半抗原、人工抗原和的檢測(cè)方法
1.本發(fā)明涉及食品安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及半抗原、人工抗原和的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
2.，作為擬除蟲菊酯類殺蟲劑的一種，是一類神經(jīng)毒劑，由于其低毒和易生物降解等優(yōu)良特性，該類殺蟲劑于20世紀(jì)80年代得到大力發(fā)展。其主要作用途徑為觸殺和胃毒，原理是抑制生物體atp酶活性，對(duì)鈉離子通道造成干擾，擾亂昆蟲神經(jīng)的正常生理，使之由興奮、痙攣到麻痹而死亡。
3.隨著有機(jī)磷、氨基甲酸酯類等高毒農(nóng)藥的禁用，該類農(nóng)藥具備了更廣泛的使用空間，但同時(shí)也帶來了環(huán)境污染和食品安全的問題。20世紀(jì)90年代以來,國內(nèi)外大量檢測(cè)結(jié)果表明,擬除蟲菊酯類農(nóng)藥中和氟氯氰菊酯是蔬菜中殘留出現(xiàn)頻率和殘留量最高的農(nóng)藥之一。現(xiàn)有研究證實(shí)，對(duì)水生動(dòng)物毒性高，對(duì)某些益蟲也有傷害，長期重復(fù)使用還易導(dǎo)致害蟲產(chǎn)生抗藥性。噴灑于蔬菜水果上的農(nóng)藥部分殘留甚至被植物所吸收，人類食用會(huì)導(dǎo)致其進(jìn)入人體并進(jìn)一步富集。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥進(jìn)入人體后會(huì)快速代謝，發(fā)生酯鍵斷裂和氧化作用生成cis/trans-3-(2,2-二氯苯乙烯基)-2,2-二甲基環(huán)丙基-1-羧酸和3-苯氧基苯甲醇，3-苯氧基苯甲醇進(jìn)一步氧化成3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid,3-pba)。根據(jù)gb 2763-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》，的最大殘留限量為0.01-5mg/kg。可見擬除蟲菊酯類殺蟲劑對(duì)多種生物體構(gòu)成的潛在健康風(fēng)險(xiǎn)不容忽視，發(fā)展更為先進(jìn)、有效、靈敏的農(nóng)殘檢測(cè)技術(shù)就顯得尤為重要。
4.目前，的檢測(cè)方法較少，傳統(tǒng)檢測(cè)方法有氣相譜法(gc)、高效液相譜法(hplc)，氣相譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gc-ms/ms)等。儀器檢測(cè)技術(shù)雖具有較好的準(zhǔn)確性，但所需要的儀器昂貴，樣品前處理復(fù)雜，且檢測(cè)時(shí)間長，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求。酶聯(lián)免疫分析技術(shù)具有靈敏度高、快速、高通量等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。瞿建宏等制備了的多克隆抗體，建立了水產(chǎn)品中該農(nóng)藥殘留的elisa檢測(cè)方法，檢出限為20μg/kg(瞿建宏，馬曉燕，劉洪波，等.水產(chǎn)品中殘留的elisa快速檢測(cè)[j].安全與環(huán)境學(xué)報(bào).2007(04):1-5.)。該多抗雖有較好的靈敏度，但與單克隆抗體相比其親和力及穩(wěn)定性較差，抗體效果受免疫動(dòng)物影響較大且無法大量制備。羅香文等同樣制備了的多克隆抗體，獲得了更高靈敏度，elisa方法檢出限為8.5μg/l(羅香文，張德詠，劉勇，等.多克隆抗體的制備[j].農(nóng)藥.2009,48(12):872-874.)，但該抗體暴露出特異性較差的缺點(diǎn)，與氰戊菊酯有15％以上的交叉率。
[0005]
為進(jìn)一步完善我國食品安全監(jiān)測(cè)體系，滿足農(nóng)藥殘留現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求，膠體金試紙條檢測(cè)技術(shù)越來越受到青睞。胡靜等建立了菊酯類農(nóng)藥的廣譜型免疫層析檢測(cè)方法，對(duì)的最低檢出限為0.5μg/ml(胡靜，郭逸蓉，梁曉，等.菊酯類農(nóng)藥廣譜型免疫層析試紙條的研究及應(yīng)用[j].分析化學(xué).2016,44(12):1900-1906)梁科等評(píng)價(jià)了廣州達(dá)元綠洲所研發(fā)的膠體金試紙條，其最低檢出限為2mg/kg(梁科，黃紫茵，葉秋雄，等.
膠體金法快速檢測(cè)茶葉中農(nóng)藥殘留[j].食品安全導(dǎo)刊.2021(30):54-55.)。
[0006]
目前，關(guān)于的膠體金試紙條研究報(bào)道較少，且靈敏度較差，因此，需制備一種針對(duì)的特異性單克隆抗體，發(fā)明的靈敏、快速、簡便的檢測(cè)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
[0007]
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供半抗原、人工抗原和的檢測(cè)方法。
[0008]
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種半抗原。
[0009]
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供另一種半抗原。
[0010]
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種半抗原。
[0011]
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供另一種半抗原。
[0012]
本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供所述半抗原在制備人工抗原中的應(yīng)用。
[0013]
本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)的組合物
[0014]
本發(fā)明的第七個(gè)目的是提供所述的半抗原、所述的人工抗原在、或所述組合物在制備檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
[0015]
本發(fā)明的第八個(gè)目的是提供一種的檢測(cè)試劑盒。
[0016]
本發(fā)明的第九個(gè)目的是提供一種非疾病診斷目的的的檢測(cè)方法。
[0017]
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下方案予以實(shí)現(xiàn)的：
[0018]
一種半抗原(半抗原1)，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式如式(i)所示，
[0019][0020]
采用系統(tǒng)命名法命名為(z)-3-(3-((氰基(3-苯氧基苯基)甲氧基)羰基)-2,2-二甲基環(huán)丙基)-2-甲基丙烯酸。
[0021]
其制備方法，包括如下步驟：
[0022]
(1)將高效氯氰菊酯溶于二氯甲烷并轉(zhuǎn)移至冷阱中，在-78℃下通入預(yù)干燥并預(yù)冷卻的臭氧，反應(yīng)完成后通入預(yù)干燥并預(yù)冷卻的氮?dú)猓尤攵琢蛎眩?78℃通氮?dú)夤呐莘磻?yīng)后取出，蒸干溶劑過柱純化得無油狀中間體1，
[0023][0024]
(2)稱取(叔丁氧羰基亞甲基)三苯基膦烷，用二氯甲烷溶解，冰水浴下滴加，滴加完成后室溫反應(yīng)過夜。反應(yīng)完成后加飽和碳酸氫鈉萃取，有機(jī)相干燥旋干，
[0025][0026]
(3)取中間體1再加入甲基化三苯基磷乙酸叔丁酯，用絕干四氫呋喃溶解。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)5h。反應(yīng)完成后加適量水用乙酸乙酯萃取2～3遍，合并有機(jī)相，蒸干后過柱純化，得到無油狀中間體2，
[0027][0028]
(4)取中間體2溶于二氯甲烷中，再加入三氟乙酸。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h。反應(yīng)完成后旋蒸除去溶劑，加乙酸乙酯，用檸檬酸-檸檬酸鈉飽和溶液洗滌兩次，再用水洗滌兩次，最后用飽和食鹽水洗滌一次，有機(jī)相干燥后旋干,得無油狀物，
[0029][0030]
一種人工抗原(人工抗原1)，為所述構(gòu)式如式(i)所示半抗原(半抗原1)偶聯(lián)載體蛋白，其結(jié)構(gòu)式如式(iii)所示，
[0031][0032]
優(yōu)選地，所述載體蛋白為乳鐵蛋白(lf)、牛血清白蛋白(bsa)、卵清白蛋白(ova)、或血藍(lán)蛋白(klh)中的一種或幾種
[0033]
其制備方法包括如下步驟：
[0034]
將載體蛋白溶于bb緩沖溶液(硼酸緩沖液)中得載體蛋白溶液；將結(jié)構(gòu)式如式(i)所示半抗原溶于dmf(n,n-二甲基甲酰胺)中，加入edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基))和nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)室溫避光攪拌反應(yīng)過夜，得結(jié)構(gòu)式如式(i)所示半抗原活化液；將結(jié)構(gòu)式如式(i)所示半抗原活化液緩慢滴加入溶解有載體蛋白的溶液中，攪拌均勻，室溫避光偶聯(lián)4h；偶聯(lián)混合物低溫下透析3天，得到結(jié)構(gòu)式如式(iii)所示人工抗原。
[0035]
優(yōu)選地，所述結(jié)構(gòu)式如式(i)所示半抗原與載體蛋白的摩爾比為1:125。
[0036]
優(yōu)選地，所述結(jié)構(gòu)式如式(iii)所示人工抗原1的制備方法，包括如下步驟：
[0037]
(1)將16mg載體蛋白溶解于1.6ml的bb緩沖液(0.1m ph＝9.0)中，得載體蛋白溶液，并加入0.5ml dmf；
[0038]
(2)取16.2mg的結(jié)構(gòu)式如式(i)所示半抗原溶解于0.5ml dmf溶液中，得結(jié)構(gòu)式如式(i)所示半抗原溶液；
[0039]
(3)將12mg的edc和10mg的nhs加入到步驟(2)的結(jié)構(gòu)式如式(i)所示半抗原溶液中，室溫反應(yīng)過夜，得活化液；
[0040]
(4)取步驟(3)活化液150μl緩慢滴加到步驟(1)的載體蛋白溶液中，室溫避光偶聯(lián)4h；偶聯(lián)混合物于4℃、pbs緩沖液透析3天，得到結(jié)構(gòu)式如式(iii)所示人工抗原。
[0041]
一種半抗原(半抗原2)，其結(jié)構(gòu)式如式(ⅱ)所示，
[0042][0043]
其采用系統(tǒng)命名法命名為3-((氰基(4-氟-3-苯氧基苯基)甲氧基)羰基)-2,2-二甲基環(huán)丙烷-1-羧酸。
[0044]
其制備方法，包括如下步驟：
[0045]
用混合液體積比為ch3cn:ccl4:h2o＝10:10:15的溶劑溶解氟氯氰菊酯，加入高碘酸鈉，三氯化釕，升溫至60℃，反應(yīng)1.5h。旋蒸溶劑，萃取，飽和食鹽水洗滌，加入無水硫酸鈉干燥，過濾，過柱純化得黑油狀物。
[0046]
一種人工抗原(人工抗原2)，為所述結(jié)構(gòu)式如式(ii)所示的半抗原偶聯(lián)載體蛋白，其結(jié)構(gòu)式如式(iv)所示，
[0047][0048]
結(jié)構(gòu)式如式(iv)所示人工抗原制備方法，包括如下步驟：
[0049]
將載體蛋白溶于cb緩沖溶液(碳酸緩沖溶液)中得載體蛋白溶液；將結(jié)構(gòu)式如式(ii)所示的半抗原溶于dmf中，加入edc和nhs室溫避光攪拌反應(yīng)4h，得結(jié)構(gòu)式如式(ii)所示的半抗原活化液；將結(jié)構(gòu)式如式(ii)所示的半抗原活化液緩慢滴加入溶解有載體蛋白的溶液中，攪拌均勻，室溫避光偶聯(lián)過夜；偶聯(lián)混合物低溫下透析三天，得到結(jié)構(gòu)式如式(iv)所示人工抗原。
[0050]
優(yōu)選地，所述半抗原2與載體蛋白的摩爾比為1：30。
[0051]
優(yōu)選地，所述結(jié)構(gòu)式如式(iv)所示人工抗原的制備方法，包括如下步驟：
[0052]
(1)將50mg載體蛋白溶解于5ml的cb緩沖液中(0.01m ph＝9.8)，得載體蛋白溶液；
[0053]
(2)取8.72mg的半抗原2溶解于0.5ml dmf溶液中，得結(jié)構(gòu)式如式(ii)所示的半抗原溶液；
[0054]
(3)將6.75mg的edc和4mg的nhs加入到步驟(2)的結(jié)構(gòu)式如式(ii)所示的半抗原溶液中，室溫反應(yīng)4h，得活化液；
[0055]
(4)取步驟(3)活化液滴加到步驟(1)的載體蛋白溶液中，室溫避光偶聯(lián)過夜；偶聯(lián)混合物于4℃、pbs緩沖液透析3天，得到結(jié)構(gòu)式如式(iv)所示人工抗原。
[0056]
以上所述半抗原中的一個(gè)或幾個(gè)在制備人工抗原中的應(yīng)用，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0057]
本發(fā)明還要求保護(hù)一種用于檢測(cè)的組合物，含有所述的結(jié)構(gòu)式如式(iii)所示人工抗原和結(jié)構(gòu)式如式(iv)所示人工抗原，所述的結(jié)構(gòu)式如式(iii)所示人工抗原作為免疫原，所述的結(jié)構(gòu)式如式(iv)所示人工抗原作為包被原。
[0058]
優(yōu)選地，所述的結(jié)構(gòu)式如式(iii)所示人工抗原的載體蛋白為乳鐵蛋白作為免疫原，所述的結(jié)構(gòu)式如式(iv)所示人工抗原的載體蛋白為牛血清白蛋白作為包被原。
[0059]
以上所述的半抗原、以上所述的人工抗原在、或所述組合物在制備檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0060]
本發(fā)明還要求保護(hù)一種的檢測(cè)試劑盒，含有所述組合物。
[0061]
本發(fā)明還要求保護(hù)一種非疾病診斷目的的的檢測(cè)方法，利用所述組合物。
[0062]
優(yōu)選地，所述的結(jié)構(gòu)式如式(iv)所示的，載體蛋白為牛血清白蛋白的人工抗原作為包被原，結(jié)構(gòu)式如式(iii)所示的，載體蛋白為乳鐵蛋白的人工抗原，作為免疫原免疫動(dòng)物制備得到的抗體為檢測(cè)抗體進(jìn)行檢測(cè)。
[0063]
優(yōu)選地，包被濃度為4μg/ml，抗體稀釋倍數(shù)為16000倍。
[0064]
所述免疫分析方法包括但不局限于酶免疫分析、免疫層析、免疫傳感、或免疫膠體金等中的一種或幾種。
[0065]
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0066]
本發(fā)明制備得到了結(jié)構(gòu)式如式(i)所示半抗原，其偶聯(lián)載體蛋白結(jié)構(gòu)式如式(iii)所示得到人工抗原；制備得到了結(jié)構(gòu)式如式(ii)所示半抗原，其偶聯(lián)載體蛋白結(jié)構(gòu)式如式(iv)所示得到人工抗原，并進(jìn)一步制備得到用于檢測(cè)的特異性抗體，應(yīng)用結(jié)構(gòu)式如式(iii)所示得到人工抗原作為包被原，結(jié)構(gòu)式如式(iv)所示得到人工抗原作為人工包被原，該抗體對(duì)具有良好的靈敏度，半抑制濃度為42.92ng/ml，最低檢測(cè)限為15.11ng/ml。對(duì)常見菊酯類農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率均低于1％，說明該抗體對(duì)具有良好的特異性，可有效的排除其他菊酯類藥物的干擾，為建立的免疫檢測(cè)方法提供了核心試劑。利用本發(fā)明的半抗原、人工抗原、抗體實(shí)現(xiàn)了快速準(zhǔn)確檢測(cè)相關(guān)樣品中的目的。
附圖說明
[0067]
圖1為本技術(shù)實(shí)施例1的半抗原1的合成路線圖。
[0068]
圖2為本技術(shù)實(shí)施例1的半抗原1的質(zhì)譜鑒定圖。
[0069]
圖3為本技術(shù)實(shí)施例2的半抗原1、人工抗原1(半抗原1-lf)、lf紫外掃描圖。
[0070]
圖4為本技術(shù)實(shí)施例3的半抗原1、人工抗原2(半抗原1-bsa)、bsa紫外掃描圖。
[0071]
圖5為本技術(shù)實(shí)施例4的半抗原2的合成路線圖。
[0072]
圖6為本技術(shù)實(shí)施例4的半抗原2的質(zhì)譜鑒定圖。
[0073]
圖7為本技術(shù)實(shí)施例5的半抗原2、人工抗原3(半抗原2-bsa)、bsa紫外掃描圖。
[0074]
圖8為本技術(shù)實(shí)施例6以人工抗原1(半抗原1-lf)為免疫原所制備的抗體對(duì)的抑制曲線。
具體實(shí)施方式
[0075]
下面結(jié)合說明書附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。
[0076]
實(shí)施例1半抗原1的合成與鑒定
[0077]
一、實(shí)驗(yàn)方法
[0078]
1、半抗原1的合成
[0079]
稱取(5.00g，2.011mmol)高效氯氰菊酯(cas：65731-84-2)，用40ml二氯甲烷溶解后轉(zhuǎn)移至冷阱中，在-78℃下通入預(yù)干燥并預(yù)冷卻的臭氧反應(yīng)5h。反應(yīng)完成后通入預(yù)干燥并預(yù)冷卻的氮?dú)?5min(提供惰性氣體環(huán)境保護(hù)，防止副反應(yīng)發(fā)生)，再加入3.73g(60.053mmol 4.41ml)二甲硫醚，-78℃通氮?dú)夤呐莘磻?yīng)30min后取出(保證液體處于惰性環(huán)境中)，蒸干溶劑，使用300～400目硅膠柱純化得無油狀物即中間體1(臭氧不可由空氣制備必須使用純氧制備)。
[0080]
稱取3.76g(9.988mmol)(叔丁氧羰基亞甲基)三苯基膦烷，用30ml二氯甲烷溶解，得到(叔丁氧羰基亞甲基)三苯基膦烷的二氯甲烷溶液。冰水浴下，向(叔丁氧羰基亞甲基)三苯基膦烷的二氯甲烷溶液滴加(1.56g 10.987mmol)，滴加完成后室溫反應(yīng)過夜。反應(yīng)完成后加飽和碳酸氫鈉萃取，將有機(jī)相進(jìn)行旋蒸，得到甲基化三苯基磷乙酸叔丁酯。
[0081]
取(1.243g，3.558mmol)中間體1再加入(2.08g，5.336mmol)甲基化三苯基磷乙酸叔丁酯，用無水四氫呋喃20ml溶解。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)5h。反應(yīng)完成后加適量水用乙酸乙酯萃取2～3遍，合并有機(jī)相，將有將有機(jī)相進(jìn)行旋蒸，蒸干后過柱純化，得到無油狀物即中間體2。
[0082]
取(1.296g，2.808mmol)中間體2溶于10ml二氯甲烷中，再加入5ml三氟乙酸，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h。反應(yīng)完成后旋蒸除去溶劑(二氯甲烷和三氟乙酸)，加乙酸乙酯，用檸檬酸-檸檬酸鈉飽和溶液(0.1m ph＝6.0的檸檬酸緩沖鹽，由0.1m檸檬酸和0.1m檸檬酸三鈉
混合配制)洗滌兩次，再用水洗滌兩次，最后用飽和食鹽水洗滌一次，有機(jī)相干燥后旋干，得無油狀物。
[0083]
2、半抗原1的鑒定
[0084]
對(duì)半抗原1進(jìn)行質(zhì)譜及核磁氫譜分析，以確定其分子量及結(jié)構(gòu)特征。
[0085]
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0086]
半抗原1的核磁結(jié)果：1h nmr(600mhz,dmso)δ12.23(s,3h),7.52(d,j＝8.0hz,3h),7.43(t,j＝8.0hz,7h),7.35(s,2h),7.20(s,3h),7.19(d,j＝17.3hz,6h),7.18(s,3h),7.14
–
7.08(m,3h),7.07(dd,j＝8.3,7.3hz,6h),7.11
–
7.02(m,6h),7.01(dd,j＝8.9,7.8hz,2h),6.72(d,j＝7.0hz,2h),6.69
–
6.49(m,1h),5.76(s,4h),5.76(s,3h),2.32
–
2.20(m,2h),2.15(dd,j＝4.6,1.9hz,5h),2.15(dd,j＝4.6,1.9hz,3h),1.82(dd,j＝7.7,1.1hz,6h),1.82(dd,j＝7.7,1.1hz,6h),1.18(dt,j＝9.0,3.6hz,21h),1.22
–
1.11(m,25h).
[0087]
半抗原1的esi-ms鑒定結(jié)果：如圖2所示，該半抗原1的ms：c
24h23
no5：405.45，esi-[m-h]-：404.10。
[0088]
半抗原1的結(jié)構(gòu)式如式(i)所示：
[0089][0090]
半抗原1采用系統(tǒng)命名法命名為(z)-3-(3-((氰基(3-苯氧基苯基)甲氧基)羰基)-2,2-二甲基環(huán)丙基)-2-甲基丙烯酸。
[0091]
實(shí)施例2人工抗原1的合成與鑒定
[0092]
一、實(shí)驗(yàn)方法
[0093]
1、人工抗原1的合成
[0094]
利用實(shí)施例1制備得到的半抗原1，通過活潑酯法偶聯(lián)乳鐵蛋白(lf)制備人工抗原1，其方法具體如下：
[0095]
取16.2mg實(shí)施例1制得的半抗原1溶于0.5ml dmf溶液中，攪拌加入12mg edc和10mg nhs，室溫避光攪拌反應(yīng)過夜，得半抗原1活化液；取16mg lf溶解于1.6ml ph＝9.0的bb緩沖液中后，攪拌加入150μl半抗原1活化液，攪拌均勻后，室溫避光偶聯(lián)4h，得到偶聯(lián)混合物；偶聯(lián)混合物于4℃下用pbs緩沖溶液透析3天，每天更換透析液2次，得到的人工抗原1(半抗原1-lf)，人工抗原1以1mg/ml的濃度分裝，凍存于-20℃冰箱。
[0096]
2、人工抗原1的鑒定
[0097]
對(duì)載體蛋白乳鐵蛋白(lf)、半抗原1及人工抗原1進(jìn)行紫外掃描測(cè)定(190～400nm)。
[0098]
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0099]
測(cè)定結(jié)果如圖3所示，從圖3可以看出完全抗原的紫外特征吸收峰相對(duì)于半抗原和載體蛋白都有不同程度的偏移，且發(fā)現(xiàn)人工抗原1同時(shí)具備半抗原和lf的特征吸收峰，說明半抗原1與lf偶聯(lián)成功，成功制備得到人工抗原1，其結(jié)構(gòu)式如式(iii)，其中protein為lf。
[0100][0101]
實(shí)施例3人工抗原2的合成與鑒定
[0102]
一、實(shí)驗(yàn)方法
[0103]
1、人工抗原2的合成
[0104]
利用實(shí)施例1制備得到的半抗原1，通過活潑酯法偶聯(lián)牛血清白蛋白(bsa)制備人工抗原2，其方法具體如下：
[0105]
取16.2mg實(shí)施例1制得的半抗原1溶于0.5ml dmf溶液中，攪拌加入12mg edc和10mg nhs，室溫避光攪拌反應(yīng)過夜，得半抗原1活化液；取24mg bsa溶解于2.4ml ph＝9.0的bb緩沖液中后，攪拌加入225μl半抗原1活化液，攪拌均勻后，室溫避光偶聯(lián)4h，得到偶聯(lián)混合物；偶聯(lián)混合物于4℃下用pbs緩沖溶液透析3天，每天更換透析液2次，得到的人工抗原2(半抗原1-bsa)，人工抗原2以1mg/ml的濃度分裝，凍存于-20℃冰箱。
[0106]
2、人工抗原2的鑒定
[0107]
對(duì)載體蛋白牛血清白蛋白(bsa)、半抗原1及人工抗原2進(jìn)行紫外掃描測(cè)定(190～400nm)。
[0108]
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0109]
測(cè)定結(jié)果如圖4所示，從圖4可以看出完全抗原的紫外特征吸收峰相對(duì)于半抗原和載體蛋白都有不同程度的偏移，且發(fā)現(xiàn)人工抗原2同時(shí)具備半抗原和bsa的特征吸收峰，說明半抗原1與bsa偶聯(lián)成功，成功制備得到人工抗原2，其結(jié)構(gòu)式如上式(iii)，其中protein為bsa，
[0110][0111]
實(shí)施例4半抗原2的合成與鑒定
[0112]
一、實(shí)驗(yàn)方法
[0113]
1、半抗原2的合成
[0114]
用體積比為ch3cn:ccl4:h2o＝10:10:15的混合液作為溶劑，溶解氟氯氰菊酯，加入高碘酸鈉，三氯化釕，升溫至60℃，反應(yīng)1.5h。旋蒸溶劑，加入水、乙酸乙酯多次萃取，保留有機(jī)相。用飽和食鹽水洗滌，加入無水硫酸鈉干燥，過濾，用300～400目硅膠柱過柱純化得黑油狀物。
[0115]
2、半抗原2的鑒定
[0116]
對(duì)半抗原2進(jìn)行質(zhì)譜及核磁氫譜分析，以確定其分子量及結(jié)構(gòu)特征。
[0117]
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0118]
半抗原2的核磁結(jié)果：1h nmr(600mhz,meod)δ7.60
–
7.30(m,1h),7.19(ddd,j＝16.3,8.2,1.8hz,0h),7.08
–
6.86(m,0h),6.54(d,j＝30.6hz,0h),2.14(dt,j＝103.3,7.6hz,0h),1.47
–
1.03(m,6h).
[0119]
半抗原2的esi-ms鑒定結(jié)果：如圖6所示，該半抗原2的ms：c
21h18
fno5：383.38，esi-[m-h]-:：382.0。
[0120]
半抗原2的結(jié)構(gòu)式如式(ⅱ)所示：
[0121][0122]
半抗原2采用系統(tǒng)命名法命名為3-((氰基(4-氟-3-苯氧基苯基)甲氧基)羰基)-2,2-二甲基環(huán)丙烷-1-羧酸。
[0123]
實(shí)施例5人工抗原3的合成和鑒定
[0124]
利用實(shí)施例4制備得到的半抗原2，通過活潑酯法偶聯(lián)牛血清白蛋白(bsa)制備人工抗原3，其方法具體如下：
[0125]
取8.72mg實(shí)施例4制得的半抗原2溶于0.5ml dmf溶液中，攪拌加入6.75mg edc和4mg nhs，室溫避光攪拌反應(yīng)4h，得半抗原2活化液；取50mg bsa溶解于5ml的cb緩沖液中，攪拌緩慢滴加半抗原2活化液，攪拌均勻后，室溫避光偶聯(lián)過夜，得到偶聯(lián)混合物；偶聯(lián)混合物于4℃下用pbs緩沖溶液透析3天，每天更換透析液2次，得到的人工抗原3(半抗原2-bsa)，人工抗原3以1mg/ml的濃度分裝，凍存于-20℃冰箱。
[0126]
對(duì)載體蛋白牛血清白蛋白(bsa)、半抗原2及人工抗原3進(jìn)行紫外吸收峰掃描測(cè)定(190～400nm)，測(cè)定結(jié)果如圖7所示，半抗原2紫外峰值略低，這是由于其溶解稀釋后濃度偏低導(dǎo)致，但通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，完全抗原3的紫外特征吸收峰相對(duì)于半抗原2和載體蛋白bsa都有不同程度的偏移，且發(fā)現(xiàn)人工抗原3同時(shí)具備半抗原2和bsa的特征吸收峰，說明半抗原2和bsa偶聯(lián)成功，成功制備得到人工抗原3，其結(jié)構(gòu)式如式(iv)，其中protein為bsa，
[0127][0128]
實(shí)施例6抗體的制備及鑒定
[0129]
1、小鼠的免疫：取250μl實(shí)施例2制備并稀釋為1mg/ml的人工抗原1(半抗原1-lf)與等量的免疫佐劑(第一次免疫用弗氏完全佐劑，以后加強(qiáng)免疫均用弗氏不完全佐劑)乳化均勻，免疫動(dòng)物。將6～7周大的bal b/c小鼠分別采用背部皮下、各部位皮下、腹腔和腳部多種注射方式免疫，免疫計(jì)量為100μl/只，2周后第二次免疫，以后每間隔2周加強(qiáng)免疫一次。第三次加強(qiáng)免疫1周后小鼠尾部取血，并利用間接競(jìng)爭elisa測(cè)定血清效價(jià)。當(dāng)效價(jià)不再上升時(shí)，取100μl濃度為1mg/ml人工抗原1腹腔注射沖擊免疫。
[0130]
2、細(xì)胞融合：在沖擊免疫三天后，使用peg(聚乙二醇)進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下：
[0131]
a、收集小鼠脾細(xì)胞：頸椎脫臼法處死小鼠，立即放入75％酒精中浸泡殺菌，無菌操作取出小鼠的脾臟放入200目細(xì)胞篩網(wǎng)中，用無菌注射器的膠頭適度研磨，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基沖洗得到脾細(xì)胞懸液，收集，離心(1000rpm，7min)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌脾細(xì)胞三次，最后一次離心后，將脾細(xì)胞稀釋到一定體積，計(jì)數(shù)，備用；
[0132]
b、收集sp2/0細(xì)胞：融合前7-10天，將sp2/0骨髓瘤細(xì)胞用完全培養(yǎng)基在5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合前要求sp2/0瘤細(xì)胞數(shù)量達(dá)到1～4
×
107，保證融合前sp2/0瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期。融合時(shí)，收集骨髓瘤細(xì)胞，懸浮于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
[0133]
c、按照脾細(xì)胞：sp2/0＝5：1的比例混合兩種細(xì)胞，離心，棄上清，得沉積在離心管底部的混合細(xì)胞；
[0134]
d、融合：第一分鐘，向離心管底部細(xì)胞緩緩滴加1ml peg；第二分鐘，保持離心管勻速搖動(dòng)；第三分鐘，滴加1ml預(yù)熱好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；第四分鐘，滴加3ml預(yù)熱好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；第五分鐘，滴加8ml預(yù)熱好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；第六分鐘，滴加8ml預(yù)熱好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；離心(1000rpm，7min)，棄上清，重懸入含hat篩選培養(yǎng)液中，按照200μl/孔加到96孔細(xì)胞板，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0135]
3、細(xì)胞篩選與細(xì)胞株建立：在細(xì)胞融合的第5天用ht培養(yǎng)基對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行半換液，第8天進(jìn)行全換液，在第10天取細(xì)胞上清，通過ic-elisa進(jìn)行篩選，對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行效價(jià)抑制效果測(cè)定。選擇對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品均有較好抑制的細(xì)胞孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。重復(fù)4～5次，獲得細(xì)胞株c5b6。
[0136]
4、單克隆抗體的制備與鑒定：取10周齡以上的bal b/c小鼠數(shù)只，每只小鼠腹腔注射液體石蠟500μl；7天后每只小鼠腹腔注射約1
×
106雜交瘤細(xì)胞，再過7天待小鼠腹部腫脹收集腹水，將收集到的腹水通過層析柱法純化。使用1ml protein g填料裝柱，加入經(jīng)pbs緩沖液稀釋后的腹水50ml，將流穿液反復(fù)上樣7～8次，之后用甘氨酸洗脫，用tris-hcl將洗脫液及時(shí)調(diào)至中性。透析脫鹽，最終得到純化后的單克隆抗體c5b6，分裝后置于-20℃保存。
[0137]
5、利用間接競(jìng)爭elisa測(cè)定抗體的效價(jià)和抑制率，具體方法為：
[0138]
(1)包被：用包被液稀釋包被原到1μg/ml，100μl/孔，37℃水浴中包被過夜；
[0139]
(2)封閉：棄去包被液，洗板2次，吸水紙上拍干，每孔加120μl封閉液，37℃水浴孵育封閉3h。甩干，37℃烘箱倒置1h烘干；
[0140]
(3)加抗體及藥物：單克隆抗體c5b6用pbs稀釋1k(1000)、2k、4k、8k、16k、32k、64k等倍數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)品用pbs稀釋至100ng/ml，備用。
[0141]
效價(jià)列：每孔先加入50μl pbs緩沖液，后將倍比稀釋好的單克隆抗體c5b6按50μl/孔依次加入孔內(nèi)，最后一個(gè)孔加pbs作空白對(duì)照；
[0142]
抑制列：每孔先加入50μl經(jīng)pbs緩沖液稀釋的藥物，后將經(jīng)梯度稀釋的抗體50μl/孔依次加入孔內(nèi)，最后一個(gè)孔加pbs作空白對(duì)照；
[0143]
37℃溫育40min，洗板5次；
[0144]
(4)加二抗：加入經(jīng)pbst緩沖液稀釋5000倍的羊抗鼠二抗(100μl/孔)，溫育37℃30min，洗板5次；
[0145]
(5)顯：tmb底物緩沖液a、b液等體積混合得到底物液，加入底物液(100μl/孔)，37℃孵育10min；
[0146]
(6)終止：在酶標(biāo)板上加入10％h2so4的終止液(50μl/孔)終止反應(yīng)；
[0147]
(7)讀數(shù)：在波長450nm條件下用酶標(biāo)儀讀取吸光值(od)。選擇吸光度值在1.0～1.5區(qū)間內(nèi)的抗體稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)，抗體的藥物識(shí)別性能由其抑制率得出。抑制率的計(jì)算方式如式1所示。抗體效價(jià)和結(jié)果如表1所示。
[0148][0149]
表1不同包被原組合的抗血清效價(jià)和抑制率
[0150][0151]
從表1可知，同源包被表現(xiàn)出較高效價(jià)為45k，但相應(yīng)抑制率較低，僅為21％。而使用異源包被后，抗體效價(jià)為8k，此時(shí)抑制率顯著提升為79％，因此可以通過使用異源包被的方式提高檢測(cè)方法的靈敏度。同時(shí)，還可以通過進(jìn)一步濃縮抗體或者提高包被濃度的方式解決抗體效價(jià)較低的缺陷。
[0152]
實(shí)施例7包被濃度與抗體稀釋倍數(shù)對(duì)ic
50
的影響
[0153]
一、實(shí)驗(yàn)方法
[0154]
在檢測(cè)免疫分析方法中，使用棋盤檢測(cè)法檢測(cè)包被濃度與單克隆抗體濃度對(duì)檢測(cè)的影響。
[0155]
以實(shí)施例5制備的人工抗原3(半抗原2-bsa)作為包被原，以實(shí)施例6制得的抗體(單克隆抗體c5b6)為抗體。
[0156]
分別用濃度為8、6、4、2、1μg/ml的包被原在96孔酶標(biāo)板上包被；將抗體分別稀釋
1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000倍，標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為100ng/ml的溶液；將50μl經(jīng)系列梯度稀釋的抗體(實(shí)施例6制得的單克隆抗體c5b6)和50μl 100ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品加入96孔酶標(biāo)板中，競(jìng)爭反應(yīng)后通過酶標(biāo)儀讀出吸光值在1.0～1.5的抗體濃度及包被濃度組合。
[0157]
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0158]
以藥物濃度為橫坐標(biāo)，b/b0為縱坐標(biāo)，采用歸一法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算半數(shù)抑制濃度ic
50
并選取最大吸光度a
max
，取ic
50
值最小，a
max
/ic
50
值最大為最佳工作濃度。該抗體(單克隆抗體c5b6)的最佳包被濃度為4μg/ml，抗體稀釋倍數(shù)為16k。
[0159]
實(shí)施例8一種檢測(cè)的方法
[0160]
一種檢測(cè)的間接競(jìng)爭elisa方法，包括以下步驟：
[0161]
(1)將實(shí)施例5制備的人工抗原3(半抗原2-bsa，其結(jié)構(gòu)式如式(iv)，其中protein為bsa)作為包被原，用碳酸鹽緩沖液(cb，0.1m ph＝9.8)稀釋至4μg/ml，包被96孔酶標(biāo)板，每孔加入100μl，37℃孵育過夜(12h)，傾去孔中液體，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封閉液，37℃避光孵育2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存
[0162][0163]
(2)棄去包被液，洗滌兩次，拍干；
[0164]
(3)每孔加入120μl封閉液(即質(zhì)量比5％脫脂奶粉)，37℃封閉3h；
[0165]
(4)棄去封閉液，拍板，37℃烘干30min后取出，用自封袋裝好備用；
[0166]
(5)用磷酸鹽緩沖液(pbs，0.01m，ph＝7.4)1：16000倍稀釋實(shí)施例6制備的單克隆抗體，并將待檢測(cè)藥物2倍梯度稀釋至2000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、7.8125ng/ml、3.90625ng/ml、1.953125ng/ml；
[0167]
(6)每行加入50μl待檢測(cè)藥物稀釋液(三組平行)，再加入50μl/孔實(shí)施例6制備的單克隆抗體稀釋液，37℃孵育40min，洗滌五次，拍干；
[0168]
(7)加入經(jīng)磷酸吐溫緩沖液(pbst，0.01m)5000倍稀釋后的羊抗鼠二抗-hrp，100μl/孔，37℃孵育30min，洗滌五次，拍干；
[0169]
(8)加入顯液，每孔100μl，顯10min；
[0170]
(9)加入50μl 10％的h2so4溶液終止反應(yīng)，并在450nm處讀取od值。
[0171]
(10)按上述步驟(1)到(9)進(jìn)行操作，將步驟(6)中待測(cè)稀釋液替換成經(jīng)過提取的待測(cè)樣品稀釋液，結(jié)合所繪制的標(biāo)曲，即可測(cè)定未知樣品中實(shí)際藥物的含量。
[0172]
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0173]
用于檢測(cè)藥物的抗體間接競(jìng)爭elisa標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖8所示，從圖8可知用于檢測(cè)藥物的抗體半抑制濃度(ic
50
)為42.92ng/ml，定量檢測(cè)范圍為21.63～91.36ng/ml，最低檢測(cè)限(lod)為15.11ng/ml；說明本發(fā)明制備得到的用于檢測(cè)的抗體靈敏度高，可以滿足檢測(cè)要求。
[0174]
實(shí)施例9一種檢測(cè)的試劑盒
[0175]
一、組成
[0176]
檢測(cè)的試劑盒，包含下述各部分：
[0177]
(1)包被有包被原的酶標(biāo)板的制備：將實(shí)施例5制備的人工抗原3(半抗原2-bsa，其結(jié)構(gòu)式如式(iv)，其中protein為bsa)作為包被原，用碳酸鹽緩沖液(cb，0.1m ph＝9.8)將包被原稀釋成4μg/ml，每孔加入100μl，37℃避光孵育過夜，傾去孔中液體，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封閉液，37℃避光孵育2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存；其中，包被緩沖液為ph值為9.6的0.05mol/l的碳酸鹽緩沖液，封閉液為ph值為7.1～7.5，含有質(zhì)量比1％～3％酪蛋白和0.1～0.3mol/l的磷酸鹽緩沖液；
[0178]
(2)標(biāo)準(zhǔn)品溶液：8個(gè)濃度梯度，分別為25000μg/l，5000μg/l，1000μg/l，200μg/l，40μg/l，8μg/l，1.6μg/l，0.32μg/l；
[0179]
(3)實(shí)施例6制備的單克隆抗體(單克隆抗體c5b6)；
[0180]
(4)酶結(jié)合物：辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗；
[0181]
(5)底物顯液：由a液和b液組成，a液為過氧化脲，b液為四甲基聯(lián)苯胺；
[0182]
(6)終止液為體積分?jǐn)?shù)為10％h2so4；
[0183]
(7)洗滌液為ph值為7.4，含有0.5％～1.0％吐溫-20、0.01
‰
～0.03
‰
疊氮化鈉防腐劑、0.1～0.3mol/l的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。
[0184]
二、使用方法
[0185]
同實(shí)施例8。
[0186]
實(shí)施例10對(duì)及其他常見菊酯類農(nóng)藥檢測(cè)的靈敏度
[0187]
一、實(shí)驗(yàn)方法
[0188]
使用實(shí)施例9的試劑盒，將50μl系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和50μl稀釋16k的實(shí)施例6制備得到的抗體加入96孔酶標(biāo)板中，競(jìng)爭反應(yīng)后通過酶標(biāo)儀分析儀測(cè)定吸光值(od)。
[0189]
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0190]
以b/b0為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，采用歸一法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線半數(shù)抑制量濃度為ic
50
，以ic
10
為檢測(cè)限，以ic
20
～ic
80
為檢測(cè)范圍。以為標(biāo)準(zhǔn)品建立elisa的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖8，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)見表2。
[0191]
表2抗體對(duì)的檢測(cè)參數(shù)
[0192][0193]
結(jié)合圖8和表2可知，以為標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具備典型的s型曲線，說
明利用本發(fā)明的抗體進(jìn)行檢測(cè)靈敏度良好。
[0194]
實(shí)施例11對(duì)對(duì)及其他常見菊酯類農(nóng)藥檢測(cè)的特異性
[0195]
一、實(shí)驗(yàn)方法
[0196]
使用實(shí)施例9的試劑盒，對(duì)及其他常見菊酯類農(nóng)藥進(jìn)行檢測(cè)。
[0197]
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0198]
結(jié)果如表3。交叉反應(yīng)率的計(jì)算方式如式2所示。
[0199][0200]
表3：
[0201]
[0202][0203]
由表3可知，以抗體對(duì)的交叉反應(yīng)率為100％，ic
50
值為42.92ng/ml，對(duì)其他菊酯類農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率均低于1％，說明本技術(shù)的抗體可特異性識(shí)別，進(jìn)一步檢測(cè)的含量。
[0204]
最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明及思路的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
技術(shù)特征：
1.一種半抗原，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式如式(i)所示，2.一種人工抗原，其特征在于，為權(quán)利要求1所述半抗原偶聯(lián)載體蛋白，其結(jié)構(gòu)式如式(iii)所示，3.一種半抗原，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式如式(ⅱ)所示，4.一種人工抗原，其特征在于，為權(quán)利要求3所述半抗原偶聯(lián)載體蛋白，其結(jié)構(gòu)式如式(iv)所示，5.權(quán)利要求1和/或3所述半抗原在制備人工抗原中的應(yīng)用。6.一種用于檢測(cè)的組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求2和4所述的人工抗原，權(quán)利要求2所述的人工抗原作為免疫原，權(quán)利要求4所述的人工抗原作為包被原。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，權(quán)利要求2所述的人工抗原載
體蛋白為乳鐵蛋白作為免疫原，權(quán)利要求4所述的人工抗原載體蛋白為牛血清白蛋白作為包被原。8.權(quán)利要求1和/或3所述的半抗原、權(quán)利要求2和/或3所述的人工抗原在、或權(quán)利要求6所述組合物在制備檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。9.一種的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求6所述組合物。10.一種非疾病診斷目的的的檢測(cè)方法，其特征在于，利用權(quán)利要求6所述組合物。
技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了半抗原、人工抗原和的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法對(duì)具有良好的靈敏度，半抑制濃度為42.92ng/mL，最低檢測(cè)限為15.11ng/mL。對(duì)常見菊酯類農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率均低于1％，具有良好的特異性，可有效的排除其他菊酯類藥物的干擾。利用本發(fā)明的半抗原和人工抗原實(shí)現(xiàn)了快速準(zhǔn)確檢測(cè)相關(guān)樣品中的目的。測(cè)相關(guān)樣品中的目的。測(cè)相關(guān)樣品中的目的。
