大黃魚、小黃魚及其制品數字PCR鑒偽方法與流程
大黃魚、小黃魚及其制品數字pcr鑒偽方法
技術領域
1.本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及大黃魚、小黃魚及其制品數字pcr鑒偽方法。
背景技術：
2.大黃魚(larimichthys crocea)和小黃魚(larimichthys polyactis)統稱為黃魚，又名黃花魚，是我國重要的海產經濟魚類，在沿海海域均有分布，因口味鮮美、營養豐富，深受消費者所喜愛。
3.然而，全球范圍內海產魚類市場錯標虛標、摻假的現象非常普遍，位列食品摻假的首位。歸結其原因，一方面是因為魚類品種繁多，部分種類形態相近、組織結構相似，難以分辨識別，導致錯標虛標現象時有發生；另一方面，由于魚類品質不同，價格差異較大，不法商販在利益驅動下故意以品質價格較低的魚類假冒偽劣、摻假混雜。近年來，關于“染黃魚”、假冒黃魚的事件時常曝出。在冰鮮魚銷售方面，與大、小黃魚體型外觀近似的黃姑魚、白姑魚、三牙魚等是常用的替代品，電子商城、網絡銷售平臺同一產品標注黃魚、黃花魚、黃姑魚等現象也屢見不鮮，為了澤外觀上更加相近，甚至使用具有致癌風險的黃偶氮染料如堿性黃、堿性橙等進行染。另外，在魚類深加工制品方面，如魚片、魚糜、魚丸、魚香腸、魚排、魚干、魚翅、魚肚、魚罐頭等，由于不具備原有外觀特征及組織結構形態，更是假冒偽劣的重災區。由此可見，包括大、小黃魚在內的魚類摻假現象，不僅擾亂市場秩序，影響社會形象，損害消費者合法權益，而且存在潛在的食用安全隱患，迫切需要實施市場監管，打擊不法行為。因此，開發準確可靠的魚源性成分鑒別技術具有重要意義。
4.目前，魚類產品真假鑒別方法主要有形態觀測法、波譜分析法、蛋白分析法以及分子生物學法等，其中，以遺傳物質dna為分析對象的分子生物學法是最為理想的方案也是魚類真假鑒別最常用的方法，這是由于dna分子具有高度的穩定性和物種特異性，相對于其他方法而言受外界影響因素較小。當前，在分子生物學pcr分析技術中，數字pcr技術因具有絕對定量的性能，被視為新一代pcr技術,在食品摻假比例分析中具有更大優勢。
5.食品質量與安全一直是社會關注的焦點。目前國內外，對于食品質量與安全尚未有有效的、高可信度的大、小黃魚及其制品成分真實性檢測方法。為了整治黃魚類產品摻假摻雜、假冒偽劣的現象，維護消費者權益，確保食品安全，開發準確可靠的大、小黃魚及其制品真偽鑒定方法至關重要。
技術實現要素：
6.本發明的目的是針對現有技術存在的不足，提供一種大黃魚、小黃魚及其制品數字pcr鑒偽方法。數字pcr具有絕對定量能力，無需借助標準品直接獲得樣品中目標基因的拷貝數。本發明為大、小黃魚及其制品真實性鑒別提供了新方法。
7.為實現上述目的，本發明大黃魚、小黃魚及其制品數字pcr鑒偽方法，通過數字pcr技術對大黃魚、小黃魚成分進行檢測，包括以下步驟：
8.s1、分別針對大黃魚、小黃魚線粒體細胞素b(cytb)保守序列片段設計上游引物、下游引物和探針；
9.s2、樣本dna提取：選取樣本后，經剪碎或研磨、混合均勻后，采用ctab法進行dna提取，或采用試劑盒進行抽提；
10.s3、采用數字pcr反應體系，其總量為20μl，反應體系使用70μl微滴生成油借助微滴生成儀生成微滴，轉移至96孔板密封后進行擴增，其中數字pcr擴增參數如下：
11.第一步：95℃變性5min；
12.第二步：94℃變性30s，60℃退火/延伸60s，循環40次；
13.第三步：98℃變性10min，4℃保存，轉移到微滴讀取儀中，選擇相應的熒光通道進行讀??；
14.s4、結果判別：根據體系中陰性擴增體系終點熒光值設定熒光的閾限值；閾限值需明確區分擴增體系中的陰性微滴和陽性微滴，若樣品擴增終點熒光信號超過閾限值，則表明目標成分檢出；若樣品擴增終點熒光信號低于閾限值，則表明目標成分未檢出。
15.作為上述方案的進一步地改進，所述步驟s1中的引物及探針序列如下所示：
16.大黃魚cytb基因：
17.上游引物：5＇-ggcctgaactcggatataga-3＇；
18.下游引物：5＇-aagagagctagggtggtaag-3＇；
19.探針：5＇-agaccttctaggctttgcaatcctca-3＇；
20.小黃魚cytb基因：
21.上游引物：5＇-tcatccgttgcacacatc-3＇；
22.下游引物：5＇-tggaggtagaggcagataaa-3＇；
23.探針：5＇-tgactcatccgaaaccttcatgccaa-3＇。
24.作為上述方案的進一步地改進，所述步驟s3中的總量為20μl體系組成包括：數字pcr反應液dd pcr supermix for probes(no dutp)10μl，濃度為20μmol的大黃魚、小黃魚線粒體細胞素b(cytb)兩種上游引物各0.9μl，濃度為20μmol的兩種下游引物各0.9μl，濃度為10μmol的兩種探針各0.5μl，加入模板dna1-3μl，補充ddh2o至20μl。
25.作為上述方案的進一步地改進，所述5＇端為fam、hex/vic兩組中各選其中1組進行標記，3＇端使用bhq1或bhq2標記。
26.本發明的有益效果為：這種大黃魚、小黃魚及其制品數字pcr鑒偽方法采用多重熒光定量pcr鑒別方法，針對大黃魚、小黃魚保守dna序列片段以及魚類通用內參基因設計引物和taqman探針，通過使用相應的引物和相應的標記有不同熒光信號的探針，在同一個反應體系中實現大黃魚、小黃魚兩種成分同時檢測，具有通量高的優勢；數字pcr由于具有絕對定量能力，所有無需標準品直接獲得樣品中目標基因的拷貝數。
附圖說明
27.圖1是本發明實施例黃姑魚陰性對照擴增體系微滴分散圖；
28.圖2是本發明實施例中大、小黃魚dna混合樣本擴增體系微滴分散圖；
29.圖3是本發明實施例中大、小黃魚dna混合樣本樣本二維散點圖；
30.圖4是本發明實施例中大、小黃魚魚糜制品樣本擴增體系微滴分散圖；
31.圖5是本發明實施例中大、小黃魚魚糜制品樣本二維散點圖；
32.其中：ch1為大黃魚cytb，ch2為小黃魚cytb。
具體實施方式
33.為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合本發明實施例的附圖，對本發明實施例的技術方案進行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實施例是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基于所描述的本發明的實施例，本領域普通技術人員所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
34.實施例1
35.大黃魚、小黃魚及其制品數字pcr鑒偽方法，通過數字pcr技術對大黃魚、小黃魚成分進行檢測，包括以下步驟：
36.s1、分別針對大黃魚、小黃魚線粒體細胞素b(cytb)保守序列片段設計上游引物、下游引物和探針，引物及探針序列如下所示：
37.大黃魚cytb基因：
38.上游引物：5＇-ggcctgaactcggatataga-3＇；
39.下游引物：5＇-aagagagctagggtggtaag-3＇；
40.探針：5＇-agaccttctaggctttgcaatcctca-3＇；
41.小黃魚cytb基因：
42.上游引物：5＇-tcatccgttgcacacatc-3＇；
43.下游引物：5＇-tggaggtagaggcagataaa-3＇；
44.探針：5＇-tgactcatccgaaaccttcatgccaa-3＇；
45.大黃魚、小黃魚線粒體細胞素b(cytb)所用探針5＇分別用fam、vic標記，3＇端分別用bhq1標記。
46.s2、選取樣本后，經剪碎或研磨、混合均勻后，采用ctab法進行dna提取，或采用試劑盒進行抽提；
47.s3、數字pcr反應體系總量為20μl，包括：數字pcr反應液dd pcr supermix for probes(no dutp)10μl，濃度為20μmol的大黃魚、小黃魚線粒體細胞素b(cyt b)兩種上游引物各0.9μl，濃度為20μmol的兩種下游引物各0.9μl，濃度為10μmol的兩種探針各0.5μl，加入模板dna1-3μl，補充ddh2o至20μl。每反應體系使用70μl微滴生成油借助微滴生成儀生成微滴，轉移至96孔板密封后進行擴增。數字pcr擴增參數：第一步：95℃變性5min；第二步：94℃變性30s，60℃退火/延伸60s，循環40次；第三步：98℃變性10min，4℃保存。轉移到微滴讀取儀中，選擇相應的熒光通道進行讀?。?br/>48.s4、結果判別：根據體系中陰性擴增體系終點熒光值設定熒光的閾限值；閾限值需明確區分擴增體系中的陰性微滴和陽性微滴，若樣品擴增終點熒光信號超過閾限值，則表明目標成分檢出；若樣品擴增終點熒光信號低于閾限值，則表明目標成分未檢出。
49.實施例2
50.利用海洋動物組織提取試劑盒分別提取大黃魚、小黃魚、黃姑魚dna，將大、小黃魚dna按比例稀釋混合，按本發明所提供的數字pcr方法進行擴增，所用反應體系包括：數字pcr反應液dd pcr supermix for probes(no dutp)10μl，濃度為20μmol的大黃魚、小黃魚
線粒體細胞素b(cytb)兩種上游引物各0.9μl，濃度為20μmol的兩種下游引物各0.9μl，濃度為10μmol的兩種探針各0.5μl，加入模板dna 2μl，補充ddh2o至20μl。同時，以黃姑魚dna設置陰性對照。每個反應體系使用70μl微滴生成油借助微滴生成儀生成微滴，轉移至96孔板密封后進行擴增。數字pcr擴增參數：第一步：95℃變性5min；第二步：94℃變性30s，60℃退火/延伸60s，循環40次；第三步：98℃變性10min，4℃保存。轉移到微滴讀取儀中，選擇相應的熒光通道進行讀取。其中，圖1為黃姑魚陰性對照擴增體系微滴分散圖，圖2為大、小黃魚dna混合樣本擴增體系微滴分散圖，圖3為大、小黃魚dna混合樣本二維散點圖。
51.圖1可以看出陰性擴增體系兩個熒光通道終點熒光值僅有一條區帶且信號較低；而圖2樣本擴增體系中兩個熒光通道各有兩條區帶，其中熒光信號低的區帶為陰性微滴，熒光信號低的區帶為陽性微滴，表明兩通道結果均為檢出，即檢出大黃魚和小黃魚成分,根據樣本微滴數分析，在10255個微滴中，大黃魚微滴數為7128、小黃魚微滴數為3816；圖3二維散點圖中，則進一步顯示樣本微滴分布即微滴中包含兩種信號的微滴個數為2687，僅包含大黃魚熒光信號微滴個數為4441，僅包含大黃魚熒光信號微滴個數為1129，不含有熒光信號的微滴個數為1998。
52.實施例3
53.取隨機混合的大、小黃魚魚糜制品，按照ctab法進行提取dna，稀釋100倍，按本發明所提供的數字pcr方法進行擴增，所用反應體系包括：數字pcr反應液dd pcr supermix for probes(no dutp)10μl，濃度為20μmol的大黃魚、小黃魚線粒體細胞素b(cytb)兩種上游引物各0.9μl，濃度為20μmol的兩種下游引物各0.9μl，濃度為10μmol的兩種探針各0.5μl，加入模板dna 2μl，補充ddh2o至20μl。每個反應體系使用70μl微滴生成油借助微滴生成儀生成微滴，轉移至96孔板密封后進行擴增。數字pcr擴增參數：第一步：95℃變性5min；第二步：94℃變性30s，60℃退火/延伸60s，循環40次；第三步：98℃變性10min，4℃保存。轉移到微滴讀取儀中，選擇相應的熒光通道進行讀取。其中，圖4為大、小黃魚魚糜制品樣本擴增體系微滴分散圖，圖5為大、小黃魚魚糜制品樣本二維散點圖。
54.圖4大、小黃魚魚糜制品樣本擴增體系中兩個熒光通道各有兩條區帶，其中熒光信號低的區帶為陰性微滴，熒光信號低的區帶為陽性微滴，表明兩通道結果均為檢出，即檢出大黃魚和小黃魚成分,根據樣本微滴數分析，在14693個微滴中，大黃魚微滴數為1683、小黃魚微滴數為1445；圖5大、小黃魚魚糜制品樣本二維散點圖中，則進一步顯示樣本微滴分布即微滴中包含兩種信號的微滴個數為246，僅包含大黃魚熒光信號微滴個數為1437，僅包含大黃魚熒光信號微滴個數為1199，不含有熒光信號的微滴個數為11811。
55.以上所述實施例而已并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
技術特征：
1.大黃魚、小黃魚及其制品數字pcr鑒偽方法，其特征在于：通過數字pcr技術對大黃魚、小黃魚成分進行檢測，包括以下步驟：s1、分別針對大黃魚、小黃魚線粒體細胞素b(cytb)保守序列片段設計上游引物、下游引物和探針；s2、樣本dna提取：選取樣本后，經剪碎或研磨、混合均勻后，采用ctab法進行dna提取，或采用試劑盒進行抽提；s3、采用數字pcr反應體系，其總量為20μl，反應體系使用70μl微滴生成油借助微滴生成儀生成微滴，轉移至96孔板密封后進行擴增，其中數字pcr擴增參數如下：第一步：95℃變性5min；第二步：94℃變性30s，60℃退火/延伸60s，循環40次；第三步：98℃變性10min，4℃保存，轉移到微滴讀取儀中，選擇相應的熒光通道進行讀??；s4、結果判別：根據體系中陰性擴增體系終點熒光值設定熒光的閾限值；閾限值需明確區分擴增體系中的陰性微滴和陽性微滴，若樣品擴增終點熒光信號超過閾限值，則表明目標成分檢出；若樣品擴增終點熒光信號低于閾限值，則表明目標成分未檢出。2.根據權利要求1所述的一種大黃魚、小黃魚及其制品數字pcr鑒偽方法，其特征在于：所述步驟s1中的引物及探針序列如下所示：大黃魚cytb基因：上游引物：5＇-ggcctgaactcggatataga-3＇；下游引物：5＇-aagagagctagggtggtaag-3＇；探針：5＇-agaccttctaggctttgcaatcctca-3＇；小黃魚cytb基因：上游引物：5＇-tcatccgttgcacacatc-3＇；下游引物：5＇-tggaggtagaggcagataaa-3＇；探針：5＇-tgactcatccgaaaccttcatgccaa-3＇。3.根據權利要求1所述的大黃魚、小黃魚及其制品數字pcr鑒偽方法，其特征在于：所述步驟s3中的總量為20μl體系組成包括：數字pcr反應液dd pcr supermix for probes(no dutp)10μl，濃度為20μmol的大黃魚、小黃魚線粒體細胞素b(cytb)兩種上游引物各0.9μl，濃度為20μmol的兩種下游引物各0.9μl，濃度為10μmol的兩種探針各0.5μl，加入模板dna1-3μl，補充ddh2o至20μl。4.根據權利要求2所述的大黃魚、小黃魚及其制品數字pcr鑒偽方法，其特征在于：所述5＇端為fam、hex/vic兩組中各選其中1組進行標記，3＇端使用bhq1或bhq2標記。
技術總結
本發明公開了大黃魚、小黃魚及其制品數字PCR鑒偽方法，利用數字PCR技術對大黃魚、小黃魚成分進行檢測，包括如下步驟：(1)大黃魚、小黃魚以及魚類內參基因引物及其熒光探針設計與修飾；(2)樣品DA提取；(3)數字PCR反應體系配制、微滴生成、擴增參數設置以及微滴讀取；(4)數字PCR結果判別。本發明為大黃魚、小黃魚及其制品魚源性成分真偽識別提供準確可靠的分析方法，能夠實現大黃魚、小黃魚兩種成分同時快速檢出，數字PCR具有絕對定量能力，可以不借助標準品直接獲得樣品中目標基因的拷貝數。借助標準品直接獲得樣品中目標基因的拷貝數。借助標準品直接獲得樣品中目標基因的拷貝數。
