GhGPX5和GhGPX13基因在提高植物鹽脅迫耐受性中的應(yīng)用
ghgpx5和ghgpx13基因在提高植物鹽脅迫耐受性中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
1.本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ghgpx5和ghgpx13基因在提高植物鹽脅迫耐受性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2.植物在整個生育期中，會遭受各種生物脅迫和非生物脅迫的環(huán)境，各種脅迫因素最終造成植物體內(nèi)過量活性氧的積累，從而影響植物的生長發(fā)育。已有研究認為，活性氧是植物新陳代謝過程中的一個副產(chǎn)物，在細胞信號傳遞和氧化還原平衡等過程中起著重要的作用。低濃度的活性氧在植物體內(nèi)可作為信號分子起作用，而高濃度的活性氧會對植物細胞產(chǎn)生毒害作用，會氧化胞內(nèi)組分如dna、蛋白和質(zhì)膜等生物大分子，從而影響植物生長發(fā)育，進而降低作物的產(chǎn)量。
3.植物體在進化過程中形成了復(fù)雜的酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)以消除由活性氧產(chǎn)生的氧化損傷，維持活性氧動態(tài)平衡。其中酶促系統(tǒng)包括各種過氧化酶家族，研究這些抗氧化基因的功能可以為提高植物抗逆性提供理論依據(jù)和應(yīng)用基礎(chǔ)。
4.植物gpxs能清除由于脅迫環(huán)境產(chǎn)生的過量的活性氧，其通常以trx作為還原劑，而不是gsh，因此被認為其具有硫氧還蛋白過氧化物酶活性。有些植物gpxs同時表現(xiàn)谷胱甘肽過氧化物酶和硫氧還蛋白過氧化物酶的活性，但以硫氧還蛋白為底物，其酶活性較以谷胱甘肽為底物的活性高。但總體而言，由于gpxs基因及其對應(yīng)蛋白類型較多，作用過程較為復(fù)雜，因而尚需進一步加以研究，以便為基因的具體應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。
5.我國對原棉的需求日益加劇，但依靠擴大耕地面積提高總產(chǎn)量是不現(xiàn)實的，我國有1億多畝地產(chǎn)鹽堿地，3億畝鹽堿荒地，60%~80%棉田在干旱和半干旱地區(qū)。由于棉花比其它作物需要相對較強的抗旱性和耐鹽堿性，生長過程中容易受到多種脅迫因素影響，因而生物體內(nèi)易于積累大量活性氧，而gpxs家族具有清除活性氧，進而抵御外界環(huán)境脅迫的能力。因而通過對棉花中g(shù)pxs基因研究，可以更清楚的了解棉花在生物和非生物脅迫下gpxs蛋白家族所起的作用。進而利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育能夠抵御外界脅迫條件的棉花品種，對于我國棉花生產(chǎn)的長期穩(wěn)定發(fā)展有著十分重要的意義，了解并到與抗旱性和耐鹽堿性更多相關(guān)的基因，從分子層面研究基因?qū)γ藁ǖ纳L發(fā)育及逆境抗性的影響具有重要意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
6.本發(fā)明的目的是提供ghgpx5和ghgpx13基因在提高植物鹽脅迫耐受性中的應(yīng)用。
7.為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案概述如下：本發(fā)明采用的ghgpx5基因在ncbi中基因序列號（sequence id）為xm_041083558.1，ghgpx5基因的信使rna（mrna）序列長度為1313 bp， ghgpx5基因的編碼序列長度為702 bp，包括233個氨基酸；ghgpx13基因在ncbi中基因序列號（sequence id）為xm_016881552.2，ghgpx13的信使rna（mrna）序列長度1256 bp，ghgpx13基因的編碼序列長度為702 bp，包括233個氨基
酸。ghgpx5和ghgpx13的氨基酸序列之間具有較高的同源性。
8.本發(fā)明還構(gòu)建一系列植物表達載體，含有上述基因的表達載體、重組載體或轉(zhuǎn)基因植物系以及含有所述載體的宿主細胞在提高植物耐鹽脅迫方面的功能也落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
9.本發(fā)明所保護的基因的功能，不僅包括上述ghgpx5和ghgpx13基因，還包括與ghgpx5和ghgpx13基因具有較高同源性（同源性高達99％）的同源基因在耐鹽脅迫方面的功能。
10.本發(fā)明公開的ghgpx5和ghgpx13基因在植物耐鹽脅迫中的生物學(xué)功能，具體表現(xiàn)在：在鹽脅迫下，ghgpx5和ghgpx13基因沉默株系的葉片萎蔫程度、黃化程度高于野生型，而ghgpx5和ghgpx13過表達株系的種子萌發(fā)率高于野生型，葉片黃化程度低于野生型。
11.根據(jù)其功能，可以通過轉(zhuǎn)基因的方式來獲得耐鹽脅迫的植株，具體地，可以通過將ghgpx5和ghgpx13基因?qū)肽康闹参铮玫睫D(zhuǎn)基因植物，該植株耐鹽脅迫能力高于目的植物。
12.具體地，ghgpx5和ghgpx13基因具體可通過所述重組表達載體導(dǎo)入所述目的植物。所述方法中，所述重組表達載體可通過使用ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。
13.為了提高植物的優(yōu)良性狀，本發(fā)明還保護一種新的植物育種方法，所述方法為以下（1）或（2）或（3）：（1）通過增加目的植物中g(shù)hgpx5和ghgpx13蛋白的活性，獲得鹽脅迫耐受性強于目的植物的植株；（2）通過促進目的植物中g(shù)hgpx5和ghgpx13基因的表達，獲得鹽脅迫耐受性強于目的植物的植株；（3）通過抑制目的植物中的ghgpx5和ghgpx13基因的表達，獲得鹽脅迫耐受性低于目的植物的植株。
[0014]“促進目的植物中g(shù)hgpx5和ghgpx13基因的表達”的實現(xiàn)方式可為如下（1）或（2）或（3）:（1）將ghgpx5和ghgpx13基因?qū)肽康闹参铮唬?）引入強啟動子和/或增強子；（3）本領(lǐng)域內(nèi)的其它常見方法。
[0015]
其中，目的植物，本發(fā)明所述目的植物是棉花、擬南芥。
[0016]
目的基因，也稱靶標基因，在基因工程設(shè)計和操作中，被用于基因重組、改變受體細胞性狀和獲得預(yù)期表達產(chǎn)物的基因。可以是生物體本身的，也可以是來自不同生物體的。
[0017]“調(diào)控植物中的ghgpx5和ghgpx13基因的表達”的方法為過表達、沉默或定向突變 ghgpx5和ghgpx13基因。
[0018]
調(diào)控基因表達水平包括利用dna同源重組技術(shù)、病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系調(diào)控所述 ghgpx5和ghgpx13表達，獲得轉(zhuǎn)基因植物株系。
[0019]
本發(fā)明中，對于適用于本發(fā)明的植物沒有特別的限制，只要其適合進行基因的轉(zhuǎn)化操作，如各種農(nóng)作物、花卉植物、或林業(yè)植物等。所述的植物比如可以是（不限于）：雙子葉
植物、單子葉植物或裸子植物。
[0020]
作為一種優(yōu)選方式，所述的“植物”包括但不限于：棉花、擬南芥，尤其是陸地棉（gossypium hirsutum），凡是具有該基因或者與之同源的基因均適用。
[0021]
本發(fā)明中所說的“植物”包括整株植物，其親本和子代植株以及植物的不同部位，包括種子、果實、芽、莖、葉、根（包括塊莖）、花、組織和器官，在這些不同的部分均有我們目的基因或者核酸。這里所提及的“植物”也包括植物細胞、懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚、分生組織區(qū)、配子體、孢子體、花粉和小孢子，同樣，其中每種前述對象包含目的基因/核酸。
[0022]
本發(fā)明包括任何植物細胞，或任何由其中的方法獲得或可獲得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖體。本專利也包含由任何前述方法所獲得的轉(zhuǎn)染細胞、組織、器官或完整植物。唯一的要求是子代表現(xiàn)出相同的基因型或表型特征，使用本專利中的方法獲得的子代特性相同。
[0023]
本發(fā)明還擴展到如上所述的植物的可收獲的部分，但不限于種子、葉、果實、花、莖、根、根莖、塊莖和球莖。同時進一步涉及植株收獲后的其他衍生物，如干燥顆粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及由相關(guān)植物獲得的食品或食品添加劑。
[0024]
本發(fā)明的優(yōu)點：（1）本發(fā)明采用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法，創(chuàng)新性地對陸地棉（gossypium hirsutum）中響應(yīng)逆境脅迫、參與抗氧化調(diào)節(jié)過程的谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，gpx）ghgpx5和ghgpx13（合稱ghgpx5/13）進行了克隆。構(gòu)建原核表達載體6p1-ghgpx5/13，將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達感受態(tài)細胞rosette(de3)中，誘導(dǎo)gst-ghgpx5/13大量表達并進行純化，結(jié)果顯示ghgpx5/13具有過氧化物酶活性和氧化還原狀態(tài)。進一步構(gòu)建ghgpx5/13基因沉默載體trv2-gpx5/13，利用農(nóng)桿菌侵染棉花葉片的方法將含有trv2-gpx5/13的農(nóng)桿菌注射棉花葉片，獲得gpx5/13沉默的植株，結(jié)果表明基因沉默植株在高鹽脅迫下葉片萎蔫嚴重，黃化現(xiàn)象嚴重，表明對高鹽處理更為敏感。接著構(gòu)建gpx5/13的過表達載體p35s-ghgpx5-gfp和p35s-ghgpx13-gfp，利用農(nóng)桿菌花序侵染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥（clo-0，wt），獲得過表達植株，分析結(jié)果表明在高鹽脅迫下，相對于野生型，ghgpx5/13能夠提高種子萌發(fā)率。為作物耐鹽分子育種提供基因資源。
[0025]
（2）可以通過轉(zhuǎn)基因的方式來獲得耐鹽性的植株，具體地，可以通過將ghgpx5/13基因?qū)肽康闹参铮玫睫D(zhuǎn)基因植物，該植株耐鹽性高于目的植物，為植物耐鹽育種提供一種新的途徑。
附圖說明
[0026]
圖1是 ghgpx5和ghgpx13 cds序列和所編碼氨基酸序列比對分析；圖1a顯示ghgpx5和ghgpx13的cds序列，僅存在七個位點的差異；圖1b顯示bghgpx5和ghgpx13所編碼的氨基酸僅存在三個位點差異；圖2是 ghgpx5/13蛋白的酶活性和氧化還原狀態(tài)分析；圖3a顯示高鹽脅迫誘導(dǎo)表達的標志基因gherf38的表達量在鹽脅迫處理8 h時上升到10倍以上，在鹽脅迫處理12 h時上升到15倍；圖3b顯示在鹽脅迫處理12 h時，ghgpx5/13的表達量升高到2.5倍；圖4a顯示在農(nóng)桿菌侵染7天后，作為陽性對照組的轉(zhuǎn)化trv::ghcla（trv::00）植株出現(xiàn)葉片白化的表型；圖4b顯示創(chuàng)制gpx5/13沉默的不同植株中g(shù)px5/13的表達水平；
圖3是鹽脅迫條件下gherf38和ghgpx5/13基因表達水平分析；圖4是 ghgpx5/13基因沉默植株中g(shù)hgpx5/13表達水平分析；圖4a顯示在農(nóng)桿菌侵染7天后，作為陽性對照組的轉(zhuǎn)化trv::ghcla（trv::00）植株出現(xiàn)葉片白化的表型；圖4b顯示創(chuàng)制gpx5/13沉默的不同植株中g(shù)px5/13的表達水平；圖5是鹽脅迫下棉花ghgpx5/13沉默植株（trv::gpx5/13）和正常植株（trv::00）表型對比；圖6是鹽脅迫下棉花ghgpx5/13沉默植株和正常植株表型，生理指標及酶活性分析；圖6a顯示ghgpx5和ghgpx13的共同沉默使葉片出現(xiàn)數(shù)量較多的黃斑，嚴重的部位呈現(xiàn)大面積的黃化現(xiàn)象；圖6b顯示高鹽處理后的葉片中棕褐沉積物明顯較對照組（h2o浸泡）的葉片中多，而且，trv::gpx5/13葉片出現(xiàn)大面積的棕褐部位，其染程度較trv::00更深；圖6c顯示高鹽脅迫造成trv::gpx5/13葉片中過量h2o2的積累；圖6d顯示高鹽處理后的葉片中藍沉積物明顯增多；圖6e顯示相對于trv::00葉片，trv::gpx5/13植株的葉片中藍部位明顯增多；圖6f顯示在高鹽處理條件下，葉片中h2o2和超氧陰離子的含量增加；圖6g顯示與trv::00相比，trv::gpx5/13葉片中h2o2和超氧陰離子的含量更高；圖6h顯示與trv::00相比，trv::gpx5/13葉片中積累了更多的mda；圖6i和圖6j顯示gpx5/13基因沉默導(dǎo)致葉片內(nèi)cat和sod的活性較trv::00葉片中酶活性更低；圖7是 ghgpx5和ghgpx13轉(zhuǎn)基因擬南芥表達水平分析和熒光檢測結(jié)果；圖7a顯示ghgpx5的表達量在2個不同株系中上調(diào)了約40倍；圖7b顯示ghgpx13的表達量在2個不同株系中上調(diào)了超過50倍；圖7c顯示在ghgpx5和ghgpx13轉(zhuǎn)基因植株的根部，均能檢測到gfp熒光；圖8是高鹽脅下過表達ghgpx5和ghgpx13擬南芥種子萌發(fā)率和幼苗生長狀況分析；圖8a顯示過表達ghgpx13的種子萌發(fā)率大于70%，而wt的種子萌發(fā)率不超過30%；圖8b顯示過表達ghgpx5和ghgpx13的萌發(fā)率超過90%，而wt的種子萌發(fā)率約為70%；圖8c顯示過表達ghgpx5的種子萌發(fā)率接近100%，過表達ghgpx13的萌發(fā)率約為90%，而wt的種子萌發(fā)率不到70%；圖8d顯示過表達ghgpx5的種子萌發(fā)率接近80%，過表達ghgpx13的萌發(fā)率約為60%，而wt的種子萌發(fā)率不到20%；圖8e顯示在不同濃度鹽處理條件下，過表達ghgpx5和ghgpx13的幼苗長勢明顯較wt好，表現(xiàn)為其生長相對于wt對高鹽脅迫不敏感；圖9是高鹽脅下過表達ghgpx5和ghgpx13擬南芥植株生長狀況分析。
具體實施方式
[0027]
下面將通過具體實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。提供這些實施例是為了能夠更透徹地理解本發(fā)明，并且能夠?qū)⒈景l(fā)明的范圍完整的傳達給本領(lǐng)域的技術(shù)人員。
[0028]
若未特別指明，實施例中所用技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。下述實施例中的試驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。如無特殊說明，所采用的試劑及材料，均可以通過商業(yè)途徑獲得。
[0029]
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0030]
除非另有說明，本發(fā)明的實施將使用本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的植物學(xué)常規(guī)技
術(shù)、微生物、組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、化學(xué)、生物化學(xué)、dna重組及生物信息學(xué)技術(shù)。這些技術(shù)均在已經(jīng)公開的文獻中進行了充分解釋，另外，本發(fā)明所采用的dna提取、系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建、基因編輯方法、基因編輯載體的構(gòu)建、基因編輯植物獲得等方法，除了下述實施例采用的方法外，采用現(xiàn)有文獻中已經(jīng)公開的方法均能實現(xiàn)。
[0031]
此處使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”術(shù)語意思是指包括分離的dna分子(例如，cdna或者基因組dna)，rna分子(例如，信使rna)，自然類型，突變類型，合成的dna或rna分子，核苷酸類似物組成的dna或rna分子，單鏈或是雙鏈結(jié)構(gòu)。這些核酸或多聚核苷酸包括基因編碼序列、反義序列及非編碼區(qū)的調(diào)控序列，但不僅限于此。這些術(shù)語包括一個基因。“基因”或“基因序列”廣泛用來指一有功能的dna核酸序列。因此，基因可能包括基因組序列中的內(nèi)含子和外顯子，和/或包括cdna中的編碼序列，和/或包括cdna及其調(diào)控序列。在特殊實施方案中，例如有關(guān)分離的核酸序列，優(yōu)先默認其為cdna。
[0032]
生物材料棉花tm-1種子為實驗室保存；擬南芥col-0種子為實驗室保存；原核表達載體pgex6p1；基因沉默載體空載體和陽性對照載體trv::ghcla為實驗室保存；過表達載體psuper-1300-gfp為實驗室保存；大腸桿菌dh5α和農(nóng)桿菌gv3101為實驗室保存；引物合成及測序，由鄭州擎科生物公司完成。
[0033]
實驗試劑rna提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購買自諾唯贊生物科技有限公司；nacl等常用試劑購買自索萊寶公司；潮霉素購買自索萊寶生物公司；ms培養(yǎng)基購買自北京酷來搏科技有限公司；各種核酸內(nèi)切酶購買自莫納生物科技有限公司；一步克隆酶購買自諾唯贊生物科技有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購買自北京天根生物技術(shù)有限公司。
[0034]
實驗設(shè)備pcr儀購買自bio-rad公司；制冷離心機購買自eppendorf公司；定量pcr儀購買自bio-rad公司；激光共聚焦顯微鏡購買自蔡司公司；高溫高壓滅菌器mls-3750購買自日本三洋公司；核酸檢測儀nanodrop 2000c購買自thermo scientific公司；常溫離心機、酶標儀spectramax id5購買自thermo scientific公司。
[0035]
實施例1 ghgpx5/13基因的克隆及其氨基酸序列分析提取生長15天的陸地棉tm-1的rna，以反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得的cdna為模板，由ncbi數(shù)據(jù)庫中獲得的基因序列經(jīng)primer premier5.0設(shè)計特異性引物經(jīng)過pcr反應(yīng)，分別克隆ghgpx5/13二個基因的編碼序列，經(jīng)translate（https://www.expasy.org/resources/在線工具將核酸序列轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)序列。進一步地，利用dnaman軟件對ghgpx5/13基因序列和所
編碼蛋白質(zhì)序列進行比對。
[0036]
結(jié)果表明，棉花谷胱甘肽過氧化物酶ghgpx5/13基因的編碼序列，均包含702 bp堿基。所編碼的蛋白均包括233個氨基酸。ghgpx5和ghgpx13的cds序列，僅存在七個位點的差異（圖1a），所編碼的氨基酸僅存在三個位點差異（圖1b），同源性較高。
[0037]
實施例2 表達載體pgex6p1-ghgpx5/13的構(gòu)建為了探究ghgpx5/13蛋白的特性，發(fā)明人分別構(gòu)建了原核表達載體pgex6p1-ghgpx5/13，具體過程簡要介紹如下。
[0038]
首先，設(shè)計帶有限制性內(nèi)切酶ecor
?ⅰ
酶切位點的的引物，序列如下:6p1-x5-f：5'-gggatccccggaattcatgctcgttcgacgaaat-3'6p1-x5-r：5'-gtcgacccgggaattcgccaagcagtttctttat-3'6p1-x13-f：5'-gggatccccggaattcatgctcgttcgacgaaatct-3'6p1-x13-r：5'-gtcgacccgggaattccgtatccactcccaatgctt-3'然后，以實例1制備的cdna樣品為模板，進行pcr擴增，并純化回收擴增產(chǎn)物；第三，對pgex6p1載體采用ecor
?ⅰ
進行單酶切，對酶切產(chǎn)物進行純化。
[0039]
第四，把pcr擴增產(chǎn)物和酶切后的載體進行同源重組連接，構(gòu)建6p1-ghgpx5/13表達載體；第五，采用熱激轉(zhuǎn)化法，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，進行a（氨芐霉素，50 μg/ml）抗性篩選，選擇陽性菌落進行pcr檢測，對pcr檢測鑒定正確菌落進行擴增、送測序，測序正確的菌液提取質(zhì)粒備用。
[0040]
第六，將所提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達感受態(tài)細胞rosette(de3)中，誘導(dǎo)gst-ghgpx5/13大量表達并進行純化，獲得ghgpx5/13蛋白。
[0041]
在h2o2存在的條件下，以trx為底物檢測純化的ghgpxs是否具有過氧化物酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ghgpx5/13具有過氧化物酶活性（圖2）。為了進一步分析ghgpx5/13是否具有氧化還原狀態(tài)的特征，以β-巰基乙醇（β-me），二硫蘇糖醇（dtt）和h2o2處理純化到的ghgpx5/13蛋白，通過聚丙烯酰氨凝膠電泳（sds-page）分析，發(fā)現(xiàn)具有過氧化物酶的ghgpx5/13均具有氧化還原狀態(tài)。
[0042]
實施例3 沉默ghgpx5/13基因驗證其在棉花鹽脅迫耐受性中的功能為了分析ghgpx5/13是否參與棉花響應(yīng)高鹽脅迫的過程，首先，分析了高鹽脅迫條件下ghgpx5/13的表達模式。以400 mm nacl溶液浸泡生長18天的野生型棉花植株tm-1，分別于0 h，2 h，4 h，8 h，12 h和24 h對葉片進行取樣，通過實時熒光定量pcr（qrt-pcr）檢測ghgpx5/13（ghgpx5/13的同源性較高，根據(jù)其保守序列設(shè)計一對引物能同時檢測二個基因的表達水平）的表達水平。
[0043]
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高鹽脅迫誘導(dǎo)表達的標志基因gherf38的表達量在鹽脅迫處理8 h時上升到10倍以上，在鹽脅迫處理12 h時上升到15倍（圖3a），表明棉花幼苗確實受到高鹽脅迫的處理；在鹽脅迫處理12 h時，ghgpx5/13的表達量升高到2.5倍（圖3b）。這一結(jié)果暗示，ghgpx5/13可能參與調(diào)節(jié)棉花對高鹽脅迫的響應(yīng)過程。
[0044]
為了深入研究ghgpx5/13在陸地棉對高鹽響應(yīng)中的功能，針對ghgpx5/13的保守區(qū)域，利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing, vigs）體系，發(fā)明人構(gòu)建了ghgpx5/13的基因沉默載體trv2-gpx5/13，獲得了gpx5/13沉默的棉花植株（ghgpx5/13的
同源性較高，構(gòu)建的trv2-gpx5/13載體能同時沉默二個基因。）。具體過程簡要介紹如下。
[0045]
第一，設(shè)計帶有限制性內(nèi)切酶ecor
?ⅰ
和kpn
?ⅰ
酶切位點的的引物，序列如下：trv2-gpx5/13-f：gtgagtaaggttaccgaattcgagtcctccaaggggtcagtttrv2-gpx5/13-r：gagacgcgtgagctcggtaccacctttgctagccttcaggaa第一，以實例1制備的cdna樣品為模板，進行pcr擴增，并純化回收擴增產(chǎn)物；第三，對trv2載體采用ecor
?ⅰ
和kpn
?ⅰ
進行雙酶切，對酶切產(chǎn)物進行純化；第四，把pcr擴增產(chǎn)物和酶切后的載體進行同源重組連接，構(gòu)建trv2-ghgpx5/13表達載體；第五，采用熱激轉(zhuǎn)化法，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，進行k
+
（卡那霉素，50 μg/ml）抗性篩選，選擇陽性菌落進行pcr檢測，對pcr檢測鑒定正確菌落進行擴增、送測序，測序正確的菌液提取質(zhì)粒備用。
[0046]
第六，將所提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞gv3101中，-80℃保存?zhèn)溆谩?br/>[0047]
第七，利用農(nóng)桿菌侵染棉花葉片的方法將含有trv2-gpx5/13、trv2、trv-cla、trv1的農(nóng)桿菌注射棉花葉片，獲得gpx5/13沉默的植株。
[0048]
結(jié)果顯示在農(nóng)桿菌侵染7天后，作為陽性對照組的轉(zhuǎn)化trv::ghcla（trv::00）植株出現(xiàn)葉片白化的表型（圖4a），表明基因沉默體系發(fā)揮了作用。通過qrt-pcr實驗檢測vigs體系創(chuàng)制gpx5/13沉默的不同植株中g(shù)px5/13的表達水平，結(jié)果顯示，所檢測的6株棉花幼苗中，1、2、3和6號植株的gpx5/13的表達水平為對照組的1/5，而3和4號植株中g(shù)px5/13的表達水平僅為對照組的1/10（圖4b），這些結(jié)果表明，成功創(chuàng)制了gpx5/13沉默植株。
[0049]
在前述實例4結(jié)果分析基礎(chǔ)上，用含有400 mm nacl的水溶液處理基因沉默植株trv::gpx5/13和trv::00，處理8天后trv::00植株葉片仍為綠，而trv::gpx5/13植株葉片萎蔫嚴重（圖5）。這一結(jié)果表明表明ghgpx5/13正調(diào)控棉花對高鹽脅迫的耐受性。
[0050]
在前述結(jié)果分析基礎(chǔ)上，將創(chuàng)制的基因沉默植株trv::gpx5/13和trv::00的第二片真葉分別浸泡在h2o和含有400 mm nacl的水溶液中，24 h后水中浸泡的葉片仍為綠，而高鹽溶液中浸泡的葉片出現(xiàn)了不同程度的黃斑，表現(xiàn)為trv::00葉片出現(xiàn)少數(shù)黃斑，而trv::gpx5/13葉片上出現(xiàn)數(shù)量較多的黃斑，嚴重的部位呈現(xiàn)大面積的黃化現(xiàn)象（圖6a）。這表明ghgpx5和ghgpx13的共同沉默使葉片的耐受高鹽脅迫的能力顯著降低。
[0051]
為了分析高鹽脅迫下trv::gpx5/13和trv::00植株葉片內(nèi)活性氧的水平，對高鹽處理12 h后trv::gpx5/13和trv::00的第二片真葉進行dab（3,3-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽）染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高鹽處理后的葉片中棕褐沉積物明顯較對照組（h2o浸泡）的葉片中多，而且，trv::gpx5/13葉片出現(xiàn)大面積的棕褐部位，其染程度較trv::00更深（圖6b），表明高鹽脅迫下trv::gpx5/13葉片積累更多的h2o2。
[0052]
以image j分別取不同葉片的相同部位，對葉片染程度的定量結(jié)果也表明高鹽脅迫造成trv::gpx5/13葉片中過量h2o2的積累（圖6c）。此外，以nbt（氯化硝基四氮唑藍）染分析葉片中超氧陰離子的積累量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高鹽處理后的葉片中藍沉積物明顯增多（圖6d），而相對于trv::00葉片，trv::gpx5/13植株的葉片中藍部位明顯增多，對染部位定量分析也驗證了這一結(jié)果（圖6e）。這些結(jié)果表明，gpx5/13三個基因的沉默導(dǎo)致高鹽處理下trv::gpx5/13植株積累更多的活性氧，從而對葉片造成更多的損害，表現(xiàn)為葉片黃化程度較深，對高鹽處理更為敏感。
[0053]
為了分析高鹽處理下葉片中trv::gpx5/13和trv::00植株葉片中h2o2和超氧陰離子的水平，我們檢測了高鹽脅迫下h2o2和超氧陰離子的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高鹽處理條件下，葉片中h2o2和超氧陰離子的含量增加，而與trv::00相比，trv::gpx5/13葉片中h2o2和超氧陰離子的含量更高（圖6f，g），這一結(jié)果與dab和nbt染的結(jié)果一致。
[0054]
為了進一步分析高鹽脅迫下細胞內(nèi)活性氧的水平，我們檢測了葉片中丙二醛（mda）的含量，結(jié)果顯示，高鹽脅迫導(dǎo)致葉片中積累較多的mda，而與trv::00相比，trv::gpx5/13葉片中積累了更多的mda（圖6h）。mda是衡量氧化脅迫程度的常用指標之一，能反映植物膜脂過氧化的程度，mda的過量積累，表明在高鹽脅迫條件下，gpx5/13基因沉默導(dǎo)致葉片細胞膜脂過氧化程度更高。此外，為了分析其它清除活性氧的酶對細胞內(nèi)活性氧水平的影響，我們分別檢測了葉片中過氧化氫酶（cat）和超氧化物歧化酶（sod）的活性。結(jié)果表明，與對照組相比，高鹽處理降低了cat和sod的活性，而且，gpx5/13基因沉默導(dǎo)致葉片內(nèi)cat和sod的活性較trv::00葉片中酶活性更低（圖6i，j）。這一結(jié)果表明，高鹽脅迫條件下，trv::gpx5/13葉片積累過量的活性氧，一方面是由于gpx5/13表達量下調(diào)導(dǎo)致，另一方面是由于葉片中cat和sod的活性降低造成的。
[0055]
實施例4 過表達擬南芥驗證ghgpx5/13基因在擬南芥鹽脅迫耐受性中的功能為了進一步分析gpx5/13的功能，發(fā)明人分別構(gòu)建了gpx5/13的過表達載體p35s-ghgpx5-gfp和p35s-ghgpx13-gfp，獲得了過表達擬南芥植株。具體過程簡要介紹如下。
[0056]
第一首先，設(shè)計帶有限制性內(nèi)切酶sal
?ⅰ
酶切位點的的引物，序列如下：1300-gpx5-f：5'
??
ggggcccggggtcgacatgctcgttcgacgaaat-3'1300-gpx5-r：5'
??
gtatttaaatgtcgacggccaagcagtttctttat-3'1300-gpx13-f：5'
??
ggggcccggggtcgacatgctcgttcgacgaaatct-3'1300-gpx13-r：5'
??
gtatttaaatgtcgacggccaagcagtttctttatat-3'然后，以實例1制備的cdna樣品為模板，進行pcr擴增，并純化回收擴增產(chǎn)物；第三，對1300-gfp載體采用sal
?ⅰ
進行單酶切，對酶切產(chǎn)物進行純化。
[0057]
第四，把pcr擴增產(chǎn)物和酶切后的載體進行同源重組連接，構(gòu)建1300-ghgpx5/13過表達載體；第五，采用熱激轉(zhuǎn)化法，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，進行k
+
（卡那霉素，50 μg/ml）抗性篩選，選擇陽性菌落進行pcr檢測，對pcr檢測鑒定正確菌落進行擴增、送測序，測序正確的菌液提取質(zhì)粒備用。
[0058]
第六，將所提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞gv3101中，-80℃保存?zhèn)溆谩?br/>[0059]
第七，利用農(nóng)桿菌花序侵染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥（clo-0，wt），將收獲的種子在含有潮霉素的ms培養(yǎng)基上篩選，對潛在的轉(zhuǎn)基因植株單株收獲種子，再次在含有潮霉素的培養(yǎng)基上篩選，直至t3代篩選獲得潛在的純合轉(zhuǎn)基因植株。
[0060]
利用qrt-pcr分別分析潛在轉(zhuǎn)基因植株中g(shù)hgpx5和ghgpx13的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ghgpx5潛在轉(zhuǎn)基因植株中，在ghgpx5潛在轉(zhuǎn)基因植株中，ghgpx5的表達量在2個不同株系中上調(diào)了約40倍（圖7a），在ghgpx13潛在轉(zhuǎn)基因植株中，ghgpx13的表達量在2個不同株系中上調(diào)了超過50倍（圖7b）。通過激光共聚焦顯微鏡觀察過表達擬南芥根部gfp熒光，結(jié)果表明，所篩選到的ghgpx5和ghgpx13轉(zhuǎn)基因植株的根部，均能檢測到gfp熒光（圖7c）。這些結(jié)果表明，所構(gòu)建的ghgpx5和ghgpx13轉(zhuǎn)基因擬南芥分別為ghgpx5-gfp和ghgpx13-gfp過表達
植株。
[0061]
高鹽脅迫能抑制種子的萌發(fā)，為了進一步分析ghgpx5和ghgpx13是否參與調(diào)控高鹽脅迫抑制種子萌發(fā)的過程，我們將wt、過表達ghgpx5和ghgpx13擬南芥種子分別播種在含有不同濃度nacl（0 mm、50 mm、100 mm和150 mm）的ms培養(yǎng)基上，在4
°
c低溫處理3 d，然后放置于12h光照/12h黑暗的溫室（21
°
c）中，每間隔12 h于體式顯微鏡下統(tǒng)計種子的萌發(fā)情況。
[0062]
結(jié)果表明，在ms培養(yǎng)基上生長的過表達種子萌發(fā)率在24 h與36 h時明顯高于wt，表現(xiàn)為36 h時過表達ghgpx5的種子萌發(fā)率接近100%，過表達ghgpx13的種子萌發(fā)率大于70%，而wt的種子萌發(fā)率不超過30%（圖8a）；不同濃度的nacl處理明顯抑制了種子的萌發(fā)，而且，隨著ms培養(yǎng)基中nacl濃度升高，抑制種子萌發(fā)的效果更加顯著。在含有50 mm的ms培養(yǎng)基上生長36 h的種子，過表達ghgpx5和ghgpx13的萌發(fā)率超過70%，而wt的種子萌發(fā)率不到20%，生長60 h后，過表達ghgpx5和ghgpx13的萌發(fā)率超過90%，而wt的種子萌發(fā)率約為70%（圖8b）。
[0063]
在含有100 mm的ms培養(yǎng)基上生長48 h的種子，過表達ghgpx5和ghgpx13的萌發(fā)率超過60%，而wt的種子萌發(fā)率約為10%，生長72 h后，過表達ghgpx5的種子萌發(fā)率接近100%，過表達ghgpx13的萌發(fā)率約為90%，而wt的種子萌發(fā)率不到70%（圖8c）；在含有150 mm的ms培養(yǎng)基上生長60 h的種子，過表達ghgpx5和ghgpx13的萌發(fā)率約為30%，而wt的種子萌發(fā)率約為5%，生長72 h后，過表達ghgpx5的種子萌發(fā)率接近80%，過表達ghgpx13的萌發(fā)率約為60%，而wt的種子萌發(fā)率不到20%（圖8d）。
[0064]
這些結(jié)果表明，在擬南芥中過表達ghgpx5和ghgpx13可以促進高鹽脅迫下種子的萌發(fā)。觀察生長8天后的種子發(fā)現(xiàn)，在不同濃度鹽處理條件下，過表達ghgpx5和ghgpx13的幼苗長勢明顯較wt好，表現(xiàn)為其生長相對于wt對高鹽脅迫不敏感（圖8e）。
[0065]
此外，用含有200 mm nacl的水溶液處理生長25天的擬南芥wt和過表達ghgpx5和ghgpx13轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高鹽脅迫7天后，在對照組中（不含nacl的水處理），過表達ghgpx5和ghgpx13轉(zhuǎn)基因植株與wt沒有明顯的區(qū)別，而高鹽脅迫明顯抑制了過表達ghgpx5和ghgpx13轉(zhuǎn)基因植株和wt的生長，表現(xiàn)出較小的蓮座葉，而且，wt的葉片出現(xiàn)明顯的黃化現(xiàn)象，與wt相比較，過表達ghgpx5和ghgpx13轉(zhuǎn)基因植株未出現(xiàn)黃化的葉片（圖9），表現(xiàn)出了更強的高鹽耐受性。
[0066]
綜上，沉默ghgpx5/13基因后棉花的鹽脅迫耐受性降低，表明ghgpx5/13基因正調(diào)控棉花對高鹽脅迫的耐受性；而過表達擬南芥后其鹽脅迫耐受性提高，同樣表明，ghgpx5/13基因正調(diào)控擬南芥對高鹽脅迫的耐受性。可見，ghgpx5/13基因在調(diào)控植物高鹽脅迫方面起著重要的作用，對于培育能夠抵御外界脅迫條件的棉花品種具有重要的意義。
[0067]
以上所述之實施例，只是本發(fā)明的較佳實施例而已，僅僅用以解釋本發(fā)明，并非限制本發(fā)明實施范圍，對于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，當(dāng)然可根據(jù)本說明書中所公開的技術(shù)內(nèi)容，通過置換或改變的方式輕易做出其它的實施方式，故凡在本發(fā)明的原理上所作的變化和改進等，均應(yīng)包括于本發(fā)明申請專利范圍內(nèi)。
技術(shù)特征：
1.ghgpx5和ghgpx13基因在提高植物鹽脅迫耐受性中的應(yīng)用，其特征在于，所述ghgpx5和ghgpx13基因在ncbi中基因序列號分別為xm_041083558.1和xm_016881552.2。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述鹽脅迫耐受性為高濃度鹽脅迫耐受性，所述高濃度鹽濃度為400 mm。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，通過構(gòu)建ghgpx5和ghgpx13過表達載體，獲得鹽脅迫耐受性高的轉(zhuǎn)基因植株。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為棉花或擬南芥。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述鹽脅迫耐受性表現(xiàn)為：在鹽脅迫下，ghgpx5和ghgpx13基因沉默株系的葉片萎蔫程度和黃化程度均高于野生型，而ghgpx5和ghgpx13過表達株系的種子萌發(fā)率高于野生型，葉片的黃化程度低于野生型。6.一種植物育種方法，其特征在于，所述方法為以下（1）或（2）或（3）：（1）通過增加目的植物中g(shù)hgpx5和ghgpx13蛋白的活性，獲得鹽脅迫耐受性強于目的植物的植株；（2）通過促進目的植物中g(shù)hgpx5和ghgpx13基因的表達，獲得鹽脅迫耐受性強于目的植物的植株；（3）通過抑制目的植物中的ghgpx5和ghgpx13基因的表達，獲得鹽脅迫耐受性低于目的植物的植株；所述ghgpx5和ghgpx13基因在ncbi中基因序列號分別為xm_041083558.1和xm_016881552.2。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的植物育種方法，其特征在于，所述目的植物為棉花或擬南芥。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的植物育種方法，其特征在于，調(diào)控目的植物中g(shù)hgpx5和ghgpx13基因的表達的方式為過表達、沉默或定向突變ghgpx5和ghgpx13基因。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的植物育種方法，其特征在于，改變基因表達水平包括利用dna同源重組技術(shù)、病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)調(diào)控所述ghgpx5和ghgpx13表達水平，獲得轉(zhuǎn)基因植物株系。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種GhGPX5和GhGPX13基因在提高植物鹽脅迫耐受性中的應(yīng)用，所述GhGPX5和GhGPX13基因在CBI中基因序列號分別為XM_041083558.1和XM_016881552.2。本發(fā)明通過基因沉默方式獲得GhGPX5/13沉默的植株，結(jié)果表明基因沉默植株在高鹽脅迫下葉片萎蔫嚴重，黃化現(xiàn)象嚴重，表明其對高鹽處理更為敏感。接著構(gòu)建GhGPX5/13的過表達載體p35S-GhGPX5-GFP和p35S-GhGPX13-GFP，利用農(nóng)桿菌花序侵染法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥（Clo-0，WT），獲得過表達植株，分析結(jié)果表明在高鹽脅迫下，相對于野生型，GhGPX5/13能夠提高種子萌發(fā)率，增強擬南芥幼苗鹽脅迫耐受性，從而為作物耐鹽分子育種提供了基因資源。了基因資源。了基因資源。
