PAX6基因突變體及其應(yīng)用的制作方法
pax6基因突變體及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
1.本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體涉及pax6基因突變體及其應(yīng)用，更具體地涉及核酸、多肽、基因突變，用于先天性無虹膜癥的藥物、構(gòu)建體、重組細胞、檢測先天性無虹膜癥的試劑盒等。
背景技術(shù)：
2.先天性無虹膜是一種全眼疾病，發(fā)病率為1.31/100000，影響雙側(cè)的虹膜、角膜、晶狀體、中心凹和視神經(jīng)的形成，其明顯特征是虹膜完全或部分發(fā)育不全，伴有眼球震顫和中心凹發(fā)育不全，是出生后視力下降的主要原因。而遲發(fā)性白內(nèi)障、無虹膜相關(guān)角膜病變（ark）和青光眼會導(dǎo)致進一步的視力喪失。無虹膜患者的表型多種多樣，虹膜受累范圍從幾乎正常到無虹膜，中心凹發(fā)育不全的程度也有所不同。
3.大約三分之一的先天性無虹膜病例為散發(fā)病例，而三分之二的先天性無虹膜病例有明確的遺傳史，符合常染體顯性遺傳模式。在11p13區(qū)域染體缺失引起的wagr綜合征（腎母細胞瘤、無虹膜、泌尿生殖系統(tǒng)疾病和精神發(fā)育遲滯）中可能出現(xiàn)先天性無虹膜散發(fā)病例。pax6位于染體區(qū)域11p13，大小為22kb，調(diào)節(jié)約450kb的基因組dna（lagali n, wowra b, fries fn, latta l, moslemani k, utheim tp, wylegala e,seitz b, kasmann-kellner b. pax6 mutational status determines aniridia associated keratopathy phenotype. ophthalmology. 2020;127(2):273
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5. moosajee, m.; hingorani, m.; moore, a.t. pax6-related aniridia. in genereviews((r)); adam, m.p .,ardinger, h.h., pagon, r.a., wallace, s.e., bean, l.j.h., stephens, k., amemiya, a., eds.; university of washington: seattle, dc, usa, 2018.）。轉(zhuǎn)錄因子在生物進化過程中高度保守，參與各種組織和器官的胚胎發(fā)育，尤其是眼睛的發(fā)育。pax6基因中的雜合致病性突變被認為是先天性無虹膜的主要原因。“pax6突變數(shù)據(jù)庫”目錄報告了pax6中的所有突變，并記錄了490多個獨特的突變體（2018年最后一次更新）。這些突變大多是移碼突變、剪接位點突變或無義突變，被認為會產(chǎn)生截短或無義轉(zhuǎn)錄物，導(dǎo)致與眼部異常體征相關(guān)的單倍體不足，而其它突變是錯義的。在數(shù)據(jù)庫中，約96%的變體是基因內(nèi)突變，其它是5'和3'調(diào)控區(qū)中描述的全基因缺失或變體（pedersen, h.r.; hagen, l.a.; landsend, e.c.s.; gilson, s.j.; utheim, o.a.; utheim, t.p .; neitz, m.; baraas, r.c.color vision in aniridia. investig. ophthalmol. vis. sci. 2018, 59, 2142
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2152.）。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
4.本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種pax6基因突變體及其應(yīng)用。先天性無虹膜是一種先天性眼部異常，大約80%的先天性無虹膜病例是由pax6的基因突變引起的。三分之二的無虹膜病例有明顯的遺傳史，為常染體顯性遺傳，其余病例為散發(fā)病例。公認的是，核苷酸變化，包括無義、
移碼（幀外插入或缺失）和pax6中引入過早終止密碼子（ptc）的大多數(shù)剪接位點突變，主要導(dǎo)致突變轉(zhuǎn)錄物的降解，并導(dǎo)致50%的pax6蛋白水平的損失。ptc是pax6中最常見的突變，導(dǎo)致出現(xiàn)空等位基因。pax6中的ptc突變與嚴重虹膜發(fā)育不全和最嚴重和最早發(fā)病的ark有關(guān)，而錯義突變與影響較小的虹膜和較輕的非進展性ark有關(guān)。發(fā)明人利用高通量測序技術(shù)對dna的目標片段進行測序，研究了1個中國先天性無虹膜系，鑒定了1個新的致病性突變，還分析了與之相關(guān)的表型特征。
5.為此，本發(fā)明第一方面提供一種核酸。在本發(fā)明的一些實施方案中，與野生型pax6基因相比，所述核酸具有c.314dela突變。
6.發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)人類(homo sapiens)pax6基因（登錄號：nm_001604）的c.314dela突變，chr11:31823193-31823194，導(dǎo)致pax6蛋白發(fā)生移碼突變，第105號氨基酸由賴氨酸突變?yōu)榻z氨酸并產(chǎn)生新的閱讀框架，終止于第105號密碼子下游33號密碼子處。這種突變導(dǎo)致編碼氨基酸的過早終止，最終導(dǎo)致pax6單倍體劑量不足。c.314dela突變與先天性無虹膜癥的發(fā)病密切相關(guān)，從而可以通過檢測上述基因突變在生物樣品中是否發(fā)生，可以有效地檢測生物樣品源自的個體是否患先天性無虹膜癥。
7.本發(fā)明第二方面提供一種多肽。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述多肽由第一方面所述的核酸表達而成。
8.發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，pax6基因的c.314dela突變，導(dǎo)致pax6蛋白發(fā)生移碼突變，第105號氨基酸由賴氨酸突變?yōu)榻z氨酸并產(chǎn)生新的閱讀框架，終止于第105號密碼子下游33號密碼子處。這種突變導(dǎo)致編碼氨基酸的過早終止，最終導(dǎo)致pax6單倍體劑量不足。而pax6蛋白與先天性無虹膜癥的發(fā)病密切相關(guān)。
9.本發(fā)明第三方面提供一種可檢測的基因突變。在本發(fā)明的一些實施方案中，與野生型pax6基因相比，所述基因突變具有c.314dela突變。
10.發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)pax6基因的c.314dela突變，chr11:31823193-31823194，導(dǎo)致pax6蛋白發(fā)生移碼突變，c.314dela突變與先天性無虹膜癥的發(fā)病密切相關(guān)，從而可以通過檢測上述基因突變在生物樣品中是否發(fā)生，可以有效地檢測生物樣品源自的個體是否患先天性無虹膜癥。
11.本發(fā)明第四方面提供檢測第一方面所述的核酸或第二方面所述的多肽或第三方面所述的可檢測的基因突變的試劑在制備試劑盒或者設(shè)備中的用途。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述試劑盒或者設(shè)備用于診斷先天性無虹膜癥。
12.上述的基因突變、核酸、多肽與先天性無虹膜癥的發(fā)病密切相關(guān)，進而能夠檢測上述的基因突變、核酸或者多肽的試劑能夠用于制備試劑盒或設(shè)備，所得到的試劑盒或者設(shè)備能有效篩選出患先天性無虹膜癥，尤其是常染體顯性先天性無虹膜癥的生物樣品。
13.在本發(fā)明的一些實施方案中，所述試劑包括特異性針對所述核酸、所述多肽、所述基因突變中至少之一的探針、引物、抗體以及質(zhì)譜檢測試劑的至少之一。
14.本發(fā)明第五方面提供生物模型在篩選藥物中的用途。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述生物模型攜帶下列至少之一：（1）第一方面所述的核酸；（2）表達第二方面所述的多肽；（3）第三方面所述的可檢測的基因突變。
15.在本發(fā)明的一些實施方案中，所述生物模型為細胞模型或者動物模型。
16.本發(fā)明第六方面提供特異性改變第一方面所述的核酸或者第三方面所述的可檢測的基因突變的試劑在制備藥物中的用途。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述藥物用于先天性無虹膜癥。
17.需要說明的是，這里的特異性改變是指能使得突變的核酸或者基因突變的位點恢復(fù)到原來的野生狀態(tài)或者其它不具有致病性的狀態(tài)，而對于個體基因組的其它序列不產(chǎn)生實質(zhì)影響。如前所述，前面所述的核酸或者前面所述的基因突變與先天性無虹膜癥，尤其是常染體顯性先天性無虹膜癥的發(fā)病密切相關(guān)，由此，特異性改變前面所述的核酸或者前面所述的基因突變的試劑制備的藥物能有效用于先天性無虹膜癥，尤其是常染體顯性先天性無虹膜癥。
18.在本發(fā)明的一些實施方案中，所述先天性無虹膜癥為常染體顯性先天性無虹膜癥。
19.在本發(fā)明的一些實施方案中，所述試劑為基于同源重組修復(fù)、堿基的直接插入修復(fù)、talen、zfn中至少之一進行缺失修復(fù)的試劑。
20.本發(fā)明第七方面提供一種用于先天性無虹膜癥的藥物。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述藥物含有：特異性改變第一方面所述的核酸或者第三方面所述的可檢測的基因突變的試劑。
21.需要說明的是，這里的特異性改變是指能使得突變的核酸或者基因突變的位點恢復(fù)到原來的野生狀態(tài)或者其它不具有致病性的狀態(tài)，而對于個體基因組的其它序列不產(chǎn)生實質(zhì)影響。如前所述，前面所述的核酸或者前面所述的基因突變與先天性無虹膜癥的發(fā)病密切相關(guān)，由此，包含特異性改變前面所述的核酸或者前面所述的基因突變的試劑的藥物能有效用于先天性無虹膜癥。
22.在本發(fā)明的一些實施方案中，所述先天性無虹膜癥為常染體顯性先天性無虹膜癥。
23.在本發(fā)明的一些實施方案中，所述試劑為基于同源重組修復(fù)、堿基的直接插入修復(fù)、talen、zfn中至少之一進行缺失修復(fù)的試劑。
24.本發(fā)明第八方面提供一種構(gòu)建體。在本發(fā)明的一些實施方案中，包含第一方面所述的核酸或第三方面所述的可檢測的基因突變。
25.本發(fā)明第九方面提供一種重組細胞。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述重組細胞是通過第八方面所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細胞獲得的。
26.本發(fā)明的重組細胞，能夠有效地用作先天性無虹膜癥，尤其是常染體顯性先天性無虹膜癥的相關(guān)研究的模型。
27.本發(fā)明第十方面提供一種檢測先天性無虹膜癥的試劑盒。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述試劑盒中包括檢測第一方面所述的核酸的試劑，和/或檢測第二方面所述的多肽的試劑，和/或檢測第三方面所述的可檢測的基因突變的試劑。
28.前面所述的核酸、多肽、基因突變與先天性無虹膜癥的發(fā)病密切相關(guān)，因此，包含能有效地檢測前面所述的核酸或前面所述的基因突變或前面所述的多肽的試劑的試劑盒能有效篩選出患先天性無虹膜癥，尤其是常染體顯性先天性無虹膜癥的生物樣品。
29.本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變
得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
附圖說明
30.本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：圖1顯示了先證者的裂隙燈前節(jié)照片和前節(jié)oct檢查結(jié)果，其中，a圖和b圖展示了先證者的裂隙燈前節(jié)照片，a圖中白箭頭表示晶狀體赤道，黑箭頭表示成熟白內(nèi)障；b圖中白箭頭表示周邊至中周邊角膜結(jié)膜化，血管向內(nèi)生長，黑箭頭顯示整個角膜存在增厚的不透明區(qū)域，c圖和d圖顯示了先證者的前節(jié)oct檢查結(jié)果，od代表右眼，os代表左眼；圖2顯示了無虹膜家族先證者的眼底特征，a圖顯示了先證者的眼底照片，黑箭頭顯示黃斑區(qū)的結(jié)構(gòu)，b圖顯示了先證者的黃斑oct檢查，白箭頭表示黃斑中央凹的結(jié)構(gòu)；圖3a顯示了中國無虹膜病家系pax6移碼突變c.314dela（p.k105sfs*33）的鑒定家譜，正方形表示男性，圓圈表示女性，空符號和填充符號分別代表正常個體和受影響個體，wt：野生型，mt：突變，圖3b為序列譜圖，顯示了野生型和實施例3中鑒定的pax6 c.314dela（p.k105sfs*33）突變，箭頭表示突變的位置，顯示的是sanger測序反向測序驗證。
具體實施方式
31.下面詳細描述本發(fā)明的實施例。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
32.需要說明的是，術(shù)語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。進一步地，在本發(fā)明的描述中，除非另有說明，“多個”的含義是兩個或兩個以上。
33.在本文中所披露的范圍的端點和任何值都不限于該精確的范圍或值，這些范圍或值應(yīng)當(dāng)理解為包含接近這些范圍或值的值。對于數(shù)值范圍來說，各個范圍的端點值之間、各個范圍的端點值和單獨的點值之間，以及單獨的點值之間可以彼此組合而得到一個或多個新的數(shù)值范圍，這些數(shù)值范圍應(yīng)被視為在本文中具體公開。
34.為了更容易理解本發(fā)明，以下具體定義了某些技術(shù)和科學(xué)術(shù)語。除顯而易見在本文件中的它處另有明確定義，否則本文中使用的所有其它技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通常理解的含義。
35.在本文中，術(shù)語“包含”或“包括”為開放式表達，即包括本發(fā)明所指明的內(nèi)容，但并不排除其它方面的內(nèi)容。
36.在本文中，術(shù)語“任選地”、“任選的”或“任選”通常是指隨后所述的事件或狀況可以但未必發(fā)生，并且該描述包括其中發(fā)生該事件或狀況的情況，以及其中未發(fā)生該事件或狀況的情況。
37.ptc是pax6中最常見的突變，導(dǎo)致出現(xiàn)空等位基因。pax6中的ptc突變與嚴重虹膜發(fā)育不全和最嚴重和最早發(fā)病的ark有關(guān)，而錯義突變與影響較小的虹膜和較輕的非進展性ark有關(guān)。發(fā)明人利用一個先天性無虹膜家系成員接受了詳細的臨床評估，包括最佳矯正
視力、裂隙燈檢查、壓平眼壓測量和眼底鏡檢查。還進行了眼底照相、光學(xué)相干斷層掃描對角膜及黃斑進行了檢查。在家系成員外周血中提取基因組dna，利用高通量測序技術(shù)檢測遺傳性視網(wǎng)膜疾病相關(guān)基因。家系的先證者中發(fā)現(xiàn)一個新的pax6基因的移碼突變c.314dela（p.k105sfs*33）；chr11:31823193-31823194，導(dǎo)致pax6蛋白發(fā)生移碼突變，第105號氨基酸由賴氨酸突變?yōu)榻z氨酸并產(chǎn)生新的閱讀框架，終止于第105號密碼子下游33號密碼子處。這種突變導(dǎo)致編碼氨基酸過早終止，最終導(dǎo)致pax6單倍體劑量不足。其父母和未出現(xiàn)先天性無虹膜表現(xiàn)，并且未檢測到異常突變。
38.發(fā)明人在一個先天性無虹膜癥的中國家系中發(fā)現(xiàn)了一個新的pax6基因缺失，pax6 c.314dela（p.k105sfs*33）；chr11:31823193-31823194是常染體顯性先天性無虹膜的新的致病突變。該發(fā)現(xiàn)擴大了pax6基因的突變譜，有助于先天性無虹膜疾病的遺傳診斷。對理解pax6突變引起的先天性無虹膜疾病的發(fā)病機制有很大幫助。
39.本文中，術(shù)語“先天性無虹膜癥”在本領(lǐng)域也常被稱為“先天性虹膜缺損”或“先天性無虹膜”，其是一種全眼疾病，影響雙側(cè)的虹膜、角膜、晶狀體、中心凹和視神經(jīng)的形成，其明顯特征是虹膜完全或部分發(fā)育不全，伴有眼球震顫和中心凹發(fā)育不全，是出生后視力下降的主要原因。而遲發(fā)性白內(nèi)障、無虹膜相關(guān)角膜病變（ark）和青光眼會導(dǎo)致進一步的視力喪失。
40.術(shù)語“常染體顯性先天性無虹膜癥”是指無虹膜癥是發(fā)生在常染體上的顯性等位基因所控制的，只需要兩個等位基因中的至少一個具有患病突變，該患者就表現(xiàn)為患病。
41.而且，需要說明的是，本文中所提供的pax6基因上的突變位點，可以用來作為先天性無虹膜癥，更具體地說是常染體顯性先天性無虹膜癥的標示；或者這些突變位點的出現(xiàn)用來說明生物樣品患有先天性無虹膜癥，更具體地說是患有常染體顯性先天性無虹膜癥。這并不意味著“先天性無虹膜癥”、“常染體顯性先天性無虹膜癥”是作為pax6基因上該突變位點的一種限制。也就是說，如果要對pax6基因上的該突變位點所表征的疾病進行詳細地指示或者說明時，可以知悉其可以說明該生物樣品是患有先天性無虹膜癥，更具體地說是常染體顯性先天性無虹膜癥；但是也完全可以根據(jù)具體目的或者針對對象不同，被直接告知患有先天性無虹膜癥。
42.本文中，野生型pax6基因的dna序列（例如包括內(nèi)含子序列、外顯子序列等）、rna序列、所編碼的蛋白信息等有關(guān)該野生型pax6基因的信息均在ncbi數(shù)據(jù)庫中有收錄。本文中所示出的c.314dela突變是以ncbi數(shù)據(jù)庫中野生型pax6基因（nm_001604）的序列為參考而確定的。
43.本文中，所示出的c.314dela突變是指與野生型pax6基因的核酸序列相比，第314位發(fā)生a的缺失，導(dǎo)致發(fā)生pax6移碼突變c.314dela（p.k105sfs*33），提前終止密碼子（ptc）進入pax6開放閱讀框，獲得了相比于野生型的pax6蛋白的多肽序列更短的新的多肽序列。
44.需要說明的是，上述給出的突變位點以及序列等，均是以收錄于ncbi數(shù)據(jù)庫中的內(nèi)容作為參考，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，由于數(shù)據(jù)庫的更新或者數(shù)據(jù)庫的不同，所示出的突變位點以及序列可能會稍有不同或者變化，這些不同或者變化均可以給出的該數(shù)據(jù)庫中的內(nèi)容為標準到，這些不同或者變化也均包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
45.而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，本文中所使用的野生型pax6基因序列位置
是以人類基因組中野生型pax6基因的序列為準，但當(dāng)該野生型pax6基因存在于其它物種時，該序列可能會有所差異，可以將該物種的野生型pax6基因與人類基因組中野生型pax6基因進行比對，獲得該物種的野生型pax6基因中所對應(yīng)的位置。
46.核酸在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提出了一種核酸。根據(jù)本發(fā)明的實施例，與野生型pax6基因相比，所述核酸具有c.314dela突變。發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)pax6基因的c.314dela突變，chr11:31823193-31823194，導(dǎo)致pax6蛋白發(fā)生移碼突變，第105號氨基酸由賴氨酸突變?yōu)榻z氨酸并產(chǎn)生新的閱讀框架，終止于第105號密碼子下游33號密碼子處。這種突變導(dǎo)致編碼氨基酸的過早終止，最終導(dǎo)致pax6單倍體劑量不足。c.314dela突變與先天性無虹膜癥的發(fā)病密切相關(guān)，從而可以通過檢測上述基因突變在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品源自的個體是否患先天性無虹膜癥。
47.對于本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，提及核酸，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，實際包括互補雙鏈的任意一條，或者兩條。為了方便，在本說明書和權(quán)利要求書中，雖然多數(shù)情況下只給出了一條鏈，但實際上也公開了與之互補的另一條鏈。例如，提及pax6基因的序列，實際包括其互補序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以理解，利用一條鏈可以檢測另一條鏈，反之亦然。
48.需要說明的是，野生型pax6基因的編碼序列可以從ncbi上獲得。
49.本文中所提到的c.314dela突變是以ncbi數(shù)據(jù)庫中所對應(yīng)的pax6基因編碼序列進行定位的。
50.多肽在本發(fā)明另一方面，本發(fā)明提出了一種多肽。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述多肽由上述核酸表達而成。如前所述，pax6基因的c.314dela突變，導(dǎo)致pax6蛋白發(fā)生移碼突變，第105號氨基酸由賴氨酸突變?yōu)榻z氨酸并產(chǎn)生新的閱讀框架，終止于第105號密碼子下游33號密碼子處。這種突變導(dǎo)致編碼氨基酸的過早終止，最終導(dǎo)致pax6單倍體劑量不足。而pax6蛋白與先天性無虹膜癥的發(fā)病密切相關(guān)，進而通過檢測上述多肽在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品源自的個體是否患先天性無虹膜癥。
51.基因突變在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提出了一種基因突變。根據(jù)本發(fā)明的實施例，與野生型pax6基因相比，所述基因突變具有c.314dela突變。c.314dela突變與先天性無虹膜癥的發(fā)病密切相關(guān)，從而可以通過檢測上述基因突變在生物樣品中是否發(fā)生，可以有效地檢測生物樣品源自的個體是否患先天性無虹膜癥。
52.基因突變通常指基因在結(jié)構(gòu)上發(fā)生堿基對組成或者排列順序的改變。本文中，基因突變是指發(fā)生在pax6基因上的缺失突變。該基因突變是可以被檢測的或者說是可以被辨別的，其可以作為pax6基因上的一個突變位點被檢測或者辨別，也可以被作為pax6基因的部分核酸或者pax6基因的全部核酸被檢測或者辨別。
53.檢測前面所述的核酸、基因突變、多肽的試劑在制備試劑盒或設(shè)備中的用途在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了前面所述的基因突變或前面所述的核酸或前面所述的多肽的試劑在制備試劑盒或者設(shè)備中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述試劑盒或者設(shè)備用于診斷先天性無虹膜癥。如前所述，前面所述的核酸、基因突變、多肽與先天性
無虹膜癥的發(fā)病密切相關(guān)，進而檢測前面所述的核酸或前面所述的基因突變或前面所述的多肽的試劑用于制備試劑盒或者設(shè)備，所得到的試劑盒或者設(shè)備能有效篩選出患先天性無虹膜癥，尤其是常染體顯性先天性無虹膜癥的生物樣品。
54.根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述試劑包括特異性針對所述核酸、所述基因突變和所述多肽的至少之一的抗體、探針、引物以及質(zhì)譜檢測試劑的至少之一。例如，發(fā)明人可通過特異性識別所述多肽的抗體與所述多肽的特異性結(jié)合來檢測待測樣品中是否存在上述突變，即通過特異性抗體與抗原的相互作用來檢測上述多肽是否存在；發(fā)明人還可以通過預(yù)先設(shè)計特異性識別所述核酸或基因突變的探針，通過探針與上述核酸或基因突變位點所在的核酸片段發(fā)生互補配對，來鑒別上述核酸或基因突變的存在；發(fā)明人還可以設(shè)計用于擴增上述基因突變所在外顯子的特異性引物，進而通過基因擴增以及測序，確定上述基因突變是否存在；發(fā)明人還可以通過質(zhì)譜來檢測多肽的m/z來判斷，上述發(fā)生c.314dela突變所表達的多肽是否存在。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例的抗體、探針、引物以及質(zhì)譜檢測試劑的至少之一能特異性、高靈敏性地篩選出前面所述的核酸或者前面所述的基因突變或者前面所述的多肽，進而特異性、高靈敏性地篩選出患先天性無虹膜癥，尤其是患常染體顯性先天性無虹膜癥的生物樣品，進而能有效用于制備篩選患先天性無虹膜癥，尤其是患常染體顯性先天性無虹膜癥的生物樣品的試劑盒或者設(shè)備。
55.生物模型在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了生物模型在篩選藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述生物模型攜帶下列至少之一：（1）前面所述的核酸；（2）表達前面所述的多肽；（3）前面所述的基因突變。根據(jù)本發(fā)明的實施例的生物模型能有效地用作先天性無虹膜癥，尤其是常染體顯性先天性無虹膜癥的相關(guān)研究的模型。這些生物模型可以是細胞模型也可以是動物模型。
56.試劑在制備藥物中的用途在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了特異性改變前面所述的核酸或者前面所述的基因突變的試劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于先天性無虹膜癥。需要說明的是，這里的特異性改變是指能使得突變的核酸或者基因突變的位點恢復(fù)到原來的野生狀態(tài)或者其它不具有致病性的狀態(tài)，而對于個體基因組的其它序列不產(chǎn)生實質(zhì)影響。如前所述，前面所述的核酸或者前面所述的基因突變與先天性無虹膜癥的發(fā)病密切相關(guān)，由此，由這些能夠特異性改變前面所述的核酸或者前面所述的基因突變的試劑所制備的藥物能有效用于先天性無虹膜癥。
57.根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述試劑為基于同源重組修復(fù)、堿基的直接插入修復(fù)、talen、zfn至少之一的試劑。例如，通過同源重組方式，在pax6基因的c.314dela突變位點處插入a，從而回復(fù)為野生型狀態(tài)，或者通過堿基的直接插入來修復(fù)缺失的堿基。
58.先天性無虹膜癥的藥物在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提出了一種用于先天性無虹膜癥的藥物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述藥物含有：特異性改變前面所述的核酸或者前面所述的基因突變的試劑。需要說明的是，這里的特異性改變是指能使得突變的核酸或者基因突變的位點恢復(fù)到原來的野生狀態(tài)或者其它不具有致病性的狀態(tài)，而對于個體基因組的其它序列不產(chǎn)生實質(zhì)影響。如前所述，前面所述的核酸或者前面所述的基因突變與先天性無虹膜癥的發(fā)病
密切相關(guān)，由此，包含特異性改變前面所述的核酸或者前面所述的基因突變的試劑的藥物能有效用于先天性無虹膜癥。
59.根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述試劑為基于同源重組修復(fù)、堿基的直接插入修復(fù)、talen、zfn至少之一的試劑。例如，通過同源重組方式，在pax6基因的c.314dela突變位點處插入a，從而回復(fù)為野生型狀態(tài)，或者通過堿基的直接插入來修復(fù)缺失的堿基。
60.構(gòu)建體及重組細胞在本發(fā)明的又一個方面，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構(gòu)建體包含前面所述的核酸或前面所述的基因突變。
61.需要說明的是，“構(gòu)建體包含前面所述的核酸”表示，本發(fā)明的構(gòu)建體與野生型pax6基因相比，其包含c.314dela突變；“構(gòu)建體包含前面所述的基因突變”表示，本發(fā)明的構(gòu)建體與野生型pax6基因相比具有c.314dela突變；由此，根據(jù)本發(fā)明實施例的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細胞獲得的重組細胞，能夠有效地用作先天性無虹膜癥，尤其是常染體顯性先天性無虹膜癥的相關(guān)研究的模型。其中，所述受體細胞的種類不受特別限制，例如可以為大腸桿菌細胞、哺乳動物細胞，優(yōu)選該受體細胞來源于哺乳動物。
62.在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“構(gòu)建體”是指這樣的一種遺傳載體，其包含特定核酸序列，并且能夠?qū)⒛康暮怂嵝蛄修D(zhuǎn)入宿主細胞中，以獲得重組細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，構(gòu)建體的形式不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實施例，其可以為質(zhì)粒、噬菌體、人工染體、粘粒（cosmid）、病毒的至少一種，優(yōu)選質(zhì)粒。質(zhì)粒作為遺傳載體，具有操作簡單，可以攜帶較大片段的性質(zhì)，便于操作和處理。質(zhì)粒的形式也不受特別限制，既可以是環(huán)形質(zhì)粒，也可以是線性質(zhì)粒，即可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進行選擇。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“核酸”可以是任何包含脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于經(jīng)過修飾的或者未經(jīng)修飾的dna、rna，其長度不受任何特別限制。對于用于構(gòu)建重組細胞的構(gòu)建體，優(yōu)選所述核酸為dna，因為dna相對于rna而言，其更穩(wěn)定，并且易于操作。
63.在本發(fā)明的再一個方面，本發(fā)明提出了一種重組細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述重組細胞是通過前面所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細胞而獲得的。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，本發(fā)明的重組細胞，能夠有效地用作先天性無虹膜癥，尤其是常染體顯性先天性無虹膜癥的相關(guān)研究的模型。
64.根據(jù)本發(fā)明的實施例，受體細胞的種類不受特別限制，例如可以為大腸桿菌細胞、哺乳動物細胞，優(yōu)選所述受體細胞來源于非人哺乳動物。
65.檢測先天性無虹膜癥的試劑盒在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提出了一種檢測先天性無虹膜癥的試劑盒。
66.根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述試劑盒中包括檢測前面所述的核酸的試劑，和/或檢測前面所述的基因突變的試劑，和/或檢測前面所述的多肽的試劑。如前所述，前面所述的核酸、基因突變、多肽與先天性無虹膜癥的發(fā)病密切相關(guān)，因此，包含能有效地檢測前面所述的核酸或前面所述的基因突變或前面所述多肽的試劑的試劑盒能有效篩選出患先天性無虹膜癥，尤其是常染體顯性先天性無虹膜癥的生物樣品。
67.在本發(fā)明中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一個與pax6基因突變相關(guān)的先天性無虹膜家系，其先證者具有典型的先天性無虹膜疾病的表型，包括：眼球震顫、視力低下、角膜混濁、中心凹發(fā)育
不良等。其父母和均正常，無眼部異常及全身異常。
68.無虹膜是一種影響雙側(cè)虹膜、角膜、晶狀體、黃斑中心凹和視神經(jīng)的全眼疾病。發(fā)病率為1:40000-100000，具有完全外顯率和可變表達率（moosajee, m.; hingorani, m.; moore, a.t. pax6-related aniridia. in genereviews((r)); adam, m.p.,ardinger, h.h., pagon, r.a., wallace, s.e., bean, l.j.h., stephens, k., amemiya, a., eds.; university of washington: seattle, dc, usa, 2018; yokoi, t.; nishina, s.; fukami, m.; ogata, t.; hosono, k.; hotta, y.; azuma, n. genotype-phenotype correlation of pax6 gene mutations in aniridia. hum. genome var. 2016, 3, 15052 ; dubey, s.k.; mahalaxmi, n.; vijayalakshmi, p.; sundaresan, p. mutational analysis and genotype-phenotype correlations in southern indian patients with sporadic and familial aniridia. mol. vis. 2015, 21, 88
–
97)。最明顯的眼部特征是完全或部分虹膜發(fā)育不全，伴有眼球震顫、白內(nèi)障、無虹膜相關(guān)角膜病（ark）、青光眼、視盤發(fā)育不全和中央凹發(fā)育不全（lima cunha d, arno g, corton m, moosajee m. the spectrum of pax6 mutations and genotype-phenotype correlations in the eye. genes (basel) 2019, 10(12). https://doi.org/10.3390/genes10121050; wang p, sun w, li s, xiao x, guo x, zhang q. pax6 mutations identified in 4 of 35 families with microcornea. invest ophthalmol vis sci. 2012;53(10):6338
–
42; lagali n, wowra b, fries fn, latta l, moslemani k, utheim tp, wylegala e,seitz b, kasmann-kellner b. pax6 mutational status determines aniridia associated keratopathy phenotype. ophthalmology. 2020;127(2):273
–
5）。無虹膜患者可以表現(xiàn)出廣泛的表型譜，基因型和表型之間沒有明顯的相關(guān)性(moosajee, m.; hingorani, m.; moore, a.t. pax6-related aniridia. in genereviews((r)); adam, m.p .,ardinger, h.h., pagon, r.a., wallace, s.e., bean, l.j.h., stephens, k., amemiya, a., eds.; university of washington: seattle, dc, usa, 2018.)，即使來自具有相同pax6突變家族的成員出現(xiàn)不同程度的虹膜受累，其范圍從幾乎正常的虹膜到無虹膜，并伴有不同程度的中央凹發(fā)育不全(pedersen, h.r.; hagen, l.a.; landsend, e.c.s.; gilson, s.j.; utheim, o.a.; utheim, t.p .; neitz, m.; baraas, r.c.color vision in aniridia. investig. ophthalmol. vis. sci. 2018, 59, 2142
–
2152; pedersen, h.r.; neitz, m.; gilson, s.j.; landsend, e.c.s.; utheim, o.a.; utheim, t.p .; baraas, r.c. the cone photoreceptor mosaic in aniridia: within-family phenotype-genotype discordance. ophthalmol. retin.2019, 3, 523
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534.)。在本發(fā)明中，發(fā)明人利用靶向外顯子測序（tes）研究了一個中國無虹膜家族的遺傳異常，并在pax6基因中鑒定了1個新的ptc突變。結(jié)合國內(nèi)外文獻及發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有pax6基因突變的患者都有臨床表型，如：低視力、虹膜缺失、黃斑中心凹發(fā)育不良，其中部分患者有上瞼下垂、眼球震顫、白內(nèi)障、ark、青光眼、黃斑中央凹發(fā)育不良。即使來自具有相同突變的同一家族的患者也可以具有不同的表型。然后鑒定這些有義突變，并將其與疾病表型共同分離。
69.在pax6中觀察到的最常見的基因內(nèi)突變是無義突變（39%），其次是移碼突變（27%）、錯義突變（12%）、剪接位點突變（15%）、小指數(shù)突變（2%）和c端延伸（或運行子突變）
（2%）(moosajee, m.; hingorani, m.; moore, a.t. pax6-related aniridia. in genereviews((r)); adam, m.p .,ardinger, h.h., pagon, r.a., wallace, s.e., bean, l.j.h., stephens, k., amemiya, a., eds.; university of washington: seattle, dc, usa, 2018; tzoulaki, i.; white, i.m.; hanson, i.m. pax6 mutations: genotype-phenotype correlations. bmc genet. 2005,6, 27)。約85%的無虹膜病例是由基因內(nèi)ptc引起的突變、全基因缺失或調(diào)節(jié)區(qū)失活引起的pax6單倍體不足。在本發(fā)明中，pax6移碼突變c.314dela（p.k105sfs*33）誘導(dǎo)提前終止密碼子（ptc）進入pax6開放閱讀框，含ptc的mrna通過無義介導(dǎo)的衰變過程降級，導(dǎo)致單倍體缺乏。此外，包含pax6和wt1基因座的11p區(qū)域的染體重排或小缺失會導(dǎo)致wagr綜合征（腎母細胞瘤、無虹膜、泌尿生殖系統(tǒng)異常和智力低下）。大約30%的散發(fā)性無虹膜患者患有該綜合征，診斷出的兒童有50%至70%的風(fēng)險發(fā)展為腎母細胞瘤并累及腎臟(fischbach, b.v .; trout, k.l.; lewis, j.; luis, c.a.; sika, m. wagr syndrome: a clinical review of 54 cases.pediatrics 2005, 116, 984
–
988)。
70.不同pax6病例中虹膜發(fā)育不良的嚴重程度也不相同，晶狀體異常也分為不同程度和類型的白內(nèi)障和晶狀體異位(lagali n, wowra b, fries fn, latta l, moslemani k, utheim tp, wylegala e,seitz b, kasmann-kellner b. pax6 mutational status determines aniridia associated keratopathy phenotype. ophthalmology. 2020;127(2):273
–
5)。角膜病變在無虹膜患者中很常見，因為pax6基因負責(zé)角膜的胚胎發(fā)育和出生后發(fā)育。pax6水平降低可能導(dǎo)致角膜上皮細胞不完全分化(ramaesh t , ramaesh k , martin collinson j , chanas sa ,dhillon b , w e s t jd . developmental and cellular factors underlying corneal epithelial dysgenesis in the pax6 + /
??
mouse model of aniridia. exp eye res. 2005;81(2):224
–
35)。缺乏pax6也可將角膜緣干細胞轉(zhuǎn)化為皮膚樣上皮(ouyang h ,xue y ,lin y ,et al.wnt7a and pax6 define corneal epithelium homeostasis and pathogenesis. nature. 2014;511(7509):358
–
61)。有實驗表明，pax6單倍體不足（pax6+/-）被誘導(dǎo)，證明角膜上皮細胞之間的異常粘附，包括橋粒結(jié)構(gòu)的變化和細胞之間的較大間隙(davis j ,duncan mk ,robison wg, jr ,piatigorsky j . requirement for pax6 in corneal morphogenesis: a role in adhesion. j cell sci. 2003;116(pt 11):2157
–
67)。在先天性無虹膜的角膜病變（ark）的發(fā)展過程中，角膜最初是透明的，角膜緣完整，隨后中央角膜厚度增加，基底上皮混濁，角膜敏感性降低。角膜從邊緣到頂點逐漸變?yōu)椴煌该鳎╨agali n, wowra b, fries fn, latta l, moslemani k, utheim tp, wylegala e, seitz b, kasmann-kellner b. pax6 mutational status determines aniridiaassociated keratopathy phenotype. ophthalmology. 2020;127(2):273
–
5）。在該家族中，先證者的右眼角膜保持透明，但中央角膜厚度增加，左眼角膜帶狀變性，中央角膜厚度增加，角膜緣血管性血管翳表明存在早期ark(lagali n, wowra b, fries fn, latta l, moslemani k, utheim tp, wylegala e, seitz b, kasmann-kellner b. pax6 mutational status determines aniridiaassociated keratopathy phenotype. ophthalmology. 2020;127(2):273
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5)。無虹膜青光眼通常發(fā)生在成年早期，包括嬰幼兒。
71.人類pax6基因于1991年被克隆，并且從脊椎動物和無脊椎動物中分離出來。它由
14個外顯子組成，編碼具有配對型dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子。它具有兩個不同的dna結(jié)合亞結(jié)構(gòu)域，n末端亞結(jié)構(gòu)域（nts）和c末端亞結(jié)構(gòu)（cts），在配對結(jié)構(gòu)域中，其結(jié)合相應(yīng)的dna序列以識別目標基因。人類pax6基因產(chǎn)生2種交替剪接的亞型，其具有配對結(jié)構(gòu)域(glaser t, walton ds, maas rl. genomic structure, evolutionary conservation and aniridia mutations in the human pax6 gene. nat genet. 1992;2(3):232
–?
9)的獨特結(jié)構(gòu)。在人類pax6數(shù)據(jù)庫中報告了約500個突變（ouyang h ,xue y ,lin y ,et al.wnt7a and pax6 define corneal epithelium homeostasis and pathogenesis. nature. 2014;511(7509):358
–
61）。值得注意的是，在“關(guān)鍵區(qū)域”內(nèi)的一個非編碼元件中的變化，其它順式調(diào)節(jié)元件也可能導(dǎo)致無虹膜(bhatia s, bengani h, fish m, brown a, divizia mt, de marco r, damante g, grainger r, van heyningen v, kleinjan da. disruption of autoregulatory feedback by a mutation in a remote, ultraconserved pax6 enhancer causes aniridia. am j hum genet. 2013;93(6):1126
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34)。在一些pax6基因突變檢測為陰性的無虹膜患者中發(fā)現(xiàn)了pax6全基因缺失和端粒順式調(diào)節(jié)元件缺失。因此，建議將pax6全基因直接測序與分子檢測拷貝數(shù)改變（cnv）的方法例如高分辨率比較雜交（hr-cgh）陣列、熒光原位雜交（fish）等，和多重連接依賴性探針擴增（mlpa）推廣應(yīng)用，對于提高與pax6基因變異相關(guān)的先天性無虹膜患者的檢測率非常重要，會更適用于那些基因篩查結(jié)果為陰性的無虹膜病例（ansari m, rainger j, hanson im, williamson ka, sharkey f, harewood l, sandilands a, clayton-smith j, dollfus h, bitoun p, et al. genetic analysis of
?‘
pax6-negative
’?
individuals with aniridia or gillespie syndrome. plos one. 2016;11(4):e0153757）。目前的研究認為，在散發(fā)的和伴有綜合征的患者中可能存在更大的基因異質(zhì)性。因此，改進檢測方法有助于提高無虹膜病致病基因的檢出率。
72.簡而言之，一個新的pax6基因中的移碼突變c.314dela（p.k105sfs*33）在一個先天性無虹膜的中國家系中被鑒定，這可能導(dǎo)致pax6單倍體不足。與該突變相關(guān)的表型包括無虹膜，ark、青光眼、白內(nèi)障和中央凹發(fā)育不全。本發(fā)明擴大了pax6基因的突變譜，有助于先天性無虹膜疾病的遺傳診斷。
73.下面將結(jié)合實施例對本公開的方案進行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本公開，而不應(yīng)視為限定本公開的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
74.實施例1臨床資料本研究由中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會（中國北京）批準。一個獨立先證者在中國人民解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院（中國海南省三亞市），被診斷為先天性無虹膜，該先證者以及家系成員均簽署了知情同意書。
75.本研究中評估的家庭來自中國南方。先證者以視力下降為首發(fā)癥狀。在這個家系中，先證者是一名8歲的男性，自幼雙眼低視力伴畏光，bcva右眼為0.02，左眼為hm/10cm。眼科檢查顯示雙眼水平眼球震顫，雙眼角膜緣血管擴張、充血，右眼角膜透明、虹膜完全缺損、晶體混濁半脫位，眼底視網(wǎng)膜360度脫離呈寬漏斗狀；左眼角膜帶狀變性，眼底窺不清（圖1中a、b圖所示）。眼壓：右眼：6mmhg，左眼：42mmhg。右眼行玻璃體切除、視網(wǎng)膜復(fù)位、視網(wǎng)膜光
凝、硅油填充術(shù)后1月，見右眼底視盤界清，淡紅，c/d約0.3，視網(wǎng)膜復(fù)位好，視網(wǎng)膜血管走行可，黃斑區(qū)未見中心凹反光。oct提示：左眼角膜增厚、右眼黃斑區(qū)無中心凹結(jié)構(gòu)（圖1中c、d圖以及圖2所示）。先證者的父母和妹沒有明顯的眼部異常及全身疾病。
76.實施例2 樣本測序和致病突變篩選收集家系的遺傳資料和臨床資料。繪制家系圖，對家系中的患者和正常成員進行眼科檢查，使用國際標準視力表檢查視力，sl-2g裂隙燈（日本東京topcon公司）拍攝眼前節(jié)照片，sd-oct檢查使用rtvue xr oct設(shè)備（美國加利福尼亞州弗里蒙特市optovueinc）進行，使用trc-50dx（ia型）視網(wǎng)膜照相機（日本東京topcon公司）進行眼底檢查和拍照，faf和ffa使用spectralis hra血管造影儀（德國海德堡海德堡工程gmbg）檢查，根據(jù)國際臨床視覺電生理學(xué)會（iscev，www.iscev.org）的標準，使用reti port/scan 21裝置（德國勃蘭登堡-德哈維爾羅蘭）進行erg和eog測試。全身檢查包括血液檢查、尿檢、心電圖、胸片、血液生化、血脂和凝血試驗，以排除其它系統(tǒng)性疾病。
77.根據(jù)《赫爾辛基宣言》關(guān)于人類受試者研究的指南，采集所有參與者的外周血樣本，同時提取基因組dna用于pax6突變篩查。先證者及其家人通過直接dna測序進行pax6基因突變鑒定。使用gencap捕獲試劑盒（mygenotics gencap enrichment technologies；mygenotics，inc.，中國北京）捕獲擴增dna。通過聚合酶鏈反應(yīng)（pcr）從基因組dna中擴增pax6的所有編碼外顯子。通過primer3程序設(shè)計用于擴增的引物。特異性遺傳性眼睛的目標富集小組收集了371個目標基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)（由馬里蘭州巴爾的摩mygenetics設(shè)計），用于下一代測序，其中包括37個與虹膜疾病相關(guān)的基因（pax6、elp4、foxd3、pitx3、foxe3、pitx2、adamts10、fbn1、ltbp2、adamts17、mthfr、tyr、mitf、pax3、snai2、sox10、rbp4、chd7、tmem67、rpgrip1l、cc2d2a、yap1、maf、c12orf57、foxc1、b3glct、nf1、gpr143、oca2、tyrp1、crygc、adamsl4、sall2、igbp1、cyp1b1、myoc、sall1）。一些虹膜異常疾病，如無虹膜、wagr綜合征、axenfeld-rieger綜合征與這些基因相關(guān)。特異性高通量測序采用相同的程序。
78.根據(jù)制造商的協(xié)議，進行了捕獲實驗。簡言之，將1μg dna文庫與緩沖液bl和gencap基因板探針（mygenotics，中國北京）混合，在pcr機上在95℃加熱7分鐘和65℃加熱2分鐘；然后將23μl 65
°
c預(yù)熱緩沖液hy（mygenostics inc，中國北京）添加到混合物中，并將混合物在65
°
c下保持，pcr蓋子加熱22小時以進行雜交。50μl肌酮珠粒（life technology）在500μl 1x結(jié)合緩沖液中洗滌3次，然后再懸浮在80μl 1x緩沖液中。向混合混合物中添加64μl 2x緩沖液，并用80μl肌酮珠轉(zhuǎn)移到試管中。混合物在旋轉(zhuǎn)器上旋轉(zhuǎn)1小時。然后在室溫下用wb1緩沖液清洗珠子15分鐘一次，在65
°
c下用wb3緩沖液清洗珠子15分鐘三次（wb1緩沖液和wb3緩沖液源自康為世紀）。然后用緩沖液洗脫結(jié)合的dna。最終使用以下程序?qū)⑾疵摰膁na擴增15個周期：98℃ 30秒（1個周期）；98
°
c持續(xù)25秒，65
°
c持續(xù)30秒，72
°
c持續(xù)30秒（15個循環(huán)）；72
°
c持續(xù)5分鐘（1個循環(huán)）。根據(jù)制造商的方案，使用spri珠（beckman coulter）純化pcr產(chǎn)物。富集文庫在illumina hiseq x ten測序儀上測序，成對讀取150bp。
79.進行測序后，原始數(shù)據(jù)以fastq格式保存（英國劍橋威康信托桑格研究所），使用cutadapt (http://cutadapt.readthedocs.io/en/stabl美國馬薩諸塞州劍橋市麻省理工學(xué)院）篩除illumina測序適配器和低質(zhì)量讀數(shù)（《80 bp），進行質(zhì)量控制。使用burrows
–
wheeler（bwa；http://bio-bwa.sourceforge.net)軟件包（wellcome trust sanger institute）檢測變異。使用picard (http://broadinstitute.github.io/picard麻省理工
學(xué)院，劍橋，馬薩諸塞州，美國）刪除重復(fù)讀取序列。使用gatk haplotype caller (https://software.broadinstitute.org/gatk；美國馬薩諸塞州劍橋市布羅德研究所）檢測單核苷酸多態(tài)性（snps）的變異以及插入和缺失。使用基因組分析工具包（gatk；broad institute）進行變異篩選。然后將數(shù)據(jù)結(jié)果轉(zhuǎn)換為變異調(diào)用格式，并用注釋變異對變異進行注釋（美國費城兒童醫(yī)院應(yīng)用基因組學(xué)中http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest)，在多個數(shù)據(jù)庫中搜索變異，如1000基因組（1000基因組項目聯(lián)盟），esp6500（國家心臟、肺和血液研究所exome測序項目，華盛頓大學(xué)，西雅圖，瓦城，美國），bsnp（國家生物技術(shù)信息中心，貝塞斯達，md，美國），exome聚集聯(lián)盟（blued institute），innhore（mygenostics，inc.）和人類基因突變數(shù)據(jù)庫（醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究所，威爾士）。利用基因組進化速率譜（gerphttp://mendel.stanford.edu/sidowlab/downloads/gerp/)，罕見的外顯子組變體組合學(xué)習(xí)（revel，https://sites.google.com/site/revelgenomics/)，區(qū)分不容忍與容忍突變（篩選，https://sift.bii.a-star.edu.sg；新加坡生物信息學(xué)研究所，新加坡共和國），polyph-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2哈佛大學(xué)、劍橋、美國、馬薩諸塞州）和突變計劃（www. mututhastest.org；查理埃特-柏林醫(yī)科大學(xué)，柏林，德國）預(yù)測突變的危害性。
80.根據(jù)以下原則篩選潛在的致病突變：（1）突變讀數(shù)不應(yīng)小于5，突變率》30%；（2）在1000個基因組、esp6500和內(nèi)部數(shù)據(jù)庫中，突變頻率不超過5%；（3）該突變不存在于innormal數(shù)據(jù)庫（mygenotics，inc.）中；（4）突變不是同義的。致病性突變是根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)院的標準和指南確定的。
81.實施例3 突變鑒定經(jīng)過實施例2中的致病突變篩選過程，在家系中的先證者的pax6基因外顯子7中發(fā)現(xiàn)了移碼突變，c.314dela（p.k105sfs*33），chr11:31823193-31823194，導(dǎo)致pax6蛋白發(fā)生移碼突變，第105號氨基酸由賴氨酸突變?yōu)榻z氨酸并產(chǎn)生新的閱讀框架，終止于第105號密碼子下游33號密碼子處。這種突變導(dǎo)致編碼氨基酸的過早終止，最終導(dǎo)致pax6單倍體劑量不足。其父母和未檢測到異常突變。這個突變在之前提到的數(shù)據(jù)庫或報告的文獻中都不存在，并通過sanger測序驗證，并檢測其它家族成員，這些雜合突變與相應(yīng)家族中的無虹膜表型共分離。受影響的個體攜帶突變，而未受影響的成員沒有（圖3a，圖3b）。這些結(jié)果表明，pax6 c.314dela（p.k105sfs*33），chr11:31823193-31823194是常染體顯性先天性無虹膜的新的致病突變。
82.在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、“一些實施方案”或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結(jié)合和組合。
83.盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。
技術(shù)特征：
1.一種核酸，其特征在于，與野生型pax6基因相比，所述核酸具有c.314dela突變。2.一種多肽，其特征在于，所述多肽由權(quán)利要求1所述的核酸表達而成。3.一種可檢測的基因突變，其特征在于，與野生型pax6基因相比，具有c.314dela突變。4.檢測權(quán)利要求1所述的核酸或權(quán)利要求2所述的多肽或權(quán)利要求3所述的可檢測的基因突變的試劑在制備試劑盒或者設(shè)備中的用途，其特征在于，所述試劑盒或者設(shè)備用于診斷先天性無虹膜癥，所述試劑包括特異性針對所述核酸、所述多肽、所述基因突變中至少之一的探針、引物、抗體以及質(zhì)譜檢測試劑的至少之一。5.生物模型在篩選藥物中的用途，其特征在于，所述生物模型攜帶下列至少之一：（1）權(quán)利要求1所述的核酸；（2）表達權(quán)利要求2所述的多肽；（3）權(quán)利要求3所述的可檢測的基因突變；其中，所述生物模型為細胞模型或者動物模型。6.特異性改變權(quán)利要求1所述的核酸或者權(quán)利要求3所述的可檢測的基因突變的試劑在制備藥物中的用途，其特征在于，所述藥物用于先天性無虹膜癥，所述先天性無虹膜癥為常染體顯性先天性無虹膜癥。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述試劑為基于同源重組修復(fù)、堿基的直接插入修復(fù)、talen、zfn中至少之一進行缺失修復(fù)的試劑。8.一種用于先天性無虹膜癥的藥物，其特征在于，所述藥物含有：特異性改變權(quán)利要求1所述的核酸或者權(quán)利要求3所述的可檢測的基因突變的試劑，所述先天性無虹膜癥為常染體顯性先天性無虹膜癥。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于先天性無虹膜癥的藥物，其特征在于，所述試劑為基于同源重組修復(fù)、堿基的直接插入修復(fù)、talen、zfn中至少之一進行缺失修復(fù)的試劑。10.一種構(gòu)建體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的核酸或權(quán)利要求3所述的可檢測的基因突變。11.一種重組細胞，其特征在于，所述重組細胞是通過權(quán)利要求10所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受體細胞獲得的。12.一種檢測先天性無虹膜癥的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括檢測權(quán)利要求1所述的核酸的試劑，和/或檢測權(quán)利要求2所述的多肽的試劑，和/或檢測權(quán)利要求3所述的可檢測的基因突變的試劑。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體涉及PAX6基因突變體及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種先天性無虹膜癥相關(guān)的基因突變體及其應(yīng)用，所提供的基因突變與野生型PAX6基因相比，具有c.314delA突變。該基因突變是先天性無虹膜癥的新的相關(guān)的致病突變，通過檢測該突變在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品源自的個體是否患先天性無虹膜癥。該基因突變擴大了PAX6基因的突變譜，為該疾病的診斷和提供了新的檢測位點，以及新的檢測方法和途徑。以及新的檢測方法和途徑。以及新的檢測方法和途徑。
