一種互穿網絡結構交聯透明質酸或其鹽凝膠及其制備方法與流程
1.本發明屬于生物材料技術領域，具體涉及一種具有互穿網絡結構的交聯透明質酸或其鹽凝膠及其制備方法。
背景技術：
2.透明質酸是一種天然粘多糖，由(1-β-4)d-葡糖醛酸和(1-β-3)n-乙酰基-d-氨基葡糖雙糖單位重復連接而成，是人和動物皮膚、玻璃體、關節潤滑液和軟骨組織的重要成分，透明質酸鈉在人體內具有多種作用，包括：空間填充、水合作用、關節潤滑、以及提供細胞可以通過其遷移的基質，雖然透明質酸的優點眾多，但是天然的透明質酸力學性能薄弱、在體內容易被降解等性質限制了其在生物材料方面的應用。交聯透明質酸鈉是透明質酸鈉通過化學交聯修飾得到的高分子凝膠，彌補了天然透明質酸鈉存留時間短的缺點，現有技術中，往往采用多次交聯來改善透明質酸鈉的粘滯性、內聚性以及吸水性等性能。但是，二次交聯制備工藝復雜，操作不夠簡便，且兩次交聯均需要加入交聯劑，可能會造成交聯劑殘留，影響其安全性。另外，多次交聯往往需要將透明質酸鈉的分子量控制在適宜的范圍內才能得到高粘滯性、高內聚性、低吸水性的凝膠，因而制備工藝的批間穩定性較差，實現產業化的難度則較高。因此，現有技術不能兼顧透明質酸凝膠制備工藝簡單，安全性好，粘滯性強，內聚性高，吸水率低等產業化需求。
3.現有技術有加入水溶性纖維素對交聯透明質酸鈉進行改性的方案，如專利cn102492180b是將透明質酸鈉(ha)與羥丙基甲基纖維素(hpmc)物理混合，利用hpmc填補ha凝膠顆粒間的間隙，其游離于透明質酸鈉凝膠顆粒與顆粒之間，阻止透明質酸酶的進入，減少ha降解，但是該方案中hpmc是在交聯ha凝膠形成后加入進去的，hpmc穿插到ha網格內部的難度很大，穿插到ha三維網絡結構內部的效果有限，hpmc主要是游離在交聯ha凝膠顆粒間的空隙中，因而不能有效提高交聯ha凝膠內聚性和粘滯性，以及不能有效降低交聯ha凝膠吸水性。
4.專利cn102226011b將透明質酸與羥丙基甲基纖維素進行酯化反應，得到透明質酸與羥丙基甲基纖維素復合非水凝膠，降低產品的體外酶解速率，提高產品的熱穩定性能，但是該方案需要較長的反應時間，以及必須經過脫水等復雜的后處理步驟才能完成，制備工藝復雜，且反應過程需要引入有機溶劑，故有機溶劑的殘留風險較高。
技術實現要素：
5.針對上述存在的問題，本發明提供一種具有互穿網絡結構的交聯透明質酸或其鹽凝膠及其制備方法。本發明的交聯透明質酸或其鹽凝膠中含有水溶性纖維素，所述交聯透明質酸或其鹽具有三維網絡結構，水溶性纖維素穿插到其三維網格內部，形成互穿網絡結構，進一步穩固與緊致交聯透明質酸或其鹽的三維網格；同時，由于穿插在交聯透明質酸或其鹽三維網格中的水溶性纖維素分子間具有很強的相互作用力，因而增強了透明質酸或其鹽凝膠顆粒與顆粒之間的粘附性。本發明凝膠的吸水率低，內聚性高，粘滯性強，具有更好
的組織相容性，制備工藝簡單，適合工業化生產。
6.本發明采用的技術方案如下：
7.本發明第一方面公開了一種具有互穿網絡結構的交聯透明質酸或其鹽凝膠，所述凝膠含有交聯透明質酸或其鹽和水溶性纖維素，所述交聯透明質酸或其鹽具有三維網絡結構，所述水溶性纖維素通過先溶脹再溶解，使其穿插到交聯透明質酸或其鹽的三維網格內部，形成互穿網絡結構。
8.進一步的，所述水溶性纖維素選自羥乙基甲基纖維素(hemc),羥丙基甲基纖維素(hpmc),羥丁基甲基纖維素(hbmc),乙基甲基纖維素(emc)和羧甲基纖維素(cmc)的一種或多種，優選為羥丙基甲基纖維素(hpmc)；
9.進一步的，所述羥丙基甲基纖維素的分子量為50～500kda；優選為100～400kda；更優選為150～300kda；
10.優選的，透明質酸或其鹽的分子量為300～3000kda，更優選為500～2600kda。
11.所述凝膠中，交聯透明質酸或其鹽的含量為8～25mg/ml，水溶性纖維素的含量為0.4～4mg/ml。
12.所述透明質酸鹽為透明質酸的金屬鹽，選自透明質酸鈉、透明質酸鉀、透明質酸鎂、透明質酸鈣、透明質酸鋅中的一種或多種，優選透明質酸鈉。
13.本發明第二方面提供一種第一方面所述的具有互穿網絡結構的交聯透明質酸或其鹽的凝膠的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
14.步驟一：將透明質酸或其鹽溶解，加入堿性試劑，攪拌均勻后，混入水溶性纖維素，混合均勻后，水溶性纖維素溶脹但不溶解，然后加入交聯劑進行交聯，得到交聯的透明質酸或其鹽；
15.步驟二：將交聯的透明質酸或其鹽調節ph值至6.5～7.5，加入局部麻醉劑，再加入生理上可接受的等張緩沖液載體，混合均勻，均質，濕熱滅菌，即得。
16.所述步驟一中透明質酸或其鹽的分子量為300～3000kda；所述分子量包括但不限于：300kda、400kda、500kda、600kda、700kda、800kda、900kda、1000kda、1100kda、1200kda、1500kda、1800kda、2000kda、2200kda、2500kda、3000kda，優選為500～2600kda；
17.優選的，所述水溶性纖維素為羥丙基甲基纖維素。
18.所述羥丙基甲基纖維素的分子量為50～500kda，包括但不限于：50kda、80kda、100kda、150kda、200kda、250kda、300kda、350kda、400kda，450kda、500kda，優選為100～400kda。
19.優選的，步驟一中，透明質酸或其鹽的濃度為5％～35％，優選為10％～25％，通過控制透明質酸或其鹽的濃度，使水溶性纖維素在堿化透明質酸或其鹽的體系中，處于溶脹但不溶解的狀態。本發明中所用的濃度均為質量濃度。
20.所述步驟一中加入堿性試劑后透明質酸或其鹽溶液的ph為9以上，優選為10～13。
21.所述堿性試劑包括：氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、亞硫酸鈉、亞硫酸鉀，更優選為氫氧化鈉；
22.和/或，所述交聯反應溫度為10～30℃；更優選的，所述交聯反應溫度為15～25℃；
23.和/或，所述交聯劑為：1,4-丁二醇二縮水甘油醚(bdde)、二乙烯基砜、聚乙二醇、京尼平、乙二醇二縮水甘油醚(egde)、1,6-己二醇二縮水甘油醚(hde)、一縮二乙二醇二縮
水甘油醚(dgeg)和碳化二亞胺中的一種或任意兩種以上的混合，優選為1,4-丁二醇二縮水甘油醚。
24.優選的，所述交聯反應時間為2～60h；優選為12～24h；
25.進一步的，所述交聯劑與透明質酸或其鹽的質量比為：0.5％～5％；
26.本發明通過控制交聯前透明質酸或其鹽的濃度范圍，可以使水溶性纖維素實現從溶脹到逐漸溶解狀態。如果交聯前透明質酸或其鹽濃度低，水溶性纖維素會溶解，但是交聯效果較弱，凝膠難以形成互穿網絡結構，耐濕熱滅菌能力較差，填充效果有限；即使提高交聯劑用量，hpmc可能會交聯，但難以形成互穿網絡結構，而且交聯的hpmc可能會存在體內降解問題，產生一定風險；如果交聯前透明質酸或其鹽濃度過高，可能存在交聯程度不均勻，雖然水溶性纖維素不溶解，但是其難以均勻分散到交聯透明質酸或其鹽的三維網格內部。
27.進一步的，所述步驟二中交聯透明質酸或其鹽的含量為8～25mg/ml，水溶性纖維素的含量為0.4～4mg/ml；
28.所述生理上可接受的等張緩沖液載體包括乳酸鈉林格試液、醋酸鈉林格試液、磷酸鹽緩沖溶液、眼內沖洗液中的一種或多種，優選為乳酸鈉林格試液；
29.所述局部麻醉劑包括利多卡因、丁卡因、布比卡因和普魯卡因中的一種以上，優選為利多卡因；
30.優選的，所述混合還包括再加入維生素、氨基酸、卵磷脂、肉毒堿中的一種或多種。
31.進一步的，所述混勻的時間為24～48h。
32.所述方法還包括灌裝、滅菌步驟；
33.優選的，所述灌裝包括：將混合樣品灌裝至預灌封注射器中，得到罐裝樣品；
34.優選的，滅菌包括：將灌裝樣品，置于高壓蒸汽滅菌柜中，滅菌；
35.所述滅菌的時間包括5～30min，優選為15min；
36.所述滅菌的溫度為110～130℃，優選為121℃。
37.本發明首先將水溶性纖維素均勻分散到透明質酸或其鹽的堿性溶液中，以羥丙基甲基纖維素hpmc為例，通過控制透明質酸或其鹽的濃度，使水溶性纖維素能均勻分散在堿化透明質酸或其鹽的體系中，處于溶脹但不溶解的狀態，其分子鏈段在此時呈蜷縮狀；而當向堿性溶液中加入交聯劑之后，蜷縮狀的羥丙基甲基纖維素雖然不參與交聯反應，但是仍能均勻的分散在交聯透明質酸或其鹽凝膠中；其次，在交聯反應結束之后，隨著反應體系被酸性試劑中和至中性以及反應體系被等張緩沖液載體稀釋，此時分散在交聯透明質酸或其鹽凝膠中的羥丙基甲基纖維素則開始逐漸溶解，蜷縮分子鏈段在此時呈舒展狀，其舒展的鏈段會逐漸穿插到交聯透明質酸或其鹽凝膠的三維網絡結構中，將交聯透明質酸或其鹽凝膠的三維網格進一步加固和緊致，得到具有獨特互穿網絡結構的交聯透明質酸或其鹽凝膠。
38.通過本發明的制備方法，增強凝膠的強度，減少凝膠的吸水性；同時，由于穿插在交聯透明質酸三維網格中的羥丙基甲基纖維素具有很強的分子間相互作用力，因而增強了透明質酸凝膠顆粒與顆粒之間的粘附性，保證凝膠被均質之后仍能夠保持較強的內聚力和粘滯性。本發明制備工藝簡單，不需要通過復雜的二次交聯即可得到吸水率低，內聚性高，粘滯性強，具有更好的組織相容性的凝膠。
39.相較于交聯透明質酸鈉凝膠與水溶性纖維素物理混合的工藝而言，本發明在透明
質酸或其鹽交聯反應之前引入水溶性纖維素，隨著均勻分散的水溶性纖維素溶解狀態變化，使其更容易穿插到交聯透明質酸或其鹽的三維網格內部，在交聯透明質酸三維網絡結構中形成更多“緊致點位”，從而能夠有效穩固交聯透明質酸的三維網格，增強凝膠強度和內聚力，以及降低凝膠吸水性。
40.本發明第三方面提供一種由第二方面所述的方法制備的交聯透明質酸或其鹽凝膠。
41.本發明第四方面還提供一種第一方面所述的凝膠或第三方面所述的交聯透明質酸或其鹽凝膠在制備組織工程材料、藥品、化妝品中的應用。
42.優選的，所述組織工程材料包括軟組織填充材料、軟骨修復材料、組織植入材料、生物材料植入物的涂層；
43.優選的，所述生物材料植入物的涂層包括乳房填充物、導管、插管、骨骼修補物、軟骨替代物、微型泵和其它藥物輸送裝置、人工臟器和血管、組織增強用的網的涂層；
44.優選的，所述軟組織填充材料包括作為面部、頸部、頭部、耳部、乳房、關節的填充材料或關節潤滑劑；
45.優選的，所述藥品包括傷口愈合材料、注射液、活性劑的輸送材料；
46.更優選的，所述傷口愈合藥物為傷口敷料；
47.優選的，所述活性劑包括化學劑或生物學上的活性因子；
48.更優選的，所述活性因子包括消炎劑，抗生素，止痛藥，麻醉劑，傷口愈合促進劑，細胞生長抑制劑，免疫刺激劑，免疫抑制劑和抗病毒藥。
49.本發明的有益效果：
50.1、本發明的制備方法借助水溶性纖維素在堿化透明質酸或其鹽中溶解狀態變化，使得均勻分散在交聯透明質酸或其鹽中的纖維素分子鏈段從蜷縮到舒展后，更容易穿插到交聯透明質酸的三維網格內部，形成互穿網絡結構，進一步穩固與緊致凝膠的三維網格，增強凝膠的強度，減少凝膠的吸水性；同時，由于穿插到交聯透明質酸三維網格內部的水溶性纖維素具有很強的分子間相互作用力，增強了透明質酸凝膠顆粒與顆粒之間的粘附性，保證凝膠被均質之后仍能夠保持較強的內聚力和粘滯性，最終形成了內聚性高，粘滯性強的凝膠，具有更好的組織相容性。
51.2、本發明通過控制交聯前透明質酸或其鹽濃度，水溶性纖維素實現從溶脹到逐漸溶解狀態。如果交聯前透明質酸濃度過低，則水溶性纖維素會溶解，缺少分子鏈段從蜷縮到舒展的過程，難以形成互穿網絡結構，另外，該條件下的透明質酸交聯程度也較弱，填充效果有限；即使提高交聯劑用量，hpmc可能會交聯，但難以無法形成互穿網絡結構，而且交聯的hpmc可能會存在體內降解問題，產生一定風險；如果交聯前透明質酸濃度過高，可能存在交聯程度不均勻，水溶性纖維素也難以均勻分散到交聯透明質酸的三維網格內部的問題，較難實現產業化。
52.3、本發明形成的互穿網絡結構，相對于交聯透明質酸凝膠與水溶性纖維素物理混合的工藝而言，本發明在透明質酸或其鹽交聯反應之前引入水溶性纖維素，隨著均勻分散的水溶性纖維素溶解狀態變化，使其更容易穿插到交聯透明質酸或其鹽三維網格內部，在交聯透明質酸或其鹽三維網絡結構中形成更多“緊致點位”，從而能夠有效穩固交聯透明質酸或其鹽的三維網格，增強凝膠強度和內聚力，以及降低凝膠吸水性。
53.4、當采用本發明的透明質酸進行軟組織填充時，很少吸水或幾乎不吸水，與常規的交聯透明質酸和羥丙基甲基纖維素的物理混合產品而言，吸水率減少70％，能夠有效減少注射后發生紅腫的概率，使即刻填充效果更佳；
54.5、本發明的制備方法通過采用熱穩定性更好的乳酸鈉林格試液，增強凝膠抵抗濕熱滅菌的能力。
55.6、本發明的制備方法簡便，不需要復雜的二次交聯，能耗低、污染少，適合工業化生產。
56.總體來說，本發明的制備方法能夠兼顧內聚性高，凝膠不易分散，粘滯性強，吸水較少，其簡便，能耗低、污染少，適合工業化生產。
附圖說明
57.圖1所示為實施例1中凝膠的互穿網絡結構示意圖；
58.圖2所示為實施例1中羥丙基甲基纖維素溶解前后的凝膠照片，其中，圖2a所示為實施例1中羥丙基甲基纖維素溶解前的凝膠照片；圖2b所示為實施例1中羥丙基甲基纖維素溶解后的凝膠照片；
59.圖3所示為交聯透明質酸鈉凝膠的內聚性分級照片，其中，圖3a所示為實施例1交聯透明質酸鈉凝膠產品的內聚性分級照片，圖3b所示為對比例1交聯透明質酸鈉凝膠產品的內聚性分級照片；
60.圖4所示為交聯透明質酸鈉凝膠的粘滯性分級照片，圖4a所示為實施例1交聯透明質酸鈉凝膠產品的粘滯性分級照片，圖4b所示為實施例3交聯透明質酸鈉凝膠產品的粘滯性分級照片，圖4c所示為對比例1交聯透明質酸鈉凝膠產品的粘滯性分級照片，圖4d所示為對比例3交聯透明質酸鈉凝膠產品的粘滯性分級照片；
61.圖5所示為實施例1中凝膠的熒光顯微鏡照片；
62.圖6所示為對比例1中凝膠的熒光顯微鏡照片；
63.圖7所示為對比例2中凝膠的熒光顯微鏡照片；
64.圖8所示為對比例3中凝膠的熒光顯微鏡照片；
65.圖9所示為對比例4中凝膠的熒光顯微鏡照片。
具體實施方式
66.除非另有定義，本發明中所使用的所有科學和技術術語具有與本發明涉及技術領域的技術人員通常理解的相同的含義。
67.本發明中，術語“交聯”是將具有化學反應活性的線型結構聚合物通過化學反應變為三維網狀(體型)結構聚合物的過程。常被用于聚合物改性。
68.本發明中，術語“bdde”是指1,4-丁二醇二縮水甘油醚，屬水溶性環氧樹脂。黃透明液體，環氧值0.63～0.74，黏度15～20mpa
·
s。由1,4-丁二醇與環氧氯丙烷縮聚制得。多與雙酚a型環氧樹脂配合使用，常用于制備低黏度復合物、鑄塑料、浸漬液、膠黏劑、涂料和樹脂改性劑等。
69.本發明中，術語“交聯劑”是指能在線型的分子之間產生能化學鍵，使線型分子相互連在一起，形成網狀結構的試劑，用于提高高分子材料的強度。
70.本發明中，術語“乳酸鈉林格試液”是指一種調節體液電解質及酸堿平衡的溶液，主要成分為乳酸鈉、氯化鈣、氯化鈉和氯化鉀，一般作為溶劑，起溶解保護試劑的作用。
71.下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
72.實施例1交聯透明質酸鈉的制備
73.(1)稱取5g透明質酸鈉(分子量為710kda)加入到20ml注射用水中，溶解；加入5mol/l氫氧化鈉溶液調節ph值至11，用電動攪拌器(ika，eurostar 20digita)在150r/min轉速下攪拌15min，得到堿化后的透明質酸鈉溶液；加入0.5g羥丙基甲基纖維素(分子量為280kda)，繼續攪拌5min，并用多功能振蕩器振搖5min，將羥丙基甲基纖維素均勻分散到堿化后的透明質酸鈉溶液中，此時hpmc發生溶脹，整體呈乳白(如圖2a)；再加入bdde150μl，室溫下攪拌20min，25℃反應24h，得到交聯的透明質酸鈉凝膠。
74.(2)向上述交聯的透明質酸鈉凝膠中加入1mol/l鹽酸溶液調節體系ph值至6.9-7.1，再加入100mg/ml鹽酸利多卡因溶液10ml，用乳酸鈉林格試液調控凝膠中透明質酸鈉的含量為15mg/ml，此時對應的羥丙基甲基纖維素含量為1.5mg/ml，此時hpmc溶解，體系呈清澈透明狀(如圖2b)。然后，置于滾式混勻器(美國精騏有限公司，mr-03u)上，在80r/min轉速下混合42h，得到樣品。
75.(3)將制備得到的樣品均質后，灌裝至預灌封注射器中。然后，將灌裝后的樣品置于高壓蒸汽滅菌柜中121℃滅菌15min。
76.實施例2交聯透明質酸鈉的制備
77.制備方法與實施例1相同，不同之處在步驟(2)：將乳酸鈉林格試液替換為磷酸鹽緩沖溶液。
78.實施例3交聯透明質酸鈉的制備
79.制備方法與實施例1相同，不同之處在步驟(1)：稱取5g透明質酸鈉(分子量為710kda)加入到50ml注射用水中，溶解，以及bdde加入量為250μl。
80.實施例4交聯透明質酸鈉的制備
81.制備方法與實施例1相同，不同之處在步驟(1)：稱取5g透明質酸鈉(分子量為2470kda)加入到20ml注射用水中，溶解。
82.對比例1交聯透明質酸鈉的制備
83.(1)稱取5g透明質酸鈉(分子量為710kda)加入到20ml注射用水中；加入氫氧化鈉溶液調節ph值至11，用電動攪拌器(ika，eurostar 20digita)在150r/min轉速下攪拌15min，得到堿化后的透明質酸鈉溶液；加入bdde 150μl，室溫下攪拌20min，25℃反應24h，得到交聯的透明質酸鈉凝膠。
84.(2)向上述交聯的透明質酸鈉凝膠中加入1mol/l鹽酸溶液調節體系ph值至6.9～7.1，再加入100mg/ml鹽酸利多卡因溶液10ml，用乳酸鈉林格試液調控凝膠中透明質酸鈉的含量為15mg/ml。然后，置于滾式混勻器(美國精騏有限公司，mr-03u)上，在80r/min轉速下混合42h，均質，得到樣品。
85.(3)向上述樣品中加入0.5g羥丙基甲基纖維素(分子量為280kda)，用多功能振蕩
器振搖，將羥丙基甲基纖維素均勻分散到交聯透明質酸鈉凝膠中，此時對應的羥丙基甲基纖維素含量為1.5mg/ml。然后，置于滾式混勻器(美國精騏有限公司，mr-03u)上，在80r/min轉速下混合24h，得到最終樣品。
86.(4)將制備得到的樣品灌裝至預灌封注射器中。然后，將灌裝后的樣品置于高壓蒸汽滅菌柜中121℃滅菌15min。
87.對比例2交聯透明質酸鈉的制備
88.(1)稱取5g透明質酸鈉(分子量為710kda)加入到20ml注射用水中；加入5mol/l氫氧化鈉溶液調節ph值至11，用電動攪拌器(ika，eurostar 20digita)在150r/min轉速下攪拌15min，得到堿化后的透明質酸鈉溶液；再加入bdde 150μl，室溫下攪拌20min，25℃反應24h，得到交聯的透明質酸鈉凝膠。
89.(2)向上述交聯的透明質酸鈉凝膠中加入1mol/l鹽酸溶液調節體系ph值至6.9～7.1，再加入100mg/ml鹽酸利多卡因溶液10ml，用乳酸鈉林格試液調控凝膠中透明質酸鈉的含量為15mg/ml。然后，加入0.5g羥丙基甲基纖維素(分子量為280kda)，用多功能振蕩器振搖，將羥丙基甲基纖維素均勻分散到交聯透明質酸鈉凝膠中，此時對應的羥丙基甲基纖維素含量為1.5mg/ml；然后，置于滾式混勻器(美國精騏有限公司，mr-03u)上，在80r/min轉速下混合42h，均質，得到樣品。
90.(3)將制備得到的樣品灌裝至預灌封注射器中。然后，將灌裝后的樣品置于高壓蒸汽滅菌柜中121℃滅菌15min。
91.對比例3交聯透明質酸鈉的制備
92.制備方法與實施例1相同，不同之處在步驟(1)：稱取5g透明質酸鈉(分子量為710kda)加入到110ml注射用水中，溶解，以及bdde加入量為400μl。
93.對比例4交聯透明質酸鈉的制備
94.制備方法與實施例1相同，不同之處在步驟(1)：稱取5g透明質酸鈉(分子量為710kda)加入到110ml注射用水中，溶解。
95.驗證例1交聯透明質酸鈉的吸水率測試
96.稱取1g樣品質量記為m0，置于500目篩網上，篩網的質量記為m1，將篩網置于平皿中，一次性加入30ml 0.9％氯化鈉溶液，使其完全浸潤樣品，靜置溶脹30min，將篩網并樣品一起取出，用濾紙吸去篩網底部和周邊多余液體水分，稱量記作m2(凝膠加篩網的質量)，根據公式吸水率＝(m
2-m
1-m0)/m0計算。對實施例和對比例中的樣品進行吸水率測試，測試結果見表1。從表中結果可知，相同透明質酸鈉含量和緩沖溶液條件下，實施例1-4中樣品的吸水率明顯低于對比例1-3中樣品的吸水率；對比例4由于交聯度效果較弱，滅菌后無法維持凝膠形貌，無法檢測吸水率。說明在實施例的制備工藝下，更有助于羥丙基甲基纖維素的分子鏈段向交聯透明質酸鈉的三維網格內部穿插，更易于形成互穿網絡結構，進一步穩固與緊致凝膠的三維網絡結構，使得可以進入三維空間網格的水量變少，進而減少凝膠的吸水性，故能夠得到吸水率相對較低的樣品，即可以滿足低吸水、不腫脹的臨床需求。因此，當采用本發明的實施例中樣品進行軟組織填充時，能夠減少注射后發生紅腫的概率，使即刻填充效果更佳。
97.表1交聯透明質酸鈉凝膠的吸水率測試結果
98.編號吸水率
實施例10.36實施例20.49實施例30.45實施例40.33對比例11.13對比例20.94對比例31.97對比例4滅菌后呈溶液態，無法檢測
99.驗證例2交聯透明質酸鈉的內聚性測試
100.將樣品用1％的甲苯胺藍染后，安裝27g
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1/2推擠針頭，緩慢推注樣品至生理鹽水中，100r/min轉速下攪拌5min，觀察并記錄樣品的狀態來表征內聚性。對實施例和對比例中的樣品進行內聚性測試，測試結果見表2。從表中結果可知，在相同轉速、相同攪拌條件下，實施例1-4中的樣品仍呈規則、平滑長線狀(實施例1如圖3a)，對比例1-3中的樣品呈長短不一的線段狀(對比例1如圖3b)，對比例4由于滅菌后無法維持凝膠狀態，幾乎呈溶液態，無法驗證內聚性。說明在實施例的制備工藝下，不僅在交聯透明質酸與羥丙基甲基纖維素之間形成了互穿網絡結構，而且由于羥丙基甲基纖維素分子間很強的相互作用力，使得透明質酸凝膠顆粒與顆粒之間的粘附性增強，即使是在強力攪拌后凝膠仍不易分散，保持原有的規則、平滑長線狀，即內聚性更高。
101.表2交聯透明質酸鈉凝膠的內聚性測試結果
102.編號內聚性(在生理鹽水中攪拌5min之后的性狀)實施例1呈規則、平滑長線狀實施例2呈規則、平滑長線狀實施例3呈規則、平滑長線狀實施例4呈規則、平滑長線狀對比例1長短不一的線段狀對比例2長短不一的線段狀對比例3長短不一的線段狀對比例4——
103.驗證例3交聯透明質酸鈉的流動性測試
104.分別向聚四氟乙烯板(300mm
×
200mm)上10mm
×
10mm的區域推注0.5ml樣品(使用前與生理鹽水按照2:1體積比進行混合)。然后，將聚四氟乙烯板置于90
°
支撐架上，觀察各樣品沿著聚四氟乙烯板豎直向下流動30min后的情況，進而模擬樣品在注射至人體組織后的粘滯性與相容性。對實施例和對比例中的樣品進行流動性測試，測試結果見表3。從表中結果可知，實施例1、實施例3以及對比例1、對比例3中的樣品在聚四氟乙烯板上豎直懸掛30min后均呈現流動但不滾動狀態(實施例1如圖4a；實施例3如圖4b)，即樣品的粘滯性更強，組織相容性更好；而對比例1、3樣品則呈現滾動狀態(對比例1如圖4c；對比例3如圖4d)，即樣品的粘滯性較差，具有較差的組織相容性，進一步說明在實施例的制備工藝下，透明質酸凝膠顆粒與顆粒之間的粘附性得到增強，保證凝膠被均質之后仍能夠保持較強的粘滯性。
105.表3交聯透明質酸鈉凝膠的流動性測試結果
106.編號流動狀態實施例1流動但不滾動實施例2流動但不滾動實施例3流動但不滾動實施例4流動但不滾動對比例1滾動對比例2滾動對比例3滾動對比例4流動
107.驗證例4交聯透明質酸鈉的彈性模量測試
108.采用流變儀(ta，dhr-2)對實施例和對比例中的樣品進行彈性模量測試，來表征凝膠的堅固性。具體方法如下：測試夾具為直徑25～60mm的平板夾具，裝載間隙為1000μm，測試溫度通過帕爾貼板進行控制，測試時間為60s～120s，測試形變量為0.01～3000％，測試頻率為0.1～10hz，測試結果見表4。從表中結果可知，在相同的檢測條件下，實施例1中樣品的彈性模量為328pa，對比例1和對比例2中樣品的彈性模量則分別為239pa、253pa；進一步說明本發明實施例的制備方法更有利于形成互穿網絡結構。另外，值得注意的是，實施例1與實施例2制備工藝基本一致，唯一區別在于所加入的緩沖鹽溶液不同，而制備得到最終樣品的彈性模量卻相差較大，分別為328pa和296pa，說明當選擇不含磷酸鹽的乳酸鈉林格試液作為緩沖溶液時，可以得到更耐濕熱滅菌的凝膠。推測乳酸鈉林格試液由于含有乳酸根，相較于磷酸緩沖鹽中的磷酸氫根，其熱穩定性更好，故能夠更好的保護凝膠的三維網絡結構以及互穿網絡結構，盡量減少高溫對其結構的破壞，進而增強凝膠抵抗濕熱滅菌的能力。而對比例4經滅菌后幾乎呈溶液態，彈性模量無測試意義。
109.表4交聯透明質酸鈉凝膠的彈性模量測試結果
110.編號彈性模量實施例1328pa實施例2296pa實施例3307pa實施例4345pa對比例1239pa對比例2253pa對比例3135pa對比例4無測試意義
111.驗證例5交聯透明質酸鈉的互穿網絡結構表征
112.將異硫氰酸熒光素(fitc)標記的羥丙基甲基纖維素hpmc作為原料，分別按照實施例1、對比例1-4中的制備方法制備得到fitc標記的交聯透明質酸鈉凝膠，并經過透析得到最終樣品，通過熒光顯微鏡拍攝各樣品在470nm波長下的熒光照片(放大倍數50
×
)，來表征羥丙基甲基纖維素與交聯透明質酸鈉凝膠形成互穿網絡結構的實際情況，具體結果如圖5～圖9(即圖中熒光點即代表hpmc)。從圖中可以看出，實施例1中的樣品(圖5)在顯微鏡視野
下的熒光分布較為致密、均勻，這是由于本發明的制備方法使hpmc從溶脹到逐漸溶解狀態，使得hpmc均勻分散在交聯透明質酸鈉中，hpmc分子鏈段更容易穿插在交聯透明質酸的三維網格內部，形成互穿網絡結構；而對比例1、對比例2和對比例3中的樣品(依次為圖6、圖7和圖8)在相同顯微鏡視野下的熒光分布則較為稀疏，且不均勻，這是由于對比例1-2制備方法中的hpmc均是在溶解狀態下與交聯透明質酸鈉凝膠混合，hpmc難以均勻分散到交聯透明質酸鈉的三維網格內部，因此，hpmc熒光點數量較少且不均勻；對比例3制備方法中的hpmc雖然可能會在提高交聯劑用量后發生交聯反應，但難以形成互穿網絡結構，而且經濕熱滅菌，三維網絡結構容易被破壞，因此，hpmc熒光點數量也較少。另外，對比例4中的樣品(圖9)在顯微鏡視野下并未觀察到熒光現象，這是由于在對比例4的制備方法中，交聯反應前的透明質酸鈉濃度低，雖然hpmc基本上溶解于堿性的透明質酸鈉中，但由于體系中hpmc與透明質酸鈉的濃度均較低，交聯效果較弱，耐濕熱滅菌能力較差，故推測在滅菌的高溫條件下交聯ha三維網絡結構可能被完全破壞，也很難得到交聯態的hpmc，仍然主要為游離態hpmc，所以透析后未觀察到熒光現象。
技術特征：
1.一種具有互穿網絡結構的交聯透明質酸或其鹽凝膠，其特征在于，所述凝膠含有交聯透明質酸或其鹽和水溶性纖維素，所述交聯透明質酸或其鹽具有三維網絡結構，所述水溶性纖維素通過先溶脹再溶解，使其穿插到交聯透明質酸或其鹽的三維網格內部，形成互穿網絡結構。2.如權利要求1所述的凝膠，其特征在于，所述水溶性纖維素選自羥乙基甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羥丁基甲基纖維素，乙基甲基纖維素和羧甲基纖維素的一種或多種，優選為羥丙基甲基纖維素。3.如權利要求2所述的凝膠，其特征在于，所述羥丙基甲基纖維素的分子量為50～500kda；優選為100～400kda；透明質酸或其鹽的分子量為300～3000kda，優選為500～2600kda。4.如權利要求1所述的凝膠，其特征在于，交聯透明質酸或其鹽的含量為8～25mg/ml，水溶性纖維素的含量為0.4～4mg/ml。5.如權利要求3所述的凝膠，其特征在于，所述透明質酸鹽選自透明質酸鈉、透明質酸鉀、透明質酸鎂、透明質酸鈣、透明質酸鋅中的一種或多種，優選透明質酸鈉。6.一種具有互穿網絡結構的交聯透明質酸或其鹽凝膠的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟一：將透明質酸或其鹽溶解，加入堿性試劑，攪拌均勻后，混入水溶性纖維素，混合均勻后，水溶性纖維素溶脹但不溶解，然后加入交聯劑進行交聯，得到交聯的透明質酸或其鹽；步驟二：將交聯的透明質酸或其鹽調節ph值至6.5～7.5，加入局部麻醉劑，再加入生理上可接受的等張緩沖液載體，混合均勻，均質，滅菌，即得。7.如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟一中透明質酸或其鹽的分子量為300～3000kda；優選為500～2600kda；所述水溶性纖維素選自：羥乙基甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羥丁基甲基纖維素，乙基甲基纖維素和羧甲基纖維素的一種或多種；優選的，所述水溶性纖維素為羥丙基甲基纖維素；優選的，所述羥丙基甲基纖維素的分子量為50～500kda；優選為100～400kda。8.如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟一中透明質酸或其鹽的濃度為5％～35％，優選為10％～25％；所述步驟一中加入堿性試劑后透明質酸或其鹽溶液的ph為9以上，優選為10～13。9.如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述堿性試劑包括：氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、亞硫酸鈉、亞硫酸鉀，優選為氫氧化鈉；和/或，步驟一交聯反應溫度10～30℃；更優選的，反應溫度為15～25℃；和/或，所述交聯劑為：1,4-丁二醇二縮水甘油醚、二乙烯基砜、聚乙二醇、京尼平、乙二醇二縮水甘油醚、1,6-己二醇二縮水甘油醚、一縮二乙二醇二縮水甘油醚和碳化二亞胺中的一種或任意兩種以上的混合，優選為1,4-丁二醇二縮水甘油醚；優選的，所述交聯反應時間為2～60h；更優選為12～24h；所述交聯劑與透明質酸或其鹽的質量比為：0.5％～5％；所述生理上可接受的等張緩沖液載體包括乳酸鈉林格試液、醋酸鈉林格試液、磷酸鹽緩沖溶液、眼內沖洗液中的一種或多種，優選為乳酸鈉林格試液；
所述局部麻醉劑包括利多卡因、丁卡因、布比卡因和普魯卡因中的一種以上，優選為利多卡因；優選的，所述混合還包括再加入維生素、氨基酸、卵磷脂、肉毒堿中的一種或多種。10.權利要求1所述的凝膠或權利要求6-9任一項所述制備方法得到的凝膠在制備組織工程材料、藥品、化妝品中的應用；優選的，所述組織工程材料包括軟組織填充材料、軟骨修復材料、組織植入材料、生物材料植入物的涂層；優選的，所述生物材料植入物的涂層包括乳房填充物、導管、插管、骨骼修補物、軟骨替代物、微型泵和其它藥物輸送裝置、人工臟器和血管、組織增強用的網的涂層；優選的，所述軟組織填充材料包括作為面部、頸部、頭部、耳部、乳房、關節的填充材料或關節潤滑劑；優選的，所述藥品包括傷口愈合材料、注射液、活性劑的輸送材料；更優選的，所述傷口愈合藥物為傷口敷料；優選的，所述活性劑包括化學劑或生物學上的活性因子；更優選的，所述活性因子包括消炎劑，抗生素，止痛藥，麻醉劑，傷口愈合促進劑，細胞生長抑制劑，免疫刺激劑，免疫抑制劑和抗病毒藥。
技術總結
本發明涉及一種具有互穿網絡結構的交聯透明質酸或其鹽凝膠，所述凝膠含有交聯透明質酸或其鹽和水溶性纖維素，所述交聯透明質酸或其鹽具有三維網絡結構，水溶性纖維素穿插到其三維網格內部，形成互穿網絡結構，進一步穩固與緊致交聯透明質酸或其鹽的三維網格；同時，由于穿插在交聯透明質酸或其鹽三維網格中的水溶性纖維素的分子間具有很強的相互作用力，因而增強了交聯透明質酸或其鹽凝膠顆粒與顆粒之間的粘附性。本發明制備所得凝膠的吸水率低，內聚性高，粘滯性強，具有更好的組織相容性，制備工藝簡單，適合工業化生產。適合工業化生產。適合工業化生產。
