一種巴西甜突變體及其應用的制作方法
1.本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種巴西甜突變體及其應用。
背景技術：
2.甜味劑是食品加工領域不可或缺的重要添加劑。傳統的甜味劑如蔗糖、果糖、麥芽糖、葡萄糖，具有食用安全和營養價值，然而存在甜度低，熱量高，長期攝入容易引起齲齒、肥胖、心腦血管等疾病。正因為這些弊端，無熱量的人工甜味劑相繼被開發出來，如：阿巴斯甜，安賽蜜，糖精，紐甜。這些甜味劑得到了廣泛使用，但依然存在頭暈、頭痛等不良反應，其代謝產物對環境和人體健康的安全性難以檢測。所以迫切需要尋一種天然的甜味物質，以滿足人們生活需要。
3.植物甜蛋白作為一種天然產物，因具有安全性高，甜度高，熱量低的優點而被人們所關注。植物甜蛋白這些性質使其成為目前低熱量高甜度的人工甜味劑的理想替代品。相繼有八種植物甜蛋白被發現出來，這些甜蛋白是傳統甜味劑和人工甜味劑的最佳替代品之一。其中brazzein是從西非攀緣植物中提取的甜蛋白，甜度是蔗糖的500-2000倍，而且與其他甜蛋白相比，甜味味覺感受與蔗糖更相似。在ph2.5-8.0范圍內，保持穩定，而且耐熱性好，易溶于水，適用于各種食品加工工藝。植物中的甜蛋白含量低，提取困難，難以規模化生產。
4.為了解決植物甜蛋白產量低，難以產業化的問題，近年來，國內外學者利用微生物異源表達甜蛋白，提升甜蛋白產量的報道較多。如大腸桿菌，絲狀真菌，動物細胞等，然而這些都共同存在產量不足以用于生產的問題，這也是甜蛋白難以產業化的瓶頸。
技術實現要素：
5.本發明為解決現有技術問題，通過蛋白質工程技術，篩選能提高巴西甜brazzein甜度的基因突變位點，并在畢赤酵母中超量表達巴西甜，以期達到工業化的要求。
6.本發明一方面涉及一種巴西甜蛋白，其氨基酸序列為seq id no:1，編碼核苷酸序列為seq id no:2。
7.本發明一方面涉及一種巴西甜突變體，所述突變體是氨基酸序列為seq id no:1的巴西甜蛋白的第14位氨基酸由ser變為arg。
8.所述突變體的氨基酸序列為seq id no:3，編碼核苷酸序列為seq id no:4。
9.本發明一方面涉及一種巴西甜突變體，所述突變體是氨基酸序列為seq id no:3的巴西甜蛋白的第22位氨基酸由cys變為ala。
10.所述突變體的氨基酸序列為seq id no:5，編碼核苷酸序列為seq id no:6。
11.本發明一方面涉及一種巴西甜突變體，所述突變體是氨基酸序列為seq id no:5的巴西甜蛋白的第48位氨基酸由ile變為tyr。
12.所述突變體的氨基酸序列為seq id no:7，編碼核苷酸序列為seq id no:8。
13.本發明還提供了一種重組表達質粒，攜帶有上述突變體的編碼核苷酸序列
本發明還涉及一種宿主細胞，包含上述重組表達質粒。
14.在本發明的一些實施例中，宿主細胞為畢赤酵母（pichia pastoris）。
15.將上述重組表達質粒轉入畢赤酵母宿主細胞中進行重組表達，獲得的巴西甜突變體的甜度得到顯著提高。
16.本發明還涉及上述巴西甜突變體在飼料或食品加工領域中的應用。
17.本發明提供的巴西甜突變體b1-2、b1-3、b1-4在畢赤酵母中表達后，其甜度比突變前的巴西甜b1分別提高了133%、233%、300%，取得了意料不到的技術效果。所述突變體可作為甜味劑廣泛應用于飼料、食品加工等領域，應用前景廣闊。
具體實施方式
18.本發明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規技術和方法，例如molecular cloning: a laboratory manual, 3nd ed. (sambrook, 2001)和current protocols in molecular biology (ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是，本領域的技術人員可以在本發明所記載的技術方案的基礎上，采用本領域其它常規的方法、實驗方案和試劑，而不限于本發明具體實施例的限定。
19.菌株與載體：大腸桿菌dh5α本公司保藏，畢赤酵母gs115、載體ppic9k、amp、g418、zeocin購自invitrogen公司。
20.酶與試劑盒：dna聚合酶購買自takara公司，t4連接酶、限制性內切酶購自fermentas公司，質粒提取試劑盒及膠純化回收試劑盒購自omega公司，genemorph ii隨機誘變試劑盒購自北京博邁斯生物科技有限公司。
21.培養基配方：大腸桿菌培養基（lb培養基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%nacl，ph7.0；lb+amp培養基：lb培養基加100μg/ml氨芐青霉素；酵母培養基（ypd培養基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；ypd+zeocin培養基：ypd培養基加100μg/ml zeocin；酵母篩選培養基（md培養基）：1.34% ynb，4
×
10-5
生物素，1%甘油、2%瓊脂糖；bmgy培養基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mm磷酸鉀緩沖液(ph6.0)，1.34% ynb，4
×
10-5
%生物素，1%甘油；bmmy培養基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mm磷酸鉀緩沖液(ph6.0)，1.34% ynb，4
×
10-5
%生物素，0.5%甲醇。
22.下面結合實施例，進一步闡述本發明。
23.實施例1 巴西甜b1的基因合成查閱genbank中的基因序列，在pentadiplandra brazzeana中到一個巴西甜蛋白基因，命名為b1，genbank號為p56552.1。所述巴西甜蛋白的氨基酸序列為seq id no:1，其編碼核苷酸序列為seq id no:2。由華大基因公司進行全基因合成；b1基因全長165bp。
24.實施例2 巴西甜b1突變體的篩選為了進一步提高巴西甜b1的甜味活性，通過定向進化技術對該基因進行了大量的突變篩選；以b1基因為模板，利用引物1（f）和引物1（r）用genemorph ii隨機突變pcr試劑盒
（stratagene）進行pcr擴增；引物1（f）：gcgcgaattccaagataaatgtaagaaggtgtacg；引物1（r）：taaagcggccgctcaatattcacaataatcaca。
25.膠回收pcr產物，ecori、not i進行酶切處理后與經同樣酶切后的pet21a載體連接，轉化至大腸桿菌bl21（de3）中，涂布于lb+amp平板，37℃倒置培養；待轉化子出現后，用牙簽逐個挑至96孔板，每個孔中加入150 ul含有0.1mm iptg的lb+amp培養基，37℃、220 rpm培養6 h左右，離心棄上清，菌體用緩沖液重懸，反復凍融破壁，獲得含有巴西甜的大腸桿菌細胞裂解液。再離心去除菌體，將上清液進行巴西甜的甜味活性測定。
26.實驗結果表明，有些突變對巴西甜b1的甜味活性沒有影響，有些突變甚至使其甜味活性變得更低了。最終，申請人篩選到甜味活性顯著提高的突變位點及其組合：s14r單點突變，s14r/c22a兩點突變，s14r/c22a/i48y三點突變。
27.將含單點突變s14r的巴西甜突變體命名為b1-2，其氨基酸序列為seq id no:3，編碼核苷酸序列為seq id no:4。
28.將含s14r/c22a兩點突變的巴西甜突變體命名為b1-3，其氨基酸序列為seq id no:5，編碼核苷酸序列為seq id no:6。
29.將含s14r/c22a/i48y三點突變的巴西甜突變體命名為b1-4，其氨基酸序列為seq id no:7，編碼核苷酸序列為seq id no:8。
30.以上突變體的基因由華大基因公司合成。
31.用引物1（f）和引物1（r）對上述三個突變體進行pcr擴增，pcr條件為：94℃變性5min；然后94℃變性30s，56℃復性30s，72℃延伸1min，35個循環后，72℃保溫10min。結果顯示，突變體b1-2、b1-3、b1-4三個基因的長度與b1基因相同，全長165bp。
32.實施例3重組表達巴西甜的畢赤酵母工程菌的構建1、重組質粒的構建將克隆得到的巴西甜基因b1和三個突變體基因（b1-2、b1-3、b1-4）分別用限制性內切酶ecor i和not i進行雙酶切，100 μl酶切體系如下：巴西甜基因b1（b1-2、b1-3、b1-4）的 pcr產物40 μl、10
×
h buffer 10 μl、10
×
bsa 10 μl、ecor i 5 μl、not i 5 μl、ddh2o 30 μl。37℃酶切4 h后，瓊脂糖凝膠電泳回收。
33.將表達載體ppic9k先用限制性內切酶ecor i進行單酶切，100 μl酶切體系如下：表達載體ppic9k 20 μl、10
×
h buffer 10 μl、ecor i 5 μl、ddh2o 65 μl。37℃酶切4 h后，瓊脂糖凝膠電泳回收。將回收片段再用限制性內切酶not i進行單酶切，100 μl酶切體系如下：ppic9k回收片段20 μl、10
×
h buffer 10 μl、10
×
bsa 10 μl、10
×
triton 10 μl、not i 5 μl、ddh2o 45 μl。37℃酶切4 h后，瓊脂糖凝膠電泳回收。
34.將經ecor i和not i雙酶切的b1片段、b1-2片段、b1-3片段、b1-4片段分別與經同樣酶切后的表達載體ppic9k連接，構建重組表達質粒ppic9k-b1、ppic9k-b1-2、ppic9k-b1-3、ppic9k-b1-4。連接體系如下：表達載體ppic9k雙酶切產物5 μl、b1（b1-2、b1-3、b1-4）基因雙酶切產物3 μl、10
×
t
4 ligase buffer 1 μl、t
4 ligase 1 μl。22 ℃連接過夜，轉化到大腸桿菌dh5α，挑取轉化子測序驗證。測序驗證正確的轉化子轉接到lb+amp液體培養基中，37℃過夜培養，提質粒，即為重組酵母表達質粒ppic9k-b1（ppic9k-b1-2、ppic9k-b1-3、ppic9k-b1-4）。
35.2、轉化與篩選將重組酵母表達質粒ppic9k-b1、ppic9k-b1-2、ppic9k-b1-3、ppic9k-b1-4分別用sal i進行線性化，線性化產物用柱純化試劑盒純化后，通過電穿孔法轉化畢赤酵母gs115，涂布md平板。在md平板上生長出的菌落即為畢赤酵母工程菌株，然后涂布含不同濃度遺傳霉素g418的ypd平板上篩選多拷貝的轉化子。
36.3、搖瓶發酵驗證挑取單個多拷貝轉化子分別接入bmgy培養基中，30℃、220rpm振蕩培養24小時后，再轉入bmmy培養基中，30℃、220rpm振蕩培養，每24小時添加0.5%的甲醇。誘導表達4d后，離心去除菌體，將上清液進行甜蛋白活性測定。
37.結果顯示，搖瓶水平下轉化子中巴西甜b1的甜度最高達到標準蔗糖的300倍，蛋白含量為1.50g/l，將該轉化子編號為b1-33；巴西甜b1-2的甜度最高達到標準蔗糖的700倍，蛋白含量為1.63g/l，將該轉化子編號為b1-2-78；巴西甜b1-3的甜度最高達到標準蔗糖的1000倍，蛋白含量為1.43g/l，將該轉化子編號為b1-3-46；巴西甜b1-4的甜度最高達到標準蔗糖的1200倍，蛋白含量為1.49g/l，該轉化子編號為b1-4-24。
38.上述結果顯示，本發明提供的巴西甜突變體b1-2、b1-3、b1-4在畢赤酵母中表達后，其甜度比突變前的巴西甜b1分別提高了133%、233%、300%，取得了意料不到的技術效果。
39.一、甜味蛋白的甜味檢測方法甜味蛋白的甜味鑒定采用盲測實驗。盲測實驗對照組采用10%的蔗糖水溶液，甜味蛋白的待檢測樣品配制成不同濃度梯度后隨機編號，由10人組成評定小組對樣品進行品嘗，判斷不同濃度梯度樣品中與10%蔗糖水溶液的甜度相同或相近的樣品，從而計算出樣品的甜度。
40.公式為：相對蔗糖甜度倍數=10
×
稀釋倍數甜味蛋白不同濃度梯度樣品的配制：先稱取甜味蛋白樣品1.0g加蒸餾水稀釋至100ml，即成1.0%的樣品溶液；再量取1.0%樣品溶液，用蒸餾水進一步稀釋成2倍，4倍，6倍，8倍，10倍，20倍，50倍，100倍，200倍，300倍等不同稀釋倍數的待測溶液。
41.二、考馬斯亮藍法檢測蛋白含量1、試劑（1）考馬斯亮藍g-250染液：取考馬斯亮藍g-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀釋至1升，常溫可使用1個月；（2）標準蛋白溶液：用牛血清蛋白，預先經微量凱氏定氮法測定蛋白質含量，根據其純度，配制成1 mg/ml的蛋白質標準溶液；（3）標準原液的配制：在分析天平上精確稱取0.05g結晶牛血清蛋白，于小燒杯中，加入少量蒸餾水溶解后轉入50ml容量瓶中，燒杯內殘液用少量蒸餾水沖洗數次，沖洗液一并倒入容量瓶中，最后用蒸餾水定容至刻度。配制成標準原液，其中牛血清蛋白濃度為1000μg/ml。
42.2、標準曲線的繪制。
43.（1）分別取6支試管，編號，按下表加入試劑，混勻。管號123456樣品（ml）00.10.20.30.40.5水（ml）2.01.91.81.71.61.5蛋白質含量（mg/ml）00.050.10.150.20.25
44.準確吸取2.5ml 考馬斯亮藍溶液于6支干凈試管中，準確吸取上述各管溶液0.1ml，對應放于各自編號的試管中，渦旋混勻，室溫放置5min后，以1號試管調零，測定在595nm處比，記錄吸光值。
45.（2）繪制標準曲線：記錄1-6管所讀吸光值，以蛋白質含量（μg）為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪出標準曲線。注意，由于考馬斯亮藍染能力強，比杯一定要洗干凈。不可用石英杯測定。
46.3、樣品的測定樣品的準備：（1）液體樣品：將待測樣品稀釋至蛋白含量0.1-0.3mg/ml，控制除去空白后的吸光值（減去空白以后）在0.2-0.4之間；（2）固體樣品：準確稱取1.0000g樣品于100ml三角瓶中，用移液加入20ml去離子水，磁力攪拌10min，4000rpm離心10min，取上清進一步稀釋測定蛋白含量，稀釋方法參見液體樣品。
47.樣品檢測：取干凈試管，加入到含有2.5ml考馬斯亮藍溶液，然后加入待測樣品，渦旋震蕩搖勻，室溫放置5min，以標準曲線空白作對照，用1cm光徑的微量比杯在595nm測定吸光度，根據標曲求得蛋白含量。
48.4、蛋白含量計算蛋白含量=x*稀釋倍數*標樣折算系數。
49.x：根據標曲求出的蛋白含量（mg/ml）；標樣折算值：標樣為47mg/ml，根據實測值折算一個系數。
50.本發明提供的巴西甜突變體可作為甜味劑廣泛應用于飼料、食品加工等領域，應用前景廣闊。
技術特征：
1.一種巴西甜，其特征在于，所述巴西甜的氨基酸序列為seq id no:1，編碼核苷酸序列為seq id no:2。2.一種巴西甜突變體，其特征在于，所述突變體是氨基酸序列為seq id no:1的巴西甜的第14位氨基酸由ser變為arg。3.如權利要求2所述的突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列為seq id no:3，編碼核苷酸序列為seq id no:4。4.一種巴西甜突變體，其特征在于，所述突變體是氨基酸序列為seq id no:3的巴西甜的第22位氨基酸由cys變為ala。5.如權利要求4所述的突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列為seq id no:5，編碼核苷酸序列為seq id no:6。6.一種巴西甜突變體，其特征在于，所述突變體是氨基酸序列為seq id no:5的巴西甜的第48位氨基酸由ile變為tyr。7.如權利要求6所述的突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列為seq id no:7，編碼核苷酸序列為seq id no:8。8.一種重組表達質粒，其特征在于，所述質粒攜帶有權利要求2-7任一所述突變體的編碼核苷酸序列。9.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞包含權利要求8所述的重組表達質粒。10.權利要求2-7任一所述的巴西甜突變體在飼料或食品加工領域中的應用。
技術總結
本發明涉及基因工程與蛋白質改造技術領域，具體涉及一種巴西甜突變體及其應用。申請人通過蛋白質工程技術，篩選到顯著提高巴西甜Brazzein甜度的基因突變位點，并在畢赤酵母中超量表達巴西甜。所述突變體可作為甜味劑，廣泛應用于飼料或食品加工領域。泛應用于飼料或食品加工領域。
