無血清分離純化、培養擴增、儲存與復蘇。本方法采用全程無血清方法處理人嗅黏膜間充質干細胞，在形態、純度以及分化能力上與10％胎牛血清培養的人嗅黏膜間充質干細胞無明顯差異。人嗅黏膜間充質干細胞無明顯差異。人嗅黏膜間充質干細胞無明顯差異。
