Prdx1IgG中和抗體及其制備方法和在制備急性器官損傷藥物中的應用
prdx1 igg中和抗體及其制備方法和在制備急性器官損傷藥物中的應用
技術領域
1.本發明屬于醫藥領域，具體涉及prdx1 igg中和抗體及其制備方法和在制備急性器官損傷藥物中的應用。
背景技術：
2.急性肝損傷(acute liver injury,以下簡稱ali)是由各種原因引起的肝臟損害，其病情發展迅速。研究表明，外源性物質，如病毒感染、濫用酒精或藥物以及接觸毒素都可能導致ali。在我國急性肝損傷的首要病因是病毒感染，其次是藥物。由于長期的肝損傷會導致慢性肝臟炎癥和纖維化反應，而ali所引起的壞死后型肝硬化更是不能治愈。這不僅嚴重影響患者的生活質量，同時也給國家帶來了沉重的醫療負擔。因此預防急性、慢加急性和/或慢性肝損傷對公共衛生非常重要。對于嚴重ali，肝移植是最有效的手段之一，但統計表明接受肝移植的患者不足10％。當前國內外對急性肝衰竭的十分有限，病死率非常高。因此，尋ali的替代療法是一項迫切的醫療需求。
3.全球范圍內已經開展了大量研究工作以尋有效的防治ali的藥物，部分在臨床使用較長時間，但目前這些藥物的效果依然差強人意。
4.急性腎損傷(acute kidney injury，aki)是一種臨床常見的綜合征，它的發生常伴隨著患者住院時間延長，部分患者預后不良進一步發展為慢性腎臟病。全球每年約1300萬人發生aki(85％的患者生活在發展中國家)，約170萬人死于aki及其并發癥。aki可發生于臨床多個學科，特別是在icu中發病率超過50％。在我國，一項大樣本多中心流行病學調查數據顯示，按照kdigo aki的診斷標準和擴展標準，aki發生率為0.99％和2.03％，而住院病死率高達12.4％。近年來，無論是高收入國家還是低收入國家，aki的患病率均呈迅速上升趨勢，且病死率居高不下，給國家和社會造成了巨大的經濟負擔。
5.長期以來臨床對于aki始終沿襲對癥支持的原則，靜待腎臟病變自身的轉歸，迄今為止尚無一種可以用于在aki中減輕腎組織損傷或促進腎臟修復或防止后期腎臟慢性纖維化的藥物獲批上市。
技術實現要素：
6.本發明所要解決的技術問題是，克服以上背景技術中提到的不足和缺陷，提供prdx1 igg中和抗體及其制備方法和在制備急性器官損傷藥物中的應用，用以解決目前醫藥領域對于急性肝損傷和急性腎損傷藥物的缺失的技術問題。
7.為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案為：
8.一種prdx1 igg中和抗體，其主要由igg與prdx1蛋白特異性結合后得到。
9.上述的prdx1 igg中和抗體，優選的，所述prdx1 igg中和抗體包括prdx1單克隆中和抗體或prdx1多克隆中和抗體。
10.優選的，所述prdx1 igg中和抗體包括兔來源、人來源、小鼠來源、大鼠來源或人鼠
嵌合的prdx1中和抗體。
11.peroxiredoxin1(prdx1，prx1)是一種抗氧化蛋白，屬于peroxiredoxins(prdxs)超家族。prdx1是該家族中表達最為廣譜、表達豐度最高的成員，被認為是體內最重要的抗氧化酶之一。經過前期的研究發現：prdx1的中和抗體具有對于急性肝、腎損傷的潛在作用。有望成為一種急性肝、腎損傷的新藥，用以解決目前醫藥領域對于急性肝損傷和急性腎損傷藥物的缺失的技術問題。
12.基于一個總的發明構思，還提供一種prdx1 igg中和抗體的制備方法，包括以下步驟：采用重組prdx1蛋白作為免疫原，免疫哺乳動物，獲得表達prdx1 igg中和抗體的哺乳動物，最后制備和純化prdx1 igg中和抗體。
13.上述的制備方法，優選的，具體包括以下步驟：
14.(1)選取兔作為免疫動物，在制備中和抗體之前進行血清采集；
15.(2)于第1天采用免疫原，即重組prdx1蛋白0.4-0.6mg，并予以完全弗氏佐劑對免疫動物進行皮下注射免疫原；
16.(3)于第14天、第35天、第56天采用免疫原，即重組prdx1蛋白0.2-0.3mg，并予以不完全弗氏佐劑對免疫動物進行皮下注射免疫；
17.(4)于第63天，采集步驟(3)處理后的兔血液，提取血清，使用血清進行elisa檢測是否存在prdx1 igg中和抗體；
18.(5)挑選出血清中表達prdx1 igg中和抗體的兔子，于第70天再次使用0.2-0.3mg免疫原并予以不完全弗氏佐劑對免疫動物進行加免；
19.(6)采集步驟(5)處理后的兔子血清，采用抗原親和柱純化抗體，即得到所述的prdx1igg中和抗體；并使用elisa法檢測其與prdx1重組蛋白的親和力；使用western blot法檢測prdx1 igg中和抗體的特異性。
20.基于一個總的發明構思，還提供一種prdx1 igg中和抗體在制備急性器官損傷藥物中應用。
21.優選的，所述急性器官損傷包括急性肝損傷、急性腎損傷、急性肺損傷或炎癥性腸病活動期損傷。
22.更優選的，所述急性肝損傷包括但不限于脂多糖/d-氨基半乳糖胺誘導或對乙酰氨基酚誘導的急性肝損傷；所述脂多糖/d-氨基半乳糖胺誘導的急性肝損傷的主要表現為炎癥、氧化應激/細胞壞死和凋亡；所述對乙酰氨基酚誘導的急性肝損傷為以藥物或毒物中毒引起的急性肝損傷。
23.更優選的，所述急性腎損傷包括但不限于腎缺血再灌注損傷誘導的急性腎損傷。所述腎缺血再灌注損傷誘導的急性腎損傷的主要表現為氧化應激或炎癥損傷。
24.所述急性肺損傷包括各種原因誘導的急性肺損傷；所述炎性腸病活動期損傷包括各種原因、病因引起的炎性腸病。
25.優選的，所述prdx1 igg中和抗體急性器官損傷可用于小鼠或其他哺乳動物。
26.優選的，所述prdx1 igg中和抗體用于急性肝損傷及急性腎損傷時，用于兔、鼠的給藥劑量為300ug/只。
27.與現有技術相比，本發明的有益效果為：
28.1.本發明利用重組prdx1蛋白免疫兔，獲得血清igg中和抗體(即prdx1 igg中和抗
體)，其有中和、阻斷血清中prdx1的促炎作用，能夠急性器官損傷，例如急性肝損傷、急性腎損傷、急性肺損傷和炎癥性腸病活動期損傷。
29.2.本發明制備原材料易得，凡是哺乳類都可以免疫產生prdx1 igg中和抗體，提取或重組同源性所有的prdx1蛋白都屬于免疫原。
附圖說明
30.為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
31.圖1為本發明用于免疫印跡的照片，上樣為小鼠原代巨噬細胞、肝組織、腎組織；
32.圖2為elisa檢測小鼠原代巨噬細胞分泌炎癥因子的結果；
33.圖3為脂多糖/d-氨基半乳糖誘導急性肝損傷模型中各組小鼠肝臟he染圖(200倍)；
34.圖4為對乙酰氨基酚誘導急性肝損傷模型中各組小鼠肝臟he染圖(200倍)；
35.圖5為缺血再灌注誘導的急性腎損傷模型中各組小鼠腎臟he染圖(200倍)。
具體實施方式
36.為了便于理解本發明，下文將結合說明書附圖和較佳的實施例對本發明做更全面、細致地描述，但本發明的保護范圍并不限于以下具體實施例。
37.除非另有定義，下文中所使用的所有專業術語與本領域技術人員通常理解含義相同。本文中所使用的專業術語只是為了描述具體實施例的目的，并不是旨在限制本發明的保護范圍。
38.除非另有特別說明，本發明中用到的各種原材料、試劑、儀器和設備等均可通過市場購買得到或者可通過現有方法制備得到。
39.本發明采用的重組prdx1蛋白為市場上可以買到的過氧化還原酶1重組蛋白，采購自abclone公司(武漢市東湖高新區生物園三路高科園三路9號武漢精準醫療產業基地，郵編430074)。
40.實施例1：
41.一種prdx1 igg中和抗體，由peroxiredoxin1和igg抗體特異性結合得到。其制備方法的步驟如下：
42.s1、選取兔作為免疫動物，在制備中和抗體之前進行血清采集(5ml/只)；
43.s2、于第1天采用免疫原，即重組prdx1蛋白0.5mg，并予以完全弗氏佐劑進行皮下多點(4點)注射免疫；
44.s3、于第14天、第35天、第56天采用免疫原，即重組prdx1蛋白0.25mg，并予以不完全弗氏佐劑進行皮下多點(4點)注射免疫；
45.s4、于第63天，采集上述兔的血液，1ml/只，提取血清，使用上述血清進行elisa檢測是否存在prdx1 igg中和抗體；
46.s5、挑選出血清中表達prdx1 igg中和抗體的兔子，于第70天再次使用0.25mg免疫
原并予以不完全弗氏佐劑進行加免；
47.s6、采集上述兔子血清，采用抗原親和柱純化抗體，得到所述的prdx1 igg中和抗體；并使用elisa法檢測其與prdx1重組蛋白的親和力(見下表1)；使用western blot法檢測prdx1 igg中和抗體的特異性(見圖1)，證明prdx1 igg可有效識別不同組織來源的prdx1。
48.表1通過elisa方法檢測prdx1 igg對于重組prdx1的結合活性
[0049][0050]
實驗方法：
[0051]
本實施例將在體外驗證prdx1 igg中和抗體可中和重組prdx1蛋白，阻斷其誘導小鼠原代巨噬細胞分泌炎癥因子的作用，下文將對prdx1 igg中和抗體的體外抗炎效果進行論證：
[0052]
1.實驗方法
[0053]
(1)小鼠原代巨噬細胞的提取
[0054]
采用10周齡c57雄性小鼠3只，3％硫代乙醇酸鹽溶液按每只小鼠3ml的量腹腔注射。3天后處死小鼠，收集腹腔灌洗液鋪板，2h后換液洗去未貼壁細胞。
[0055]
(2)重組prdx1刺激小鼠原代巨噬細胞
[0056]
上述原代巨噬細胞采用空1640培基培養，分為空白組、重組prdx1刺激組、重組prdx1+prdx1 igg中和抗體組、prdx1 igg中和抗體組。重組prdx1刺激時加入200nm prdx1，prdx1 igg中和抗體每孔加入200nm(以一般igg平均分子量約為160kda換算得到)。12或24h后收集細胞上清，elisa法檢測上清內的炎癥因子含量。
[0057]
2.統計學方法：所有計量數據以
±
s表示，多組間比較采用單因素方差(anova)分析：該統計學方法是藥物領域實驗中對于此類多組間療效差異比較的最常用方法。得到組間有差異后，再使用turky檢驗進一步驗證組內差異。定義雙側p《0.05認為有統計學意義。
[0058]
3.實驗結果
[0059]
3.1prdx1 igg中和抗體可以阻斷重組prdx1刺激小鼠原代巨噬細胞產生il-1β、tnf-α及il-6等炎癥因子的作用(如圖2)差異，證明prdx1 igg中和抗體可阻斷小鼠原代巨噬細胞分泌炎癥因子，具有統計學意義。
[0060]
實施例2：
[0061]
本實施例將prdx1 igg中和抗體應用于急性肝損傷藥物的制備中，下文將對prdx1 igg中和抗體的效果進行論證：
[0062]
1.實驗方法
[0063]
(1)制備脂多糖/d-氨基半乳糖胺誘導急性肝損傷(ali)實驗動物模型以觀察
prdx1 igg中和抗體炎癥、氧化應激/細胞壞死和凋亡為主要表現的ali的療效：
[0064]
spf級c57bl/6小鼠(10-12周齡，雄性，體重25-28g)共17只，分為3組，分別為對照組、模型組和實驗組。模型組及prdx1 igg中和抗體組小鼠以100μg/kg lps和500mg/kg d-gain的劑量腹腔注射造模。造模后2h予以中和抗體組小鼠prdx1 igg中和抗體300ug/只的劑量腹腔注射，而正常組及模型組小鼠注射同等劑量的對照igg。造模后6h麻醉小鼠并采血留取血清，隨后處死小鼠。
[0065]
(2)制備對乙酰氨基酚(paracetamol，apap)誘導急性肝損傷(ali)實驗動物模型以觀察prdx1 igg中和抗體藥物、毒物中毒等引起的ali的療效：
[0066]
spf級c57bl/6小鼠(8-10周齡，雄性，體重23-25g)共18只，分為3組，分別為對照組、模型組和實驗組。模型組及prdx1 igg中和抗體組小鼠以300mg/kgapap的劑量腹腔注射造模。對照組小鼠每只腹腔注射生理鹽水0.3ml。造模后2h予以中和抗體組小鼠prdx1 igg中和抗體300ug/只的劑量腹腔注射，而正常組及模型組小鼠注射同等劑量的對照igg。造模后8h麻醉小鼠并采血留取血清，隨后處死小鼠。
[0067]
分離(1)和(2)的小鼠肝臟，留取左外葉制石蠟切片，余下肝臟組織置于液氮罐中。連續監測法檢測各組小鼠肝功能，石蠟切片行he染觀察肝臟損傷情況。
[0068]
lps/d-gain模型肝臟組織損傷評分標準參考carlos a.等人采用的方法對肝臟病理損傷進行半定量分析。評分標準：0級：受傷的證據很少或沒有；1級：輕度損傷，胞漿空泡化，局灶性核固縮；2級：中度至重度損傷，伴有廣泛的核固縮、胞質嗜酸性粒細胞增多和胞間邊界缺失；3級：伴有肝索脫失、出血和中性粒細胞浸潤的嚴重壞死。apap模型中肝臟組織損傷評分標準參考zhang-xu liu等人采用的方法對肝臟病理損傷進行半定量分析。評分標準：0分：無損傷；0.5分：在鄰近中心層的第一個細胞層上看到的單個壞死細胞，并且存在亞線變性；1分：壞死細胞從中央靜脈延伸出兩到三個細胞層；2分：壞死細胞從中央靜脈延伸三至六個細胞層，但局限于周圍分布；3分：與2相同，但壞死從一個中心靜脈延伸到另一個；4分：比3更嚴重，整個切片廣泛小葉中心壞死。每張切片隨機選取200倍視野5個視野進行評分，取平均值為該例樣本評分值。
[0069]
2.統計學方法：所有計量數據以
±
s表示，多組間比較采用單因素方差(anova)分析：該統計學方法是藥物領域實驗中對于此類多組間療效差異比較的最常用方法。得到組間有差異后，再使用turky檢驗進一步驗證組內差異，即模型組與對照組的差異及各劑量給藥組相對于模型組的差異是否具有統計學意義。定義雙側p《0.05認為有統計學意義。
[0070]
3.實驗結果
[0071]
3.1he染結果
[0072]
lps/g-gain損傷后6小時，小鼠肝臟出現了較為廣泛胞間邊界缺失，肝索脫失及壞死、肝竇充血，核固縮。與模型組相比，予以prdx1 igg中和抗體后的小鼠肝臟中，上述病變明顯減輕，損傷范圍減小(如圖3所示)，且肝臟損傷病理評分明顯降低(p《0.05)，見表2。apap損傷后24小時，小鼠肝臟出現了較為廣泛細胞凋亡、核固縮及壞死。與模型組相比，予以prdx1 igg中和抗體后的小鼠肝臟中，上述病變明顯減輕，損傷范圍減小(如圖4所示)，見表3。
[0073]
表2 lps/g-gain致肝損傷中各組小鼠肝臟損傷評分(x
±
s)
[0074][0075][0076]
表3 apap致肝損傷中各組小鼠肝臟損傷評分(x
±
s)
[0077][0078]
3.2各組小鼠血轉氨酶檢測結果
[0079]
與對照組相比，lps/d-gain模型組小鼠血轉氨酶明顯升高，予以prdx1 igg中和抗體療后，小鼠血轉氨酶明顯下降，且差異具有統計學意義(p《0.001)，詳見表4。與對照組相比，apap模型組小鼠血轉氨酶明顯升高，予以prdx1 igg中和抗體療后，小鼠血轉氨酶明顯下降，且差異具有統計學意義(p《0.01)，詳見表5。
[0080]
表4 lps/d-gain致肝損傷中各組小鼠血轉氨酶水平(x
±
s)
[0081][0082]
表5 apap致肝損傷中各組小鼠血轉氨酶水平(x
±
s)
[0083][0084]
上表2、表3、表4、表5中，*與對照組相比，p《0.05；**與對照組相比，p《0.01；***與對照組相比，p《0.001；#與對照組相比，p《0.05；##與對照組相比，p《0.01；###與對照組相比，p《0.001；
[0085]
4.實驗結論：prdx1 igg中和抗體能有效lps/d-gain及apap誘導的小鼠急性肝損傷。
[0086]
實施例3：
[0087]
本實施例將prdx1 igg中和抗體應用于急性腎損傷藥物的制備中，下文將對prdx1 igg中和抗體對于缺血再灌注引起的急性腎損傷(以氧化應激及炎癥為主要損傷表現)的效果進行論證：
[0088]
1.實驗方法
[0089]
(1)制備腎缺血再灌注損傷(iri)誘導的急性腎損傷(aki)小鼠模型以觀察prdx1 igg中和抗體aki的療效：spf級c57bl/6小鼠(8-10周齡，雄性，體重23-25g)共11只，分為3組，分別為對照組、iri+igg組和iri+prdx1中和抗體組。iri+igg組及iri+prdx1中和抗體組小鼠用水合氯醛麻醉，剃除背部毛發，背部左右兩側切口暴露并分離雙側腎蒂，用非創傷性微血管夾夾住腎蒂30分鐘，然后松開血管夾開始再灌注，縫合切口。在整個手術過程中，小鼠體溫通過溫控加熱裝置保持在36.5-37.5℃。造模后20h予以中和抗體組小鼠prdx1 igg中和抗體300ug/只的劑量腹腔注射，而正常組及模型組小鼠注射同等劑量的對照igg。造模后24h麻醉小鼠并采血留取血清，隨后用生理鹽水進行心臟灌注并處死小鼠。分離小鼠腎臟，留取同一側腎臟的一半組織固定，石蠟包埋切片行he染觀察腎臟損傷情況；余下組織置于液氮罐中。小鼠血清送檢腎功能檢測。
[0090]
2.統計學方法：所有計量數據以
±
s表示，多組間比較采用單因素方差(anova)分析：該統計學方法是藥物領域實驗中對于此類多組間療效差異比較的最常用方法。得到組間有差異后，再使用turky檢驗進一步驗證組內差異，即模型組與對照組的差異及各劑量給藥組相對于模型組的差異是否具有統計學意義。定義雙側p《0.05認為有統計學意義。
[0091]
3.實驗結果
[0092]
3.1 he染結果
[0093]
可見模型組(iri)小鼠腎小管出現明顯的腎小管的上皮細胞明顯腫脹、空泡變性、脫落、壞死及管腔擴張。予以prdx1 igg中和抗體后，上述病變范圍及程度均明顯減輕(如圖5)。在he染切片中對腎小管損傷進行評分。實驗結果顯示，與假手術組相比，模型組腎小管損傷評分顯著的增高，差異具有統計學意義(p＜0.001)；在給予prdx1 igg中和抗體后，與模型組相比，腎小管損傷評分顯著降低(p＜0.001)。
[0094]
3.2各組小鼠血腎功能檢測結果
[0095]
與對照組相比，缺血再灌模型組小鼠血肌酐明顯升高，予以prdx1中和抗體療后，小鼠血血肌酐明顯下降，且差異具有統計學意義(p《0.01)，詳見表6。
[0096]
表6缺血再灌致腎損傷中各組小鼠血腎功能水平(x
±
s)
[0097][0098][0099]
表中，*與對照組相比，p《0.05；**與對照組相比，p《0.01；***與對照組相比，p《0.001；
#
與模型組相比，p《0.05；
##
與模型組相比，p《0.01；
###
與模型組相比，p＜0.001。
[0100]
4.實驗結論：prdx1中和抗體能有效缺血再灌誘導的小鼠急性腎損傷。
技術特征：
1.一種prdx1 igg中和抗體，其特征在于，其主要由igg與prdx1蛋白特異性結合后得到。2.根據權利要求1所述的prdx1 igg中和抗體，其特征在于，所述prdx1 igg中和抗體包括prdx1單克隆中和抗體或prdx1多克隆中和抗體。3.根據權利要求1或2所述的prdx1 igg中和抗體，其特征在于，所述prdx1 igg中和抗體包括兔來源、人來源、小鼠來源、大鼠來源或人鼠嵌合的prdx1中和抗體。4.一種如權利要求1-3中任一項所述的prdx1 igg中和抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：采用重組prdx1蛋白作為免疫原，免疫哺乳動物，獲得表達prdx1 igg中和抗體的哺乳動物，最后制備和純化prdx1 igg中和抗體。5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟：(1)選取兔作為免疫動物，在制備中和抗體之前進行血清采集；(2)于第1天采用免疫原，即重組prdx1蛋白0.4-0.6mg，并予以完全弗氏佐劑對免疫動物進行皮下注射免疫原；(3)于第14天、第35天、第56天采用免疫原，即重組prdx1蛋白0.2-0.3mg，并予以不完全弗氏佐劑對免疫動物進行皮下注射免疫；(4)于第63天，采集步驟(3)處理后的兔血液，提取血清，使用血清進行elisa檢測是否存在prdx1 igg中和抗體；(5)挑選出血清中表達prdx1 igg中和抗體的兔子，于第70天再次使用0.2-0.3mg免疫原并予以不完全弗氏佐劑對免疫動物進行加免；(6)采集步驟(5)處理后的兔子血清，采用抗原親和柱純化抗體，即得到所述的prdx1igg中和抗體。6.一種如權利要求1-3中任一項所述的prdx1 igg中和抗體或由權利要求4-5中任一項所述制備方法制備得到的prdx1 igg中和抗體在制備急性器官損傷藥物中應用。7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述急性器官損傷包括急性肝損傷、急性腎損傷、急性肺損傷或炎癥性腸病活動期損傷。8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述急性肝損傷包括脂多糖/d-氨基半乳糖胺誘導或對乙酰氨基酚誘導的急性肝損傷。9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述脂多糖/d-氨基半乳糖胺誘導的急性肝損傷的主要表現為炎癥、氧化應激/細胞壞死和凋亡；所述對乙酰氨基酚誘導的急性肝損傷為以藥物或毒物中毒引起的急性肝損傷。10.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述急性腎損傷包括腎缺血再灌注損傷誘導的急性腎損傷；所述腎缺血再灌注損傷誘導的急性腎損傷的主要表現為氧化應激或炎癥損傷。
技術總結
本發明屬于醫藥領域，具體公開了一種Prdx1IgG中和抗體，其主要由IgG與Prdx1蛋白特異性結合后得到。還公開了該Prdx1IgG中和抗體的制備方法和在制備急性器官損傷藥物中應用。本發明利用重組prdx1蛋白免疫哺乳動物，獲得血清IgG中和抗體(即Prdx1IgG中和抗體)，其有中和、阻斷血清中Prdx1的促炎作用，能夠急性器官損傷，例如急性肝損傷、急性腎損傷、急性肺損傷和炎癥性腸病活動期損傷。肺損傷和炎癥性腸病活動期損傷。肺損傷和炎癥性腸病活動期損傷。
